JP3318021B2 - Ｎａｄシンセターゼをコードするｄｎａ及び該ｄｎａを使用したｎａｄシンセターゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤシンセターゼ
（ＮＡＤ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、以下ＮＡＤＳと略
す）ポリペプチドをコードする遺伝子、プラスミド、形
質転換体及びこれを用いてなる遺伝子組換え酵素ＮＡＤ
Ｓの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＮＡＤＳは生体におけるＮＡＤ（ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド：Ｎｉｃｏｔｉｎｅａ
ｍｉｄｅ Ａｄｅｎｉｎｅ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ）の生合成系の最終段階で、ＮＨ₃ とＡＴＰの存在
下、デアミドＮＡＤ⁺ のカルボキシル基のＯＨ基をアミ
ノ基に置換して、ＮＡＤ⁺ とＡＭＰとピロリン酸を生じ
る反応を触媒する酵素である（Ｅ．Ｃ．６．３．１．
５）。

【０００３】ＮＡＤＳは、他の酵素反応系により生成ま
たは消費されたＡＴＰ、デアミドＮＡＤ⁺ 、アンモニア
またはアンモニウムイオンのいずれか一つの測定や、Ｍ
ｇ²⁺の測定に使用され、特に生成物であるＮＡＤ⁺ を補
酵素とするサイクリング反応系と組み合わせることによ
り、高感度の測定を実施するのに利用される（特開昭５
９−１９８９９５号公報）。

【０００４】従来、公知のＮＡＤＳとしては、ラット肝
臓（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２３，４９３−５０
０（１９５８））、ブタ肝臓（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２３６，５２５−５３０（１９６１））、酵母
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，４７９４−４８
０２（１９７２））、大腸菌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２３６，１４９４−１４９７（１９６１）；Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，３８５−３９２（１９
６７））などにより生産されているものが知られてい
る。

【０００５】また、バチラス・ステアロサーモフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）Ｈ−８０４株もＮＡＤＳを生産していることが
知られている（特開昭６３−１８５３７８号公報参
照）。このＮＡＤＳは耐熱性であり、かつＮＨ₃ 供与体
としてグルタミンおよびアスパラギンに対して基質特異
性を有さない特徴を有する酵素である。

【０００６】

【発明が解決しようとする問題点】上記の如くＮＡＤＳ
の生産法は特開昭６３−１８５３７８号公報に報告され
ているが、本方法における培養活性はたかだか０．１〜
０．０１ｕ／ｍｌであり、１回の培養で得られる培養酵
素が少なく不経済であり、効率のよい高純度かつ高品質
ＮＡＤＳ生産法が望まれていた。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記問
題点に関し鋭意研究の結果、上記バチラス・ステアロサ
ーモフィラスに属する微生物よりＮＡＤＳを構成するポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードするポリペプチドの
一次構造の決定、及び該酵素のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡの塩基配列を決定した。

【０００８】また、該ＮＡＤＳ遺伝子を任意のベクター
に導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を
形質転換体とし、該形質転換体を培養して、ＮＡＤＳ遺
伝子情報を発現させ、該培養物からＮＡＤＳを確認し、
優れた工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至
った。本発明は、上記の知見に基づいてなされたもの
で、Ｎ末端側より図１で表されるアミノ酸配列で表され
るＮＡＤＳポリペプチドをコードすることを特徴とする
ＤＮＡ、Ｎ末端側より図１に表されるアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを保持することを特徴とするプラスミ
ド、宿主がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
に属する微生物であって、宿主にとって外来性であるＮ
末端側より図１で表されるアミノ酸配列で表されるＮＡ
ＤＳポリペプチドをコードするＤＮＡを保持することを
特徴とする形質転換体、Ｎ末端側より図１で表されるア
ミノ酸配列で表されるＮＡＤＳポリペプチドをコードす
るＤＮＡを保持する形質転換体を培養して該ＤＮＡの遺
伝情報を発現せしめ、該培養物からＮＡＤＳを採取する
ことを特徴とするＮＡＤＳの製造法である。

【０００９】本発明の図１で表されるＮＡＤＳポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その
図１にて表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端
側はアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合で
あってもよく、Ｎ末端側であるＧｌｎの上流にはさらに
一個または複数のアミノ酸残基を有してもよく、そのア
ミノ酸残基としては開始コドンまたはシグナルペプチド
が挙げられ、またＣ末端側のＰｈｅの下流には、さらに
一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。

【００１０】さらに、本発明のＮＡＤＳを構成するアミ
ノ酸配列は図１で表されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する図１
中のアミノ酸配列の一部であってもよい。本発明の図１
で表されるアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡは、
そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペ
プチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応す
る一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤ
ＮＡであればよい。

【００１１】さらに、本発明のＮＡＤＳを構成するアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡは図１で表されるアミノ酸
配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の
効果を発現する図１中の一部分のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡであってもよい。上記ＤＮＡの代表例とし
て、５’末端側より図２で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、５’末端の上
流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したも
のでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドン
であればよい。さらに、好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、そ
れら以外の開始コドン又はシグナルペプチドに対応する
コドンを有したものを挙げることができる。３’末端た
るＴＴＴの下流側には、アミノ酸をコードするコドンを
１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのい
ずれでもよく、更に、その３’末端側にアミノ酸をコー
ドするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸
をコードするコドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有
することが好ましい。

【００１２】図１に示されたアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡは、例えば、ＮＡＤＳを生産するＮＡＤＳ遺伝子
の供与体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製
した後、超音波、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮ
Ａと切断してリニヤーにした発現ベクターとを両ＤＮＡ
の平滑または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどに
より結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡベ
クターのマーカーとＮＡＤＳの活性とを指標としてスク
リーニングして取得した組み換えＤＮＡベクターを保持
する微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡ
ベクターを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡベクタ
ーからＮＡＤＳ遺伝子であるＤＮＡを取得すればよい。

【００１３】ＤＮＡの供与体である供与微生物として
は、バチラス属、好ましくはバチラス・ステアロサーモ
フィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）Ｈ−８０４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
０８）を利用するとよい。該菌株の菌学的性状、培養手
段、精製手段については特開昭６３−１８５３７８公報
に記載の通りである。

【００１４】遺伝子の供与体である微生物に由来するＤ
ＮＡを採取するには以下の如く行う。例えば、上述の供
与体である微生物を、液体培地で約１〜３日間通気撹拌
培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いで
これを溶菌させることによってＮＡＤＳ遺伝子を含有す
る溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチ
ームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要に
よりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリ
ウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理
的破壊法である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号
公報参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組み
合わせで行ってもよい。

【００１５】この様にして得られた溶菌物からＤＮＡを
分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽
出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレア
ーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜
組み合わせることにより行うことができる。分離精製さ
れた微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波処
理、制限酵素処理などにより行うことができるが、得ら
れるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるた
め、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用す
る、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。

【００１６】ベクターとしては、宿主微生物体内で自律
的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み
換え用として構築されたものが適している。ファージベ
クターとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合
にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。

【００１７】また、プラスミドベクターとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、
プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１
８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮＩなどが使用できる。この様
なベクターを、先に述べたＮＡＤＳ遺伝子供与体である
微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素
で切断して、ベクター断片を得ることが望ましい。

【００１８】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とのア
ニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの作用により微
生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組み換えＤＮＡを作
製する。必要ならばアニーリングの後、宿主微生物に移
入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用して組み換えＤ
ＮＡを作成することもできる。

【００１９】宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安
定かつ自律的に増殖可能で、かつ外来性ＤＮＡの形質が
発現できるものであればよく、例えば宿主微生物がエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
に属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ ＤＨ１、
エシェリヒア・コリ ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ Ｃ６００、等が利
用できる。

【００２０】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属
する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組
み換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微
生物の場合にはコンピテントセル法またはリポソーム組
み換えＤＮＡのプロトプラスト宿主細胞内への電気的な
融合移入法などを採用することができ、さらにマイクロ
インジェクション法を用いてもよい。

【００２１】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、図３に例示した予め合成したＮ
ＡＤＳのＤＮＡプローブを³²Ｐ等で放射能ラベル化し、
予め予想した遺伝子ライブラリーとのコロニーハイブリ
ダイゼーション法によりポジティブ株を目的の形質転換
体とすればよい。かくして得られた形質転換体である微
生物、例えばエシェリヒア属に属し、エシェリヒア・コ
リに属する微生物は、栄養培地に培養されることによ
り、多量のＮＡＤＳを安定して産生し得る。また必要な
ら、得られた形質転換体よりプラスミドを常法にしたが
って抽出し、ＮＡＤＳ遺伝子を含む、より限定的なＤＮ
Ａ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏ
ｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７．
（１９８３））による制限酵素認識部位の作製や、制限
酵素による切り出しにより分離し、新たにベクターに組
み込んで作製したプラスミドにより、さらに効率のよい
形質転換体を作成し、より多量のＮＡＤＳを安定に産生
させてもよい。

【００２２】上記の遺伝子操作に一般的に使用される量
的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮ
Ａを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０
ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、
程度が例示される。形質転換体を具体的に例示すれば、
図２に示されたＤＮＡをプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造
社製）に組み込み、宿主微生物エシェリヒア・コリ Ｄ
Ｈ１（ＡＴＣＣ ３３８４９）（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８
２），５０４−５０６）にトランスフォーメーション
し、ＮＡＤＳを生成する微生物を選択して得た形質転換
体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ） ＤＨ１・ｐｌＮＡＤＳ１（工業技術院生命工学
工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３９４）が
挙げられる。

【００２３】この様にして一度選択された組み換えＤＮ
Ａは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から
取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵
素などにより切断してＮＡＤＳを構成するポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と
同様な方法により切断して得られる他の開環ベクター末
端とを結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを
作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。

【００２４】また、本発明のＮＡＤＳは公知の遺伝子操
作手段によりペプチドの変異をなしてもよく、このよう
なムテインのＤＮＡは、本発明のＮＡＤＳ遺伝子から遺
伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味
し、この人工変異遺伝子は部位特異的塩基変換法及び目
的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換する
などの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、か
くして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質
を有するＮＡＤＳムテインＤＮＡについては最終的には
このムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組み換え
ＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることに
よって、ＮＡＤＳムテインの製造が可能である。

【００２５】ＮＡＤＳをコードするＤＮＡを含むベクタ
ーの具体的な例示としては、エシェリヒア・コリ ＤＨ
１・ｐｌＮＡＤＳ１より採取したプラスミドｐｌＮＡＤ
Ｓ１が挙げられる（その制限酵素地図を図６に示し
た）。上述の方法によって得られたＮＡＤＳを構成する
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基
配列は、ジデオキシ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２
０５−１２１０（１９８１））で解読し、またＮＡＤＳ
を構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列
より予測決定した。また、以下の方法により培養精製し
た該ＮＡＤＳであるポリペプチドを用いて、液相プロテ
インシーケンサー（ベックマン社製：ＢＥＣＫＭＡＮ
Ｓｙｓｔｅｍ ８９０ ＭＥ）によりそのＮ末端アミノ
酸配列が、予測決定されたアミノ酸配列の一部と一致す
ることを確認した。

【００２６】形質転換体により該ＮＡＤＳを製造するに
当たっては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体内
又は培養液中に該ＮＡＤＳを産生せしめ、培養終了後、
得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌
体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチー
ムなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴ
Ａ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該ＮＡＤ
Ｓの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分
画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーにより処理して、純度のよい該ＮＡＤＳを得ることが
できる。

【００２７】形質転換体である微生物の培養条件はその
栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、
通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトー
ス、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用され
る。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良
く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、
鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定
のビタミンなどが必要に応じて使用される。

【００２８】培養温度は微生物が発育し、ＮＡＤＳを生
産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの
場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件
は、条件によって多少異なるが、ＮＡＤＳが最高終了に
達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すれば
よく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４８時
間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＮＡＤＳを生産
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場
合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。

【００２９】培養物中のＮＡＤＳは、菌体を含む培養液
そのままを採取し、利用することもできるが、一般には
常法に従って、ＮＡＤＳが培養液中に存在する場合に
は、濾過、遠心分離などによりＮＡＤＳ含有溶液と微生
物菌体とを分離した後に利用される。ＮＡＤＳが菌体内
に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分
離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を
機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、
又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は界
面活性剤を添加してＮＡＤＳを可溶化し水溶液として分
離採取する。

【００３０】この様にして得られたＮＡＤＳ含有溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱
せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半
透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去す
ることができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤など
によるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるＮ
ＡＤＳ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により
精製されたＮＡＤＳが得られる。

【００３１】以上の製造法により得られるＮＡＤＳとし
て例えば下記の諸物性を有するＮＡＤＳが例示される。 （１）酵素作用 下記式に示した通りに、Ｍｇ²⁺またはＭｎ²⁺存在下、デ
アミドＮＡＤ⁺ およびＡＴＰ、ＮＨ₃ からＮＡＤ⁺ およ
びＡＭＰ、ピロリン酸を生成する反応を触媒する。

【００３２】

【化１】

【００３３】（２）基質特異性 アンモニアに基質特異性を有し、Ｌ−バリン、Ｌ−ホモ
セリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、
Ｌ−チロシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェニルアラニン、
Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンに
基質特異性を有しない。 （３）分子量 ５４，０００±５，０００（ゲル濾過による実測値。た
だし、２量体） （４）等電点 ｐＨ５．３付近（等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ社
製）、キャリアーアンフォラインｐＨ３．５〜１０．０
（ＬＫＢ社製）を用い、７００Ｖ、４８時間通電した
後、カラム（２４×３０ｃｍ）から２ｍｌずつ分画し、
各々の画分のｐＨと活性を測定することによる。） （５）熱安定性 ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に本酵素を溶
解し、各温度で１５分間加熱処理した後、その残存活性
を後記の酵素活性測定法に従って測定した結果、本酵素
は少なくとも５５℃以下では安定であった。 （６）至適温度 ５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃の各温度にお
いて後記の酵素活性測定法の反応液１で１０分間反応せ
しめ、その後直ちに冷却し、３７℃で反応液２を加え、
後記の酵素活性測定法に従って測定した結果、本酵素は
５５℃付近に至適温度を有した。 （７）ｐＨ安定性 本酵素を５０ｍＭのジメチルグルタル酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．５〜９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）に溶解し、５５℃で１
５分間処理した後、その残存活性を後記の酵素活性測定
法に従って測定した。その結果、本酵素はｐＨ７．５〜
９．０の範囲で安定であった。 （８）至適ｐＨ 後記の酵素活性測定法の反応液をジメチルグルタル酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜９．０）、グリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）に加えて
酵素反応を行った後、１００℃１０分間加熱して反応を
停止せしめ、生成したＮＡＤの量を測定した。その結
果、本酵素はｐＨ８．５〜１０．０付近に至適ｐＨを有
した。 （９）ＮＡＤＳの酵素活性測定法 反応液組成 反応液１：４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
２０ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭのＮＨ₄ Ｃｌ、２ｍＭ
のＡＴＰ、０．５ｍＭのデアミドＮＡＤ、０．１％ウシ
血清アルブミン（シグマ社製） 反応液２：４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
５ｕ／ｍｌジアフォラーゼ（旭化成工業社製）、３％エ
タノール、５Ｕ／ｍｌアルコールデヒドロゲナーゼ（東
洋紡績社製）、０．０２５％ＮＢＴ（和光純薬工業社
製）、０．１％トリトンＸ−１００、０．５％ウシ血清
アルブミン、０．１ＭのＥＤＴＡ 酵素活性測定 酵素反応液１を１ｍｌ容小試験管に入れ、３７℃で５分
間インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０．
０２ｍｌを添加して撹拌し、３７℃で反応を開始する。
正確に１０分間反応の後に、３７℃に保温した酵素反応
液２を１ｍｌ加え、さらに正確に５分間反応した後、
０．２Ｎ−塩酸１ｍｌを添加して撹拌し、反応を停止し
て、Ａ５５０ｎｍを測定して吸光度Ａを求めた。また、
上記反応液１よりデアミドＮＡＤを除き、代わりに０〜
１００μＭのＮＡＤを加えた反応液を用いて同様の測定
を行い（酵素液は添加しない）、その吸光度を測定し、
標準曲線を作製し、１分間に１μｍｏｌｅのＮＡＤを生
成する酵素活性を１ユニットとして酵素活性濃度を求め
た。

【００３４】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げて詳細に説明す
るが、何等本発明はこれによって限定されるものではな
い。

【００３５】

【実施例１】 ＜バチラス・ステアロサーモフィラスからのＤＮＡの抽
出＞ＬＢ培地（１％ Ｂａｃｔｏ ｔｒｉｐｔｏｎｅ、
０．５％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（以上ＤＩＦＣ
Ｏ社製）、１％ ＮａＣｌ）２００ｍｌに、ＮＡＤＳ生
産菌であるバチラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｏｐｈｉｌｕ
ｓ）Ｈ−８０４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４０８）を植菌
し５５℃で１昼夜振盪培養した。

【００３６】培養液を遠心分離（３，０００Ｇ、４℃、
１０分）し、集菌した菌体を２０ｍｌのＴＥＳ（５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０、１５％Ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁し、最
終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにリゾチーム（ＳＩＧ
ＭＡ社製）を加え、３７℃で１０分間処理し、細胞壁を
破壊した。これに１０％ＳＤＳを０．５ｍｌ加え、さら
に２１ｍｌのフェノールとクロロホルムの１対１混合液
を加え撹拌した後、遠心分離（２５，０００Ｇ、１５
分）し、分離した水層を他の容器に移し、４２ｍｌのエ
タノールを加え析出してくる染色体をガラス棒にからめ
て取得した。

【００３７】この染色体を２０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８．０）に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホ
ルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した
後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に
移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ５．５緩衝液２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加
え、撹拌後−７０℃で２０分間冷却した後、遠心分離
（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を
７５％ エタノールで洗い、減圧乾燥した。

【００３８】以上の操作によりバチラス・ステアロサー
モフィラスの染色体標品４ｍｇを得た。

【００３９】

【実施例２】 ＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞バチラス・ステアロサ
ーモフィラス Ｈ−８０４株より生産された酵素ＮＡＤ
Ｓを精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法
により決定した。判明したＮ末端の３０アミノ酸配列を
基に、その遺伝子の５’末端側から９０塩基配列を予想
した。この予想配列を基に設計されるオリゴヌクレオチ
ドプローブには無数の形状があるが、本発明ではそのう
ちＮＡＤＵ１と命名したオリゴヌクレオチドを使用し
た。ＮＡＤＵ１の塩基配列構造を図３に示した。

【００４０】このオリゴヌクレオチドをアール・エル・
レッシンジャーらの方法（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ，．Ｗ．Ｂ．Ｌｕｒｓｆｏｒｄ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ９８，３６５５）に基
づきＤＮＡシンセサイザー（ベックマン社製：Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ１ ｐｌｕｓ）を用いて合成し
た。

【００４１】完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇを
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）および、７
４０ｋＢｑ（キロベクレル）〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（アマ
シャムジャパン社製）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（東洋紡績社製）８．５ｕで３７℃、３０分間反
応せしめ、アイソトープ³²Ｐを取り込ませ放射性オリゴ
ヌクレオチドプローブとした。

【００４２】

【実施例３】 ＜ＮＡＤＳ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞実施
例１の操作で得られたバチラス・ステアロサーモフィラ
ス Ｈ−８０４株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリ
ーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、
目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検
定する操作を行った。即ち、バチラス・ステアロサーモ
フィラス Ｈ−８０４株の染色体ＤＮＡ（５μｇ）を各
種制限酵素（宝酒造社製、以下制限酵素類は全て宝酒造
社製であり、反応条件は添付のマニュアルに従った）で
切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、
４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液ｐＨ７．４、２ｍＭの
ＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、泳動後
のアガロースゲルをアルカリ変性溶液（０．５ＮのＮａ
Ｃｌ、１．５ＭのＮａＣｌ）に１時間浸してＤＮＡを変
性させ、さらに３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５）に１時間浸した。

【００４３】このアガロースゲルにナイロンメンブレン
フィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）を重ね、
ティー・マニアチスらの方法（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉ
ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ ８６−９４ １９８２）によってＤＮＡ
をアガロースゲルからナイロンメンブレンフィルターに
移行させた。

【００４４】このフィルターを風乾後、８０℃で２時間
減圧下で加熱し、菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフ
ィルターに固定した。このフィルターを１０％のホルム
アミド濃度のハイブリダイゼーション溶液に、浸し（メ
ンブレン１００平方ｃｍ当り約４ｍｌ）、４２℃で１時
間加温してプレハイブリダイゼーションを行った。ハイ
ブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸
３ナトリウム（ｐＨ６．５）、１ｇ／ｌのドデシル硫酸
ナトリウム、１ｇ／ｌのフィコール（ファルマシア社
製）、１ｇ／ｌのポリビニルピロリドン、１ｇ／ｌのＢ
ＳＡ（ベーリンガー・マンハイム社製）、２５０ｍｇ／
ｌのサケ精子ＤＮＡ（ファルマシア社製）、適宜濃度の
ホルムアミド、なお使用直前に１００℃、１０分間加温
し直ちに氷で急冷してサケ精子ＤＮＡを変性させた。

【００４５】但し、１×ＳＳＣ：０．１５ＭのＮａＣ
ｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
を意味する。加温後、ハイブリダイゼーション溶液を捨
て、再び同じホルムアミド濃度のハイブリダイゼーショ
ン溶液を加え（メンブレン１００平方ｃｍ当り約２ｍ
ｌ）さらに実施例２で調製された放射性ＤＮＡプローブ
ＮＡＤＵ１を１０分の１量加え、４２℃で１６時間ハイ
ブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション
後、洗浄液（２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム）でフィルターを３回洗い（室温、フィルター１０
０平方ｃｍ当り約５０ｍｌ／回）続いて５０℃の洗浄液
中で（フィルター１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）１０
分間洗った後フィルターを自然乾燥した。この乾燥フィ
ルターをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製、Ｎｅｗ
ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オ
ートラジオグラフィーを行った。

【００４６】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＳａｌＩ切断
により約５ｋｂｐ（キロベースペアー：ＤＮＡ鎖長の単
位、１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にＮＡ
ＤＳ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＳａｌＩ
で切断した染色体ＤＮＡの５ｋｂｐフラグメントから遺
伝子ライブラリーを作成することとした。

【００４７】

【実施例４】 ＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例１の操作で得られ
たバチラス・ステアロサーモフィラス Ｈ−８０４株の
染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＳａｌＩで切断し、テ
ィー・マニアティスらの方法（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉ
ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ６．３
０−６．３１ １９８９）に従い、約５ｋｂｐのＤＮＡ
フラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、
制限酵素ＳａｌＩで切断しアルカリフォスファターゼ
（ＢＡＰ：宝酒造社製）１ｕで切断末端を脱リン酸化し
たｐＵＣ１１８（宝酒造社製）２μｇと、ＤＮＡ Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させた。こ
れを用いてＫ．Ｓｈｉｇｅｓａｄａの方法（細胞工学
２，６１６−６２６，１９８３）によってコンピテント
細胞としたエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９（宝酒造社
製）（ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄ
Ｒ１７，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｃＡ１，ｔｈｉ，△（ｌａ
ｃ−ｐｒｏＡＢ）／Ｆ^, 〔ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ
Ｂ⁺ ，ｌａｃＩ^q ，ｌａｃＺ△Ｍ１５〕，ｍｃｒＡ^- ，
ｍｃｒＢ⁺ （Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎ
ｅ，３３，１１９．））をトランスフォーメーション
し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地
（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵
母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌの１０
ｇ／ｌ、バクトアガー（ＤＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）
にて一夜培養し、約８０，０００個のアンピシリン耐性
コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。

【００４８】

【実施例５】 ＜ＮＡＤＳ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞実施
例４により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブ
レンフィルター（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレ
プリカし、このフィルターを別の５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有Ｌ平板寒天培地上に、コロニー面が上になる
ように重ね、３７℃で１６時間培養した。培養後、この
フィルターをアルカリ変性溶液（０．５ＮのＮａＣｌ、
１．５ＭのＮａＣｌ）に５分間浸し、さらに３Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に５分間浸した後乾燥し
た。このフィルターを８０℃で２時間減圧下で加熱し、
菌体中にあったプラスミドＤＮＡをフィルターに固定し
た。

【００４９】このフィルターを１０％のホルムアミド濃
度のハイブリダイゼーション溶液に浸し（メンブレン１
００平方ｃｍ当り約４ｍｌ）、４２℃で１６時間加温し
てプレハイブリダイゼーションを行った。加温後、ハイ
ブリダイゼーション溶液を捨て、再びハイブリダイゼー
ション溶液を加え（メンブレン１００平方ｃｍ当り約２
ｍｌ、ホルムアミド濃度はプレハイブリダイゼーション
時と同じ）、さらに実施例２で調製された放射性ＤＮＡ
プローブＮＡＤＵ１を１０分の１量加え、４２℃で２４
時間ハイブリダイゼーションを行った。

【００５０】ハイブリダイゼーション後、フィルターを
２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム洗浄液で
３回洗い（室温、フィルター１００平方ｃｍ当り約５０
ｍｌ／回）続いて５０℃の各洗浄液中で（フィルター１
００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）１０分間洗った後、再び
室温の洗浄液約１００ｍｌで洗った後フィルターを自然
乾燥した。この乾燥フィルターをＸ線フィルム（富士写
真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光
下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行っ
た。

【００５１】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーを２個確
認した。

【００５２】

【実施例６】 ＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例５で選ばれたポジ
ティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ液体培地（バクトトリプトン（ＤＩＦ
ＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）
５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）１．５ｍｌに植菌し
３７℃で１６時間振盪培養した後、ティー・マニアチス
らの方法（Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ８６−９
４ １９８２）で、プラスミドを抽出した。その結果、
２つのコロニーより抽出されたプラスミドは同じもので
あり、このプラスミドをｐｃＮＡＤＳ１と命名した。

【００５３】

【実施例７】 ＜ＮＡＤＳ構造遺伝子配列の決定＞さらにこのプラスミ
ドよりＮＡＤＳをコードする部分についてジデオキシ法
（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０（１９
８１））により塩基配列を決定した結果を図２に示し、
そのアミノ酸配列を図１に示した。

【００５４】

【実施例８】 ＜部位特異的変異用オリゴヌクレオチドプライマーの作
製＞高率なＮＡＤＳ発現プラスミドを作製するために、
ＮＡＤＳ遺伝子の開始コドン上にＳｐｈＩ制限酵素サイ
トを作製するためのオリゴヌクレオチドプライマーＮＳ
ｓｍ１を、実施例２に示したものと同じ方法で合成し
た。ＮＳｓｍ１の塩基配列構造を図３に示した。

【００５５】

【実施例９】 ＜ＮＡＤＳ発現用プラスミドｐｌＮＡＤＳ１の作製＞プ
ラスミドｐｃＮＡＤＳ１の２μｇを制限酵素ＳｐｈＩと
ＳａｃＩＩにより切断し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ
Ｋｉｔ（宝酒造社製）を使用して添付のマニュアルに従
って切断末端を平滑化した後、ＮＡＤＳ遺伝子を含む約
１．１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを分離し、このうち
１００ｎｇを、制限酵素ＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ Ｂ
ｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔを使用して切断末端を平滑化し
た後、ＢＡＰで末端を脱リン酸化したｐＴＶ１１８Ｎ
（宝酒造社製）１００ｎｇと、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させた。これを用いて
Ｋ．Ｓｈｉｇｅｓａｄａの方法によってコンピテント細
胞としたエシェリヒア・コリ ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）（Ｆ^- ，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９
６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^- ，ｍ_k ⁺ ），ｓ
ｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，λ^- （Ｔ．ｍａｎｉａｔｉ
ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８
２），５０４−５０６））をトランスフォーメーション
し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地
（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ，酵
母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ，ＮａＣｌの１０
ｇ／ｌ，バクトアガー（ＤＩＦＣＯ社製）１５ｇ／ｌ）
にて一夜培養し、形質転換体を得た。この形質転換体よ
り実施例６と同様の方法でプラスミドを抽出、精製し、
このプラスミドをｐｃＮＡＤＳ２と命名した。

【００５６】次に、オリゴヌクレオチドプライマーＮＳ
ｓｍ１と部位特異的変異反応用キットＭｕｔａｎ−Ｋ
（宝酒造社製）を使用し、添付のマニュアルに従って、
プラスミドｐｃＮＡＤＳ２に部位特異的変異を施し、Ｎ
ＡＤＳ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上にＳｐｈＩ制限酵素
サイトを付加した。即ち、実施例４の方法に従ってプラ
スミドｐｃＮＡＤＳ２で形質転換したエシェリヒア・コ
リ ＣＪ２３６（ｄｕｔ１，ｕｎｇ１，ｔｈｉ−１，ｒ
ｅｌＡ１／ｐＣＪ１０５（ｃａｍ^r ，Ｆ^, ）：Ｍｕｔａ
ｎ−Ｋ添付）を使用して、ビエイラらの方法（Ｖｉｅｉ
ｒａ，Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８７）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５
３，３−１１）に従って一本鎖ｐｃＮＡＤＳ２を調製
し、この一本鎖ｐｃＮＡＤＳ２にプライマーＮＳｓｍ１
をアニーリングさせ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖
プラスミドを合成した。この合成プラスミドでエシェリ
ヒア・コリ ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ（Δ（ｌａｃ−
ｐｒｏＡＢ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｍｕｔＳ２１５：：
Ｔｎ１０（ｔｅｔ^{r )/F,} （ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ
Ｂ⁺ ，ｌａｃＩ^q ，ｌａｃＺΔＭ１５）：Ｍｕｔａｎ−
Ｋ添付）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。これ
らの形質転換体に保持されるプラスミドのうち、制限酵
素ＳｐｈＩでＮＡＤＳ構造遺伝子の５’末端部分が切断
されることをアガロース電気泳動パターンで確認された
プラスミドをｐｃＮＡＤＳ２Ｓとして回収した。

【００５７】次に、プラスミドｐｃＮＡＤＳ２の２μｇ
をＮｃｏＩとＳｐｈＩで切断し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉ
ｎｇ Ｋｉｔを使用して切断末端を平滑化した後、ｐＴ
Ｖ１１８ＮベクターとＮＡＤＳ遺伝子を含む約４．３ｋ
ｂｐのＤＮＡフラグメントを分離し、ＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔで環状化し、これを用いて、コンピテ
ント細胞としたエシェリヒア・コリ ＤＨ１を形質転換
した。この形質転換体より実施例６で示したのと同様の
方法でプラスミドを抽出・精製し、このプラスミドをｐ
ｃＮＡＤＳ３と命名した。

【００５８】次に、プラスミドｐｃＮＡＤＳ３の２μｇ
を制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、ＮＡＤＳ遺伝子とｐＴ
Ｖ１１８Ｎの一部を含む約１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグ
メントを分離し、このうち１００ｎｇをＰｖｕＩＩで切
断し、ＢＡＰで末端を脱リン酸化したｐＵＣ１８（宝酒
造社製）１００ｎｇと、ＤＮＡ ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉ
ｔ（宝酒造社製）で連結させた。これを用いて、コンピ
テント細胞としたエシェリヒア・コリ ＤＨ１を形質転
換した。この形質転換体より実施例６で示したのと同様
の方法でプラスミドを抽出・精製し、このプラスミドを
ｐｌＮＡＤＳ１と命名した。また、ｐｌＮＡＤＳ１を保
持するエシェリヒ・コリ ＤＨ１をエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ１・ｐｌ
ＮＡＤＳ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３９４）と命名した。
ｐｌＮＡＤＳ１の保持するバチラス・ステアロサーモフ
ィラス由来約１．１ｋｂｐＤＮＡフラグメントの塩基配
列を図２に、ｐｌＮＡＤＳ１の作製手順を図４および図
５に示した。

【００５９】

【実施例１０】 ＜ｐｌＮＡＤＳ１保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の
調製＞エシェリヒア・コリ ＤＨ１・ｐｌＮＡＤＳ１を
５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１００μＭのＩＰＴ
Ｇ（和光純薬社製）を含有したＬＢ液体培地１０ｍｌで
３７℃、１６時間培養し遠心分離（１５，０００Ｇ、１
分、４℃）により集菌し１００μｌの１００ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を用
いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５
分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。同様
に、ＮＡＤＳ遺伝子を含まないクローニングベクターｐ
ＵＣ１８により形質転換されたエシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ１・ｐＵＣ１
８の抽出液も調製した。

【００６０】

【実施例１１】 ＜細胞抽出液中のＮＡＤＳ酵素活性の確認＞実施例１０
で調製したエシェリヒア・コリ ＤＨ１・ｐｌＮＡＤＳ
１、およびエシェリヒア・コリ ＤＨ１・ｐＵＣ１１８
の細胞抽出液中のＮＡＤＳ酵素活性を、前記のＮＡＤＳ
酵素活性測定法によって測定した。その結果を表１に示
したもので、その結果、エシェリヒア・コリ ＤＨ１・
ｐｌＮＡＤＳ１でのＮＡＤＳの活性発現が確認された。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【発明の効果】ＮＡＤＳのＮ末端アミノ酸配列に基づい
て合成したオリゴヌクレオチドを使用して、ＮＡＤＳ生
産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＮＡＤ
Ｓ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＮＡＤＳ遺
伝子を分離したもので、該ＮＡＤＳ遺伝子を利用して、
高効率なＮＡＤＳの生産が可能になった。

【００６３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） 株名：Ｈ−８０４ 配列の特徴 １６５−９０２ Ｐ ＣＤＳ 配列 GCATGCGCTC TTATTTCCGG CTGATGTGTT TCGTGAATGG CGGTCAGCCG CCGCGCGCCG 60 CCGCCCTCTT GTGTTTGACC GCAAGCGGAG AGAACGGTTT GTCCGCAGCC TTTATGCTAT 120 GCTACAATGA GAAATGGAAT CTTTGGAAAA GGAGTCGAGG GCGG ATG CAA GAA AAA 176 Met Gln Glu Lys -1 １ ATT GAC AAA CTC GTG CAA TGG TTG CGT GAC CAA GTC TCA TCA GCC GGT 224 Ile Asp Lys Leu Val Gln Trp Leu Arg Asp Gln Val Ser Ser Ala Gly 5 10 15 TTA AAC GGG GCG GTC GTC GGC ATC AGC GGC GGC ATC GAC TCG GCG GTT 272 Leu Asn Gly Ala Val Val Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asp Ser Ala Val 20 25 30 35 GTC GCC CAT TTG ATT AAG CGT GCC TTT CCG GAC GAT TCG CTG GGG CTG 320 Val Ala His Leu Ile Lys Arg Ala Phe Pro Asp Asp Ser Leu Gly Leu 40 45 50 ATC ATG CCT TGC AAA AGC AAT CCG AAA GAT ATG GAA GAT GCG CTG AAA 368 Ile Met Pro Cys Lys Ser Asn Pro Lys Asp Met Glu Asp Ala Leu Lys 55 60 65 GTG GTG AAA AGC TGC GGC ATC CGG CAT TTG GTC ATC GAT TTG ACC GAG 416 Val Val Lys Ser Cys Gly Ile Arg His Leu Val Ile Asp Leu Thr Glu 70 75 80 GCG CAC CGG ACG TTG TTT GGC GCG GTC GAG GCC GAG CTG AAA GCC ATC 464 Ala His Arg Thr Leu Phe Gly Ala Val Glu Ala Glu Leu Lys Ala Ile 85 90 95 GGG GAA TGG AGC GAA GAG CGC GCG CGC CTC GGA GAT GCG AAT ACA AGG 512 Gly Glu Trp Ser Glu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Asp Ala Asn Thr Arg 100 105 110 115 GCG CGT TTG CGC ATG ACG ACG TTG TAT GCG GTC GCC AAC AAT TAC GGC 560 Ala Arg Leu Arg Met Thr Thr Leu Tyr Ala Val Ala Asn Asn Tyr Gly 120 125 130 TAT CTC GTC GTC GGT ACG GAC AAC GCC GCC GAA TGG CAT ACG GGC TAC 608 Tyr Leu Val Val Gly Thr Asp Asn Ala Ala Glu Trp His Thr Gly Tyr 135 140 145 TTT ACG AAA TAC GGT GAC GGT GGA GTC GAT TTA GTG CCG CTC ATT CAC 656 Phe Thr Lys Tyr Gly Asp Gly Gly Val Asp Leu Val Pro Leu Ile His 150 155 160 TTT ACA AAA GGC GAA GTG CGC GAA ATG GGC CGT CTG CTC GGC GTC CCG 704 Phe Thr Lys Gly Glu Val Arg Glu Met Gly Arg Leu Leu Gly Val Pro 165 170 175 GAA GAA ATT ATC AAG AAA GCT CCA AGC GCC GGA CTG TGG GAA GGG CAG 752 Glu Glu Ile Ile Lys Lys Ala Pro Ser Ala Gly Leu Trp Glu Gly Gln 180 185 190 195 ACG GAT GAA AGC GAA ATG GGC ACG ACG TAT GAA ATG ATC GAT AAA TAT 800 Thr Asp Glu Ser Glu Met Gly Thr Thr Tyr Glu Met Ile Asp Lys Tyr 200 205 210 TTA AAA GGG GAA GAG ATT CCA GAA CGC GAT CGG AAA ATT ATT GAA CGG 848 Leu Lys Gly Glu Glu Ile Pro Glu Arg Asp Arg Lys Ile Ile Glu Arg 215 220 225 CTT CAT GAA CGT TCG CAT CAT AAA CGG CAG TTG GCG ATT GCG CCG CCG 896 Leu His Glu Arg Ser His His Lys Arg Gln Leu Ala Ile Ala Pro Pro 230 235 240 AAG TTT TAGCTGTCAT CTCGTTGGGT TGAACTGACA GCGATAAACC CCCCGCGTTT 952 Lys Phe 245 GCCGCAAGCT AAACGTAAGG CTGGCTTCAT GCCAGCCTTG GGCGAAGGAA ACCAAGGGGG 1012 GTTTTCCATT GAGATACGCG GTCAGATGGA TCGGCGCGTT GTCGGTCGCC GGATTGCTCG 1072 CCTCATGCAC CAACTACCGG GCGAATGAGG AAGGGGCGCA GCGTTATCAT GATGCGGCGA 1132 GACCGATCGG TTTTTACTCG ACGGAGCGAG GCGACGATTT CCGCTATGGC CGATATGGGA 1192 CGAATGCGCT CAATTATGAC AACCGTTATA TACGGGCGCG CCGCGG 1238

【００６４】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 Ｓ ＣＤＳ 配列 ATG CAA GAA AAA ATT GAT AAA CT 23 Met Gln Glu Lys Ile Asp Lys Leu 1 5

【００６５】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列 GTCGAGGGCG CATGCAACAA AA 22

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＮＡＤシンセターゼを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列を示す。

【図２】図２はＮＡＤシンセターゼを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを示す。

【図３】図３は実施例のＮＡＤシンセターゼ遺伝子の選
択に使用されたオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列
構造を示す。

【図４】図４はプラスミドｐｌＮＡＤＳ１の作製手順の
一部を示す。

【図５】図５は図４に続くプラスミドｐｌＮＡＤＳ１の
作製手順の一部を示す。

【図６】図６はプラスミドｐｌＮＡＤＳ１の制限酵素地
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ末端側より図１で表されるアミノ酸配
   列で表されるＮＡＤシンセターゼポリペプチドをコード
   することを特徴とするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ＤＮＡが、５’末端側より図２で表され
   る塩基配列である請求項第１項記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 Ｎ末端側より図１に表されるアミノ酸配
   列をコードするＤＮＡを保持することを特徴とするプラ
   スミド。
4. 【請求項４】 プラスミドが、プラスミドｐｌＮＡＤＳ
   １である請求項第３記載のプラスミド。
5. 【請求項５】 宿主がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ）属に属する微生物であって、宿主にとって外来
   性であるＮ末端側より図１で表されるアミノ酸配列で表
   されるＮＡＤシンセターゼポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡを保持することを特徴とする形質転換体。
6. 【請求項６】 宿主が、エシェリヒア属に属する微生物
   が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
   ｏｌｉ）に属する微生物である請求項５記載の形質転換
   体。
7. 【請求項７】 形質転換体が、エシェリヒア・コリ（Ｅ
   ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１・ｐｌＮＡＤ
   Ｓ１（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３９４）である請求
   項第５項記載の形質転換体。
8. 【請求項８】 Ｎ末端側より図１で表されるアミノ酸配
   列で表されるＮＡＤシンセターゼポリペプチドをコード
   するＤＮＡを保持する形質転換体を培養して該ＤＮＡの
   遺伝情報を発現せしめ、該培養物からＮＡＤシンセター
   ゼを採取することを特徴とするＮＡＤシンセターゼの製
   造法。