JPWO2012133761A1 - 改変型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
1.以下の(a)または(b)のアミノ酸配列を含む、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ[NAD(P)+GDH]活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列において、170番目のグルタミン酸および252番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換され、さらに31番目のグルタミン、64番目のグリシン、111番目のリジン、159番目のアラニン、179番目のリジン、217番目のチロシン、218番目のイソロイシンおよび246番目のアラニンからなる群より選択される少なくとも1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
(b)前記(a)のアミノ酸配列において、前記170番目、252番目、31番目、64番目、111番目、159番目、179番目、217番目、218番目および246番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
2.前記(a)のアミノ酸配列が、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸置換がなされ、且つ、(2)〜(9)からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列である、前項1に記載のタンパク質。
(1)E170K+Q252L
(2)Q31G
(3)G64A
(4)K111R
(5)A159C
(6)K179Y
(7)Y217R
(8)I218L
(9)A246V
3.前記(a)のアミノ酸配列が、配列表の配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39および41のいずれか1で示されるアミノ酸配列である前項1または2に記載のタンパク質。
4.前項3に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、前記170番目、252番目、31番目、64番目、111番目、159番目、179番目、217番目、218番目および246番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、NAD(P)+GDH活性を有するタンパク質。
5.配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列において、I165M+E170K+P194T+A197K+K204E+K206R+E222D+S237Cのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて、無機塩の非存在下における70℃、30分の加熱処理後の残存活性が高い前項1〜4のいずれか1に記載のタンパク質。
6.無機塩の非存在下における70℃、30分の加熱処理後の残存活性が20%以上である前項1〜5のいずれか1に記載のタンパク質。
7.無機塩の非存在下における80℃、30分の加熱処理後の残存活性が1%以上である前項1〜6のいずれか1に記載のタンパク質。
8.無機塩の非存在下における84℃、30分の加熱処理後の残存活性が1%以上である前項1〜7のいずれか1に記載のタンパク質。
9.無機塩の非存在下における有機溶媒処理後の残存活性が、配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列において、I165M+E170K+P194T+A197K+K204E+K206R+E222D+S237Cのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて高い前項1〜8のいずれか1に記載のタンパク質。
10.無機塩の非存在下における有機溶媒処理後の残存活性が、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の該処理後の該残存活性に比べて高い前項1〜9のいずれか1に記載のタンパク質。
11.前項1〜10のいずれか1に記載のタンパク質をコードするDNA。
12.DNAの塩基配列におけるコドン利用頻度を大腸菌のコドン利用頻度に最適化した前項11に記載のDNA。
13.前項11または前項12に記載のDNAを含む、組換えベクター。
14.前項12に記載の組換えベクターにより得られる形質転換体。
15.宿主が大腸菌である前項14に記載の形質転換体。
16.前項14または前項15に記載の形質転換体を培養することによりNAD(P)+GDHを生成させ、該NAD(P)+GDHを採取することを含む、改変型NAD(P)+GDHの製造方法。
17.前項1〜10のいずれか1に記載のタンパク質を含むグルコース測定検査薬。
18.前項1〜10のいずれか1に記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
19.前項1〜10のいずれか1に記載のタンパク質を用いるグルコース濃度の測定方法。
(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列において、170番目のグルタミン酸および252番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換され、さらに31番目のグルタミン、64番目のグリシン、111番目のリジン、159番目のアラニン、179番目のリジン、217番目のチロシン、218番目のイソロイシンおよび246番目のアラニンからなる群より選択される少なくとも1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列。
(i)170番目のグルタミン酸:リジン、アルギニンまたはイソロイシンへの置換が好ましく、リジンへの置換がより好ましい。
(ii)252番目のグルタミン:ロイシンへの置換が好ましい。
(iii)31番目のグルタミン:グリシンまたはアラニンへの置換が好ましく、グリシンへの置換がより好ましい。グリシンは、31番目のグルタミンの後述する祖先型アミノ酸である。
(iv)64番目のグリシン:アラニン、メチオニン、ロイシンまたはシステインへの置換が好ましく、アラニンへの置換がより好ましい。アラニンは、64番目のグリシンの後述する祖先型アミノ酸である。
(v)111番目のリジン:アルギニン、ロイシン、グリシンまたはグルタミン酸への置換が好ましく、アルギニンへの置換がより好ましい。アルギニンは、111番目のリジンの後述する祖先型アミノ酸である。
(vi)159番目のアラニン:システイン、グリシン、スレオニンまたはセリンへの置換が好ましく、システインへの置換がより好ましい。システインは、159番目のアラニンの後述する祖先型アミノ酸である。
(vii)179番目のリジン:チロシン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、アスパラギン酸またはアラニンへの置換が好ましく、チロシンへの置換がより好ましい。チロシンは、179番目のリジンの後述する祖先型アミノ酸である。
(viii)217番目のチロシン:アルギニン、リシンまたはヒスチジンへの置換が好ましく、アルギニンへの置換がより好ましい。アルギニンは217番目のチロシンの後述する祖先型アミノ酸である。
(ix)218番目のイソロイシン:ロイシン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、プロリンまたはメチオニンへの置換が好ましく、ロイシンへの置換がより好ましい。ロイシンは、218番目のイソロイシンの後述する祖先型アミノ酸である。
(x)246番目のアラニン:バリンまたはイソロイシンへの置換が好ましく、バリンへの置換がより好ましい。バリンは、246番目のアラニンの後述する祖先型アミノ酸である。
(1)E170K+Q252L
(2)Q31G
(3)G64A
(4)K111R
(5)A159C
(6)K179Y
(7)Y217R
(8)I218L
(9)A246V
(b)前記(a)のアミノ酸配列において、前記170番目、252番目、31番目、64番目、111番目、159番目、179番目、217番目、218番目および246番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
本発明において、NAD(P)+GDHの活性は下記試薬を用いて、下記測定条件で測定する。
100mM トリス−塩酸緩衝液 pH8.0
100mM NAD(P)+水溶液
1M D−グルコース水溶液
酵素活性測定試薬:上記トリス−塩酸緩衝液を17.5mL、NAD(P)+水溶液を0.5mL、グルコース水溶液を2mL、を混合して酵素活性測定試薬とする。
酵素活性測定溶液:酵素[NAD(P)+GDH]を所望の濃度に希釈するための溶液(以下、「酵素希釈液」ともいう)として、20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を使用し、以下の活性値が5〜15U/mLとなるように酵素の原液(以下、「酵素原液」ともいう)を希釈して酵素活性測定溶液とする。
酵素活性測定試薬0.9mLを分光光度計用セルに入れ、37℃で5分間以上プレインキュベートする。酵素活性測定溶液0.005mLを添加してよく混合し、37℃で予めインキュベートされた分光光度計で、340nmの吸光度変化を40秒間記録し、1分間あたりの吸光度変化(ΔOD/分)を計算する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに水を酵素活性測定試薬に混合して上記のように1分間あたりの吸光度変化(ΔODblank/分)を計算する。これらの値から、下記の計算式にしたがって活性値を求める。
比活性値とは、酵素の活性をタンパク質重量当たりの活性値で表現した値である。本発明において、NAD(P)+GDHの比活性値は下記試薬を用いて、下記測定条件で測定する。
酵素希釈液:20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)
酵素活性測定試薬:上記の酵素活性測定試薬
必要であれば酵素原液を酵素希釈液で希釈し、上記活性測定法により活性を求める。酵素原液のタンパク質濃度を、280nmの吸光度において、1OD=1mg/mlとして計算する。
本発明の改変型NAD(P)+GDHは、無機塩の非存在下において70℃以上で熱安定性を示す。ここで、無機塩としては、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびホウ酸ナトリウム等が挙げられ、中でも塩化ナトリウムが好ましい。
(1)酵素希釈液により、酵素原液を特定の濃度に希釈して酵素活性測定溶液を得る。酵素活性測定溶液における酵素のタンパク質濃度は、1〜1000μg/mLとすることが好ましい。ここで、酵素希釈液、酵素原液および酵素活性測定溶液のいずれも無機塩を含まない条件とする。
(2)無機塩を含まない条件において、酵素活性測定溶液を、任意の温度で特定の時間熱処理し、熱処理前後の酵素活性を求める。熱処理時間は30分〜1時間が好ましい。熱処理前の活性値を100としたときの熱処理後の残存活性率(%)を求める。
本発明の改変型NAD(P)+GDHは、アミノ酸置換前(以下、「改変前」ともいう)の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるNAD(P)+GDH(以下、「野生型NAD(P)+GDH」ともいう)と比較して、無機塩の非存在下における有機溶媒耐性が向上したポリペプチドであることが好ましい。
(1)酵素希釈液により、酵素原液を特定の濃度に希釈して酵素活性測定溶液を得る。ここで、酵素希釈液、酵素原液、酵素活性測定溶液のいずれも無機塩を含まない条件とする。酵素活性測定溶液における酵素のタンパク質濃度は、1〜1000μg/mLとすることが好ましい。
(2)無機塩を含まない条件において、酵素活性測定溶液を有機溶媒中に投入して攪拌した後、熱乾燥によりすべての溶媒を除去する。熱乾燥の条件は有機溶媒の種類により異なるが、通常、温度は、20〜80℃とすることが好ましく、時間は5分〜1時間とすることが好ましい。
(3)乾燥終了後の酵素を酵素希釈液で再懸濁し、有機溶媒/熱乾燥前後の酵素活性を求める。有機溶媒/熱乾燥前の活性値を100としたときの、有機溶媒/熱乾燥後の残存活性率(%)を求める。
本発明の改変型NAD(P)+GDHは、一般的に用いられる進化工学的な手法を利用したランダム変異導入法ではなく、以下の(1)マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法に加えて、さらに(2)系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法を併用することにより決定されるアミノ酸置換を、配列表の配列番号1で示される野生型NAD(P)+GDHのアミノ酸配列に導入することにより得られる。
マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法とは、本来は抗体の機能改変を目的として利用され始め、酵素の熱安定性の向上を目的として利用された実績もあるDNA配列あるいはアミノ酸配列における部位特異的変異導入法(配列上のどの位置にどの変異を導入するか部位特異的に決定する方法)である。詳細についてはB.Steipe,et al.,J.Mol.Biol.,240,188−192,1994に記述されている。
系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法は、ある特定の酵素についての複数の生物種における共通祖先のアミノ酸配列を推定し、該共通祖先のアミノ酸配列の一部あるいは全部をもとの酵素に変異として導入することにより共通祖先の酵素の機能を推察する目的で開発された手法である。
本発明の改変型NAD(P)+GDHをコードするDNAは、改変前の野生型NAD(P)+GDHのDNAに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。
本発明の改変型NAD(P)+GDHをコードするDNAを含む組換えベクター(以下、本発明の組換えベクターという)は、発現ベクターに本発明の改変型NAD(P)+GDHをコードするDNAを挿入することにより得ることができる。
本発明の形質転換体は、組換えベクターにマーカーを施して、該組換えベクターを宿主に導入することにより得られる。該形質転換体から、組換えベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、改変型NAD(P)+GDHをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する遺伝子供与微生物を得る。
(1−1)NAD(P)+GDH相同アミノ酸配列情報の取得
配列表の配列番号1で示されるバチルス・サブチリス由来NAD(P)+GDHのアミノ酸配列を使用してBlast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)により相同性検索を行い、様々な生物種由来のアミノ酸配列情報を得た。
上記のデータベースに登録されたアミノ酸配列データを、ClustalWによりアライメントし、アライメント図(図1〜図2)とデータファイルを得た。得られたデータは、後述の分子系統樹の作成に使用した。
NAD(P)+GDHを含むマルチプルアライメント図のデータを使用して、公知のコンピュータープログラムを使用して最尤法により4種類の分子系統樹を作成した。WAG+Gモデルを分子置換モデルとして採用した。4種類の分子系統樹をそれぞれ図3〜図6に示す。
公知のコンピュータープログラム、NAD(P)+GDHを含むマルチプルアライメント図のデータ、上述した4種類の分子系統樹を用いて、最尤法により、それぞれの分子系統樹の根の位置における祖先型アミノ酸配列を計算した。WAGモデルを分子置換モデルとして採用した。
4種類の分子系統樹から推定された祖先型アミノ酸配列を、図1〜図2に示したマルチプルアライメント図に追加した。得られた推定祖先型アミノ酸配列とNAD(P)+GDHを含むマルチプルアライメント図を図7〜図9に分割して示す。
変異体2:Q31G+A159C+E170K+Q252L
変異体3:G64A+A159C+E170K+Q252L
変異体4:K111R+A159C+E170K+Q252L
変異体5:A159C+E170K+K179Y+Q252L
変異体6:A159C+E170K+A246V+Q252L
変異体7:E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体8:Q31G+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体9:G64+AE170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体10:K111R+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体11:E170K+K179Y+Y217R+I218L+Q252L
変異体12:E170K+Y217R+I218L+A246V+Q252L
変異体13:A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体14:Q31G+A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体15:G64A+A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体16:K111R+A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体17:A159C+E170K+K179Y+Y217R+I218L+Q252L
変異体18:A159C+E170K+Y217R+I218L+A246V+Q252L
変異体19:G64A+K111R+A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体20:Q31G+G64A+A159C+E170K+Y217R+I218L+Q252L
変異体21:E133K+E170K+Q252L
変異体22:E170K+Q252L
変異体23:P45A+N46E+F155Y+E170K+V227A+W230F+Q252L
(2−1)NAD(P)+GDH遺伝子への部位特異的変異導入
上述した変異体1〜変異体23の遺伝子をそれぞれ合成すべく、配列番号2の野生型NAD(P)+GDHのDNA配列に対してPCRによる部位特異的変異導入を行った。それに先立ち、PCRによる部位特異的変異導入に使用するオリゴヌクレオチドを以下に記述するように設計して合成した。
上述の6種類の形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレート培地で培養してコロニーを形成させた。それぞれの形質転換体の単一コロニーを100μg/mLのアンピシリンを含むLB培地1mLに植菌し、37℃で振とう培養した。
−80℃で保存した大腸菌を20mLの20mM リン酸緩衝液(pH8)に懸濁して超音波により破砕した。破砕液を遠心分離(10000×g、10分)して上清を回収した。得られた上清を、60℃で60分間、熱処理し、遠心分離(10000×g、20分)して上清を回収した。
該変異体酵素の性能評価は、以下に示す「比活性」、「熱安定性」、「アセトン/熱乾燥耐性」に関して実施した。すべての項目は、酵素原液、酵素希釈液、酵素活性測定溶液のいずれもNAD(P)+GDHの安定化作用のある塩化ナトリウムを全く含まない条件で実施した。実験結果は表2にまとめて示す。
6種類のNAD(P)+GDH変異体酵素それぞれの比活性は、上記した通りの方法により求めた。結果を表2に示す。
精製酵素を酵素希釈液:20mMリン酸緩衝液(pH8)によりタンパク質濃度を30μg/mLとなるように希釈した。希釈した酵素溶液を1.5mLのプラスチックチューブに0.5mLずつ分注した。該プラスチックチューブを所定の温度に調節したウォーターバスに投入し、30分間、熱処理した。熱処理が終了したら、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上記した通りの方法により求めた。
精製酵素を酵素希釈液:20mMリン酸緩衝液(pH8)によりタンパク質濃度を500μg/mLとなるように希釈した。希釈した酵素溶液10μLを1.5mLのプラスチックチューブに分注し、そこに90μLのアセトンを加えて室温で1分間よく撹拌した。
Claims (19)
- 以下の(a)または(b)のアミノ酸配列を含む、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ[NAD(P)+GDH]活性を有するタンパク質。
(a)配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列において、170番目のグルタミン酸および252番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換され、さらに31番目のグルタミン、64番目のグリシン、111番目のリジン、159番目のアラニン、179番目のリジン、217番目のチロシン、218番目のイソロイシンおよび246番目のアラニンからなる群より選択される少なくとも1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
(b)前記(a)のアミノ酸配列において、前記170番目、252番目、31番目、64番目、111番目、159番目、179番目、217番目、218番目および246番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列 - 前記(a)のアミノ酸配列が、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列において、以下の(1)のアミノ酸置換がなされ、且つ、(2)〜(9)からなる群より選択される少なくとも1のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列である、請求項1に記載のタンパク質。
(1)E170K+Q252L
(2)Q31G
(3)G64A
(4)K111R
(5)A159C
(6)K179Y
(7)Y217R
(8)I218L
(9)A246V - 前記(a)のアミノ酸配列が、配列表の配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39および41のいずれか1で示されるアミノ酸配列である請求項1または2に記載のタンパク質。
- 請求項3に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、前記170番目、252番目、31番目、64番目、111番目、159番目、179番目、217番目、218番目および246番目のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる、NAD(P)+GDH活性を有するタンパク質。
- 配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列において、I165M+E170K+P194T+A197K+K204E+K206R+E222D+S237Cのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて、無機塩の非存在下における70℃、30分の加熱処理後の残存活性が高い請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 無機塩の非存在下における70℃、30分の加熱処理後の残存活性が20%以上である請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 無機塩の非存在下における80℃、30分の加熱処理後の残存活性が1%以上である請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 無機塩の非存在下における84℃、30分の加熱処理後の残存活性が1%以上である請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 無機塩の非存在下における有機溶媒処理後の残存活性が、配列表の配列番号79に示されるアミノ酸配列において、I165M+E170K+P194T+A197K+K204E+K206R+E222D+S237Cのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて高い請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 無機塩の非存在下における有機溶媒処理後の残存活性が、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の該処理後の該残存活性に比べて高い請求項1〜9のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするDNA。
- DNAの塩基配列におけるコドン利用頻度を大腸菌のコドン利用頻度に最適化した請求項11に記載のDNA。
- 請求項11または請求項12に記載のDNAを含む、組換えベクター。
- 請求項12に記載の組換えベクターにより得られる形質転換体。
- 宿主が大腸菌である請求項14に記載の形質転換体。
- 請求項14または請求項15に記載の形質転換体を培養することによりNAD(P)+GDHを生成させ、該NAD(P)+GDHを採取することを含む、改変型NAD(P)+GDHの製造方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質を含むグルコース測定検査薬。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質を用いるグルコース濃度の測定方法。
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