CN104774825A - 腈水解酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在R-邻氯扁桃酸合成中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的；本发明所述的腈水解酶突变体较未突变的腈水解酶比酶活提高3.70倍，达到1.08U/mg，对映体选择性达到99％，且结果表明，腈水解酶突变体在两相体系中(甲苯：水＝2：8)，可催化300mM邻氯扁桃腈，产率90.8％，通过流加底物的方式，最高可催化500mM邻氯扁桃腈，产率90％，对映体选择性大于99％。

Description

腈水解酶突变体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种突变腈水解酶及其在R-邻氯扁桃酸合成中的应用。
(二)背景技术
腈水解酶(EC 3.5.5.1)：腈水解酶超级家族中一类重要的工业用酶，具有αββα折叠结构和催化三联体Glu-Lys-Cys，一般以同源多聚体形式存在，且亚基数一般为偶数个，其单亚基分子量多数在30-45kDa之间，其主要功能在于水解腈类化合物生成相应的羧酸，按照催化底物的不同，可以将腈水解酶分为三大类，即脂肪腈水解酶(aliphatic nitrilase)、芳香腈水解酶(aromatic nitrilase,主要水解芳香腈、杂环腈)和芳基脂肪腈水解酶(arylaliphatic nitrilase)。利用腈水解酶的催化活性是降解环境污染中高毒性腈的有效途径。故腈水解酶不但能应用于环境污染问题，而且能生产重要的医药中间体。在自然界中，腈水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并以细菌为主要来源。从生物技术应用角度，微生物腈水解酶作为绿色催化剂更具有商业价值，在催化应用上也更易于控制。腈水解酶的催化机理，以及蛋白结构和催化特性的关系尚不清楚，测定精确的蛋白质结构和对催化机理的探索十分重要。根据蠕虫NiFhit晶体结构分析，其活性部位含有Glu-Lys-Cys 3个残基，Brenner小组推测整个腈水解酶大家族可能是通过Glu-Lys-Cys 3个残基来催化的。其具体作用机制如下图1所示：腈水解酶先攻击CN共价键，形成酶与底物共价结合的中间体，继而加上一分子的水，并放出一分子的氨，当加上第二分子的水时，生成酸和酶。
腈水解酶已被广泛应用，但许多反应参数需要进一步改进，从而建立可行的工业过程。为解决这一问题，现主要是利用以下几种方法，筛选新的腈水解酶，酶活提高，底物结构优化，培养基和工程参数的优化。新酶的发现主要是基因组挖掘和宏基因组方法。蛋白质工程的目的是改变对底物特异性，活性以及立体选择性，改变腈水解酶中的酰胺比。底物结构的变化会影响反应的立体和化学选择性。如果在应用过程中和其他的酶以及化学催化剂相结合，并且没有昂贵的分离费用，可以得到更广泛的应用。
R-邻氯扁桃酸：
R-邻氯扁桃酸是合成新型安全高效的抗血小板聚集药物氯吡格雷(clopidogrel)的关键中间体。氯吡格雷属于拮抗剂类抗血小板药物，目前在临床使用最为广泛。氯吡格雷临床上用于预防心肌梗塞、中风或有外周动脉疾病史患者的动脉粥状样硬化，与其它几种应用比较广泛的血小板抑制剂(阿司匹林、噻氯匹定等)相比较，作用强度和耐受性高于噻氯匹定，而与阿司匹林的总体耐受性相似，副作用也较其它几种血小板抑制剂更小。因此，氯吡格雷作为抗血栓药物得以广泛的应用，近年来其全球销售额均处于领先地位，如2009年在全球畅销药榜上排第二。
目前，R-邻氯扁桃酸合成的方法主要有：不对称合成法和光学异构体拆分法。其中腈水解酶法具有转化率高，立体选择性强，反应条件温和，原子利用率理论高达100％，是非常具有应用前景的合成路线(图2)。
在目前发现的腈水解酶中，可以立体选择性催化外消旋邻氯扁桃腈的较少(DeSantis等，J AmChem Soc 2002,124:9024–9025；He等，J Ind Microbiol Biotechnol 2010,37:741–750；Schreiner等，Enzyme Microb Technol 2010,47:140–146)，而且这些腈水解酶在具有高选择性的同时，往往会受到底物抑制的影响，底物浓度一般在10-20mM。华东理工许建和团队筛选到的Alcaligenes sp.ECU0401(Zhang等，Appl.Microbiol.Biot 2012,95:91-99)，在两相体系中催化邻氯扁桃腈，最大底物浓度只达到200mM，产率153mM，对映体选择性90.4％。该团队又通过基因组挖掘，从Labrenzia aggregata中筛选得到一种新的腈水解酶(LaN)，在反应过程中利用两相体系(甲醇：水＝1：9)，可以催化300mM底物浓度，反应8小时，产率94.5％，对映体选择性96.3％。Wei et al利用基于系统发生的酶与底物特异性预测(Wang等，Org.Process.Res.Dev.2014,18:767-773)，从Burkholderia cenocepacia J2315中筛选得到一株新的腈水解酶BCJ2315，其对扁桃腈的对映体选择性有98.7％，但因为邻位的空间位阻，对邻氯扁桃腈的对映体选择性只有89.2％，故该学者利用20％乙醇为助溶剂，并采取流加补料的方法催化494mM的邻氯扁桃腈，并得到415mM产物，对映体选择性97.6％。虽在利用腈水解酶催化生产R-邻氯扁桃酸方面已有一定的进展，但为达到工业应用的要，我们应在酶的催化活力和对映体选择性还需进一步提高。
(三)发明内容
本发明目的是通过饱和突变的方法对腈水解酶基因进行改造，使改造后的基因工程腈水解酶在酶活性以及立体选择性方面有所提高，使其符合在催化生产R-邻氯扁桃酸工业化应用的需求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸或丙氨酸。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苏氨酸或赖氨酸。
更进一步，本发明所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；(2)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；(3)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；(4)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示；(5)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQID NO.12所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示；(6)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示；(7)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为组氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示；(8)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.18所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示；(9)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示，核苷酸序列为SEQ IDNO.19所示。
本发明还涉及一种由所述腈水解酶突变体构建的重组载体。
本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
此外，本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在立体选择性水解邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸中的应用，以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，以pH为7.5的Tris-HCl缓冲液为反应介质，以甲苯为助剂，在40℃、400rpm条件下反应(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为7.5)，反应完全后，获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-邻氯扁桃酸；所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10g/L，所述助剂体积终浓度为10-30％(优选20％)，所述底物用量以缓冲液体积计为100-500mmol/L(优选100mmol/L)。本发明所述底物优选采用流加的方式加入，底物初始浓度为100mM，每隔20min添加终浓度100mM的底物。
本发明还提供另外一种腈水解酶突变体在拆分邻氯扁桃酸制备R-邻氯扁桃酸中的应用，所述的应用为：具体所述的应用为：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH 7.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成菌悬液，以菌悬液为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，于含体积终浓度5％甲醇、pH为4-9的pH缓冲液中构成反应体系，在30-75℃(优选40℃)、200rpm条件下反应(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为4-9)，反应结束后，获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-邻氯扁桃酸；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-5g/L(优选1g/L)，所述底物用量以反应体系总体积计为20mmol/L。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
本发明所述的腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示)较未突变的腈水解酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)比酶活提高3.70倍，达到1.08U/mg，对映体选择性达到99％。且结果表明，腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示)在两相体系中(甲苯：水＝2：8)，可催化300mM邻氯扁桃腈，产率90.8％。通过流加底物的方式，最高可催化500mM邻氯扁桃腈，产率90％，对映体选择性大于99％。
(四)附图说明
图1腈水解酶催化机理。
图2腈水解酶催化外消旋邻氯扁桃腈，生成R-邻氯扁桃酸的合成路线。
图3为重组大肠杆菌Thr132-Ala/Phe189-Thr的蛋白电泳图，泳道1为超声破碎后的混悬液，泳道2为纯蛋白，泳道3为标准蛋白。
图4为温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响，实心图形表示相对活力，空心图形表示对映体选择性。
图5为pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响，实心图形表示相对活力，空心图形表示对映体选择性。
图6为金属离子对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响。
图7为底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T单水相系催化的影响。
图8为有机溶剂含量对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T两相体系催化的影响。
图9为底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T两相体系催化的影响。
图10为在两相体系中批次补加邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸，实心图形表示相对活力，空心图形表示对映体选择性。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：亲本腈水解酶的基因合成
为了使亲本腈水解酶的基因(GeneBank:AY487562)连接到载体pET-28b后可以表达带有His-tag的蛋白，切除其终止密码子，并以E.coli的密码子偏好性为参照对其序列进行序列优化，并且在起始密码子处引入NcoI，从而在甲硫氨酸后插入甘氨酸。新设计的腈水解酶基因(tegi)的序列如SEQ ID NO.1所示(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，基因合成工作委托上海旭冠生物科技发展有限公司完成，基因合成后连接到表达载体pET-28b中。
实施例2突变体库的构建
以实施例1获得的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的亲本序列为模板，分别以下列两对核苷酸序列为引物进行PCR扩增，分别获得将132位苏氨酸突变为精氨酸的单突变体Thr132-Arg(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，将189位苯丙氨酸突变为丝氨酸的单突变体Phe189-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和将189位苯丙氨酸突变为苏氨酸的单突变体Phe189-Thr(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)。
两对寡聚核苷酸引物如下(5’-3’)：
Forward primer(132Thr)：CTGAAACCGACCNNNGTGGAGCGTACCCTG
Reverse primer(132Thr)：CAGGGTACGCTCCACNNNGGTCGGTTTCAG
Forward primer(189Phe)：CTGAAACCGACCNNNGTGGAGCGTACCCTG
Reverse primer(189Phe)：CAGGGTACGCTCCACNNNGGTCGGTTTCAG
PCR反应体系为：
PCR程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸6min 30s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保藏。
PCR结束后，取20μL PCR产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。对检测结果为阳性的PCR产物，加入Dpn I，37℃酶切3h。
酶切反应体系如下：
Dpn I 1μL
10×buffer 2μL
DNA 10μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
酶切结束后，酶切产物在恒温金属浴65℃灭活10min。转化大肠杆菌感受态BL 21(DE3)中，涂布于含50μg/mL Kan的LB平板上，37℃培养10～12h。
实施例3：突变体库的筛选
(1)突变体库的初筛
挑取实施例2培养的单菌落于含1mL LB培养液的96孔板中，加入Kan(终浓度50μg/mL)，37℃培养至OD600达到0.6～0.8，添加IPTG(终浓度0.1mM)，28℃诱导12h。9000rpm离心10min，去上清，获得菌体。挑取湿菌体，用1mL(pH 7.5、0.1M)的磷酸缓冲液重悬，制得菌悬液。反应于Ep管中进行，1mL体系中：900μl(pH 7.5、0.1M)的磷酸缓冲液(含体积终浓度5％甲醇)、100μL上述菌悬液、终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数1000rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。利用液相检测测定静息细胞的酶活性。初步获得具有潜力的突变菌株，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
(2)突变体库的复筛
将实施例3甘油管中保藏的突变菌株接种到50mL的LB液体培养基中(含50g/mL卡那霉素)，放入37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养过夜，再取1mL种子液转接到50mL的LB液体培养基中，在37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养，当菌体的浓度OD600达到0.6-0.8的时候加入终浓度为0.5mM的IPTG。然后放入28℃，150rpm的摇床上培养8小时，离心收集菌体，再用0.85％的生理盐水洗菌体两次。利用HPLC液相色谱测定静息细胞的酶活性，获得单突变体。
(3)酶活的测定及酶活定义
称取按步骤(1)方法制备的静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.5、0.1M)中，获得菌悬液。反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系中：19mL(pH 7.5、0.1M)的磷酸缓冲液(含体积浓度5％甲醇)、1mL菌悬液、终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min，10μl(6M)HCl终止反应。取1mL反应液，8 000rpm/min离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。确定具有正向突变的重组大肠杆菌，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
腈水解酶酶活是指样品在邻氯扁桃腈浓度为20mM、反应介质为pH 7.5，0.1M Tris-HCl缓冲液，反应温度为40℃的条件下，每分钟从反应体系中生成1μmol R-邻氯扁桃酸所需的酶量，即为一个酶活单位，以U表示。
(4)液相检测方法
HPLC邻氯扁桃酸液相检测方法：采用高效液相法分析(Dionex UltiMate 3000,USA)，分离检测的色谱柱为反相手性柱(型号Astec ChirobioticTM R 250×4.6mm,Sigma,USA)，流动相为0.5％AcOH-CH3CN(12:88,v/v)，流速为1mL/min，检测波长为215nm。
最终获得单突变体Thr132-Arg(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，单突变体Phe189-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和单突变体Phe189-Thr(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)。
单突变体活力测定结果如下：
实施例4双突变体的获得
1.以SEQ ID No.3为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(189Phe)：CTGAAACCGACCNNNGTGGAGCGTACCCTG
Reverse primer(189Phe)：CAGGGTACGCTCCACNNNGGTCGGTTTCAG
2.以SEQ ID No.7为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(132Thr)CTGAAACCGACCNNNGTGGAGCGTACCCTG
Reverse primer(132Thr)：CAGGGTACGCTCCACNNNGGTCGGTTTCAG
分别按照实施例2，3，获得双突变体Thr132-Arg/Phe189-Cys(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示)、双突变体Thr132-Arg/Phe189-Ser(核苷酸序列为SEQID NO.11所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示)、双突变体Thr132-Arg/Phe189-Thr(核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示)、双突变体Thr132-Arg/Phe189-His(核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示)、双突变体Thr132-Arg/Phe189-Lys(核苷酸序列为SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.18所示)、双突变体Thr132-Ala/Phe189-Thr(核苷酸序列为SEQ ID NO.19所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示)，并将双突变体与pET-28b连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的重组大肠杆菌。双突变体菌株的酶活如下：
实施例5出发菌株和突变株催化邻氯扁桃腈对比
将实施例3、4中构建的重组大肠杆菌、出发菌株(即含SEQ ID No.1的大肠杆菌BL21(DE3))、含pET-28b空载质粒的BL21菌株和不含质粒的BL21菌株，接种至50mL LB液体培养基中(含有卡那霉素40μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有40μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h。诱导培养10h后，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体(即静息细胞)作为转化用酶。
以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：15mL pH 7.5 0.1M的磷酸缓冲液(含体积终浓度5％甲醇)、5mL菌悬液、终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，每隔10分钟取500μl反应液，用10μl 6M HCl终止反应，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。原始菌株和突变株催化邻氯扁桃腈的结果对比如下表所示：
实施例6重组大肠杆菌Thr132-Ala/Phe189-Thr的蛋白纯化及电泳
将实施例4中构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T，接种至50mL LB液体培养基中(含有卡那霉素40μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有40μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h。诱导培养10h后，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，使用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，使用洗脱液(50mM NaH2PO4·2H2O、300mM NaCl、300mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集纯蛋白，取20μL纯蛋白，加20μL SDS缓冲液混合，沸水浴加热5min，取8μL进行SDS-PAGE电泳分析。由图3可知目的蛋白大小在39KDa左右。
实施例7温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响
将实施例6中诱导表达后的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL pH 7.5 0.1M的磷酸缓冲液(含体积终浓度5％甲醇)、1mL菌悬液、终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。取1mL反应液，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图4可知，表达的腈水解酶在55℃条件下具有最高催化效率。
实施例8pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl缓冲液中，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL 0.1M缓冲液(pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0柠檬酸缓冲液；pH 6.0、6.5、7.0磷酸缓冲液；pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0Tris-HCl缓冲液，均含体积终浓度5％甲醇)、1mL菌悬液、终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。取1mL反应液，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图4可知，表达的腈水解酶在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的条件下具有最高催化效率。
实施例9金属离子对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：18mL pH 7.5 0.1M的磷酸缓冲液(含体积终浓度5％甲醇)、1mL菌悬液、1mL各种离子溶液(离子终浓度1mM，溶剂为去离子水，离子分别为：空白、Fe3+、Cu+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、EDTA、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+)，终浓度20mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。取1mL反应液，8 000rpm/min离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图6可知，大部分金属离子对酶的催化能力没有促进作用，其中Co+，Ni+，Mn2+，Cu2+，Zn2+有较大的抑制作用，且腈水解酶非金属依赖型。
实施例10底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T单水相系催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl缓冲液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL pH 7.5 0.1M的磷酸缓冲液(含体积终浓度5％甲醇)，1mL菌悬液，终浓度分别为10mM、20mM、30mM、40mM、60mM、80mM、100mM邻氯扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。取1mL反应液，8000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图7可知，表达的腈水解酶在30mM底物浓度下具有最高的催化效率，当底物超过50mM将会受到较大的抑制，当底物浓度达到100mM时腈水解酶失活。
实施例11有机溶剂含量对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T两相体系催化的影响
将将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。具体操作如下：称取上述菌体1g(湿重)，在250mL反应釜中依次加入100mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl，甲苯(甲苯体积占总体积的10％，20％，30％，流加1M氨水稳定pH在7.5)，终浓度100mM邻氯扁桃腈，温度40℃，400rpm条件下反应30min，每隔3分钟取1mL反应液，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图8可知，表达的腈水解酶在20％甲苯的条件下具有最高的转化率，且受有机溶剂的影响较小。
实施例12底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T两相体系催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。称取上述菌体1g(湿重)，在250mL反应釜中依次加入80mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl(流加1M氨水稳定pH在7.5)，终浓度分别为100mM、200mM、300mM、400mM邻氯扁桃腈，20mL甲苯(体积终浓度20％)，温度40℃，400rpm条件下反应30min，每隔3分钟取1mL反应液，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图9可知，表达的腈水解酶最高可以耐受300mM的底物浓度，且具有较高的时空产率，当底物为100mM时，其产率最高96.2％。
实施例13在两相体系中批次补加邻氯扁桃腈制备R-邻氯扁桃酸
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-T132A/F189T湿菌体作为转化用酶，以外消旋邻氯扁桃腈为底物，进行转化反应生产R-邻氯扁桃腈。称取上述菌体1g(湿重)，在250mL反应釜中依次加入80mL pH 7.5 0.1M Tris-HCl(流加1M氨水稳定pH在7.5)，终浓度100mM邻氯扁桃腈，20mL甲苯(体积终浓度20％)，温度40℃，400rpm条件下，每隔20min添加底物100mM，取1mL反应液，8 000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测R-邻氯扁桃酸的浓度。由图10可知，表达的腈水解酶最终可催化500mM底物浓度，达到文献报道的最大值，最终生成450mM R-邻氯扁桃酸，eep高于99％，且具有最高的时空产率671.76g·L-1·d-1。
实施例14R-邻氯扁桃酸的克级制备
将实施例13中得到的反应液进行分液，取下层水相。10000rpm/min离心10min，取上清液，用6M的HCl溶液将其酸化至pH 1.5左右，并用等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复三次，三次萃取液合并，加入一定量的无水硫酸钠，真空抽虑去除硫酸钠。用旋转蒸发仪使乙酸乙酯完全挥发。将固体转移至50mL烧杯中，加入5mL的甲苯，进行沸水浴，缓慢补加甲苯，直至固体完全溶解。将溶液冷却至室温，待晶体析出后，抽虑去除甲苯，晶体放置在烘箱中烘干至恒重。最终得到7.3g产物R-邻氯扁桃酸，分离产率87％，eep高于99％。

Claims (10)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的。
2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸或丙氨酸。
3.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苏氨酸或赖氨酸。
4.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；(2)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示；(3)将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示；(4)将SEQID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示；(5)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示；(6)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示；(7)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为组氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示；(8)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQ IDNO.18所示；(9)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示。
5.一种由权利要求1-4之一所述腈水解酶突变体构建的重组载体。
6.一种由权利要求5所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
7.一种权利要求1-4之一所述腈水解酶突变体在拆分邻氯扁桃酸制备(R)-邻氯扁桃酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，以pH为7.5的Tris-HCl缓冲液为反应介质，以甲苯为助剂构成反应体系，在40℃、400rpm条件下反应，反应完全后，获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-邻氯扁桃酸；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为10g/L，所述助剂体积终浓度为10-30％，所述底物用量以反应体系总体积计为100-500mmol/L。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH 7.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成菌悬液，以菌悬液为酶源，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，于含体积终浓度5％甲醇、pH为4-9的pH缓冲液中构成反应体系，在30-75℃、200rpm条件下反应，反应结束后，获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-邻氯扁桃酸；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-5g/L，所述底物用量以反应体系总体积计为20mmol/L。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
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