CN114807090A

CN114807090A - 一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用

Info

Publication number: CN114807090A
Application number: CN202210176762.1A
Authority: CN
Inventors: 孙超; 刘会川; 罗梃楷; 曾春玲; 丁波; 刘喜荣
Original assignee: Hunan Xinhexin Biological Medicine Co ltd
Current assignee: Hunan Xinhexin Biological Medicine Co ltd
Priority date: 2022-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-02-24
Also published as: CN114807090B

Abstract

本发明属于工程菌及其应用技术领域，具体是涉及到一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用，酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本申请将具有能编码特定酯酶的基因插入到质粒中，得到重组菌，以此来催化底物醋酸可的松，使其水解，得到产物，反应条件温和，实现了微生物发酵催化醋酸可的松的21位酯的水解，为甾体类侧链的水解提供了另一种可能，本发明通过调节助溶剂重量及其含量等，转化率最高可达到98％，可以有效的降低成本，提高效益。

Description

一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用

技术领域

本发明属于工程菌及其应用技术领域，具体是涉及到一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用。

背景技术

酯酶是广泛存在与动植微生物中能催化酯健合成或水解的一大类酶。

醋酸可的松(化学名：17α,21-二羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮-21-醋酸酯,17α,21-dihydroxypregn-4-ene-3,11,20-trione acetat)是肾上腺皮质激素类药物，是甾体激素类原料药中市场需求最大的品种之一。可用于治疗肾上腺皮质低功能症、类风湿性关节炎、风湿病、红斑狼疮等病的治疗；又为泼尼松醋酸酯及其他甾体的中间体。但醋酸可的松及泼尼松醋酸酯本身不具有活性，须在肝内将11位酮基还原为11位羟基后显药理活性。醋酸可的松作为原料药在后续生产较高药物价值的品种时，如：氢化可的松(专利：CN111518151A)、泼尼松(专利：CN111777654A)，伴随着21位酯的水解问题。

目前工业上，醋酸可的松的水解所用的是化学法，在有机溶剂(二氯甲烷、三氯甲烷等)中加入强碱进行水解，水解完成后需要用酸进行中和，提取出的粗产品再次使用有机溶剂进一步精制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用。

本发明的内容包括一种大肠杆菌来源的酯酶，酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种编码所述酯酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供一种重组菌，所述重组菌的制备方法，包括如下步骤，将所述的编码基因插入到质粒(质粒优选为pET-28a)中，获得重组质粒；然后将重组质粒转入宿主细胞(优选为BL21(DE3))中，获得重组菌。

本发明提供一种所述重组菌在水解醋酸可的松中的应用。

优选的，所述应用的步骤为，将醋酸可的松、助溶剂、缓冲液和重组菌混合，所述助溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、叔丁醇或DMSO(优选为异丙醇)，所述醋酸可的松和助溶剂的重量体积比大于1g:50ml，进行水解反应(反应温度优选控制在30-40℃)，反应完毕后，处理(处理的方法为，TLC监测底物残留量，取反应样，加入萃取剂三氯甲烷，充分振荡后，离心，吸取下清液)，得到产物。

优选的，重组菌在培养过程中，加入乳糖或IPTG(优选IPTG)进行诱导培养，得到诱导后的重组菌，使用诱导后的重组菌进行水解反应。具体过程一般为，将重组菌以一定的接种量(比如0.1％)接种至培养基中(比如LB培养基)，30-40℃条件下(优选37℃)培养一段时间(一般为12-16h)，以此活化菌株，将活化后的菌液接种(接种量优选为2％)到培养基(优选为含有50μg/ml卡纳的LB培养基)中，30-40℃条件下(优选37℃)培养一段时间(一般为4h)后，添加终浓度为0.01mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂，30℃诱导培养16小时，4℃离心收集菌体，得到诱导后的重组菌。

优选的，缓冲液为磷酸氢二盐-磷酸二氢盐缓冲液，优选为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，缓冲液的浓度优选为0.1M，缓冲液的pH控制在7-8。

优选的，反应过程中，控制pH值为7-8(更优选为7-7.5)，优选使用氢氧化钠溶液(质量浓度为10％)。

优选的，醋酸可的松和助溶剂的重量体积比为1g：1-20ml，优选为1g：2-20ml，更优选为1g：10-20ml。

优选的，醋酸可的松和缓冲液的重量体积比为1g：18-185mL，更优选为1g：180-185mL。

本发明的有益效果是，本申请将具有能编码特定酯酶的基因插入到质粒中，得到重组菌，以此来催化底物醋酸可的松，使其水解，得到产物，反应条件温和，实现了微生物发酵催化醋酸可的松的21位酯的水解，为甾体类侧链的水解提供了另一种可能，本发明通过调节助熔剂重量及其含量等，转化率最高可达到98％，可以有效的降低成本，提高效益。

具体实施方式

实施例1

重组工程菌的制备，大肠杆菌作为表达宿主。具体步骤为：

1.到酯酶核苷酸序列为SEQ-2，蛋白序列为SEQ-1，将SEQ-2送至上海擎科生物进行密码子优化后全基因合成并构建到pET-28a的质粒表达载体中，获得重组质粒。

2.将重组质粒用热击法导入100μL Escherichia Coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布到含有卡纳抗性的LB固体培养基中，37℃培养过夜(约有16h)。选取生长较大的单克隆用通用引物(T7,T7ter)进行菌落pcr(聚合酶链式反应)扩增筛选阳性克隆子，从而获得工程菌。

3.将重组工程菌以0.1％的接种量接种至LB培养基，37℃培养12-16小时以此活化菌株，将活化过的菌液以2％的接种量接种到新鲜的LB培养基中(含有50μg/ml的卡纳)，37℃培养4小时后添加终浓度为0.01mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂，30℃诱导培养16小时，4℃离心收集菌体，得到诱导后的重组工程菌。

LB培养基：1％重量(胰)蛋白胨，0.5％重量酵母(浸)粉，1％重量氯化钠。固体培养基再添加1.5％琼脂。

实施例2

酶活的检测

0.5Mβ-乙酸萘酯母液：称取β-乙酸萘酯0.931g，用无水乙醇溶解，到10ml容量瓶中定容，4℃避光保存。

1％坚固蓝B盐母液：称取坚固蓝B盐0.5g，于蒸馏水中溶解，并定容至50ml，4℃避光保存。

5％十二烷基硫酸钠母液：称取十二烷基硫酸钠5g，用微热的蒸馏水溶解并定容至100ml，4℃保存。

DBLS显色剂：2份1％坚固蓝B盐母液与5份5％十二烷基硫酸钠母液混合，使用前按使用量配置。

反应：实验平行三组，对照一组，向两组加入1/15M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠(pH7.0)溶液，体积分别为2.0ml、2.5ml；再加入30μl 0.5Mβ-乙酸萘酯母液混匀，37℃孵育5min，实验组加入0.5ml适当稀释后的酶液；反应5min，两组均加入0.5ml DBLS显色剂溶液终止反应。充分摇匀后，静置10min左右，于紫外分光光度计595nm处测定吸光值。

酶活定义：在最适条件下，每分钟将β-乙酸萘酯分解生成1μMβ-萘酚所需要的酶量。

实施例3

配制100mL LB培养基，使用LB粉末(配方同实施例1的LB培养基)进行液体培养基配制，121℃高压灭菌20min。冷却后用接种环挑去单菌落接入到培养基中，37℃200rpm过夜培养做种子液；配制10L发酵培养基，使用LB粉末进行液体培养基配制，将1L过夜培养的种子液接种到发酵培养基中，37℃200rpm培养至O.D 600为0.68，加入终浓度为0.01mM IPTG诱导表达12小时。4℃，8000rpm离心收集菌体。用实施例2的酶活检测方法进行酶活检测，重组菌株的酶活为976U/ml。

实施例4

称取醋酸可的松0.1g到转化瓶，加入异丙醇1mL，搅拌使之分散均匀，再加入磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液18mL(PH7.5，0.1M)，保持温度30℃继续搅拌均匀。加入重组酯酶菌体50g/L。反应开始，过程中用10％氢氧化钠溶液控制体系pH7.5左右。反应20小时终止，TLC监测底物残留量，取反应样0.2ml，加入萃取剂三氯甲烷0.3ml，充分振荡后，离心20s，吸取下清液；展开剂为三氯甲烷：甲醇：水＝6ml:1ml:0.03ml，紫外显色。转化率90％。

按照实施例4的水解底物的方法，对底物、助溶剂等进行调整，得到如表1所述的转化率表。

表1不同条件下的转化率表

通过上述实验表明，不同pH、不同温度下重组菌对醋酸可的松均有较好的水解率，尤其是在pH7.0，35℃时。

在转化体系中助溶剂的含量对转化率也有不同程度的影响：醇类的含量在20％以内对转化率有一定的促进作用，含量在20％以上对酶有抑制作用。醋酸可的松的投料量增加，转化率降低，可能是对酶的抑制或是醋酸可的松的溶解度即使是在助溶剂的帮助下溶解度也极低的原因。DMSO及25％的醇类能使酯酶失活。酯酶对雄烯二酮酯化物、3-酮石胆酸甲酯无水解作用。实验室构建的另一株酯酶重组菌B对醋酸可的松也有水解作用，但其作用不如大肠来源的酯酶。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

<110> 湖南新合新生物医药有限公司

<120> 一种大肠杆菌来源的酯酶、编码基因、重组菌和应用

<160>2

<210>1

<211>249

<212>PRT

<213>大肠杆菌（Escherichia coli）

<400>1

Met Ile Glu Ile Glu Ser Arg Glu Leu Ala Asp Ile Pro Val Leu His

1 5 10 15

Ala Tyr Pro Val Gly Gln Lys Asp Thr Pro Leu Pro Cys Ala Ile Phe

20 25 30

Tyr His Gly Phe Thr Ser Ser Ser Leu Val Tyr Ser Tyr Phe Ala Val

35 40 45

Ala Leu Ala Gln Ala Gly Leu Arg Val Ile Met Pro Asp Ala Pro Asp

50 55 60

His Gly Ser Arg Phe Ser Gly Asp Ala Ala Arg Arg Leu Asn Gln Phe

65 70 75 80

Trp Gln Ile Leu Leu Gln Ser Met Gln Glu Phe Thr Thr Leu Arg Ala

85 90 95

Ala Ile Ala Glu Glu Lys Trp Leu Leu Asp Asp Arg Leu Ala Val Gly

100 105 110

Gly Ala Ser Met Gly Ala Met Thr Ala Leu Gly Ile Thr Ala Arg His

115 120 125

Pro Thr Val Arg Cys Thr Ala Ser Met Met Gly Ser Gly Tyr Phe Thr

130 135 140

Ser Leu Ala Arg Ser Leu Phe Pro Pro Leu Ile Pro Glu Thr Thr Ala

145 150 155 160

Gln Gln Asn Glu Phe Asn Asn Ile Val Ala Pro Leu Ala Glu Trp Glu

165 170 175

Ala Thr Asn His Leu Glu Gln Leu Ser Asp Arg Pro Leu Leu Leu Trp

180 185 190

His Gly Leu Asp Asp Asp Val Val Pro Ala Asp Glu Ser Leu Arg Leu

195 200 205

Gln Gln Ala Leu Ser Glu Thr Gly Arp Asp Lys Leu Leu Thr Cys Ser

210 215 220

Trp Gln Pro Gly Val Arg His Arg Ile Thr Pro Glu Ala Leu Asp Ala

225 230 235 240

Ala Val Thr Phe Phe Arg Gln His Leu

245

<210>2

<211>750

<212>DNA

<213>大肠杆菌（Escherichia coli）

<400>2

atgattgaaa tagaatcacg cgagctggca gatattcccg ttcttcatgc ttatcctgtc 60

gggcaaaaag ataccccgtt accgtgcgta attttttatc acggctttac ttcatccagt 120

ctggtgtata gctattttgc cgttgcgctg gcgcaggctg gtttgcgggt gatcatgccg 180

gatgcgcccg atcacggtag ccgttttagt ggtgacgcag cgcggcggtt aaatcaattc 240

tggcaaatct tgctacaaag tatgcaggaa ttcactactt tacgtgcggc aatagccgaa 300

gaaaactggc tgcttgatga ccgtctggca gtcggtggcg cgtcgatggg cgcgatgacg 360

gcactgggga ttaccgctcg ccaccccacg gtgagatgta ccgccagcat gatgggatcg 420

ggctatttta catcactcgc ccgttcactg tttccaccgc tgatacctga aacggcagca 480

cagcagaatg aattcaataa cattgtcgcg ccactggcag agtgggaagc gacaaaccac 540

ctggaacaac ttagtgacag acctctactg ctgtggcatg gcctcgacga tgacgttgtg 600

cctgccgacg aatcactacg tttgcagcag gccttaagcg agacgggacg ggataaactg 660

ctaacctgtt catggcagcc aggcgtgcgt caccgcatta cgcctgaggc gttagatgct 720

gccgtgacat ttttccgcca gcatctttaa 750

Claims

1.一种大肠杆菌来源的酯酶，其特征是，酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述酯酶的编码基因，其特征是，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种重组菌，其特征是，所述重组菌的制备方法，包括如下步骤，将如权利要求2所述的编码基因插入到质粒中，获得重组质粒；然后将重组质粒转入宿主细胞中，获得重组菌。

4.一种如权利要求3所述重组菌在水解醋酸可的松中的应用。

5.如权利要求4所述应用，其特征是，步骤为，将醋酸可的松、助溶剂、缓冲液和重组菌混合，所述助溶剂为异丙醇、甲醇、乙醇、叔丁醇或DMSO，所述醋酸可的松和助溶剂的重量体积比大于1g:50ml，进行水解反应，反应完毕后，处理，得到产物。

6.如权利要求5所述应用，其特征是，重组菌在培养过程中，加入乳糖或IPTG进行诱导培养，得到诱导后的重组菌，使用诱导后的重组菌进行水解反应。

7.如权利要求5所述应用，其特征是，缓冲液为磷酸氢二盐-磷酸二氢盐缓冲液。

8.如权利要求5所述应用，其特征是，反应过程中，控制pH值为7-8。

9.如权利要求5所述应用，其特征是，醋酸可的松和助溶剂的重量体积比为1g：1-20ml。

10.如权利要求5所述应用，其特征是，醋酸可的松和缓冲液的重量体积比为1g：18-185mL。