CN117535270A - 一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：采用甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII对BspQI识别序列进行甲基化保护，构建pACYCDuet‑1‑HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒。在相同酶活力下，本发明表达纯化的限制性内切酶BspQI酶切效果更佳。

Description

一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法。
背景技术
细菌体内存在“限制-修饰”系统，即自身的DNA被甲基转移酶修饰，从而避免所产生的限制性内切酶对自身DNA片段的切割，达到抵御外来噬菌体侵染的目的。因此在原核表达体系中单一的重组表达限制性内切酶，会使宿主因基因组DNA被切割而死亡。而甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶切割的特性，保护宿主DNA，降解未被甲基化的外源DNA。
BspQI是一种IIS型限制性内切酶，来源于球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，其识别序列为5'-GCTCTTCN1/N4-3'，与常见的II型限制性内切酶识别回文序列不同，为非回文DNA序列，在识别序列之外对DNA进行切割，因此其DNA甲基化酶必须具备对识别的DNA上下两条链的正反向序列均能够起到修饰保护作用。
目前，关于BspQI限制性内切酶的表达纯化最早见于文献《Engineering BspQINicking Enzymes and Application of N.BspQI》，采用M1.EarI和M2.EarI作为甲基化修饰酶，方法单一。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供了一种能够用于限制性内切酶BspQI表达时对其识别序列进行甲基化保护的甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII，M1.HpyAII识别并甲基化5′GAAGA 3′，M2.HpyAⅡ则甲基化5′TCTTC 3′，而BspQI的识别序列为5'-GCTCTTCN1/N4-3'，M1.HpyAII和M2.HpyAII的甲基化识别序列可以将BspQI的识别序列包括在内，因此能够对限制性内切酶BspQI的识别序列进行甲基化修饰，从而避免表达的限制性内切酶BspQI切割宿主DNA导致宿主不能正常生长。
本发明提供了一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
采用甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII对BspQI识别序列进行甲基化保护，构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒。。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于，具体构建方法为：采用甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII对BspQI识别序列进行甲基化保护，将M1.HpyAII和M2.HpyAII分别构建到pACYCDuet-1的两个表达框中进行共表达。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：上述pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒的构建具体过程如下所示：
S1A.用M1.HpyAII进行DNA序列大肠杆菌密码子优化：在5’端添加BamHI酶切位点，3’端添加终止密码子和HindIII酶切位点，合成正确序列后用BamHI/HindIII酶切插入到pACYCDuet-1载体上的第一个表达框中，构建成功的质粒命名为pACYCDuet-1-HpyAIIM1；
S2A.用M2.HpyAII进行DNA序列大肠杆菌密码子优化：在5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点，合成正确序列后用NdeI/XhoI酶切插入到pACYCDuet-1-HpyAIIM1上的第二个表达框中，构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护质粒。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：将pBAD-BspQI连接产物与构建成功的pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒共同转化ER2566感受态细胞。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：上述pBAD-BspQI连接产物的构建方法为：
S1B.将pBAD载体骨架上的两个BspQI识别位点突变掉后，构建pBAD-Kan(NOBspQI)质粒；
S2B.BspQI氨基酸序列C端添加His标签，进行大肠杆菌密码子优化，合成引物扩增PCR产物无缝克隆到S1的pBAD-Kan(NO BspQI)载体上，构建pBAD-BspQI表达质粒。
在本发明的方案中，通过对BspQI表达载体pBAD进行改造，将pBAD载体骨架上的两个BspQI识别位点突变掉，避免表达的BspQI切割质粒从而影响到质粒的正常复制。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：S1B中的突变方法为：将其中一个BspQI识别位点序列由GAAGAGC突变成GCAGAGC，另一个BspQI识别位点序列由GCTCTTC突变成GTTCTTC。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：S1B中构建pBAD-Kan(NO BspQI)质粒的方法为：以pBAD载体质粒为模板，分别用pBAD-Va-F/pBAD-Va-R引物对，pBAD-Vb-F/pBAD-Vb-R引物对，pBAD-Vc-F/pBAD-Vc-R引物对进行PCR扩增，采用无缝克隆的方法连入AlwNI/BamHI酶切好的pBAD载体上，构建pBAD-Kan(NO BspQI)质粒。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
将ER2566感受态细胞，涂布于LB平板上筛选出阳性克隆；
上述阳性克隆包含有，具有正确测序结果的pBAD-BspQI和pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2两种质粒。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于，限制性内切酶BspQI的表达工艺如下：从平板上挑取阳性克隆接种LB液体培养基中制备种子， LB培养基扩大培养， 37℃摇菌至OD600 达到1.2时，用优化后的诱导剂浓度，即20%的L-阿拉伯糖37℃诱导4h，收获菌体，用于下一步纯化。
进一步地，本发明提供的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于,限制性内切酶BspQI的纯化工艺如下：包含Ni柱和Heparin柱亲和纯化，Q-HP和SP-HP柱离子交换纯化。
本发明的作用和效果：
在本发明的方案中，克服了正常限制性内切酶的表达，需要同时构建一种含有限制性内切酶目的基因的表达质粒，一种含有甲基化转移基因的甲基化保护质粒，分别构建成功后，再将两种质粒共同转化ER2566感受态细胞。而BspQI酶活性比较高，在单独构建pBAD-BspQI表达质粒时，产生的微量本底表达会切割宿主DNA，从而导致大肠杆菌宿主不能正常生长，能正常生长的经测序验证在BspQI基因序列上都会有异义突变或者移码，即正常生长的大肠杆菌都不能表达正确的BspQI基因的问题。
通过新的共同转化方法，先构建成功pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒，再将pBAD-BspQI连接产物与构建成功的pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒共同转化ER2566感受态细胞，pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2表达的M1.HpyAII和M2.HpyAII甲基转移酶对宿主 DNA上的BspQI识别序列进行甲基化保护，pBAD-BspQI即可正常表达，无需先单独用pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒转化ER2566后再制备ER2566+pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2感受态细胞的繁琐步骤，简化了共同转化的流程。
附图说明
图1.pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2质粒图谱；
图2.pBAD载体改造前质粒图谱，含有两个BspQI位点；
图3.pBAD-BspQI质粒图谱;
图4.SDS-PAGE凝胶电泳检测结果 ；
图5.纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果 ；
图6.本实施例BspQI和市场广为应用的BspQI活性检测对比。
具体实施方式
实施例
S1构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护质粒（如图1所示）
S1-1将M1.HpyAII（SEQ ID NO.1）进行DNA序列大肠杆菌密码子优化（SEQ IDNO.3），在5’端添加BamHI酶切位点，3’端添加终止密码子和HindIII酶切位点（SEQ IDNO.5），合成正确序列后用BamHI/HindIII酶切插入到pACYCDuet-1载体上的第一个表达框中，构建成功的质粒命名为pACYCDuet-1-HpyAIIM1；
M1.HpyAII 氨基酸序列（SEQ ID NO.1）
MILNKIYIEDVFTFLDKLEDKSVDLAIIDPPYNLKIASWDSFKNDEEFLTFSYAWIDKMLPKLKDTGSFYIFNTPFNCALFLAYLHHKKVHFLNFITWVKKDGFANAKKRYNHAQESILFYSMHKKNYTFNADEIRIAYESAERIKHAQSKGILKNNKRWFPNPKGKLCLDVWEITSQRHVEKEKGKILKPKHPSIKPKALIERMIKASSHKNDLILDLFSGSGMTSLVAKSLERNFIGCESHAEYVHGSLEMFRYNECE
M1.HpyAII 进行大肠杆菌密码子优化后的核苷酸序列（SEQ ID NO.3）
ATGATTCTGAACAAGATCTACATCGAAGACGTTTTTACTTTCCTGGATAAACTGGAAGATAAATCTGTGGACCTGGCAATCATTGACCCGCCTTATAACCTGAAAATCGCTTCTTGGGACTCTTTCAAAAACGACGAAGAATTCCTGACGTTCTCCTATGCGTGGATTGATAAGATGCTGCCAAAGCTGAAAGATACCGGTAGCTTTTACATCTTTAACACCCCGTTCAACTGTGCCCTGTTCCTGGCATACCTGCACCATAAGAAGGTCCACTTTCTGAACTTCATCACTTGGGTGAAGAAGGATGGCTTCGCGAACGCGAAAAAGCGTTACAATCACGCTCAGGAATCTATTCTGTTCTACTCCATGCACAAGAAAAACTATACCTTCAACGCGGACGAAATTCGTATCGCTTATGAATCCGCTGAACGTATCAAGCACGCTCAGAGCAAAGGTATTCTGAAGAACAATAAGCGTTGGTTCCCTAACCCTAAAGGCAAACTGTGCCTGGATGTGTGGGAAATCACGAGCCAGCGCCACGTTGAAAAAGAAAAAGGCAAAATCCTGAAACCGAAACACCCGTCCATTAAGCCAAAAGCTCTGATCGAACGTATGATTAAGGCGAGCTCCCACAAAAATGACCTGATCCTGGATCTGTTCTCTGGTTCTGGCATGACCTCCCTGGTTGCTAAGTCTCTGGAGCGTAATTTCATTGGCTGTGAATCTCACGCTGAGTACGTCCATGGTAGCCTGGAGATGTTCCGTTACAACGAGTGCGAG
M1.HpyAII 在5’端添加BamHI酶切位点，3’端添加终止密码子和HindIII酶切位点后的核苷酸序列（SEQ ID NO.5）
ggatccATGATTCTGAACAAGATCTACATCGAAGACGTTTTTACTTTCCTGGATAAACTGGAAGATAAATCTGTGGACCTGGCAATCATTGACCCGCCTTATAACCTGAAAATCGCTTCTTGGGACTCTTTCAAAAACGACGAAGAATTCCTGACGTTCTCCTATGCGTGGATTGATAAGATGCTGCCAAAGCTGAAAGATACCGGTAGCTTTTACATCTTTAACACCCCGTTCAACTGTGCCCTGTTCCTGGCATACCTGCACCATAAGAAGGTCCACTTTCTGAACTTCATCACTTGGGTGAAGAAGGATGGCTTCGCGAACGCGAAAAAGCGTTACAATCACGCTCAGGAATCTATTCTGTTCTACTCCATGCACAAGAAAAACTATACCTTCAACGCGGACGAAATTCGTATCGCTTATGAATCCGCTGAACGTATCAAGCACGCTCAGAGCAAAGGTATTCTGAAGAACAATAAGCGTTGGTTCCCTAACCCTAAAGGCAAACTGTGCCTGGATGTGTGGGAAATCACGAGCCAGCGCCACGTTGAAAAAGAAAAAGGCAAAATCCTGAAACCGAAACACCCGTCCATTAAGCCAAAAGCTCTGATCGAACGTATGATTAAGGCGAGCTCCCACAAAAATGACCTGATCCTGGATCTGTTCTCTGGTTCTGGCATGACCTCCCTGGTTGCTAAGTCTCTGGAGCGTAATTTCATTGGCTGTGAATCTCACGCTGAGTACGTCCATGGTAGCCTGGAGATGTTCCGTTACAACGAGTGCGAGTAAaagctt
S1-2将M2.HpyAII（SEQ ID NO.2）进行DNA序列大肠杆菌密码子优化（SEQ IDNO.4），在5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点（SEQ ID NO.6），合成正确序列后用NdeI/XhoI酶切插入到pACYCDuet-1-HpyAIIM1上的第二个表达框中，构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护质粒（SEQ ID NO.7）
M2.HpyAII 氨基酸序列（SEQ ID NO.2）
MNINKVFYHSSTNMNEVPDNSVDLIITSPPYFNIKDYAKNGTQDLQHSAQHVEDLGALEKYEDYLLGLLKVWLECYRALKPNGKLCINVPLMPMLKKVLNTHYNRHIFDLHADIQHSILHDLNNMLKNKPKMFLLDVYIWKRANPTKRLMFGSYPYPRNFYAQNTIEFIGVFVKDGKPKQPTEEQKEQSQLTQEEWVEFTKQIWEIPIPNKNDIAFGKHAALMPAELARRLIRLYSCVGDVVLDPFSGSGTTLREAKLLKRNFIGYELYENYKPLIEQKLGNLFDFE
M2.HpyAII 进行大肠杆菌密码子优化后的核苷酸序列（SEQ ID NO.4）
ATGAACATCAATAAAGTTTTCTATCACAGCAGCACCAACATGAACGAAGTACCGGATAATTCCGTCGACCTGATCATTACCTCCCCGCCATACTTTAACATCAAGGACTATGCGAAAAACGGCACCCAGGATCTGCAGCACAGCGCACAGCACGTCGAGGATCTGGGCGCACTGGAAAAGTACGAAGACTATCTGCTGGGCCTGCTGAAAGTTTGGCTGGAATGCTACCGTGCACTGAAACCGAACGGCAAACTGTGTATCAACGTTCCGCTGATGCCGATGCTGAAGAAGGTTCTGAACACTCACTACAACCGTCACATTTTCGACCTGCACGCGGACATCCAGCACTCCATCCTGCACGATCTGAACAACATGCTGAAGAACAAACCTAAGATGTTCCTGCTGGACGTCTACATTTGGAAACGCGCAAACCCGACCAAACGTCTGATGTTCGGCTCTTACCCGTATCCGCGTAACTTCTACGCACAGAACACCATCGAGTTCATCGGCGTGTTCGTCAAAGACGGTAAACCGAAGCAGCCGACTGAAGAACAGAAAGAACAATCCCAGCTGACCCAGGAGGAGTGGGTGGAGTTTACCAAACAGATCTGGGAAATCCCGATTCCGAACAAGAACGACATCGCTTTCGGTAAACACGCTGCGCTGATGCCGGCAGAACTGGCTCGTCGTCTGATCCGTCTGTATTCTTGCGTTGGTGATGTTGTACTGGACCCGTTCTCCGGCTCCGGTACTACTCTGCGTGAAGCAAAGCTGCTGAAACGTAACTTTATTGGTTACGAGCTGTATGAGAACTACAAACCACTGATTGAACAGAAACTGGGCAACCTGTTCGACTTCGAA
M2.HpyAII 在5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点后的核苷酸序列（SEQ ID NO.6）
catATGAACATCAATAAAGTTTTCTATCACAGCAGCACCAACATGAACGAAGTACCGGATAATTCCGTCGACCTGATCATTACCTCCCCGCCATACTTTAACATCAAGGACTATGCGAAAAACGGCACCCAGGATCTGCAGCACAGCGCACAGCACGTCGAGGATCTGGGCGCACTGGAAAAGTACGAAGACTATCTGCTGGGCCTGCTGAAAGTTTGGCTGGAATGCTACCGTGCACTGAAACCGAACGGCAAACTGTGTATCAACGTTCCGCTGATGCCGATGCTGAAGAAGGTTCTGAACACTCACTACAACCGTCACATTTTCGACCTGCACGCGGACATCCAGCACTCCATCCTGCACGATCTGAACAACATGCTGAAGAACAAACCTAAGATGTTCCTGCTGGACGTCTACATTTGGAAACGCGCAAACCCGACCAAACGTCTGATGTTCGGCTCTTACCCGTATCCGCGTAACTTCTACGCACAGAACACCATCGAGTTCATCGGCGTGTTCGTCAAAGACGGTAAACCGAAGCAGCCGACTGAAGAACAGAAAGAACAATCCCAGCTGACCCAGGAGGAGTGGGTGGAGTTTACCAAACAGATCTGGGAAATCCCGATTCCGAACAAGAACGACATCGCTTTCGGTAAACACGCTGCGCTGATGCCGGCAGAACTGGCTCGTCGTCTGATCCGTCTGTATTCTTGCGTTGGTGATGTTGTACTGGACCCGTTCTCCGGCTCCGGTACTACTCTGCGTGAAGCAAAGCTGCTGAAACGTAACTTTATTGGTTACGAGCTGTATGAGAACTACAAACCACTGATTGAACAGAAACTGGGCAACCTGTTCGACTTCGAATAACTCGAG
pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒全长序列（SEQ ID NO.7）
ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatatAccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccATGATTCTGAACAAGATCTACATCGAAGACGTTTTTACTTTCCTGGATAAACTGGAAGATAAATCTGTGGACCTGGCAATCATTGACCCGCCTTATAACCTGAAAATCGCTTCTTGGGACTCTTTCAAAAACGACGAAGAATTCCTGACGTTCTCCTATGCGTGGATTGATAAGATGCTGCCAAAGCTGAAAGATACCGGTAGCTTTTACATCTTTAACACCCCGTTCAACTGTGCCCTGTTCCTGGCATACCTGCACCATAAGAAGGTCCACTTTCTGAACTTCATCACTTGGGTGAAGAAGGATGGCTTCGCGAACGCGAAAAAGCGTTACAATCACGCTCAGGAATCTATTCTGTTCTACTCCATGCACAAGAAAAACTATACCTTCAACGCGGACGAAATTCGTATCGCTTATGAATCCGCTGAACGTATCAAGCACGCTCAGAGCAAAGGTATTCTGAAGAACAATAAGCGTTGGTTCCCTAACCCTAAAGGCAAACTGTGCCTGGATGTGTGGGAAATCACGAGCCAGCGCCACGTTGAAAAAGAAAAAGGCAAAATCCTGAAACCGAAACACCCGTCCATTAAGCCAAAAGCTCTGATCGAACGTATGATTAAGGCGAGCTCCCACAAAAATGACCTGATCCTGGATCTGTTCTCTGGTTCTGGCATGACCTCCCTGGTTGCTAAGTCTCTGGAGCGTAATTTCATTGGCTGTGAATCTCACGCTGAGTACGTCCATGGTAGCCTGGAGATGTTCCGTTACAACGAGTGCGAGTAAaagcttgcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacatATGAACATCAATAAAGTTTTCTATCACAGCAGCACCAACATGAACGAAGTACCGGATAATTCCGTCGACCTGATCATTACCTCCCCGCCATACTTTAACATCAAGGACTATGCGAAAAACGGCACCCAGGATCTGCAGCACAGCGCACAGCACGTCGAGGATCTGGGCGCACTGGAAAAGTACGAAGACTATCTGCTGGGCCTGCTGAAAGTTTGGCTGGAATGCTACCGTGCACTGAAACCGAACGGCAAACTGTGTATCAACGTTCCGCTGATGCCGATGCTGAAGAAGGTTCTGAACACTCACTACAACCGTCACATTTTCGACCTGCACGCGGACATCCAGCACTCCATCCTGCACGATCTGAACAACATGCTGAAGAACAAACCTAAGATGTTCCTGCTGGACGTCTACATTTGGAAACGCGCAAACCCGACCAAACGTCTGATGTTCGGCTCTTACCCGTATCCGCGTAACTTCTACGCACAGAACACCATCGAGTTCATCGGCGTGTTCGTCAAAGACGGTAAACCGAAGCAGCCGACTGAAGAACAGAAAGAACAATCCCAGCTGACCCAGGAGGAGTGGGTGGAGTTTACCAAACAGATCTGGGAAATCCCGATTCCGAACAAGAACGACATCGCTTTCGGTAAACACGCTGCGCTGATGCCGGCAGAACTGGCTCGTCGTCTGATCCGTCTGTATTCTTGCGTTGGTGATGTTGTACTGGACCCGTTCTCCGGCTCCGGTACTACTCTGCGTGAAGCAAAGCTGCTGAAACGTAACTTTATTGGTTACGAGCTGTATGAGAACTACAAACCACTGATTGAACAGAAACTGGGCAACCTGTTCGACTTCGAATAACTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaatttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacagacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatagtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacggaactccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactgatttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtccctcctgttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcgctagcggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttcccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgttagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaaattaatacgactcactata
S2.对表达载体pBAD进行改造
S2-1将pBAD载体骨架上的两个BspQI识别位点突变掉，将其中一个BspQI识别位点序列由GAAGAGC突变成GCAGAGC，另一个BspQI识别位点序列由GCTCTTC突变成GTTCTTC，避免表达的BspQI切割质粒从而影响到质粒的正常复制。
上述突变均为同义突变，没有改变载体的氨基酸序列，不会对载体的复制产生影响。
S2-2合成pBAD-Va-F、pBAD-Va-R、pBAD-Vb-F、pBAD-Vb-R、pBAD-Vc-F、pBAD-Vc-R共6条引物，以pBAD载体质粒为模板，分别用pBAD-Va-F/pBAD-Va-R引物对，pBAD-Vb-F/pBAD-Vb-R引物对，pBAD-Vc-F/pBAD-Vc-R引物对进行PCR扩增，回收PCR产物，采用无缝克隆的方法连入AlwNI/BamHI酶切好的pBAD载体上，构建pBAD-Kan(NO BspQI)质粒。
在S2-2中，酶切位点AlwNI可以换成AseI、AsisI、PvuI、SmaI等，BamHI可以换成AgeI等，基于酶切位点的更换，引物序列需要相应做调整。
引物名称 引物序列(5' to 3') 序列编号
pBAD-Va-F CGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCG SEQ ID NO.8
pBAD-Va-R GAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTGCCGCTTCCTCGCTCACTGACT SEQ ID NO.9
pBAD-Vb-F AGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGCAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTC SEQ ID NO.10
pBAD-Vb-R GTTACCGGTTTGGTTAGCGAGAAGAACCAGTAAAAGACGCAGTGACG SEQ ID NO.11
pBAD-Vc-F CGTCACTGCGTCTTTTACTGGTTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAAC SEQ ID NO.12
pBAD-Vc-R GCGATAAAAAGCGTCAGGTAGGATCCGCTAATCTTATGGATAAAAATG SEQ ID NO.13
S3.构建pBAD-BspQI表达质粒
考考虑到正常生长的菌落经测序验证在BspQI基因序列上都会有异义突变或者碱基缺失造成移码，做突变修复后重新构建pBAD-BspQI表达质粒，在BspQI基因序列上仍然会有随机异义突变或者碱基缺失造成移码，即正常生长的大肠杆菌都不能表达正确的BspQI基因，推测是构建的pBAD-BspQI表达质粒在DH5α大肠杆菌中即使没有L-阿拉伯糖诱导，也会产生微量的本底表达，一方面BspQI切割大肠杆菌基因组DNA导致大肠杆菌不能正常生长而死亡，另一方面BspQI切割大肠杆菌基因组DNA会诱发大肠杆菌做出SOS应答，大肠杆菌为了正常生长会使pBAD-BspQI质粒发生变异，从而使其不能正常表达BspQI蛋白。
在本实施例中，以如图2所示的发生突变的pBAD-BspQI质粒为模板做突变修复，扩增PCR产物无缝克隆到BamHI/BsaI酶切好的pBAD-Kan(NO BspQI)载体上，得到如图3所示的pBAD-BspQI连接产物。
具体为：在BspQI氨基酸序列C端添加6xHis标签（SEQ ID NO.14），进行大肠杆菌密码子优化（SEQ ID NO.15），选取BamHI/BsaI作为插入位点，在两端添加载体同源臂，全基因合成扩增PCR产物（SEQ ID NO.16），无缝克隆到BamHI/BsaI酶切好的pBAD-Kan(NO BspQI)载体上，构建pBAD-BspQI表达质粒（SEQ ID NO.17）。
BamHI位点可以替换成MluI、AgeI，添加的载体同源臂序列相应地需要调整。
BspQI 氨基酸序列（（SEQ ID NO.14）
MRRLAKNSRNDSYLSNRDYQEIVRENTTTISFPLKEKHTLTLTKKIGLNQTAGFGGWFFPDSPCLLTVTVLSSFGTKVTSKTFSLSKDWNRVGLAWINEHSSDTMSIVLEFSDVEIVHTWGLTCDVFNVHELIIDAIEDQNKLIDVLNQEHLSPETYYLNHDSDTDLIENLESTEEIKIVNQSQKQISLKKCCYCQRYMPVNILVRSNSSFHKHKSKKTGFQNECRACKKWRINNSFNPVRTKDQLHESAVITREKKILLKEPEILQKIKNRNNGEGLKSIIWKKFDKKCFNCEKELTIEEVRLDHTRPLAYLWPIDEHATCLCEKCNNTKHDMFPIDFYQGDEDKLRRLARITGLDYESLVKRDVNEVELARIINNIEDFATNVEARTFRSIRNKVKEVRPDTDLFEILKSKNINLYNELQYELLTRKDHHHHHH
BspQI 进行大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列（SEQ ID NO.15）
ATGCGTCGTCTGGCTAAAAACTCTCGCAACGATTCCTATCTGTCTAACCGTGACTACCAGGAAATCGTTCGTGAAAACACTACCACCATCAGCTTCCCGCTGAAAGAAAAACACACCCTGACCCTGACCAAAAAAATCGGTCTGAACCAGACTGCGGGTTTCGGCGGCTGGTTCTTTCCGGATTCCCCTTGCCTGCTGACCGTGACTGTGCTGTCTTCTTTTGGCACTAAAGTAACCAGCAAGACTTTCTCTCTGTCCAAAGACTGGAACCGCGTTGGTCTGGCGTGGATCAACGAACACTCCTCTGACACCATGTCTATCGTGCTGGAATTCAGCGACGTTGAAATTGTGCATACTTGGGGCCTGACCTGTGATGTTTTTAATGTGCACGAACTGATCATTGACGCAATTGAGGACCAGAACAAACTGATCGATGTTCTGAACCAGGAACACCTGTCTCCGGAAACCTACTACCTGAACCACGACTCTGATACTGACCTGATCGAAAACCTGGAATCCACCGAAGAAATCAAAATTGTTAACCAAAGCCAGAAACAGATCTCTCTGAAAAAATGCTGCTACTGTCAGCGTTACATGCCGGTTAACATCCTGGTTCGTTCTAACTCTTCCTTTCACAAACACAAAAGCAAAAAGACTGGTTTCCAGAACGAATGTCGCGCATGCAAAAAATGGCGTATCAACAACTCCTTCAACCCAGTGCGTACCAAAGATCAGCTGCACGAATCCGCTGTGATCACGCGTGAGAAAAAAATCCTGCTGAAGGAACCAGAAATCCTGCAGAAAATTAAAAACCGTAACAACGGCGAGGGTCTGAAATCTATCATCTGGAAAAAATTCGACAAAAAATGCTTCAACTGCGAAAAAGAACTGACGATCGAAGAAGTTCGTCTGGACCACACTCGTCCGCTGGCTTACCTGTGGCCGATTGACGAACACGCGACCTGTCTGTGTGAAAAATGTAACAACACCAAACACGACATGTTTCCGATTGACTTCTATCAAGGCGATGAAGACAAACTGCGTCGCCTGGCTCGTATCACGGGTCTGGATTACGAATCTCTGGTGAAGCGTGATGTCAACGAAGTTGAACTGGCCCGTATCATCAACAACATCGAAGACTTCGCAACTAACGTTGAAGCCCGCACCTTTCGTAGCATTCGTAACAAAGTTAAAGAAGTCCGTCCGGACACCGATCTGTTCGAGATCCTGAAGTCTAAGAACATCAACCTGTACAACGAGCTGCAGTACGAACTGCTGACTCGCAAAGATCACCACCACCATCACCAT
BspQI 选取BamHI/BsaI作为插入位点，在两端添加载体同源臂后的核苷酸序列（SEQ ID NO.16）
GcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgttttttgggctaacaggaggaattaaccATGCGTCGTCTGGCTAAAAACTCTCGCAACGATTCCTATCTGTCTAACCGTGACTACCAGGAAATCGTTCGTGAAAACACTACCACCATCAGCTTCCCGCTGAAAGAAAAACACACCCTGACCCTGACCAAAAAAATCGGTCTGAACCAGACTGCGGGTTTCGGCGGCTGGTTCTTTCCGGATTCCCCTTGCCTGCTGACCGTGACTGTGCTGTCTTCTTTTGGCACTAAAGTAACCAGCAAGACTTTCTCTCTGTCCAAAGACTGGAACCGCGTTGGTCTGGCGTGGATCAACGAACACTCCTCTGACACCATGTCTATCGTGCTGGAATTCAGCGACGTTGAAATTGTGCATACTTGGGGCCTGACCTGTGATGTTTTTAATGTGCACGAACTGATCATTGACGCAATTGAGGACCAGAACAAACTGATCGATGTTCTGAACCAGGAACACCTGTCTCCGGAAACCTACTACCTGAACCACGACTCTGATACTGACCTGATCGAAAACCTGGAATCCACCGAAGAAATCAAAATTGTTAACCAAAGCCAGAAACAGATCTCTCTGAAAAAATGCTGCTACTGTCAGCGTTACATGCCGGTTAACATCCTGGTTCGTTCTAACTCTTCCTTTCACAAACACAAAAGCAAAAAGACTGGTTTCCAGAACGAATGTCGCGCATGCAAAAAATGGCGTATCAACAACTCCTTCAACCCAGTGCGTACCAAAGATCAGCTGCACGAATCCGCTGTGATCACGCGTGAGAAAAAAATCCTGCTGAAGGAACCAGAAATCCTGCAGAAAATTAAAAACCGTAACAACGGCGAGGGTCTGAAATCTATCATCTGGAAAAAATTCGACAAAAAATGCTTCAACTGCGAAAAAGAACTGACGATCGAAGAAGTTCGTCTGGACCACACTCGTCCGCTGGCTTACCTGTGGCCGATTGACGAACACGCGACCTGTCTGTGTGAAAAATGTAACAACACCAAACACGACATGTTTCCGATTGACTTCTATCAAGGCGATGAAGACAAACTGCGTCGCCTGGCTCGTATCACGGGTCTGGATTACGAATCTCTGGTGAAGCGTGATGTCAACGAAGTTGAACTGGCCCGTATCATCAACAACATCGAAGACTTCGCAACTAACGTTGAAGCCCGCACCTTTCGTAGCATTCGTAACAAAGTTAAAGAAGTCCGTCCGGACACCGATCTGTTCGAGATCCTGAAGTCTAAGAACATCAACCTGTACAACGAGCTGCAGTACGAACTGCTGACTCGCAAAGATCACCACCACCATCACCATtaaggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcat
pBAD-BspQI 连接产物（质粒）全长序列（SEQ ID NO.17）
AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGTTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgttttttgggctaacaggaggaattaaccATGCGTCGTCTGGCTAAAAACTCTCGCAACGATTCCTATCTGTCTAACCGTGACTACCAGGAAATCGTTCGTGAAAACACTACCACCATCAGCTTCCCGCTGAAAGAAAAACACACCCTGACCCTGACCAAAAAAATCGGTCTGAACCAGACTGCGGGTTTCGGCGGCTGGTTCTTTCCGGATTCCCCTTGCCTGCTGACCGTGACTGTGCTGTCTTCTTTTGGCACTAAAGTAACCAGCAAGACTTTCTCTCTGTCCAAAGACTGGAACCGCGTTGGTCTGGCGTGGATCAACGAACACTCCTCTGACACCATGTCTATCGTGCTGGAATTCAGCGACGTTGAAATTGTGCATACTTGGGGCCTGACCTGTGATGTTTTTAATGTGCACGAACTGATCATTGACGCAATTGAGGACCAGAACAAACTGATCGATGTTCTGAACCAGGAACACCTGTCTCCGGAAACCTACTACCTGAACCACGACTCTGATACTGACCTGATCGAAAACCTGGAATCCACCGAAGAAATCAAAATTGTTAACCAAAGCCAGAAACAGATCTCTCTGAAAAAATGCTGCTACTGTCAGCGTTACATGCCGGTTAACATCCTGGTTCGTTCTAACTCTTCCTTTCACAAACACAAAAGCAAAAAGACTGGTTTCCAGAACGAATGTCGCGCATGCAAAAAATGGCGTATCAACAACTCCTTCAACCCAGTGCGTACCAAAGATCAGCTGCACGAATCCGCTGTGATCACGCGTGAGAAAAAAATCCTGCTGAAGGAACCAGAAATCCTGCAGAAAATTAAAAACCGTAACAACGGCGAGGGTCTGAAATCTATCATCTGGAAAAAATTCGACAAAAAATGCTTCAACTGCGAAAAAGAACTGACGATCGAAGAAGTTCGTCTGGACCACACTCGTCCGCTGGCTTACCTGTGGCCGATTGACGAACACGCGACCTGTCTGTGTGAAAAATGTAACAACACCAAACACGACATGTTTCCGATTGACTTCTATCAAGGCGATGAAGACAAACTGCGTCGCCTGGCTCGTATCACGGGTCTGGATTACGAATCTCTGGTGAAGCGTGATGTCAACGAAGTTGAACTGGCCCGTATCATCAACAACATCGAAGACTTCGCAACTAACGTTGAAGCCCGCACCTTTCGTAGCATTCGTAACAAAGTTAAAGAAGTCCGTCCGGACACCGATCTGTTCGAGATCCTGAAGTCTAAGAACATCAACCTGTACAACGAGCTGCAGTACGAACTGCTGACTCGCAAAGATCACCACCACCATCACCATtaaggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGCAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCTGTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG
S4.BspQI的表达菌株
将pBAD-BspQI连接产物与构建成功的pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒共同转化ER2566感受态细胞，涂布于卡那霉素和氯霉素双抗LB平板上筛选阳性克隆，阳性克隆含有pBAD-BspQI和pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2两种质粒，经测序验证，这两种质粒均测序正确，测序正确的阳性克隆即为BspQI的表达菌株。
S5.BspQI限制性内切酶的诱导表达：
将构建好的BspQI表达菌株取1μl菌液用无菌的LB液体培养基稀释到500μl，再取100μl稀释后的菌液涂布于卡那霉素和氯霉素双抗LB平板，37℃过夜培养；在平板上挑取单克隆接种于含卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床，220rpm，培养4~6h使菌液浓度OD600 = 0.8；LB培养基扩大培养，置于37℃恒温摇床，220rpm，培养3~4 h使菌液浓度OD600 = 1.2；加入优化后终浓度为20%的L-阿拉伯糖诱导，37℃继续培养4h，收获菌体用于纯化。
使用SDS-PAGE凝胶电泳检测，如图4所示，发现BspQI可溶于细胞破碎上清中，说明构建的BspQI大肠杆菌表达菌株是以可溶形式表达目的蛋白。
S6.BspQI限制性内切酶的纯化
（1）高压破碎：菌体与裂解液按照1：10比例重悬，冰浴条件下高压裂解菌体；4℃，10000 rpm离心30min，收获裂解上清，裂解上清过滤待用。
（2）Ni柱纯化：
①层析柱准备：用纯水将层析柱的保存液清洗干净。
②平衡：用平衡液1平衡层析柱直到电导与UV280基线平行，需要平衡液5-10个柱体积。
③上样：过滤后的裂解上清液冰浴条件下上样，富集目的蛋白。
④再平衡：用平衡液1冲洗层析柱，直到电导与UV280基线再次平行。
⑤洗杂：用含有20 mM咪唑的平衡液1进行洗脱杂蛋白。
⑥洗脱：用200 mM咪唑的平衡液1进行洗脱目的蛋白。
⑦检测： SDS-PAGE检测洗脱组分，保留含有目的蛋白的组分用于下一步纯化。
（3）Heparin柱纯化：
①层析柱准备：用纯水将层析柱的保存液清洗干净。
②平衡：用平衡液2平衡层析柱直到电导与UV280基线完全平行，需要平衡液5-10个柱体积。
③上样：将上一步NI亲和柱洗脱的样品脱盐后上样，富集目的蛋白。
④再平衡：用平衡液2再次冲洗层析柱直到电导与UV280基线再次平行。
⑤洗杂：用含有300 mM KCl的平衡液2进行洗脱杂蛋白。
⑥洗脱：用含有600 mM KCl的平衡液2进行洗脱目的蛋白。
⑦检测： 10%SDS-PAGE检测洗脱组分，保留含有目的蛋白的组分用于下一步纯化。
(4) Q-HP柱纯化：
①层析柱准备： 用纯水将层析柱的保存液冲洗干净。
②平衡：
用平衡液3平衡柱子直到电导与UV280基线完全平行，需要平衡5-10个柱体积。
③上样： 将上一步Heparin柱洗脱的样品脱盐后上样，富集目的蛋白。
④清洗：用平衡液3再次冲洗层析柱直到电导与UV280线再次平行。
⑤洗杂：用含有1M KCl平衡液3进行洗脱杂蛋白。
⑥检测： 10%SDS-PAGE检测流出和洗脱组分，保留目的蛋白进行下一步纯化。
(5)SP-HP柱纯化：
①层析柱准备： 用纯水将层析柱的保存液冲洗干净。
②平衡：
用平衡液3平衡柱子直到电导与UV280基线完全平行，需要平衡5-10个柱体积。
③上样： 将上一步Q-HP柱流出的样品直接上样，富集目的蛋白。
④清洗：用平衡液3再次冲洗层析柱直到电导与UV280线再次平行。
⑤洗杂：用含有300 mM KCl平衡液3进行洗脱杂蛋白。
⑥洗脱：用含有600 mM KCl平衡液3进行洗脱目的蛋白。
⑦检测： 10%SDS-PAGE检测洗脱组分，保留目的蛋白进行透析至最终体系和测活。
最终得到纯化的BspQI蛋白样品，如图5所示。
S6.BspQI活性检测
限制性内切酶BspQI的酶活定义为：在50μl的反应体系中，50℃条件下1小时内完全消化1μg质粒所需的酶量定义为1个活性单位（U）。
在50μL的酶切体系中，对纯化的BspQI蛋白样品进行梯度稀释，以pBR322 DNA质粒(含有1个BspQI酶切位点)为底物进行酶切，在相同酶活力下，如图6所示，本发明表达纯化的限制性内切酶BspQI酶切效果优于另一家市场广为使用的酶供应商(采用M1.EarI和M2.EarI作为甲基化修饰酶)。

Claims (9)

1.一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
采用甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII对BspQI识别序列进行甲基化保护，构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒；
其中，M1.HpyAII氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
M2.HpyAII氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于，具体构建方法为：采用甲基转移酶M1.HpyAII和M2.HpyAII对BspQI识别序列进行甲基化保护，将M1.HpyAII和M2.HpyAII分别构建到pACYCDuet-1的两个表达框中进行共表达。
3.如权利要求1所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：所述pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒的构建具体过程如下所示：
S1A.用M1.HpyAII进行DNA序列大肠杆菌密码子优化：在5’端添加BamHI酶切位点，3’端添加终止密码子和HindIII酶切位点，合成正确序列后用BamHI/HindIII酶切插入到pACYCDuet-1载体上的第一个表达框中，构建成功的质粒命名为pACYCDuet-1-HpyAIIM1；
S2A.用M2.HpyAII进行DNA序列大肠杆菌密码子优化：在5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点，合成正确序列后用NdeI/XhoI酶切插入到pACYCDuet-1-HpyAIIM1上的第二个表达框中，构建pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护质粒。
4.如权利要求1所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
通过将pBAD-BspQI连接产物与构建成功的pACYCDuet-1-HpyAIIM1M2甲基化保护酶质粒共同转化ER2566感受态细胞来制备BspQI的表达菌株；
其中，所述pBAD-BspQI连接产物的构建方法为：
S1B.将pBAD载体骨架上的两个BspQI识别位点突变掉后，构建不含BspQI位点的pBAD-Kan质粒；
S2B.BspQI氨基酸序列C端添加His标签，进行大肠杆菌密码子优化，选取BamHI/BsaI作为插入位点，在两端添加载体同源臂，全基因合成扩增PCR产物，无缝克隆到S1B的不含BspQI位点的pBAD-Kan质粒载体上，构建pBAD-BspQI表达质粒。
5.如权利要求4所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
S1B中的突变方法为：将其中一个BspQI识别位点序列由GAAGAGC突变成GCAGAGC，另一个BspQI识别位点序列由GCTCTTC突变成GTTCTTC。
6.如权利要求4所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
S1B中构建不含BspQI位点的pBAD-Kan质粒的方法为：以pBAD载体质粒为模板，分别用pBAD-Va-F/pBAD-Va-R引物对，pBAD-Vb-F/pBAD-Vb-R引物对，pBAD-Vc-F/pBAD-Vc-R引物对进行PCR扩增，采用无缝克隆的方法连入AlwNI/BamHI酶切好的pBAD载体上，构建不含BspQI位点的pBAD-Kan质粒。
7.如权利要求4所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于：
将ER2566感受态细胞，涂布于LB平板上筛选出阳性克隆；
所述阳性克隆包含有，具有正确测序结果的pBAD-BspQI和pACYCDuet-1- HpyAIIM1M2两种质粒。
8.如权利要求7所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于，限制性内切酶BspQI的表达工艺如下：从平板上挑取阳性克隆接种LB液体培养基中制备种子， LB培养基扩大培养， 37℃摇菌至OD600 达到1.2时，用优化后的诱导剂浓度，即20%的L-阿拉伯糖37℃诱导4h，收获菌体，用于下一步纯化。
9.如权利要求8所述的一种用于限制性内切酶BspQI表达的甲基化保护方法，其特征在于，限制性内切酶BspQI的纯化工艺如下：包含Ni柱和Heparin柱亲和纯化，Q-HP和SP-HP柱离子交换纯化。
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