JP2000511056A - 変異の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ミスマッチ結合タンパク質を使用することによる、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの非変異配列からの変異を検出するための方法およびキット。本方法は：ａ）非変異および変異標的ポリヌクレオチドの提供；ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチドの非変異および変異一本鎖からの二本鎖の形成；ｃ）一本鎖結合タンパク質のｂ）のポリヌクレオチドへの添加；ｄ）ミスマッチ結合タンパク質の活性剤とのインキュベート；ｅ）ｄ）のインキュベートしたミスマッチ結合タンパク質のｃ）のポリヌクレオチドへの添加(それによりミスマッチ結合タンパク質は、標的ポリヌクレオチドの一つの非変異および一つの変異一本鎖から形成された二本鎖に結合する)；ｆ）標的ポリヌクレオチドに結合したミスマッチ結合タンパク質の存在の検出を含む。本キットは：ａ）一本鎖結合タンパク質；ｂ）ミスマッチ結合タンパク質のための活性剤；ｃ）ミスマッチ結合タンパク質；ｄ）増幅プライマー；ｅ）標的ポリヌクレオチドまたはミスマッチ結合タンパク質の結合のための固体支持体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 変異の検出法 本発明は、標的ポリヌクレオチドの非変異配列からの変異を検出するための方 法およびキットに関する。より具体的に、本発明はミスマッチ結合タンパク質を 使用することによる、変異の検出法に関する。 ＤＮＡの変異の検出法の開発は、多くのヒト遺伝子疾患がゲノム中の一塩基置 換または小さい添加または欠失によるため、診断試験において重要である。例え ば、変異を検出する可能性は、癌の初期検出に重要なツールである。 変異の検出に利用可能な多くの方法がある。一本鎖形態多形成(ＳＳＣＰ)は、 例えば、一塩基ほどの小さい差異の一本鎖ＤＮＡが非変性環境下で異なる形態を 取り、電気泳動による分離が可能であるという事実に基づく。変性勾配ゲル電気 泳動(ＤＧＧＥ)において、塩基対変化により示される変わった融合特性を使用す る。融合二本鎖は、増加した変性濃度のゲル中を移動する時、分離される。これ らおよび他の方法は、ゲル電気泳動分離を必要とする。 １個または数個の塩基対を含む変異を検出するために実施される多くの方法は 、標準ＤＮＡ(またはＲＮＡ)と試験ＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションに基 づく。試験サンプルを、標識されていてもよい野生型サンプルと混合し、混合物 を変性し、復元させる。変異を次にヘテロ二本鎖分子中の誤対または非対塩基と して示す。誤対または非対塩基の検出のための異なる方法が知られている。化学 的または酵素的処置による開裂は、一般に使用されている方法の一つである。フ ラグメントをゲル電気泳動で観察する。ヘテロ二本鎖分子を検出するためのミス マッチ結合タンパク質の使用を記載したいくつかの特許がある(例えば、ＷＯ９ ３／０２２１６、ＷＯ９２／１２６８９)。ＤＮＡ誤対合はインビボで起こり、 修復タンパク質のファミリーにより認識され、直される。ミスマッチ含有ＤＮＡ を認識し、結合するタンパク質、いわゆるミスマッチ結合タンパク質が含まれる 。ミスマッチ結合タンパク質は、８つの可能な不適性塩基対と特異的複合体を形 成することが判明している。ミスマッチ修復システムは、エシェリキア・コリお よびサルモネラのような細菌で研究されている。MutSはエシェリキア・コリミス マッチ修復システム中で同定されたこのようなタンパク質の一つである。ミスマ ッ チ結合タンパク質のＤＮＡへの結合の検出は、あるタイプの標識により通常なさ れる。近年、無標識法を使用した点変異の検出のための迅速な方法が報告された (Ivan Babic et al.,サンディエゴにおける第５回ＢＩＡシンポジウム、１９９ ５年９月)。MutSと種々の塩基対ミスマッチを含む短オリゴヌクレオチドとの相 互作用を光学バイオセンサー法を使用して試験した。 ゲル電気泳動または標識法に基づいた当分野での検出法は時間のかかる方法で ある。従って、時間が短縮された方法の開発において、これらの方法は変異の検 出のためのサンプルの迅速なスクリーニングに適用するのは困難である。これら の方法は、また自動化も困難である。 ＷＯ９５／１２６８９およびまた上記のBabic et al.によると、MutSは誤対合 塩基対を含むＤＮＡに結合するが、誤対合がないＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡには 結合しない。しかしながら、本発明において、MutSが非特異的に結合することが 判明した。即ち、MutSが一本鎖ＤＮＡおよびミスマッチのない二本鎖ＤＮＡの両 方に結合することが判明した。これは、MutS検出法の精度が、MutSの非特異的結 合が偽陽性をもたらし得るため、変異の検出に十分ではないことを意味する。 本発明の目的は、上記の欠点のないミスマッチ結合タンパク質を使用した改善 された変異の検出法を得ることである。 本発明の更なる目的は、変異の検出に有用なキットの提供である。 本発明の目的は、請求の範囲に記載の方法およびキットにより達成される。本 発明に従って、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの非変異配列から変異を検出 する方法は、ミスマッチ結合タンパク質を使用して得られる。本方法は： ａ）非変異および変異標的ポリヌクレオチドの提供、 ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチドの非変異および変異一本鎖からの二本鎖の形成 、 ｃ）一本鎖結合タンパク質のｂ）のポリヌクレオチドへの添加、 ｄ）ミスマッチ結合タンパク質の活性剤とのインキュベート、 ｅ）ｄ）のインキュベートしたミスマッチ結合タンパク質のｃ）のポリヌクレオ チドへの添加(それによりミスマッチ結合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド の一つの非変異および一つの変異一本鎖から形成された二本鎖に結合する)、 ｆ）標的ポリヌクレオチドに結合したミスマッチ結合タンパク質の存在の検出 を含む。 本発明の更なる態様にしたがって、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの非変 異配列から変異を検出するためのキットが達成される。キットは： ａ）一本鎖結合タンパク質、 ｂ）ミスマッチ結合タンパク質のための活性剤、 ｃ）ミスマッチ結合タンパク質、 ｄ）増幅プライマー、 ｅ）標的ポリヌクレオチドまたはミスマッチ結合タンパク質の結合のための固体 支持体 を含む。 本発明により、ミスマッチ結合タンパク質の非特異的結合が避けられることが 驚くべきことに判明した。ミスマッチ結合タンパク質の一本鎖への結合は、一本 鎖結合タンパク質により阻害される。サンプルへの添加前に、活性剤でミスマッ チ結合タンパク質を活性化することにより、ミスマッチを欠く二本鎖への結合が 行われない。 本発明の好ましい態様に従い、変異または非変異標的ポリヌクレオチドを段階 ｂ）で二本鎖を形成する前に固体支持体上に固定化する。最も好ましくは、非変 異標的ヌクレオチドを固定化する。あるいは、標的ポリヌクレオチドを段階ｂ） で二本鎖形成した後に固体化支持体に固定化するか、またはミスマッチ結合タン パク質を固体支持体に固定化し、標的ポリヌクレオチドの結合を検出する。更な る好ましい態様に従って、固体支持体はセンサーチップ表面である。ミスマッチ 結合タンパク質の存在を、次いで、無標識法で検出できる。このような方法の一 つは表面プラズモン共鳴(ＳＲＰ)である。ＳＰＲを基にした光学的バイオセンサ ーシステムがファルマシア・アクチエボラーグにより出願されたＷＯ９０／０５ ２９５に記載されている。この検出方法により、ゲル電気泳動または標識による 時間のかかる検出が避けられる。 本発明の第１段階において、標的ポリヌクレオチドのサンプル、即ち変異を有 するＤＮＡまたはＲＮＡの配列を非変異(野生型)ポリヌクレオチドサンプルと混 合する。サンプルがまだ一本鎖でない場合、サンプル混合物を変性して、ポリヌ クレオチドの一本鎖とし、次いで一本鎖を二本鎖に復元させる。次いで、ホモ二 本鎖およびヘテロ二本鎖が形成される。ホモ二本鎖は二つの非変異鎖または二つ の変異鎖の二本鎖である。ヘテロ二本鎖は一つの非変異および一つの変異鎖の二 本鎖である。本発明の一つの態様に従い、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを 本発明の第１段階の前に増幅できる。慣用の増幅法、特にＰＣＲによる増幅(Ｕ Ｓ４,６８３,１９５；ＵＳ４,６８３,２０２；ＵＳ４,８００,１５９参照)を使 用できる。 一つの好ましい態様において、一本鎖非変性ポリヌクレオチドをセンサーチッ プ表面に固定化し、ポリヌクレオチドの変異を含む疑いのあるサンプルを一本鎖 形で添加する。添加サンプルをセンサーチップ上のポリヌクレオチドとアニール させる。 次段階において、混合物に残っている一本鎖に結合する一本鎖結合タンパク質 を添加する。ミスマッチ結合タンパク質をこのように製造したサンプルに添加す る前に、ミスマッチ結合タンパク質を活性剤とインキュベートする。ミスマッチ 結合タンパク質を活性化することにより、ホモ二本鎖への結合が妨げられること が判明した。活性化ミスマッチ結合タンパク質をサンプル混合物に添加し、ヘテ ロ二本鎖に結合させる。次いで、結合したミスマッチタンパク質の存在を検出す る。 ポリヌクレオチドの固定化は、吸着、共有結合またはあるタイプの結合対のよ うな慣用法により行う。この結合対の一方はポリヌクレオチドに結合するか、ミ スマッチ結合タンパク質に結合し、他方は固体支持体上に適用する。このような 結合対の例はビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、システイン −チオール基、抗原−抗体、レクチン−糖である。キットの好ましい態様におい て、増幅プライマーまたはミスマッチ結合タンパク質は結合する結合対の一方を 有し、結合対の他方は固体支持体をコートする。 一本鎖にミスマッチタンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖 結合タンパク質(ＳＳＢ)は、当分野で既知の任意のＳＳＢである。好ましい化合 物は、一本鎖結合タンパク質(エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、アフリ カツメガエル由来)およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質 および他の種由来のその相当物である。 使用するミスマッチ結合タンパク質は、MutS、HexA、MSH1-6、Rep3、RNaseA、 ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼ 、ミスマッチに結合できるタンパク質の一つである。ミスマッチ結合タンパク質 をポリヌクレオチド二本鎖に添加する前に、タンパク質を活性剤で活性化する。 好ましくは活性剤はＡＴＰ(アデノシン５'−３リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５' −２リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５'−Ｏ−(３−チオ３リン酸))、ＡＭ Ｐ−ＰＮＰ(アデノシン５'−[β,γ−イミド]３リン酸)化合物またはミスマッチ 結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つである。ミスマッチ結合タンパ ク質のこの活性化により、非変異および変異サンプルの両方への非特異的結合が 避けれられることが判明した。活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤を 、室温で数秒から数分インキュベートすることにより行う。最後に、活性化タン パク質をポリヌクレオチド混合物に添加する。 結合したミスマッチタンパク質の検出は、当分野で使用される慣用法により行 うことができる。しかしながら、好ましくは、上記のように、そして引用して本 明細書に包含させるＷ０９０／０５２９５に従った光学バイオセンサーの使用で ある。光学バイオセンサーは、変異の検出の単純で簡単な方法を提供し、臨床適 用および診断スクリーニングのためのシステムの自動化を可能にする。このよう Biosensor AB，Uppsala，Sweden)である。 本発明を以下の非限定的実施例により説明する。部および％は、特記しない限 り、重量部および重量％を意味する。実施例において、結果を以下の意味を有す る図１−３に示す：図１Ａ：MutSの、二本鎖、非ミスマッチおよびミスマッチならびに一本鎖オリ ゴヌクレオチドの両方への結合のグラフである。結合は表面プラズモン共鳴(Ｓ ＰＲ)の共鳴単位の形で示す。MutSは図のＡで緩衝液はＢで添加する。 図１Ｂ：図１Ａと同じグラフであるが、MutSの一本鎖ＤＮＡへの結合が遮断さ れている場合である。 図２：本発明に従ったMutSの結合のグラフ。結合は図１Ａおよび１Ｂのように 示す。 図３：配列表の表２に示すような、異なる種類の誤対合に関するMutS結合量。実施例１ ： 二本鎖の固定化および形成 光学検出のためのセンサーチップを使用する。チップはガラス、プラスチック または他の透明材料の透明プレートを含む。このプレートはその表面の一方に金 属フィルムを備える。誘電性フィルムを金属フィルムに付ける。この表面にスト レプトアビジンをコートする。 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.３Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、ｐＨ８.０中で１μＭのN-rasのVal９からGly15(配列表のRB671A)の配列を有す るビオチニル化２０量体オリゴヌクレオチドを、流速５μｌ／分で、２５℃の温 度でセンサーチップ表面を流した。次いで、相補的配列(配列表の681C)または単 一のミスマッチ塩基(配列表の683C)を有する１μＭの２０量体オリゴヌクレオチ ド４５μｌを流速５μｌ／分で、２５℃で固定化オリゴヌクレオチド上を流し、 センサーチップ表面にハイブリダイゼーションにより二本鎖オリゴヌクレオチド を形成させた。後者の二本鎖オリゴヌクレオチドはＧ／Ｔ誤対合を有した。ハイ ブリダイゼーションのために、０.９Ｍ ＮａＣｌおよび９０ｍＭクエン酸ナト リウムを含む緩衝液を使用した。 公知技術でのミスマッチ検出 ５０ｍＭ Hepes−ＫＯＨ、ｐＨ７.２、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ Ａ、ｐＨ８.０、１ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む結合緩衝 液中の１００ｎＭ MutS(AmershamInternationalからのE．coli Mismatch Bindi ng Protein)を固定化相補的またはＧ／Ｔミスマッチ二本鎖オリゴヌクレオチド 上およびまた固定化一本鎖オリゴヌクレオチド上を、流速５μｌ／分で２５℃で 流した。 うに、MutSのＤＮＡへの結合を示すセンサーグラムの増加した曲線が、ミスマッ チ二本鎖ＤＮＡだけでなく、一本鎖ＤＮＡおよび相補的二本鎖ＤＮＡへの結合の ための相対的共鳴単位の増加を示す。実施例２ ： 二本鎖の固定化および形成は、実施例１と同じ方法で行った。 公知技術に従っているが、一本鎖結合タンパク質で修飾したミスマッチ検出 ０.００５％トゥイン２０を含む結合緩衝液中の５０μｇ／mlの一本鎖結合タ ンパク質(Pharmacia Biotech由来の分子量１９kDaのE．coli Single-Strand Bin ding Protein)を、固定化鎖を含むセンサーチップ上を流速５μｌ／分で２５℃ で流した。MutSを次いで上記と同じ方法で適用した。 MutSの結合を実施例１と同じ方法で検出した。得られたセンサーグラムは、一 本鎖結合タンパク質が明らかにMutSの一本鎖ＤＮＡへの結合を妨げることを示し た。しかしながら、MutSはまだミスマッチおよび非ミスマッチオリゴヌクレオチ ドには結合する、図１Ｂ参照。 実施例３： 二本鎖の固定化および形成を実施例１と同じ方法で行った。 本発明に従ったミスマッチ検出 一本鎖ＤＮＡの遮断を実施例２と同じ方法で行った。 MutSを５分、２５℃で使用前に２０ｍＭ ＡＴＰ存在下でインキュベートした 。ＡＴＰとインキュベートしたMutSを図１Ａと同じ方法で固定化オリゴヌクレオ チド上を流した。 実施例１と同じ方法の検出は、ＡＴＰと予めインキュベートしたMutSがミスマ ッチＤＮＡとのみ結合し、非ミスマッチＤＮＡとはしないことを示した、図２参 照 配列表中の全ての２０量体オリゴヌクレオチドおよび配列表の表２のような固 定化および交配での実施例は、全てのミスマッチが本発明の方法で検出されるこ とを示す、図３参照。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）非変異および変異標的ポリヌクレオチドの提供、 ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチドの非変異および変異一本鎖からの二本鎖の形成 、 ｃ）一本鎖結合タンパク質のｂ）のポリヌクレオチドへの添加、 ｄ）ミスマッチ結合タンパク質の活性剤とのインキュベート、 ｅ）ｄ）のインキュベートしたミスマッチ結合タンパク質のｃ）のポリヌクレオ チドへの添加(それによりミスマッチ結合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド の一つの非変異および一つの変異一本鎖から形成された二本鎖に結合する)、 ｆ）標的ポリヌクレオチドに結合したミスマッチ結合タンパク質の存在の検出 を含む、ミスマッチ結合タンパク質を使用することによる、サンプル中の標的ポ リヌクレオチドの非変異配列からの変異を検出する方法。 ２．段階ｂ）で二本鎖が形成される前に、変異または非変異標的ポリヌクレオ チドを固体支持体に固定化することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．段階ｂ）で二本鎖が形成された後に標的ポリヌクレオチドを固体支持体に 固定化することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ４．ミスマッチ結合タンパク質を固体支持体上に結合させ、二本鎖を挿入し、 標的ポリヌクレオチドの結合を検出することを特徴とする、請求項１記載の方法 。 ５．固体支持体がセンサーチップ表面である、請求項２から４のいずれかに記 載の方法。 ６．ミスマッチ結合タンパク質の存在を無標識法で検出することを特徴とする 、請求項５記載の方法。 ７．無標識法が表面プラズモン共鳴であることを特徴とする、請求項６記載の 方法。 ８．非変異標的ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化することを特徴とす る、請求項２記載の方法。 ９．ポリヌクレオチドを結合対により固定化し、結合対の一つのメンバーはポ リヌクレオチドに結合し、他のメンバーは固体支持体をカバーしていることを特 徴とする、請求項２、３または８のいずれかに記載の方法。 １０．ミスマッチ結合タンパク質を結合対により固定化し、結合対の一つのメ ンバーはミスマッチ結合タンパク質に結合し、結合対の他のメンバーは固体支持 体をカバーしていることを特徴とする、請求項４記載の方法。 １１．ミスマッチ結合タンパク質がMutS、HexA、MSH1-6、Rep3、RNaseA、ウラ シル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼの一 つであることを特徴とする、請求項１記載の方法。 １２．段階ｄ）の活性化剤が、化合物ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＭ Ｐ−ＰＮＰまたはミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つで あることを特徴とする、請求項１記載の方法。 １３．サンプル中の標的ポリヌクレオチドを段階ａ）の前に増幅することを特 徴とする、請求項１記載の方法。 １４． ａ）一本鎖結合タンパク質、 ｂ）ミスマッチ結合タンパク質のための活性剤、 ｃ）ミスマッチ結合タンパク質、 ｄ）増幅プライマー、 ｅ）標的ポリヌクレオチドまたはミスマッチ結合タンパク質の結合のための固体 支持体 を含む、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの非変異配列から変異を検出するた めのキット。 １５．増幅プライマーまたはミスマッチ結合タンパク質が結合する結合対の一 方を有し、結合対の他方が固体支持体をコートすることを特徴とする、請求項１ ４記載のキット。