CN110945142A - 通过聚合酶链式反应直接在原始样品中检测目标dna并通过高分辨熔解分析进行基因分型的方法 - Google Patents

通过聚合酶链式反应直接在原始样品中检测目标dna并通过高分辨熔解分析进行基因分型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过聚合酶链反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的方法。该方法包含稀释原始样品、通过先升高后降低的温度梯度处理稀释的原始样品、进行PCR扩增、然后进行HRM分析。该方法还包含监测在HRM分析过程中由于释放嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化。通过读取器分析信号变化，通过连接至读取器的图形界面获得分析结果，从而对原始样品中的目标DNA进行检测。

Description

通过聚合酶链式反应直接在原始样品中检测目标DNA并通过 高分辨熔解分析进行基因分型的方法
技术领域
本公开的实施方式涉及通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法。特别地，本公开的实施方式描述了用于检测导致性传播疾病的几种病原体（例如但不限于HR-HPV（高风险人乳头瘤病毒））的方法。
更详细地，本公开允许在一个多重测定中，直接从原始生物样品（包括例如阴道或宫颈粘液）中检测病原体DNA，而无需DNA提取步骤。
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于全世界诊断应用的可靠技术。PCR由在体外扩增特异性的核酸的引物延伸反应组成。该反应利用热稳定的DNA聚合酶，并且其是基于包括不同温度步骤在内的几个循环，可以进行DNA变性、引物退火和聚合酶介导的目标DNA的延伸。
PCR可以与能够嵌入双链DNA的荧光染料或荧光标记的DNA探针结合使用；用这种方法，新合成的扩增子产生的信号可以通过荧光采集被实时采集定量。
高分辨率熔解（HRM）是另外的PCR之后的分析步骤，其通过研究双链DNA的热变性进一步表征扩增子。这是通过分析升温范围通常在65℃至95℃内、荧光采集速率为0.1 ℃/sec或更小的扩增子解离（熔解）行为来实现的。
HRM已被用于诊断（例如能够在多态的等位基因中识别SNP的基因检测），并且其已被提议用于包括病原体检测在内的多种应用。
如今，HRM分析需要高纯度的提取的DNA：这将其应用主要限制在能够自动提取DNA的高输入量（high-income）环境中。特别地，HRM需要高纯度的提取的DNA，因为DNA制备污染会导致熔解曲线发生不可预测的失真。
此外，为了获得高特异性，HRM在需要目标专用引物和探针组的PCR反应中进行，而这些引物和探针组通常不是十分便宜的试剂。尽管如此，HRM对于低输入量（low-income）环境中的有益应用（如人类病原体的表征）仍具有巨大的未开发潜力。
事实上，确实需要提供能够被用于将HRM技术直接应用于原始样品中的方法，该方法不需要昂贵且费时的DNA提取步骤，并且无需使用昂贵的引物和探针对。
众所周知，HPV是全世界浸润性宫颈癌的必要原因。
该肿瘤是女性中最常见的肿瘤之一，全球超过500,000例1，并且其主要由高风险HPV（HR-HPV）基因型的持续感染决定；迄今为止，已发现大约有20种癌症相关HR-HPV，其中HPV16和HPV18最为常见（占所有浸润性宫颈癌的70%）2,3。有效的宫颈癌筛查项目降低了这种肿瘤的发病率和死亡率4；最初的筛查是通过Papanicolau试验（Pap试验）进行的，这是一种能够识别癌前细胞的细胞学试验，通过宫颈内刷收集宫颈标本后在显微镜载玻片上接种和染色后实现。
该技术具有很高的阳性预测值，但平均灵敏度差5，且阴性预测值低。
此外，使用宫颈内刷可能会带来痛苦和侵害，并且在心理上会限制部分群体进行检查，尤其是在出于社会和宗教原因而很少去妇科就诊的情况下。
鉴于HPV DNA试验的阴性预测值较高，目前的研究表明HPV DNA试验在预防浸润性宫颈癌方面比单独进行Pap试验筛查更为有效6-8。此外，鉴于不同的HR-HPV基因型之间癌症发展的阳性预测值的差异，HPV基因分型在宫颈癌和其他HPV相关的癌症（例如，肛门-生殖器的和口咽的肿瘤）中对HPV阳性患者进行分类是有用的9-13。它也可以区分暂时性感染与持续性感染，后者是癌症转化的真正危险因素。最后，基因分型试验可以是群体研究中用于疫苗监测和群体免疫的重要工具，用于评估接种疫苗和未接种疫苗群体中每种基因型的盛行率（prevalence）的变化14。
如今，最广泛的试验可以分为两类15：
1. 信号放大试验，如基于Hybrid Capture® 2（HC2，Qiagen）技术的Digene ®HPV测试，以及Cervista® HPVHR试验。HC2是基于13种标记的HR-HPV-特异性的RNA探针组与目标HPV DNA的杂交的一种非放射性的信号放大方法；DNA-RNA杂合物被与碱性磷酸酶偶联的特异性抗体识别并被吸附至微孔底部。通过化学发光信号测量的酶活性与目标DNA的量成正比。Cervista® HPV-HR试验采用基于荧光共振能量转移（FRET）的技术，其中每种HPV类型有两个探针；其能够检测到14种HR-HPV。
这些技术是定量的且假阳性率较低，但其不提供任何HPV基因分型的信息，并且其需要专用的仪器。
2. 核酸扩增试验，基于实时PCR方法；在这些试验中，COBAS 4800 HPV试验（罗氏公司（Roche）开发）是最广泛的，在全自动系统中采用几个引物对和探针对提供HPV16和HPV18的基因分型信息。该试验（如Qiagen’s）被认为是黄金标准，并且其具有非常高的灵敏度。
其他基于PCR的试验包括Papillocheck®（Greiner Bio-One），该试验能够通过DNA芯片上的28种探针对24种HPV进行检测和基因分型；PCR后，杂交在自动扫描和分析的微阵列芯片上进行。
线性阵列HPV基因分型（Roche）是一种基于PCR的试验，结合反向线点杂交，能够区分37种HPV；但是，该试验十分耗时，而且由于容易交叉杂交，其提供的结果是模棱两可的。Cepheid HPV是市场上唯一能够在即用型盒中直接使用PreservCyt样品，然后进行专用PCR循环的试验。
所有这些试验需要特殊的仪器，并且对于广泛应用不够便宜，尤其是在发展中国家。
PCR多重分析通常是一项棘手的分析，因为其使用了几种导致荧光非特异性扩增信号（例如来自引物二聚体形成的背景）的引物组。荧光标记的探针（例如Taqman探针，LifeTechnologies）能够限制这种情况，与不区分扩增子的嵌入染料相比，其确保更高的特异性。但是，荧光标记的探针更昂贵，影响试验的稳定性，并且分析需要一个以上的荧光检测器。
需要改进用于通过PCR检测目标DNA并通过HRM进行基因分型的方法，其克服了本领域中的至少一个缺点。
特别地，本公开的一个目的是通过PCR提供直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法，同时显著提高PCR性能的稳定性。
本公开的另一个目的是提供能够直接使用原始样品（例如阴道和宫颈粘液）工作的方法，从而提供相对于女性群体具有更好依从性的测试。
本公开的另一个目的是避免DNA提取，同时显著提高HRM性能的稳定性。
发明内容
根据实施方式，本公开提供了一种通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法。根据一个实施方式，该方法包括：
-提供要进行检测分析的原始样品；
-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中所述原始样品被稀释至蛋白质浓度为0.1 μg/μl至10 μg/μl；
-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；
-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于两种或更多种目标核酸的多重扩增方法的两对或更多对引物和一种扩增缓冲液，该扩增缓冲液包含并入双链扩增子中用于发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述经处理的稀释的原始样品进行HRM分析；
其中该方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中该方法进一步包含通过读取器分析信号变化并通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果来检测原始样品中的目标DNA。
根据另外的实施方式，提供了一种诊断试剂盒，其包含处理缓冲液和PCR反应混合物，其能够被用于对先前进行实时PCR的PCR反应混合物进行PCR扩增和随后的HRM分析。在一个实施方式中，处理缓冲液包含蛋白质消化酶，并且PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，该扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物。
根据又一个实施方式，本公开提供了一种通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM进行基因分型的仪器。在一个实施方式中，该仪器包括：
-包含蛋白质消化酶的处理缓冲液，用于稀释所述原始样品；
-加热/冷却装置，其被配置为根据先升高后降低的温度梯度对稀释的原始样品进行处理；
-一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，该扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-PCR扩增装置，其被配置为使用所述PCR反应混合物和经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-用于对先前进行PCR扩增的PCR反应混合物进行HRM分析的HRM设备；
其中PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物，
-监测装置，用于在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
-读取器，用于分析信号变化以检测原始样品中的目标DNA，从而能够通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果。
在有利的实施方式中，根据本公开的方法已经被成功应用于改善HPV DNA（宫颈癌的主要原因）的检测。
根据本公开，本文所描述的方法能够使用例如阴道和宫颈粘液来工作，女性能够没有侵入性和痛苦的容易地自我采集生物样品，而不是使用心理上抑制了部分女性群体进行测试的、可能带来痛苦和侵入性的宫颈内刷。
此外，本文所描述的方法可以直接用于原始样品：原始样品（例如阴道或宫颈粘液）简单的预处理后，被直接放入反应缓冲液中。与现有技术中已知的测试相反，本公开不需要提取DNA。样品可以是例如阴道或宫颈粘液，但也可以是普通的PreservCyt、ThinPrep（Hologic）或其他未处理的原始样品。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，能够被检测的目标DNA是病原体目标DNA。
另外，根据本公开，能够提供创新的、快速的且便宜的多重技术，能够在单个反应中使用特定的反应混合物和条件直接进行多种病原体（例如病毒）的PCR检测，特别是实时直接PCR。
本文所描述的实施方式允许通过直接分析原始样品的特异性的HRM分析检测例如HPV基因型。
有利地，本文描述的实施方式允许检测多达200种HPV类型，α-HPV、β-HPV、γ-HPV、Mu-HPV、包括以下高风险和低风险HPV类型的Nupapillomavirus：6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、64、66、67、68、69、70、71、72、73（MM9）、81、82（MM4）、83（MM7）、84（MM8）、IS39、CP6108。
病毒的基因组扩增反应能够与目标DNA上样对照（例如人β-珠蛋白基因）的扩增相偶联。有利地，根据本公开的方法能够用市场上存在的最普通的实时PCR机器来进行。
能够根据本公开检测的其他病原体包括例如除了HPV以外的导致性传播疾病的其他病原体，例如与梅毒感染有关的细菌Treponema pallidum亚种苍白螺旋体、与淋病感染有关的细菌Neisseria gonorrhoeae、与衣原体感染有关的细菌Chlamydia Trachomatis、以及整合的HIV1和HIV2病毒DNA。
根据本公开所描述的实施方式完全解决了现有技术的试验和方法的上述问题，并且进一步提供了至少以下优点：
-直接检测：本公开的实施方式描述了一种无需DNA提取步骤即可以直接对预处理过的原始样品（例如宫颈和阴道粘液、以及其他体液（例如唾液、血液、尿液）、活检组织、福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）组织细胞、细针穿刺活检组织或类似生物样品）进行分析和表征目标DNA的方法；
-可负担性：与前述现有技术的试验和方法相比，本公开的实施方式更便宜，因为它们不使用数十种昂贵的标记探针，而是使用独特的嵌入分子或化合物，例如嵌入染料；
-开放可及性和多功能性：本公开的实施方式能够由任何实时PCR机器进行，并且不需要量身定制的仪器；
-单通道：与使用超过一个通道的前述现有技术的试验和方法相反，本公开的实施方式的结果能够通过对单个信号（例如，荧光）通道的分析来提供。所选择的通道能够从嵌入在任何实时PCR机器中的那些通道中选择，并且这使得本发明的实施方式适合于任何实时PCR机器。
参考以下描述、附图和所附权利要求，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。并入且构成该说明书的一部分的附图被用于说明本发明的实施方式，与说明书一起用于解释本发明的原理。
在任何可能的情况下，可以单独地应用本公开中描述的各个方面和特征。这些单独的方面（例如所附从属权利要求中描述的方面和特征）能够成为分案专利申请的主题。
应当指出，在专利申请过程中如发现任何内容是已知的则应理解为不主张权利，而是放弃声明的主题。
附图说明
为了能够详细地理解本发明的上述特征的方式，可以通过参考实施方式对以上简要概述的本发明进行更具体的描述。附图涉及本公开的实施方式，并在下文中进行描述：
-图1是显示用根据本公开的处理缓冲液处理的样品（黑色曲线）和未经处理的样品（灰色曲线）的PCR扩增反应的扩增图的图；
-图2是显示根据本公开经处理的样品（黑色曲线）和未经处理的样品（灰色曲线）的HRM基因分型分析的熔解曲线图的图；
-图3显示了经处理的样品（泳道1）与未经处理样品（泳道2）的SDS-PAGE凝胶分析之后考马斯染色的结果；
-图4是显示根据本公开稀释的原始样品（黑色曲线）和未稀释的样品（灰色曲线）的PCR扩增反应的扩增曲线的图；
-图5是显示根据本公开稀释的原始样品（灰色曲线）和未稀释的样品（黑色曲线）的HRM基因分型分析的熔解曲线图的图；
-图6是显示使用具有根据本文所描述的实施方式的内切蛋白酶（黑色曲线）和无内切蛋白酶（灰色曲线）的处理缓冲液的PCR扩增反应的扩增图的图；
-图7是显示使用具有根据本文所描述的实施方式的内切蛋白酶（黑色曲线）和无内切蛋白酶（灰色曲线）的处理缓冲液的HRM基因分型分析的熔解曲线图的图；
-图8是显示使用根据本文所描述的实施方式的添加剂（黑色曲线）和无添加剂（灰色曲线）的PCR扩增反应的扩增曲线的图；
-图9是显示HRM基因分型分析的熔解曲线图的图，该分析通过使用经根据本公开的处理缓冲液处理原始样品（黑色曲线）和装入标准PCR反应混合物中未经根据本公开的处理缓冲液处理原始样品（灰色曲线）后通过PCR反应混合物扩增获得；
-图10分别图示地示出了根据本文所描述的实施方式的包括第一相和第二相的容器以及使用包括第一相和第二相的容器的组合方法的步骤。
具体实施方式
现在将使用附图详细介绍本发明的各种实施方式。通常，仅描述关于各个实施方式的差异。每个实施例都是提供用来解释本发明，并不意味着对本发明的限制。例如，作为一个实施方式的一部分示出或描述的特征能够被用于其他实施方式或与其他实施方式结合以产生另一个实施方式。本发明旨在包括这样的修改和变化。
在描述这些实施方式之前，还应明确，本说明书的应用不限于如以下说明书中使用附图所描述的部分的构造和布置的细节。本描述能够提供其他实施方式并且能够以各种其他方式获得或执行。还应明确的是，本文使用的措词和术语仅出于描述目的，不能视为限制性的。
除非另有说明，否则所有示出的百分数和比例均指总组合物的重量（例如示出为％ w/w）。除非另有说明，否则所有测量均在25℃和大气压下进行。除非另有说明，否则所有温度均以摄氏度为单位。
本文报告的所有范围应理解为包括极限值，包括报告的两个值“之间”的间隔值。此外，本文报告的所有范围应理解为包括并描述其中包括的精确值，以及所有子间隔。此外，所有范围旨在使得最终组成中包含在其中的值的总和为100％，特别是考虑到本领域技术人员将知道如何选择范围的值使得总和不超过100％。
在提供数值范围的情况下，应理解为，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该范围之内的任何其他所述值或中间值都包括在本发明内，除非上下文中另有明确规定，否则至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。当所述范围包括一个或两个极限值时，排除那些所包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也能够被用于本发明的实践或试验，现在描述具有代表性的说明性方法和材料。
对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与其他几个实施方式中的任何一个的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。另外，对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神和范围的情况下，根据本文的教导可以对其进行某些改变和修改。任何所述的方法可以按照所述的事件的顺序或在逻辑上可能的任何其他顺序进行。
如同每个单独的出版物或专利被明确地和单独地指出通过引用并入本文一样，本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，并通过引用并入本文来公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。当该出版物列出的术语的定义与本公开的明确的或暗含的定义相冲突时，以本公开的定义为准。任何出版物的引用是由于其在申请日之前公开，并且不应该被解释为承认本发明由于在先发明而无权早于该出版物。此外，提供的公开日期可能与实际公开日期有所不同，实际公开日期可能需要独立确认。
本公开的实施方式大体上涉及一种在直接对原始样品进行PCR扩增和HRM分析之前使用处理缓冲液对其进行预处理和稀释的方法。
有利地，样品可以是阴道或宫颈粘液、其他体液、唾液、血液、尿液、活检组织、福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE）组织细胞、细针穿刺活检组织或类似的生物样品。
本公开的方法能够通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型。在一个实施方式中，该方法包括：
-提供要进行检测分析的原始样品；
-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中将原始样品稀释至蛋白质浓度为0.1 μg/μl至10 μg/μl；
-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；
-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，该扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并最终发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述经处理的稀释的原始样品进行HRM分析；
其中该方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中该方法进一步包含通过读取器分析信号变化并通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果检测目标DNA。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，能够被检测的目标DNA是病原体目标DNA。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，可在读取器中包含的电路中检测输入信号和输出信号之间的信号变化，其中所述变化是样品中存在的目标DNA（例如病原体目标DNA）的存在和类型的函数。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，蛋白质消化酶可以选自：内切蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和内肽酶。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，处理缓冲液进一步包括水解酶。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，处理缓冲液进一步包括pH稳定剂。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的可能的实施方式，处理缓冲液进一步包括防腐剂。
根据可能的实施方式，可以用专用生物样品收集器收集原始样品，并且处理缓冲液可以被嵌入收集器内部。
用处理缓冲液进行完整的预处理对于获得良好的扩增图，降低扩增信号的荧光背景以及增加HRM分析熔解峰的荧光强度至关重要；这些是提高诊断的灵敏度、特异性和分析的准确性的基本特征。特别地，在嵌入分子或化合物是嵌入荧光染料的情况下，在没有处理缓冲液处理的情况下测得的初始的高荧光背景是由于生物基质的复杂性造成的，其中蛋白质（粘液的情况下为粘蛋白）与其他生物成分一起捕获荧光染料导致高荧光背景。用根据本发明的处理缓冲液处理具有关键作用，其降低了原始样品的生物学复杂性并避免了能够保留干扰PCR反应和HRM分析的荧光染料的结构。图1的图显示了缓冲液P处理对最终PCR扩增反应的影响。与用黑色曲线表示的经处理的样品相比，灰色扩增图显示了高的初始荧光背景。图2的图显示了处理缓冲液处理对最终HRM基因分型分析的影响。与用黑色曲线表示的经处理的样品相比，灰色熔解曲线具有较低的荧光熔解峰。
通过SDS-PAGE凝胶分析之后考马斯染色观察到了阴道粘液蛋白质含量的不同模式（见图3）；泳道1显示了在使用多步温度梯度的情况下，用根据本公开的处理缓冲液处理对阴道粘液的作用。泳道2含有未经处理的阴道粘液。该组显示，用根据本公开的处理缓冲液进行的预处理能够降低影响样品蛋白质基质的原始样品（在这种情况下为阴道粘液）的生物学复杂性。
根据可能的实施方式，用于收集原始样品（例如阴道或宫颈粘液）的生物收集器可以悬浮在根据本公开的处理缓冲液中，以实现正确的和所需的样品稀释。
根据本公开，例如从生物收集器的再悬浮液中获得的原始样品的最终稀释对于分析结果至关重要。如上所述，在最终稀释中，有利地蛋白质浓度为0.1 μg/μl至10 μg/μl。
图4的图显示了原始样品稀释对最终PCR扩增反应的影响。与用黑色曲线表示的根据本公开的正确的稀释样品相比，灰色扩增图（非稀释样品）具有高的初始荧光背景。
图5的图显示了原始样品稀释对最终HRM基因分型分析的影响。与用灰色曲线表示的正确的稀释样品相比，黑色熔解曲线（非稀释样品）具有较低的荧光熔解峰。
根据本公开，稀释的原始样品的处理发生在至少包含蛋白质消化酶，并且可能包含水解酶、pH稳定剂、防腐剂的处理缓冲液中，通过多步过程进行温度升高，其中温度先升高然后降低。特别地，首先例如以两步加热的方式对处理缓冲液中的稀释的原始样品加热，然后例如在单步冷却中冷却。
在可能的实施方式中，可以使用加热/冷却装置，其被配置为对稀释的原始样品进行先升高后降低的温度梯度。如将在下文中更详细地描述的，加热/冷却装置可以是包括或嵌入这种加热/冷却装置的PCR扩增装置或机器、热循环仪、用于PCR反应的热循环仪等。在可能的实施方式中，可以例如通过使用特定的Peltier单元或模块来获得冷却。根据可能的实施方式，温度的上升包括：
-第一孵育步骤，在25 ℃至70 ℃的温度范围内进行5至60分钟，优选50 ℃至60 ℃，
-第二孵育步骤，在90 ℃至100 ℃的温度范围内进行5至60分钟，
-第三孵育步骤，在0 ℃至10 ℃的温度范围内进行5至60分钟。
有利地，处理缓冲液中所含的蛋白质消化酶对于获得有效的PCR扩增和清晰的熔解分析至关重要，避免了过多的荧光背景会影响最终结果的灵敏度、特异性和准确性。
图6的图显示了蛋白质消化酶（例如内切蛋白酶）对最终PCR扩增图的影响。与用包括用黑色曲线表示的内切蛋白酶的处理缓冲液处理过的样品相比，灰色扩增图（无内切蛋白酶的处理缓冲液）具有更高的荧光背景。
图7的图显示了蛋白质消化酶（例如内切蛋白酶）对最终HRM基因分型分析的影响。与用包括用黑色曲线表示的内切蛋白酶的处理缓冲液处理过的样品相比，灰色熔解曲线（无内切蛋白酶的处理缓冲液）具有较低的荧光熔解峰。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增包括使用所述PCR反应混合物扩增纯化的目标核酸以产生扩增子或扩增产物。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，扩增引物与目标核酸充分互补以与其杂交并触发聚合酶介导的合成。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，PCR反应混合物包含扩增引物和扩增缓冲液。
根据实施方式，扩增缓冲液被包含在作为本公开的一部分的诊断试剂盒中。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的一个实施方式中，PCR反应混合物进一步包含DNA聚合酶。DNA聚合酶被包含在所述扩增缓冲液中。DNA聚合酶是一种聚合新DNA链的酶。例如，能够使用耐热或热稳定的聚合酶，因为它更可能在高温DNA变性过程中保持完整。能够在本文所描述的实施方式中使用的耐热或热稳定的聚合酶的一个实施例是taq聚合酶。此外，能与本文所描述的实施方式结合使用的聚合酶是热启动聚合酶。在可能的实施方式中，热启动聚合酶可以是（Hot Start）@Taq DNA Euroclone、（Hot Start）PhireThermo Scientific、（Hot Start）Phusion Thermo Scientific或（Hot Start）Gold Taq聚合酶Sigma。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含脱氧核苷三磷酸（dNTP）或类似物。dNTP或类似物被包含在所述扩增缓冲液中。dNTP或类似物被用来为DNA聚合酶合成新的DNA链提供构建基础。dNTP可被功能类似物（如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、酪氨酸、尿嘧啶、乳清苷、肌苷、黄苷酸或其他）代替。
如上所述，PCR反应混合物包含并入双链扩增子或扩增产物中并发射荧光或任何可检测信号的所述嵌入分子或化合物。嵌入分子或化合物可被包含在所述扩增缓冲液中。
特别地，根据实施方式，嵌入分子可以是发射能够被读取器检测到信号的任何传感分子或报告分子，该读取器在电导测定的、电流测定的、伏安法的检测或特定波长的光存在的情况下、在荧光/化学发光检测或光散射和/或折射/衍射现象的情况下、在等离子体光学探测的情况下分析电感、电流、电势的电信号变化。
例如，在一些实施方式中，嵌入分子或化合物可以是发射荧光的嵌入染料。根据可能的实施方式，最终浓度为1至8 µM的特异性DNA嵌入染料是以下染料中的一种或多种：SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-64、SYTO-82、YO-PRO-1、SYTO-60、SYTO-62、TOTO-3、POPO-3、BOBO-3、阿霉素缀合的量子点纳米粒子或类似物。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含缓冲溶液。缓冲溶液被包含在所述扩增缓冲液中。缓冲溶液为DNA聚合酶的最佳活性和稳定性提供了合适的化学环境。例如，缓冲溶液可以包含水（特别是去离子水）、TrisHCl和/或KCl、以及在某些情况下可能包含的MgCl2。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含pH稳定剂。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含防腐剂。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含水。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含一价或二价阳离子的来源。一价或二价阳离子的来源被包含在所述扩增缓冲液中。例如，可使用含有一价离子或二价离子的氯化物。作为一价阳离子的来源，可使用钾离子。K+可从钾盐（如氯化钾，特别是浓度约为0.1 M的氯化钾）中获得。作为二价阳离子的来源，可使用镁或锰离子。Mg2+可从镁盐（例如氯化镁）中获得。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含牛血清白蛋白（BSA）。BSA被包含在所述扩增缓冲液中。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物还包含一种或多种去污剂。在可能的实施方式中，所述去污剂可以是浓度约为0.5％的Nonidet-P40。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的另一个实施方式中，PCR反应混合物可以进一步包含添加剂。添加剂可被包含在上述扩增缓冲液的一些实施方式中。在可能的实施方式中，能够被使用的添加剂选自以下添加剂中的一种、多种或所有：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。有利地，在利用荧光检测的实施方式中，添加剂的存在对于避免高的基础荧光背景是重要的，从而可实现增加诊断灵敏度、特异性和准确性（参见图1和8）。在一些可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含明胶，例如浓度为约0.1％。在其他可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含增强剂。例如，增强剂可以是浓度为约0.42 M的L-肉碱。在其他可能的实施方式中，添加剂可以进一步包含糖醇，例如浓度为约25 mM的山梨糖醇。
根据本文所描述的实施方式的添加剂的使用有利于避免PCR反应中的高的基础荧光背景，从而可实现增加诊断灵敏度、特异性和准确性。图8的图显示了根据本文所描述的可能实施方式的添加剂对最终PCR扩增图的影响。与使用含有添加剂的PCR扩增缓冲液（灰色曲线）进行的扩增相比，黑色扩增图（不含添加剂的PCR扩增缓冲液）具有更高的初始荧光背景。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，使用所述PCR反应混合物扩增纯化的目标核酸，以产生扩增子或扩增产物，所述扩增包括通过进行升温步骤而进行热循环。在一种可能的实施方式中，升温包括进行以下温度步骤：
·在95-98 ℃的范围内变性1至30秒；
·在50 ℃至70 ℃的范围内退火1至60秒；
·在60 ℃至75 ℃的范围内延伸0秒到5分钟。
在可能的实施方式中，热循环的循环数为至少30个循环，例如在30至50个循环之间。一个可能的实施例是35个循环。
在一种可能的实施方式中，可使用热启动聚合酶。热启动PCR通过在较低温度下使聚合酶失活（例如通过抗体相互作用、化学修饰或适体技术）来避免DNA的非特异性扩增。通常，特异性抑制剂（例如基于适体的抑制剂或特异性抗体）可被用于在较低温度下阻断聚合酶。如果使用热启动聚合酶，则进行从95 ℃至98 ℃持续1秒到10分钟的初始孵育步骤。该初始孵育步骤对于激活聚合酶是必需的。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，该方法包括在PCR扩增的热循环过程中，监测发射信号（例如荧光）的变化，该变化是由于嵌入分子或化合物（即嵌入染料）的释放，温度诱导的双链扩增子或扩增产物变性为两个单链DNA而产生的。嵌入分子或化合物与双链构型的DNA结合。扩增子在每个扩增循环中产生，其中嵌入分子或化合物在延伸步骤中结合，信号（例如荧光）在此过程中被获取。
有利地，PCR反应可在实时PCR机器中进行，该实时PCR机器可以检测PCR扩增中每个扩增循环发射的信号（例如荧光）的变化，进而可以定量扩增子的存在，因此可以定量扩增阶段的病毒DNA。
在其他实施方式中，PCR扩增可以在能够以每0.1℃/秒（或更低）获取所述信号发射的热循环机器中进行。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，进行HRM分析包括对先前进行PCR扩增的PCR反应混合物进行升温。在一个可能的实施方式中，升温包括进行以下温度步骤：
·在95 ℃孵育1秒至60秒
·在60 ℃孵育1秒至2分钟
·以0.1 ℃/秒或更低的速率升温至95 ℃，并进行所述发射信号（例如荧光）变化的监测，该变化是由于嵌入分子或化合物（即嵌入染料）的释放，温度诱导的双链扩增子或扩增产物变性为两个单链DNA产生的。
根据如上所述的本公开的方法允许通过直接从原始样品中扩增DNA的HRM分析对不同病原体进行基因分型。相反地，常规的PCR系统和方法不允许在没有提取DNA的情况下获得清晰的熔解曲线。图9的图显示了根据本公开的方法（黑色曲线）和不经过处理缓冲液处理的现有技术的标准PCR缓冲液（灰色曲线）直接从原始样品进行PCR获得的溶解曲线之间的比较。黑色熔解曲线能够清楚地区分单个熔解峰，从而容易地对病原体进行基因分型。灰线是使用标准直接PCR系统获得的；可能会注意到的是其荧光背景非常高，并且没有单个的、清晰的高的熔融峰。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的实施方式，PCR扩增能在例如PCR热循环仪中进行。这种PCR热循环仪可包含、包括或整合加热/冷却装置，用于用上述处理缓冲液对原始样品进行处理。
根据能与本文所描述的所有实施方式结合的另外的实施方式，PCR扩增通常能在实时PCR机器中进行。
根据本公开，由于首先对同一样品进行PCR扩增然后进行HRM分析，所以整个方法能够在单个仪器（特别是实时PCR机器）中进行。
根据可能的实施方式，PCR扩增和检测可在本领域已知的任何设备中通过实时PCR同时进行，包括可以评估被感染的样品中的病原体的定量实时PCR，然后在同一实时PCR机器中进行HRM分析。
然而，在其他实施方式中，这两个操作（即PCR扩增和HRM分析）也能够在彼此相连或相关的单独的且不同的仪器中进行，例如用于PCR扩增的典型的热循环仪和配置用于HRM分析的实时PCR。
例如，在可能的实施方式中，可使用也是便携式的专用PCR设备进行检测，该设备含有与荧光读取器或其他合适的读取设备相结合的特定的Peltier模块，能够进行HRM分析。
在另外的实施方式中，经由PCR扩增的所述检测可使用专用PCR设备进行，该专用PCR设备含有例如与不同于荧光读出设备的读出设备相结合的特定的Peltier模块，例如化学发光或电化学读出设备，电导测定的、电流测定的、伏安法的读出设备，等离子体光学红外设备或任何其他合适的读出设备。
根据可能的实施方式，PCR反应可使用能够在其中容纳原始样品的具有封闭盖的容器或微孔的板进行。在可能的实施方式中，可以在将原始样品放置在所述容器中之前使用上述处理缓冲液对其进行处理，或者替代性的可以将原始样品直接放置在用于PCR反应的容器中并在其中用上述处理缓冲液进行处理。
在能与本文所描述的所有实施方式结合的，使用图10和11描述的其他实施方式中，可以将处理缓冲液和PCR混合物或扩增缓冲液放置在用于PCR反应的容器的不同区域或分开放置在该容器的隔室中，以便使用根据本公开的处理缓冲液对原始样品进行稀释并在其中处理，然后在组合的方法中使用同一容器进行PCR扩增，该方法主要包括用蛋白质消化酶处理样品的第一步和进行PCR扩增的第二步。
例如，处理缓冲液和PCR混合物或扩增缓冲液可以通过不同的物质状态来表征，并直接置于用于PCR反应的容器内。
特别地，在可能的实施方式中，容器可以包含第一相和第二相或上相。
在图10中，数字12表示感兴趣的样品，数字14表示含有DNA聚合酶的第一相，数字15表示容器，数字16表示含有处理缓冲液的第二相。
如图10的上图所示，第一相14可位于容器15的底部，并且可以是固体、半固体或凝胶状（即凝胶）。PCR混合物或扩增缓冲液被包含在所述第一相14中。
在该实施方式中，第一相14的固体/半固体/胶凝状态可以通过在层中使用多糖聚合物材料（例如琼脂糖）或作为稀释剂并在其中包括聚合酶或通过使用气泡层来获得；可选择地，聚合酶可被包埋在微珠中，例如琼脂糖微珠或藻酸盐微珠。
第二相或上层相16被设置在第一相14上或上方，并且是液态的（例如水状的）。处理缓冲液被包含在所述第二相16中。
因此，在这些实施方式中，使用处理缓冲液的预处理、PCR反应和之后HRM分析在同一容器15中进行。有利地，在可能的实施方式中，可以根据以下方案使用相同的特定容器15来进行这三个操作，包含使用蛋白质消化酶处理样品的第一步和PCR扩增的第二步：
·第一孵育步骤，在50 ℃至70 ℃的温度范围内进行5至60分钟；
·第二孵育步骤，在90 ℃至100 ℃的温度范围内进行5至60分钟，
·第三孵育步骤，在0 ℃至10 ℃的温度范围内进行5至60分钟；
·在95 ℃到98 ℃的温度范围了孵育5秒至10分钟（如果使用热启动聚合酶）
·热循环，例如进行以下步骤至少30个循环：
-在95-98 ℃的范围内变性5至30秒；
-在50 ℃至70 ℃的范围内退火1至60秒；
-在70 ℃至75 ℃的范围内延伸1秒到5分钟；
·在95 ℃孵育5秒至60秒；
·在60 ℃孵育30秒至2分钟；
·以0.1 ℃/秒或更低的速率升温至95 ℃。
根据这样的实施方式，在容器15中存在的第一相14的PCR混合物或扩增缓冲液在预处理期间被包含处理缓冲液的第二相16有利地保护，由于如上所述加热导致两相的状态变化，在预处理结束时，PCR混合物或扩增缓冲液的含量依次释放。
具体地，如图10中的第二个图所示，在第一步中，将样品12装入容器15中，并因此用第二相16的处理缓冲液进行处理。在组合方法的第一步中，在液态的第二相16中，样品12的蛋白质被蛋白质消化酶（例如内切蛋白酶）（字母A表示）降解为完整的蛋白质样品（字母C表示），以便释放DNA模板（由字母B表示）。第一次孵育的温度范围为50 ℃至70 ℃（例如56℃），该温度范围对于蛋白质消化酶的最大持续合成能力（即酶催化连续反应而不释放其底物的能力）是有利的和最佳的。同时，保护固体/半固体/凝胶状的第一相14内部的DNA聚合酶免于降解。
在第二步中，如图10中下面的图所示，将温度从95升高到98 ℃导致蛋白质消化酶的变性，例如在孵育用来热启动聚合酶激活的情况下。同时，由于温度升高，第一相12从固相/半固相/凝胶相变为液相，例如热启动聚合酶可被激活。在这种温度下蛋白质消化酶的变性避免聚合酶降解（A），并通过PCR反应方案（B）激活扩增DNA模板的聚合酶。
本文描述的实施方式能够被用于诊断目的。具体地，在下文中，描述了存在于PCR反应混合物的两种可能的实施方式和处理缓冲液中的试剂的具体范围，其能够被用于诊断目的。随后，描述了能够被用于HPV DNA的特异性检测的具体范围。
特别地，根据本公开的含有上述处理缓冲液和PCR反应混合物的方法和诊断试剂盒能够被用于检测样品中存在的临床病原体，优选血源性病原体，包括其遗传序列。
在一个实施方式中，用于诊断目的的处理缓冲液包含蛋白酶K和TrisHCl缓冲溶液。例如，处理缓冲液的一种具体的实施方式包含：
a）蛋白酶K（1 mg/mL至1 μg/mL之间）；
b）TrisHCl缓冲溶液（1 M至10 mM之间； pH在7.0至10.0之间）。
在一个实施方式中，用于诊断目的的可能的第一扩增缓冲液包含dNTP、单价或二价阳离子的来源、缓冲溶液、BSA、热启动DNA聚合酶、嵌入分子或化合物。例如，第一扩增缓冲液的一种具体实施方式包含：
a） dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.3 mM）
b） MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：6.00至10.00）
d） KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e） BSA（最终浓度范围：0.005至0.05 mg/ml）
f） 热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
在另一个可能的实施方式中，提供了用于诊断目的的可能的替代性第二扩增缓冲液，其包括dNTP、单价或二价阳离子的来源、缓冲溶液、BSA、热启动DNA聚合酶、嵌入分子或化合物和上述添加剂。通过添加添加剂，第二扩增缓冲液能够被用作PCR增强缓冲液，如上所述，其提供增加的诊断灵敏度、特异性和准确性。例如，替代性第二扩增缓冲液的一种具体实施方式包含：
a） dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.5 mM）
b） MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：6.00至10.00）
d） KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e） BSA（最终浓度范围：0.005至0.05 mg/ml）
f） 热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）
h） TMAC（四甲基氯化铵）（最终浓度范围：10 mM至100 mM）
i） 乙酰胺（最终浓度范围：0％至5％）
j） 甲酰胺（最终浓度范围：0％至5％）
k） 甜菜碱（最终浓度范围：0 µM至5 M）
l） 明胶（最终浓度范围：0.01 mg/ml至1 mg/ml）。
在本文所述的用于诊断目的的方法和诊断试剂盒的实施方式中，由于不同的PCR机器（即不同的热循环仪模式）可能会产生不同的曲线（尤其是不同的熔解峰），因此提供了一种将每个实时PCR机器设置为对病原体进行基因分型所需的正确和精确的熔解分析的校准物。
实际上，由于机器类型不同、因维护状态导致的效率不同、或采集设置不同，可能会发生一些变化，校准物允许在特定的机器中调整观察到的测量值。校准物可以由合成的寡核苷酸组成，所述合成的寡核苷酸对应于由根据本公开的PCR反应混合物的特异性引物产生的扩增子。有利地，机器特异性的校准物可被定期放入PCR循环中来检查特定的热循环仪机器的扩增子的有效熔解温度，并将其与预期的熔解温度进行比较。
在下文中，描述了根据本公开的方法和诊断试剂盒的实施方式，其使用特异性引物用于HPV诊断的特定用途。
在一个实施方式中，本公开的方法和诊断试剂盒被用于检测临床样品中的人乳头瘤病毒DNA，并通过HRM分析来区分不同的基因型。
在一个实施方式中，例如在阴道粘液样品、或PreservCyt样品（或类似样品）、或宫颈拭子、或活检样本、福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）组织或唾液、或尿液或类似生物样品的情况下，一种用于HPV诊断的特定的处理缓冲液至少包含以下组分：
-蛋白酶K（1 mg/mL至1 μg/mL之间）
- TrisHCl缓冲溶液（1 M至10 mM之间； pH在7.0至10.0之间）。
用于HPV诊断的该处理缓冲液的试剂可能的特定浓度值的一个实施例如下：
-最终浓度为500 µg/mL的蛋白酶K；
-最终浓度为150 mM和pH为9.0的TrisHCl缓冲溶液。
在一个实施方式中，用于HPV诊断的特异性扩增缓冲液包含以下试剂，其浓度以范围表示：
a） dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.5 mM）
b） MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：7.00至10.00）
d） KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e） BSA（最终浓度范围：0.005 mg/ml至0.05 mg/ml）
f） 热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
试剂的可能的具体浓度值的一个实施例如下：
a） dNTP（最终浓度0.2 mM）
b） MgCl2（最终浓度0.75 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度30 mM；并且pH为9.0）
d） KCl（最终浓度50 mM）
e）牛血清白蛋白（最终浓度10 µg/ml）
f）热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度4 μM）。
在另一个可能的实施方式中，用于HPV诊断的另一种替代性的可能的具体扩增缓冲液提供更高的诊断灵敏度、特异性和准确性，包含以下试剂，其浓度以范围表示：
a） dNTP（最终浓度范围：0.05 mM至0.3 mM）
b） MgCl2（最终浓度范围：0.3 mM至4 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度范围：10 mM至50 mM；pH：7.00至10.00）
d） KCl（最终浓度范围：10 mM至50 mM）
e） BSA（最终浓度范围：0.005 mg/ml至0.05 mg/ml）
f）热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度范围：1 μM至8 μΜ）。
h） TMAC（四甲基氯化铵）（最终浓度范围：10 mM至100 mM）
i） 乙酰胺（最终浓度范围：0.5％至5％）
j） 甲酰胺（最终浓度范围：0.5％至5％）
k） 甜菜碱（最终浓度范围：100 µM至5 M）
l） 明胶（最终浓度范围：0.01 mg/ml至1 mg/ml）。该替代性的扩增缓冲液的试剂的可能的特定浓度值的一个实施例如下：
a） dNTP（最终浓度0.15 mM）
b） MgCl2（最终浓度0.75 mM）
c） TrisHCl缓冲溶液（最终浓度30 mM；pH为9）
d） KCl（最终浓度40 mM）
e） BSA（最终浓度10 µg/ml）
f） 热启动聚合酶
g） SYTO-9（最终浓度1 μΜ）
h） TMAC（四甲基氯化铵，最终浓度75 mM）
i） 乙酰胺（最终浓度3％）
j） 甲酰胺（最终浓度1.5％）
k） 甜菜碱（最终浓度0.5 M）
l） 明胶（最终浓度0.1 mg/ml）。
有利地，基于本文所描述的实施方式的诊断性HPV试验可提供至少一个重要的诊断信息，例如用于HPV诊断或其他性传播疾病，例如衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。 例如，对于HPV诊断，通过PCR获得的扩增曲线允许检测前14种高风险基因型（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、以及68 – Cit. IARC 2009），并提供诊断信息。当扩增曲线出现在35个PCR循环之前，且荧光阈值范围为250.000至400.000时，样品为阳性。本发明已在阳性样品（根据Mejer指导方针（2009）提取了200多名具有CIN2+ 细胞学特征的HPV阳性的女性的DNA）上进行了测试。临床数据显示，根据本文所描述的实施方式的诊断性HPV试验的灵敏度为98％，其旨在作为检测高度鳞状上皮内病变（HSIL或CIN2/3病变，其在HPV诊断中被认为是临床终点）的灵敏度。灵敏度是通过根据本文所描述的实施方式的HPV试验检测到的被诊断为HSIL的HPV感染者除以通过常规试验（例如，Pap试验）检测出的被诊断为HSIL的HPV感染者的总数所得的百分数。测试特异性几乎达到100％，测试准确度在0.93至0.98之间。
* * *
尽管前述内容针对本发明的实施方式，但是在不脱离本发明的基本范围的情况下可以设计本发明的其他和进一步的实施方式，且本发明的范围由所附权利要求书确定。
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Claims (30)

1.一种通过聚合酶链式反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的方法，所述方法包含：
-提供要进行检测分析的原始样品；
-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中将所述原始样品稀释至蛋白质浓度为0.1 μg/μl至10 μg/μl；
-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；
-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，所述扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述经处理的稀释的原始样品进行HRM分析；
其中所述方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中所述方法进一步包含通过读取器分析信号变化并通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果来检测原始样品中的目标DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品，包含进行以下温度步骤：
-第一孵育步骤，在25 ℃至70 ℃的温度范围内进行5至60分钟，
-第二孵育步骤，在90 ℃至100 ℃的温度范围内进行5至60分钟，
-第三孵育步骤，在0 ℃至10 ℃的温度范围内进行5至60分钟。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质消化酶选自：内切蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和内肽酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质消化酶是蛋白酶K，并且所述蛋白质消化酶在所述处理缓冲液中的浓度为1 mg/mL至1 μg/mL。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液包含TrisHCl缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述TrisHCl缓冲溶液的浓度为1 M至10 mM，并且pH为7.0至10.0。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含水解酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含pH稳定剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含防腐剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中PCR反应混合物的扩增缓冲液进一步包含选自以下添加剂中的一种、多种或所有添加剂：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中提供了用于进行PCR反应的容器（15），所述原始样品被包含在所述容器（15）中，其中所述容器（15）的第一区域含有包含所述PCR混合物或扩增缓冲液的第一相（14），所述第一相（14）是固体、半固体或凝胶，其中在所述第一区域上或上方具有所述容器（15）的第二区域，该第二区域含有包含所述处理缓冲液的第二相或上相（16），所述第二相或上相（16）是液体，其中使用所述处理缓冲液稀释所述原始样品以及通过进行温度梯度处理稀释的原始样品都发生在第二区域中，并且PCR反应及然后进行的HRM分析在同一所述容器（15）中的第一区域中进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中PCR扩增是实时PCR。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增在热循环仪或实时PCR热循环仪中进行，其中，当所述PCR扩增在热循环仪中进行时，HRM分析在单独的实时PCR热循环仪中进行，而当所述PCR扩增在实时PCR热循环仪中进行时，HRM分析在同一实时PCR热循环仪中进行。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述目标DNA是病原体目标DNA，其中所述病原体是导致性传播疾病或感染的病原体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病原体是人乳头瘤病毒（HPV）。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述病原体是选自导致以下感染的病原体：衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。
17.一种通过聚合酶链式反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包含用于进行PCR扩增和随后对先前进行实时PCR的PCR反应混合物进行的HRM分析的处理缓冲液和聚合酶链式反应（PCR）反应混合物，其中所述处理缓冲液包含蛋白质消化酶，并且其中所述PCR反应混合物进一步包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，所述扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物。
18.根据权利要求17所述的诊断试剂盒，其中所述蛋白质消化酶选自：内切蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和内肽酶。
19.根据权利要求17或18所述的诊断试剂盒，其中所述蛋白质消化酶是蛋白酶K，并且所述蛋白质消化酶在所述处理缓冲液中的浓度为1 mg/mL至1 μg/mL。
20.根据权利要求18或19所述的诊断试剂盒，其中所述处理缓冲液包含TrisHCl缓冲溶液。
21.根据权利要求20所述的诊断试剂盒，其中所述TrisHCl缓冲溶液的浓度为1 M至10mM，并且pH为7.0至10.0。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述处理缓冲液进一步包括水解酶。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述处理缓冲液进一步包括pH稳定剂。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述处理缓冲液进一步包含防腐剂。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述扩增缓冲液进一步包含选自以下添加剂中的一种、多种或所有添加剂：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述诊断试剂盒包含用于进行PCR反应的容器（15），所述容器（15）适合含有所述原始样品，其中所述容器（15）的第一区域含有包含所述PCR混合物或扩增缓冲液的第一相（14），所述第一相（14）是固体、半固体或凝胶，其中在所述第一区域上或上方具有所述容器（15）的第二区域，该第二区域含有包含所述处理缓冲液的第二相或上相（16），所述第二相或上相（16）是液体。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的诊断试剂盒，其中目标DNA是病原体目标DNA，其中所述病原体是导致性传播疾病或感染的病原体。
28.根据权利要求27所述的诊断试剂盒，其中所述病原体是人乳头瘤病毒（HPV）。
29.根据权利要求27所述的诊断试剂盒，其中所述病原体是选自导致以下感染的病原体：衣原体感染、梅毒感染或淋病感染。
30.一种通过聚合酶链式反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的仪器，其中所述仪器包含：
-包含蛋白质消化酶的处理缓冲液，用于稀释所述原始样品；
-加热/冷却装置，其被配置为根据先升高后降低的温度梯度对稀释的原始样品进行处理；
-一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于通过多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，所述扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-PCR扩增装置，其被配置为使用所述PCR反应混合物和经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-用于对先前进行PCR扩增的PCR反应混合物进行HRM分析的HRM设备；
其中PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物，
-监测装置，用于在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
-读取器，分析信号变化以检测原始样品中的目标DNA，从而能够通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果。
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