KR20170055766A - 약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents
약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 브루셀라 아보투스 유래 BSCP31, Omp31 또는 SOD 항원의 분비를 증가시키도록 개발된 벡터로 약독화된 살모넬라균(Salmonella Typhimurium)을 형질전환시키고 상기 형질전환된 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 접종시킨 마우스에서 항원에 대한 체액성 및 세포 매개 면역 반응뿐 아니라 브루셀라 아보투스 독성에 대하여 효과적으로 저항성을 보임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 변이주는 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 브루셀라증 예방 및 치료용 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 약독화된 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
브루셀라증(Brucellosis)은 포유동물 특히 소를 포함한 반추동물, 개, 돼지, 산양, 면양, 말 등에서 유산 및 불임을 일으키고, 사람에서는 몰타열(Malta fever, Melitensis fever)을 포함한 열병(파상열), 관절염 및 오한을 유발하는 인수 공통 전염병이다. 브루셀라증은 원인균으로 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis) 및 브루셀라 캐니스(Brucella canis) 등의 브루셀라균이 감염되어 유발되는 것으로 보고되어 있다. 이 중 브루셀라 아보투스는 소에서 발견되는 병원균으로 양축 농가에 큰 피해를 주어 국가 경제적으로 큰 문제가 되고 있다.
우리 나라는 1955년까지 브루셀라증의 비감염 지역이었으나 1956년에 미국에서 도입한 젖소군에서 처음 브루셀라증의 발병이 보고된 이후 1958년에 국립종축장의 돼지에서, 1960년에는 제주 목장에 도입된 소에서 집단 발병한 것으로 보고되었으며 이외에도 지속적인 발병 사례가 발표되고 있다(농수산부 통계연보, 1956-1994).
브루셀라증을 극복하기 위하여 세계 여러 나라에서는 젖소를 대상으로 예방 백신을 접종하거나 이를 진단하여 양성을 보이는 소를 살처분하는 2가지 방식의 정책을 시행하여 왔다. 우리 나라의 경우는 아직 브루셀라증의 발병율이 낮기 때문에 지금까지는 예방 백신을 접종하기보다는 이를 검진하여 양성인 소를 도태시키는 방식으로 브루셀라증을 근절하고자 하였다. 그러함에도 불구하고 그 발병 두수가 증가함은 물론 그의 집단 발병으로 낙농업을 포기하는 농가가 증가하고 있는 실정이다. 따라서 국가 방역 정책이 예방 접종으로 변경된다면 브루셀라증 진단약을 생산하고 그 검진 사업에 소용되는 예산의 일부로서도 전 젖소에 대하여 충분히 예방 접종을 수행할 수 있는 경제적인 이점도 기대할 수 있다.
브루셀라균은 숙주가 된 대식세포 안에서 세포 내로 침입을 하고 증식하는 병원균이다. 체액성과 세포매개 면역성 모두 브루셀라증을 예방하기 위해 필요하지만 특히 세포매개 면역반응이 숙주개체로부터 브루셀라를 제거하기 위해 필요하다. 숙주가 브루셀라 감염에 반응하여 IFN-γ에 의해 매개된 T 세포 타입 1(Th1)의 면역 반응을 활성화시킨다. 현재까지 브루셀라증을 예방하기 위해 상업적으로 사용할 수 있는 백신들은 생백신과 약독화된 브루셀라 백신 균주이다. 이러한 백신들은 병원성 균주로 되돌아가는 성질이 있고, 브루셀라 진단에 방해가 되는 등의 문제점이 있다. 이러한 제한 때문에 안전하게 사용하기 위해서는 더욱 효과적인 백신 개발이 신속하게 이루어질 필요가 있다. 현재 유전공학 기술로 재조합된 약독화 백신, 분자 표지 균주, DNA 백신 및 서브유닛 백신 등을 구축하고 있으나, 아직까지 효과적인 백신은 없는 실정이다.
한편, 한국등록특허 제0263942호에는 '브루셀라병의 예방에 사용될 수 있는 새로운 브루셀라 어보투스 균주 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1151004호에는 '소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화된 살모넬라 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 약독화된 살모넬라 변이주를 포함하는 브루셀라증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 브루셀라 아보투스 유래 BSCP31, Omp31 또는 SOD 항원의 분비를 증가시키도록 개발된 벡터로 약독화된 살모넬라균(Salmonella Typhimurium)을 형질전환시키고 상기 형질전환된 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 접종시킨 마우스에서 항원에 대한 체액성 및 세포 매개 면역 반응뿐 아니라 브루셀라 아보투스 독성에 대하여 효과적으로 저항성을 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BSCP31(cell surface 31-kilodalton protein), Omp3b(outer membrane protein 3b) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 브루셀라 아보투스 유래 BSCP31, Omp3b 및 SOD 항원 발현 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 약독화된 살모넬라 변이주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 2 이상을 포함하는 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 변이주는 BSCP31, Omp31 및 SOD 항원이 약독화 살모넬라균으로부터 외부로 분비되고 더불어 세포외벽에 발현되어 브루셀라균에 대해 효과적인 방어효과를 보이므로 본 발명의 변이주는 안전하고 경제적이며 간편하게 접종할 수 있는 브루셀라증 예방 및 치료용 백신으로 유용하게 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 사용된 pHJLP64 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 살모넬라 변이주에서 발현되는 BCSP31, Omp3b 또는 SOD 항원을 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과이다.
도 3는 본 발명의 BCSP31, Omp3b 또는 SOD 항원 각각에 대한 항체 반응을 나타낸 것이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 4는 본 발명의 살모넬라 변이주 각 항원으로 자극된 비장세포로부터 TNF-α와 IFN-γ의 발현 수준을 확인한 결과이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 5는 본 발명의 야생형 브루셀라 아보투스 544로 도전감염된 마우스 비장 내 박테리아 증식 결과를 나타낸 것이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 2는 본 발명의 살모넬라 변이주에서 발현되는 BCSP31, Omp3b 또는 SOD 항원을 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인한 결과이다.
도 3는 본 발명의 BCSP31, Omp3b 또는 SOD 항원 각각에 대한 항체 반응을 나타낸 것이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 4는 본 발명의 살모넬라 변이주 각 항원으로 자극된 비장세포로부터 TNF-α와 IFN-γ의 발현 수준을 확인한 결과이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 5는 본 발명의 야생형 브루셀라 아보투스 544로 도전감염된 마우스 비장 내 박테리아 증식 결과를 나타낸 것이다. 그룹 A: PBS 접종(대조구), 그룹 B: pHJLP64 벡터를 포함하는 살모넬라균 접종(벡터 대조구), 그룹 C: 1.2×104 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 D: 1.2×105 CFU/ml 농도의 100㎕ 백신 접종, 그룹 E: 1.2×106 CFU/ml농도의 100㎕ 백신 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BSCP31(cell surface 31-kilodalton protein), Omp3b(outer membrane protein 3b) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 변이주를 제공한다.
본 발명에 따른 살모넬라 변이주는 브루셀라 아보투스의 주요 세포막 단백질 중 항원성이 높은 BSCP31, Omp3b 및 SOD를 세포외벽에 발현하거나 세포 밖으로 분비할 수 있으며, 바람직하게는 세포외벽에 발현할 수 있다.
상기 BSCP31은 31kDa 크기의 항원 단백질로 당화 단백질(glycosylated protein) 이거나 브루셀라 다당류 일부가 단단히 연결되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 BSCP31의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 브루셀라증 백신 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 BSCP31의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
상기 Omp3b는 Omp22라고도 알려져 있으며, 브루셀라 Omps 그룹 3에 속하고, 면역성이 가장 강한 브루셀라 단백질을 최대 7가지 구성원의 그룹 중 하나에 속한다.
본 발명에 따른 Omp3b의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. 단백질의 기능적 동등물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한 Omp3b의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
상기 SOD 발현 유전자는 활성산소의 불균등화를 촉매작용시키는 구리와 아연을 포함하는 항산화 효소를 암호화한다. SOD는 대식세포로부터 활성화된 결과 유해한 활성산소가 제거됨으로써 독성인자처럼 활동할 지 모른다.
본 발명에 따른 SOD의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. 단백질의 기능적 동등물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다. 또한 SOD의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다.
본 발명의 살모넬라 변이주는 약독화된 것이 바람직하다. 상기 약독화된 살모넬라 변이주는 asd 유전자가 결실된 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 살모넬라 변이주에 있어서, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 변이주는 asd 유전자가 결실된 DAP(diaminopimellic acid) 요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, cpxR을 결실시킴으로써 림프조직 침투력이 증가되어 면역원성을 높이고, lon 유전자를 결실하여 병원성이 약독화된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 살모넬라 변이주는 agfA 신호 서열, 이에 연결된 BSCP31, Omp3b 및 SOD 발현 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자; asd 유전자; 및 p15A 복제기점;을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 살모넬라 변이주에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피무리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella Typi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella Paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella Sendai), 살모넬라 갈리나륨(Salmonella Gallinarium) 또는 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella Enteritidis) 등일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella Typhimurium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BSCP31(cell surface 31-kilodalton protein), Omp3b(outer membrane protein 3b) 및 SOD(superoxide dismutase) 발현 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 asd 유전자를 가진 재조합 벡터에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 약독화된 살모넬라 변이주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 2 이상을 포함하는, 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 제공한다.
본 발명의 상기 살모넬라 변이주 혼합물은 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균이, BSCP31, Omp3b 및 SOD 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 세포외벽에 발현/분비하는 살모넬라 변이주를 2 이상 포함하고 있는 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 살모넬라 변이주 혼합물은 BSCP31를 세포외벽에 발현/분비하는 살모넬라 변이주, Omp3b를 세포외벽에 발현/분비하는 살모넬라 변이주 및 SOD를 세포외벽에 발현/분비하는 살모넬라 변이주를 모두 포함하는 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 유전자 결실에 의해 약독화된 살모넬라균에 브루셀라 아보투스의 BSCP31, Omp3b 및 SOD 항원을 발현/분비하는 살모넬라 변이주를 하나 이상 포함하는 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 사람 또는 동물에 처리하여 브루셀라증을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에 있어서, 상기 살모넬라 변이주 혼합물은 변이주 생균 또는 사균의 형태로 준비될 수 있고, 바람직하게는 변이주 생균의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 복강 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 사람이나 동물의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 백신 조성물은 사람이나 포유동물에 접종할 수 있으며, 포유동물에는 소, 사슴, 산양, 염소, 개, 돼지 등 일 수 있으며, 바람직하게는 소, 개에 접종할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 약독화된 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 브루셀라 아보투스의 주요 세포외벽 단백질인 BSCP31, Omp3b 및 SOD을 발현 및 분비하는 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물이 브루셀라에 대한 보호 효과뿐만 아니라, 동물의 세포성 및 체액성 면역반응을 효과적으로 유도하므로 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 가축의 브루셀라증 예방 및 면역증강에 기여할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 살모넬라 변이주 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 실험동물
SAMTAKO사(한국)에서 6주령 BALB/c 암컷 마우스 50마리를 구입하여, 5그룹으로 구분해서 오전 오후 12시간 간격으로 상업용 사료와 물을 급여하였다. 본 실시예에 언급한 실험동물들은 한국 동물보호 협회 지침에 따라 준수사항을 전북대 윤리승인 위원회로부터 승인을 받아 사용하였다.
2 박테리아 균주, 플라스미드 및 생장 조건
본 발명에서 사용된 모든 균주와 플라스미드는 표 1에 기재되어 있다. 소로부터 분리된 야생균주 B. abortus(HJL200)는 암호화된 유전자 BCSP31, Omp3b 또는 SOD 항원 유전자를 증폭하기 위해 사용되었다. Brucella abortus 544; HJL 254는 도전감염 균주로 사용하였다. HJL200 균주는 한국 국립수의과학원으로부터 제공받았다. 약독화된 살모넬라 타이피무리움 변이균주(ΔlonΔcpxRΔasd)인 JOL912는 각각의 항원들을 전달하기 위해 숙주로 사용되었다. pHJLP64 플라스미드는 약독화된 살모넬라 타이피무리움 변이균주 내에서 이종항원(heterologous antigen)의 발현과 분비를 위한 벡터로 사용되었다(도 1). HJL200 및 Brucella abortus 544는 브루셀라 한천배지(Brucella agar)(Becton, Dickinson and Company, 미국) 및 브루셀라 액체배지에서 배양하였다. JOL912는 LB 액체배지(Luria-Bertani broth, LB; Becton, Dickinson and Company, 미국) 또는 LB 한천배지에서 배양하였다. 모든 균주는 37℃에서 배양하였다. JOL912와 같은 Asd-음성 박테리아 배양을 위해 디아미노피멜산(Diaminopimelic acid, DAP; Sigma-Aldrich, 미국)을 배지에 50㎍/mL 농도로 첨가하였다.
| 균주/플라스미드 | 설명 | 출처 |
| 균주 | ||
| Escherichia coli | ||
| TOP10 | F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR)endA1nupG | 실험실 보유 |
| BL21(DE3)pLysS | F-, ompT, hsdSB(rB -,mB -), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cmr | 실험실 보유 |
| HJL206 | BL21 with pET32a-BCSP31 | |
| HJL204 | BL21 with pET28a-Omp3b | |
| HJL208 | BL21 with pET28a-SOD | |
| Salmonella Typhimurium | ||
| JOL401 | S. Typhimurium wild type | 실험실 보유 |
| JOL911 | S. Typhimurium JOL401 derivative △lon△cpxR | 실험실 보유 |
| JOL912 | S. Typhimurium JOL401 derivative △lon△cpxR△asd | 실험실 보유 |
| HJL229 | JOL912 with pHJLP64 | |
| HJL228 | JOL912 with pHJLP64-BCSP31 | |
| HJL219 | JOL912 with pHJLP64-Omp3b | |
| HJL213 | JOL912 with pHJLP64-SOD | |
| Brucella abortus | ||
| HJL200 | B. abortus biotype 1 isolate from cow in Korea | 실험실 보유 |
| HJL254 | B. abortus strain 544(ATCC23448) | ATCC |
| 플라스미드 | ||
| pET28a | IPTG-inducible expression vector; Kmr | Novagen |
| pET32a | IPTG-inducible expression vector; Ampr | Novagen |
| pHJLP64 | Asd+, p15A ori,agfA-signal sequence-based periplasmic secretion plasmid, 6xHis | |
3. 재조합 단백질 항원(recombinant fimbrial antigens)의 클로닝
BCSP31, Omp3b 및 SOD 단백질은 각각 HJL206, HJL204 ,HJL208(표 1 참조)로부터 발현·정제하였고, 효소면역분석법(ELISA)의 코팅 항원으로 사용하였다. 또한 상기 항원들은 사이토카인(cytokine) 농도 측정을 위해 비장세포-자극 항원(splenocyte stimulating antigen)으로 사용하였다. 간략하게는, BCSP31, Omp3b 및 SOD 단백질을 위한 유전자는 특정 프라이머 세트(표 2 참조)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 제한효소로 절단된 PCR 절편을 pET28a 또는 pET32a 벡터에 클로닝하였다. 상기 플라스미드는 대장균 BL21(DE3)pLysS에 형질전환하여 HJL206, HJL204 및 HJL208 균주를 제조하였다. 재조합 BCSP31, Omp3b 및 SOD 항원은 HJL206, HJL204 및 HJL208 균주로부터 nickel-NTA(nitrilotriacetic acid)-agarose(Qiagen, 미국)를 사용한 정제 과정을 통해 제조하였다. 정제된 항원은 SDS-PAGE로 확인하였고, 사용되기 전까지 -70℃에 보관하였다.
| 프라이머 | 서열 | 사이트(bp) | 제한효소 | 서열번호 |
| BCSP31-F | CCGCGAATTCCAGGCCCCGACATTTTTCCG | 902 | EcoRI | 4 |
| BCSP31-R | CCGCAAGCTTGGATTATTTCAGCACGCCCGC | HindIII | 5 | |
| OMP3B-F | CCGCGAATTCGCCGACATGATGGGAGGGAC | 563 |
EcoRI | 6 |
| OMP3B-R | CCGCAAGCTTACTAGAATTTGTAGTTCAGGCC | HindIII | 7 | |
| SODC-F | CCGCGAATTCAAGTCCTTATTTATTGCATCG | 519 |
EcoRI | 8 |
| SODC-R | CCGCAAGCTTTTATTCGATCACGCCGCAGG | HindIII | 9 |
4. 백신용 살모넬라 변이주 제작
백신균주를 제작하기 위해 각각의 BCSP31, Omp3b 및 SOD 발현 유전자는 pHJLP64에 삽입하였다. 그 다음 상기 플라스미드는 전기천공법을 통해 JOL912로 삽입되었고, 그 결과 각 균주는 BCSP31를 발현/분비하는 HJL228, Omp3b를 발현/분비하는 HJL219 및 SOD를 발현/분비하는 HJL213으로 명명하였다(표 1 참조).
5. 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석은 각각 HJL228, HJL219 및 HJL213에서 각각 BCSP31, Omp3b 및 SOD 단백질의 발현/분비 확인을 위해 수행하였다. 또한 pHJLP64가 형질전환된 JOL912인 HJL229는 벡터 대조군으로 사용하였다. 각 균주는 LB 액체배지에서 37℃로 OD600가 0.8에 도달할 때까지 배양한 후 20분 동안 3,400rpm으로 원심분리하여 상층액을 수확하였다. 상기 상층액은 0.22㎛ 필터로 여과하고, 20% TCA(trichloroacetic acid)를 첨가하여 하룻밤 반응시켰다. 침전물은 차가운 PBS 용액에 재현탁하였다. 각 항원은 12% SDS-PAGE에 걸어 크기별로 분리한 다음 PVDF막에 이동시켰다. 그 다음 0.1% Tween-20을 첨가한 PBS 용액 안에 5% 탈지유를 넣고 4℃에서 하룻밤 블로킹을 진행하고, 항-His 항체와 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 토끼 항-마우스 IgG 항체로 반응시켰다. 면역반응 밴드는 AmershamTM ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare, 영국)와 CheBi illumination system(Neo science, 한국)을 사용하여 확인하였다.
6. 마우스 면역 및 샘플 수집
5주령 암컷 BALB/c 마우스 50마리를 5그룹으로 나누어 1주 후 6주령 마우스에 백신 접종하였다. 면역 접종은 표 3에서 보는 바와 같이 접종하였다. 그룹 A 마우스는 대조군으로, 멸균된 PBS를 100㎕씩 복강 내 접종했다. 그룹 B 마우스는 벡터 대조군으로, HJL229를 1.2×105 CFU/ml 정확하게 100㎕씩 복강 내 접종했다. 그룹 C, D 및 E는 각각 1.2×104, 1.2×105, 1.2×106 CFU/ml로 100㎕씩 각각 복강 내 접종했다. 혈청은 면역성을 가지기 전(0주차) 수집하였고, 혈청 IgG를 측정하기 위해 3주차 때 다시 한 번 혈청을 수집하였다. 모든 샘플은 사용 전까지 -70℃에 저장하였다.
| 그룹 | 접종균수 | 접종 경로 |
| A | PBS | 복강 |
| B | 1.2×105 CFU/ml of HJL229 | 복강 |
| C | 1.2×104 CFU/ml of the mixture of HJL228, HJL219 and HJL213 | 복강 |
| D | 1.2×105 CFU/ml of the mixture of HJL228, HJL219 and HJL213 | 복강 |
| E | 1.2×106 CFU/ml of the mixture of HJL228, HJL219 and HJL213 | 복강 |
7. ELISA 면역 반응 측정
효소면역분석법(ELISA)은 마우스 혈청 샘플에서 BCSP31, Omp3b 및 SOD 항원에 대한 면역 반응을 평가하기 위해서 이전에 실행된 방법을 약간 변형하여 수행하였다(허 등, 2011,J. Vet Med Sci 73:1265-73). 간략히 기술하면, 각각의 정제된 항원(500ng/well)을 ELISA 플레이트 분주한 후 4℃에서 하룻밤 반응시켜 항원을 코팅하였다. 혈청은 PBS로 1:100 비율로 희석하여 코팅된 항원과 반응시켰다. HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 2차 반응시켰다. o-페닐렌디아민(phenylenediamine)을 포함한 기질을 추가하여 발색 반응을 일으켰으며, ELISA spectrophotometer(Thermo Scientific Multiskan Go; Thermo Fisher Scientific, 핀란드)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 표준화된 곡선 그래프는 표준집단과 그것들의 흡광도(absorbance) 사이의 관계를 나타내기 위해서 만들어졌고, 각각의 표본에 있는 항체 집단은 이 곡선 그래프를 이용하여 결정되었다. ELISA의 결과는 평균±표준편차로 표현하였다.
8. 비장세포의 사이토카인 정량
접종 3 주차(3 WPI(week post immunization))에 각각의 그룹에 있는 다섯 마리의 마우스를 희생시켜 비장을 무균상태로 체취하였다. 비장으로부터 단일 세포 현탁물(single-cell suspension)은 균질화에 의해 얻어졌다. 비장세포(splenocyte)는 5분 정도 1,000rpm에서 원심분리하여 수집했다. 적혈구(RBC)는 0.9%의 NH4Cl로 분해되고, 상기 NH4C1을 제거하기 위해서는 완전한 RPMI 배지로 세 번 세척하였다. 비장세포는 트리판 블루 염색 배제 방법을 통해 살아있는 세포 수를 확인하였다. 비장 세포는 24 well 동물세포 배양 플레이트에 한 well 당 2×106 세포로 분주하였다. 비장세포는 각각 BSP31, Omp3b, SODC 항원(4㎍/well) 및 양성 대조군으로서의 ConA(Concavalin A)(0.5㎍/well)를 그리고 비자극 대조군으로서 배지로 인 비트로(in vitro) 자극을 주었고, 37℃, 5%의 CO2와 95%의 습도에서 배양하였다. 72시간 동안 배양 후 상층액은 사이토카인 측정으로 사용할 때까지 -70℃로 보관하였다.
9. ELISA에 의한 사이토카인 측정
ELISA는 상층액 안에 있는 IFN-γ과 TNF-α와 같은 사이토카인의 농도를 측정하기 위해서 제조사의 설명에 따라 mouse cytokine ELISA Ready-SET-GO reagent set(eBioscience Inc., 미국)로 측정하였다.
10. 도전감염
도전감염 실험을 위해 도전감염 균주(challenge strain)인 브루셀라 아보투스 544가 준비되었다. 간단히 말하자면, 브루셀라 아보투스 544는 브루셀라 액체배지에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하고, 1×105 CFU/ml로 재현탁하였다. 모든 마우스는 3 WPI에 100㎕의 도전감염 균주로 복강 내(ip) 접종하였다. 도전감염 2주 후에 비장의 무게와 비장으로부터 브루셀라 아보투스 544의 생존 수를 측정했다. 간단하게, 배양된 균주는 브루셀라 AMOS PCR 프라이머에 있는 B. abortus-특이적 프라이머(5'-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3', 서열번호 10) 및 IS711-특이적 프라이머(5'-TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT-3', 서열번호 11)를 사용하여 PCR에 의해서 확인하였다.
11. 통계적 분석
CFU 데이터는 로그 변환에 의해서 표준화되었고 일원변량분석(one-way analysis of variance)에 의해서 평가되었으며, 뒤이어 GraphPad software(GraphPad Software, Inc., 미국)를 이용한 Dunnett's post-hoc test의 사후검정 분석을 하였다. 세포 및 항체 반응은 각각 일원변량분석과 kruskal-Wallis test를 이용하여 집단간 비교하였다. 분석은 SPSS version 16.0 software(SPSS, 미국)로 실행하였다.
결과
실시예 1. 백신 구성물로부터 재조합 BCSP31, OMP3b 및 SODC 항원의 분비
살모넬라부터 재조합 BCSP31, OMP3b, SODC 항원을 발현하기 위해 상기 항원을 암호화하는 유전자는 pHJLP64로 각각 클로닝하여 약독화된 살모넬라 타이피무리움(ΔlonΔcpxRΔasd)으로 형질전환하였다. 웨스턴 블롯 분석은 BCSP31, OMP3b 및 SODC 항원이 분비하는 전달 구성물인 배양 상층액으로 진행하였다. pHJLP64를 포함하는 약독화된 살모넬라 타이피무리움(ΔlonΔcpxRΔasd)인 HJL229는 벡터 대조군으로 사용하였다. 각각의 재조합 BCSP31, OMP3b, SODC 항원은 31kDa, 22kDa, 19kDa 크기의 단백질임을 확인하였으며, 대조군은 밴드가 존재하지 않았다(도 2).
실시예 2. 백신 접종한 마우스의 체액성 면역 반응
혈청 내 각각의 항원과의 항체 반응은 도 3에 개시되었다. 그룹 D와 E에서의 모든 항원에 대한 혈청 IgG 농도는 대조군과 비교해 봤을 때 현저하게 증가했다(P≤0.05)(도 3). 또한, 그룹 E에서 각각의 항원들에 대한 혈청 IgG 농도는 그룹 B, C, D에 비해 상당히 높았다(P≤0.05)(도 3).
실시예 3. 사이토카인 분석
마우스의 비장세포에서 BCSP31, Omp31 및 SODC 각 항원에 의해 IFN-γ과 TNF-α의 농도는 ELISA를 사용해 측정하였다. TNF-α의 수치는 그룹 A, B와 비교했을 때보다 그룹 C,D 및 E에서 현저한 효과를 보였다(P<0.05)(도 4). 게다가, 그룹 C와 비교했을 때 그룹 D와 E 항원에 대한 TNF-α의 수치 높은 효과를 보여주었다. 한편, 항원에 대한 IFN-γ 농도는 그룹 A, B에서보다 그룹 D와 E에서 현저하게 더 높았다(도 4). 모든 항원에 대한 IFN-γ의 수치는 그룹 C에서보다 그룹 E에서 현저하게 증가함을 확인하였다(P<0.05)(도 4).
실시예 4. 도전감염에 대한 마우스 보호 확인
모든 마우스는 3WPI에 4×104 CFU의 도전감염 균주로 복강 내 접종하였다. 도전감염 14일 후, 감염 수준은 비장에서 CFU를 측정하여 판단하였다. 도 5에서 보면, 그룹 D와 E의 마우스는 그룹 A, B 및 C에 비해 현저하게 높은 정도의 방어효과를 유도하였다. 게다가, 그룹 A, B, C에서는 도전감염 균주가 모든 마우스에서 분리되었다(도 5). 그러나 그룹 D에서는 도전감염 균주는 5마리 중 2마리의 마우스에서 분리되었고, 그룹 E의 모든 마우스의 비장에서는 브루셀라 아보투스 야생 균주가 관찰되지 않았다(도 5).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Vaccine composition for preventing or treating brucellosis
comprising attenuated Salmonella mutant as effective component
<130> PN15176
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 301
<212> PRT
<213> Brucella abortus
<400> 1
Gln Ala Pro Thr Phe Phe Arg Ile Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Tyr Pro Ile Gly Gly Leu Ile Ala Asn Ala Ile Ser Gly Ala Gly
20 25 30
Glu Lys Gly Val Pro Gly Leu Val Ala Thr Ala Val Ser Ser Asn Gly
35 40 45
Ser Val Ala Asn Ile Asn Ala Ile Lys Ser Gly Ala Leu Glu Ser Gly
50 55 60
Phe Thr Gln Ser Asp Val Ala Tyr Trp Ala Tyr Asn Gly Thr Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Lys Gly Lys Val Glu Asp Leu Arg Leu Leu Ala Thr Leu
85 90 95
Tyr Pro Glu Thr Ile His Ile Val Ala Arg Lys Asp Ala Asn Ile Lys
100 105 110
Ser Val Ala Asp Leu Lys Gly Lys Arg Val Ser Leu Asp Glu Pro Gly
115 120 125
Ser Gly Thr Ile Val Asp Ala Arg Ile Val Leu Glu Ala Tyr Gly Leu
130 135 140
Thr Glu Asp Asp Ile Lys Ala Glu His Leu Lys Pro Gly Pro Ala Gly
145 150 155 160
Glu Arg Leu Lys Asp Gly Ala Leu Asp Ala Tyr Phe Phe Val Gly Gly
165 170 175
Tyr Pro Thr Gly Ala Ile Ser Glu Leu Ala Ile Ser Asn Gly Ile Ser
180 185 190
Leu Val Pro Ile Ser Gly Pro Glu Ala Asp Lys Ile Leu Glu Lys Tyr
195 200 205
Ser Phe Phe Ser Lys Asp Val Val Pro Ala Gly Ala Tyr Lys Asp Val
210 215 220
Ala Glu Thr Pro Thr Leu Ala Val Ala Ala Gln Trp Val Thr Ser Ala
225 230 235 240
Lys Gln Pro Asp Asp Leu Ile Tyr Asn Ile Thr Lys Val Leu Trp Asn
245 250 255
Glu Asp Thr Arg Lys Ala Leu Asp Ala Gly His Ala Lys Gly Lys Leu
260 265 270
Ile Lys Leu Asp Ser Ala Thr Ser Ser Leu Gly Ile Pro Leu His Pro
275 280 285
Gly Ala Glu Arg Phe Tyr Lys Glu Ala Gly Val Leu Lys
290 295 300
<210> 2
<211> 188
<212> PRT
<213> Brucella abortus
<400> 2
Ala Asp Met Met Gly Gly Thr Asp Tyr Thr Tyr Asn Asp Pro Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Pro His Asp Trp Ser Gly Asn Tyr Val Gly Ala Gln Val Gly
20 25 30
Gly Ser Ser Ser Lys Phe Pro Ser Pro Phe Ala Ser Arg Thr Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Gly Ile Val Val Gly Lys Asn Met Gln Asn Gly Asn Ile Val
50 55 60
Phe Gly Ala Glu Leu Glu Gly Asn Phe Ala Glu Ala Glu His Arg Ile
65 70 75 80
Gly His Gly Gly Thr Leu Gln Gln Ser Trp Asn Gly Asn Ala Lys Gly
85 90 95
Lys Val Gly Tyr Thr Phe Asp Lys Thr Leu Val Tyr Gly Thr Ala Gly
100 105 110
Tyr Gly Val Thr Arg Phe Lys Ala Lys Asp Asn Thr Thr Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Trp Glu Gly Gly Val Leu Ile Gly Ala Gly Val Glu Gln Ala Leu
130 135 140
Ser Gly Pro Leu Ser Val Lys Ala Glu Tyr Asp Phe Gln Arg Phe Asn
145 150 155 160
Asp Val Lys Ser Gln Val Asn Gly Ile Glu Gln Arg Asn Asn Leu Lys
165 170 175
Asn His Ser Ile Lys Ala Gly Leu Asn Tyr Lys Phe
180 185
<210> 3
<211> 172
<212> PRT
<213> Brucella abortus
<400> 3
Lys Ser Leu Phe Ile Ala Ser Thr Met Val Leu Met Ala Phe Pro Ala
1 5 10 15
Phe Ala Glu Ser Thr Thr Val Lys Met Tyr Glu Ala Leu Pro Thr Gly
20 25 30
Pro Gly Lys Glu Val Gly Thr Val Val Ile Ser Glu Ala Pro Gly Gly
35 40 45
Leu His Phe Lys Val Asn Met Glu Lys Leu Thr Pro Gly Tyr His Gly
50 55 60
Phe His Val His Glu Asn Pro Ser Cys Ala Pro Gly Glu Lys Asp Gly
65 70 75 80
Lys Ile Val Pro Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly Asn
85 90 95
Thr His His His Leu Gly Pro Glu Gly Asp Gly His Met Gly Asp Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Ser Ala Asn Ala Asp Gly Lys Val Ser Glu Thr Val Val
115 120 125
Ala Pro His Leu Lys Lys Leu Ala Glu Ile Lys Gln Arg Ser Leu Met
130 135 140
Val His Val Gly Gly Asp Asn Tyr Ser Asp Lys Pro Glu Pro Leu Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ala Arg Phe Ala Cys Gly Val Ile Glu
165 170
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ccgcgaattc caggccccga catttttccg 30
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ccgcaagctt ggattatttc agcacgcccg c 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
ccgcgaattc gccgacatga tgggagggac 30
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
ccgcaagctt actagaattt gtagttcagg cc 32
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
ccgcgaattc aagtccttat ttattgcatc g 31
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ccgcaagctt ttattcgatc acgccgcagg 30
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gacgaacgga atttttccaa tccc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
tgccgatcac ttaagggcct tcat 24
Claims (9)
- 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BSCP31(cell surface 31-kilodalton protein), Omp3b(outer membrane protein 3b) 및 SOD(superoxide dismutase) 항원으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 항원을 포함하는 약독화된 살모넬라 변이주.
- 제1항에 있어서, 상기 BSCP31는 서열번호 1, Omp3b는 서열번호 2, SOD는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 변이주.
- 제1항에 있어서, 상기 살모넬라 변이주는 agfA 신호 서열, 이에 연결된 BSCP31, Omp3b 및 SOD 발현 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자; asd 유전자; 및 p15A 복제기점;을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화된 살모넬라 변이주.
- (a) 브루셀라 아보투스(Brucella abortus) 유래 BSCP31(cell surface 31-kilodalton protein), Omp3b(outer membrane protein 3b) 및 SOD(superoxide dismutase) 발현 유전자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 유전자를 asd 유전자를 가진 재조합 벡터에 클로닝하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 클로닝된 플라스미드를 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 약독화된 살모넬라 변이주의 제조방법. - 제1항의 약독화된 살모넬라 변이주 중 2 이상을 포함하는 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물.
- 제1항의 약독화된 살모넬라 변이주 또는 제5항의 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 살모넬라 변이주는 생균인 것을 특징으로 하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 백신 조성물은 경구 또는 복강 내 경로를 통해 투여하는 것을 특징으로 하는 브루셀라증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
- 제1항의 약독화된 살모넬라 변이주 또는 제5항의 약독화된 살모넬라 변이주 혼합물을 유효성분으로 포함하는 브루셀라증 예방용 사료 첨가제.
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|---|---|---|---|---|
| CN111733217A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-10-02 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种数字pcr检测布鲁氏菌核酸dna的方法 |
| CN112852698A (zh) * | 2021-01-30 | 2021-05-28 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用 |
| KR20220048172A (ko) * | 2020-10-12 | 2022-04-19 | 전북대학교산학협력단 | 표적단백질발현을 증가시킨 진핵세포질 내 다중항원발현용 재조합벡터 및 진핵세포 내 벡터전달시스템용 살모넬라 티피뮤리움의 조합 조성물 |
-
2015
- 2015-11-12 KR KR1020150158955A patent/KR101753734B1/ko active IP Right Grant
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| CN112852698B (zh) * | 2021-01-30 | 2022-11-29 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 牛种布鲁氏菌A19株asd基因缺失株的构建方法和应用 |
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