CN110699467A - 一种支原体pcr通用引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种支原体PCR通用引物及其应用。本发明提供的支原体PCR通用引物是一对保守引物，其正向引物myco‑F包括21个碱基：GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG，反向引物myco‑R有22个碱基：CGG ATA ACG CTT GCG ACC TAT G。本发明设计的支原体PCR通用引物可快速地扩增细胞培养基中支原体的DNA序列，从而能够准确地鉴定细胞系有无被支原体污染，能够作为细胞培养过程中支原体污染的检测重要的工具；该支原体PCR通用引物应用在鉴定支原体时，具有灵敏度高、扩增结果重复性好及操作方法简单有效的特点。
Description
技术领域
本发明属于支原体鉴别领域，具体涉及一种支原体PCR通用引物及其应用。
背景技术
支原体是一种缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，结构简单，个体微小，大小一般在0.3-0.5 μm，能够通过过滤菌器，一般不易除去，而在细胞培养中常用的双抗为青霉素和链霉素，其二者主要通过作用于细菌细胞壁来实现抑菌的效果，不能将支原体杀死，细胞很容易受支原体污染，且细胞传代次数越多，越容易污染。在细胞培养过程中，支原体感染发生率高，当细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达都可能发生改变，而细胞的生长率并未发生显著的影响时，细胞支原体污染很难被察觉。
目前支原体的检测方法主要包括常规分离培养法、酶联免疫吸附试验、DNA荧光染色法、核酸杂交技术和PCR技术。常规培养法检测支原体，所需时间长，工作量大，且支原体对培养环境要求高，不易培养；酶联免疫吸附试验用于支原体污染的检测，具有良好的特异性和灵敏性，同时可完成大量样品的检测，但是检测试剂盒昂贵，若长期只用于检测细胞系及其培养试剂的支原体污染，成本太高；DNA荧光染色法是利用荧光染色剂双苯咪唑能够结合支原体DNA中富含A-T碱基的富集区域，被支原体污染的细胞染色后，细胞核及细胞周围可看到许多大小均一的荧光点，即为支原体DNA，检测特异性差，容易造成假阳性或假阴性结果，通常需要与分离培养法结合使用；核酸杂交技术不依赖于病原体的生长繁殖，特异性强，支原体无需培养，同时节约了检测时间，但是核酸探针的灵敏度差，采用的放射性核酸标记，不便于一般实验室常规检测；PCR作一种快速、灵敏、特异且操作简单的检测支原体方法，通过支原体基因组内特异保守序列核糖体 rRNA设计引物，对待检样的核酸进行扩增，通过扩增产物的大小分析并作出诊断。
支原体PCR检测技术主要针对支原体的ATP酶基因序列，P1粘附素基因序列及16srRNA的保守区域等设计引物进行PCR扩增，主要以商品化试剂盒应用，检测速度快、灵敏度高，但是价格昂贵，需要特殊的设备盒技术才能实现。支原体的种类很多，主要包括肺炎支原体、牛支原体、人型支原体、丝状支原体、滑液支原体和无乳支原体等。因此，需要设计具有特异性强、灵敏度高的PCR通用引物，通过普通PCR检测技术即可扩增多种支原体类型的DNA片段，不仅可以降低检测成本、缩短实验周期，而且重复性好，不易出现假阳性和假阴性的结果。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种支原体PCR通用引物及其应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明从PCR扩增角度出发，提供了一对支原体保守序列的简并引物；本发明的另一个目的在于提供利用所述的一对简并引物，通过PCR扩增技术来实现对支原体污染情况的鉴别，进一步确定被支原体污染的细胞系。
本发明设计的支原体PCR通用引物可快速地扩增细胞培养基中支原体的DNA序列，从而能够准确地鉴定细胞系有无被支原体污染，能够作为细胞培养过程中支原体污染的检测重要的工具；该支原体PCR通用引物应用在鉴定支原体时，具有灵敏度高、扩增结果重复性好及操作方法简单有效的特点。
本发明提供的一种支原体PCR通用引物，是一对保守引物，其包括正向引物myco-F和反向引物myco-R；所述正向引物myco-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其包括21个碱基，这21个碱基分别为：GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG；所述反向引物myco-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其包括22个碱基，这22个碱基分别为：CGG ATA ACG CTT GCG ACCTAT G。
本发明利用所述支原体PCR通用引物对支原体的鉴别方法，包括：
（1）利用所述支原体PCR通用引物对待测细胞系上清液中的支原体DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；
（2）扩增产物经琼脂糖电泳分离后，具有特异性条带的待测细胞系为支原体污染的细胞系。
本发明提供的一对支原体PCR通用引物，这对引物是根据NCBI数据库中已经公布的多种支原体保守序列16s rRNA设计的，其正向引物myco-F有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，反向引物myco-R有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。
本发明提供的支原体PCR通用引物能够应用在鉴别支原体污染情况中。
本发明提供的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用，具体包括如下步骤：
（1）取将待检测的细胞培养上清溶液（优选100微升）进行加热处理，得到样品溶液；
（2）将样品溶液、所述支原体PCR通用引物溶液及PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR扩增处理，得到扩增产物；
（3）将扩增产物使用琼脂糖凝胶进行电泳分离，得到电泳结果图，依据所述电泳结果图上有无出现500bp大小的特异性条带鉴别待检测的溶液中支原体污染情况；如果在电泳结果图上出现500bp大小的特异性条带，表明待检测的溶液含有支原体，如果在电泳结果图上没有出现500bp大小的特异性条带，表明待检测的溶液不含有支原体。
进一步地，步骤（1）所述加热处理的温度为100℃，加热处理的时间为5min。
进一步地，步骤（2）所述支原体PCR通用引物溶液包括正向引物myco-F溶液和反向引物myco-R溶液；所述正向引物myco-F溶液为正向引物myco-F与水混合均匀的溶液，所述正向引物myco-F溶液的浓度为200 nm/l；所述反向引物myco-R溶液为反向引物myco-R与水混合均匀的溶液，浓度为200 nm/l。
进一步地，步骤（2）所述PCR反应体系，按体积份数计，包括：
Taq buffer溶液 2.5份；
dNTP 溶液 2.5份；
正向引物myco-F溶液 0.25份；
反向引物myco-R溶液 0.25份；
rTaq 酶溶液 0.2份；
样品溶液 1-2份；
无菌DEPC水 17.3份。
优选地，步骤（2）所述PCR反应体系，按体积份数计，包括：
Taq buffer溶液 2.5份；
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正向引物myco-F溶液 0.25份；
反向引物myco-R溶液 0.25份；
rTaq 酶溶液 0.2份；
样品溶液 2份；
无菌DEPC水 17.3份。
优选地，步骤（2）所述PCR反应体系的反应容器为RANase free 的无菌EP管。
优选地，步骤（2）所述PCR反应体系（RANase free 的无菌EP管容积为200μL）包括：10× Taq Buffer 2.5μL，dNTP各0.25mmol/L，一对扩增引物各0.1μmol/L，rTaq plus DNA聚合酶0.2U，DNA模板为2μL煮沸的细胞上清液（即所述样品溶液），最后用灭菌的DEPC水补足25μL。
进一步地，所述Taq buffer溶液为1X Taq buffer溶液，所述Taq buffer溶液的pH值为8.3；在所述Taq buffer溶液中，Tris-HCl的浓度为10mM，KCl的浓度为50 mM，MgCl2的浓度为1.5mM；所述dNTP 溶液的浓度为10 mM，所述dNTP包括dATP、dCTP、 dGTP及 dTTP；所述rTaq 酶溶液的浓度为12.5U。所述rTaq 酶溶液为热稳定性的DNA聚合酶的溶液。
优选地，在PCR反应体系中，所述rTaq 酶的浓度为每20μlPCR反应体系2 units。
所述无菌DEPC水为无菌且无核苷酸的超纯水。
进一步地，步骤（2）所述PCR扩增处理的条件为：
在95°C条件下预变性1min，然后进行扩展循环，最后在温度为72°C的条件下再延伸3min；
所述扩展循环为：先在温度为95°C的条件下变性1min，然后在温度为55°C的条件下退火1min，接着在温度为72°C的条件下延伸1min 30sec，循环的次数为35。
进一步地，步骤（3）所述琼脂糖凝胶的质量体积比浓度为2.5g/L，即骤（3）所述琼脂糖凝胶的浓度为2.5%。
作为优选，本发明所述的支原体鉴别方法中，所述步骤（3）中PCR扩增产物采用2.5%（质量体积比浓度，g/L）的琼脂糖凝胶检测其大小、纯度和亮度。
进一步地，步骤（3）所述电泳分离的条件为：在电压为120 V的条件下，电泳30分钟。
本发明所述的支原体PCR扩增引物能够特异性扩增支原体的基因片段，均能获得单一的目的DNA片段，扩增产物特异性条带大小位于500bp左右的位置。
本发明提供的支原体PCR通用引物鉴别方法可广泛应用于细胞系支原体污染检测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
（1）本发明提供的支原体PCR通用引物，包括正向引物和反向引物，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；其可特异性扩增支原体的基因片段，得到单一扩增产物；利用该单一扩增产物即可检验出待测溶液中的支原体污染情况；
（2）本发明提供的支原体PCR通用引物是支原体的保守序列的简并引物，能够通过PCR技术快速扩增支原体的DNA序列，从而准确鉴定待测溶液中支原体污染的情况，具有灵敏度高、扩增结果重复性好、操作方法简单有效等优点，其能够为细胞培养过程中支原体污染的检测提供重要的工具；
（3）本发明提供的支原体PCR通用引物，检测的支原体种类多，是一种特异性强、灵敏度高的PCR通用引物，其可降低检测成本、缩短实验周期，而且重复性好，不易出现假阳性和假阴性的结果。
附图说明
图1a为肺炎支原体16s rRNA （NR_041751.1）与正向引物myco-F匹对结果图；
图1b为肺炎支原体16s rRNA （NR_041751.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图1c为牛支原体 16s rRNA （U02968.1）与正向引物myco-F匹对结果图；
图1d为牛支原体16s rRNA （U02968.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图1e为无乳支原体16s rRNA （AJ419904.1）与正向引物myco-F匹对结果图；
图1f为无乳支原体16s rRNA （AJ419904.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图1g为丝状支原体16s rRNA （U26043.1）与正向引物myco-F匹对结果图；
图1h为丝状支原体16s rRNA （U26043.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图1i为人型支原体16s rRNA （AJ002267.1）与正向引物myco-F匹对结果图；
图1j为人型支原体16s rRNA （AJ002267.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图1k为滑液支原体16s rRNA （AM073015.1）与反向引物myco-R匹对结果图；
图2为实施例1的细胞上清液支原体污染检测结果的凝胶电泳图；
图3 为实施例2的细胞上清液支原体污染检测结果的凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明公开了一种支原体PCR通用引物及其鉴别方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进PCR扩增条件实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实验所采用的PCR检测技术和琼脂糖凝胶电泳技术，均可广泛用于评价引物特异性和扩增产物单一性。
以下就本发明支原体PCR通用引物在细胞支原体污染检测中的应用做进一步说明。
实施例1 支原体PCR通用引物在细胞支原体污染检测中的应用
（1）支原体PCR通用引物设计合成
本发明所述的支原体PCR通用引物根据NCBI数据库中已经公布的支原体保守序列16srRNA进行设计；将本发明提供的支原体PCR通用引物与NCBI数据库的支原体保守序列进行比对，结果如图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f、图1g、图1h、图1i、图1j及图1k所示，这些图中的Query表示为比对参照序列，Sbjct表示为查询序列，Identities表示为比对成功率，Strand表示为Plus/Plus DNA正义链。然后由上海生工生物工程技术服务有限公司根据SEQID N，O:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列合成一对保守引物（所述支原体PCR通用引物）：
myco-F（如SEQ ID NO:1所示）：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’；
myco-R（如SEQ ID NO:2所示）：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。
由图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f、图1g、图1h、图1i、图1j及图1k可知，本发明所述的支原体PCR通用引物与多种支原体16s rRNA 保守序列均能完全匹配，说明本发明所述引物能同时扩增出多种支原体的基因片段，是鉴别多种支原体的有效手段。
（2）支原体PCR通用引物应用于细胞支原体污染检测
选用传代细胞系和正在培养的原代细胞进行支原体污染检测，这些细胞分别是HEK293-1（人胚肾脏细胞品系1）、NIH3T3-1（鼠成纤维细胞品系1）、SGC（人胃癌细胞）、SY5Y-1（神经母细胞瘤细胞）、MGC（人胃癌细胞）、NIH3T3-2（鼠成纤维细胞品系2）、E22G（支原体药物筛选的亚克隆）、293T（人胚肾脏细胞T品系）、Wnt3（人胚肾脏细胞Wnt3过表达细胞系）、NIH3T3-2（鼠成纤维细胞品系3）、AGS（胃癌细胞系）、HEK293（人胚肾脏细胞品系）、Neuron(原代培养神经元)、Microglia (原代培养小胶质细胞)、HK2（肾小管上皮细胞）及L02（人胎肝上皮细胞）；
分别采用无菌的EP管（容积为200μL）收集上述各细胞培养24h后的上清液，先在100°C下煮沸5min使支原体DNA释放得到其DNA模板，得到所述样品溶液（细胞上清液模板），然后对各细胞上清液模板进行PCR反应，PCR反应的条件为：95°C预变性1min，然后进行扩增循环，最后在72°C再延伸3min；所述扩增循环的条件为95°C变性1min，55°C退火1min，72°C延伸1min 30sec；共35个循环；其中采用的PCR反应体系组成为：10× Taq Buffer 2.5μL，dNTP各0.25mmol/L，一对扩增引物各0.1μmol/L，rTaq plus DNA聚合酶0.2U，DNA模板为煮沸的2μL细胞上清液（即样品溶液），最后用灭菌的DEPC水（无菌且无核苷酸的超纯水）补足25μL。
将得到的PCR扩增产物分别采用2.5%（质量体积比浓度，单位为g/L）的琼脂糖凝胶检测其大小和亮度，实验结果如图2所示。图2中的字母M表示为DNA Marker，HEK293-1表示为人胚肾脏细胞品系1，NIH3T3-1表示为鼠成纤维细胞品系1，SGC表示为人胃癌细胞，SY5Y-1表示为神经母细胞瘤细胞，MGC表示为人胃癌细胞，NIH3T3-2表示为鼠成纤维细胞品系2，E22G表示为支原体药物筛选的亚克隆，293T表示为人胚肾脏细胞T品系，WNT3表示为人胚肾脏细胞WNT3过表达细胞系，NIH3T3-2表示为鼠成纤维细胞品系3，FBS-1表示为胎牛血清品牌1（GIBCO，产地：澳大利亚），AGS表示为胃癌细胞系，HEK293表示为人胚肾脏细胞品系，Neuron表示为原代培养神经元，Microglia表示为原代培养小胶质细胞，HK2表示为肾小管上皮细胞，LO2表示为人胎肝上皮细胞，FBS-2表示为胎牛血清品牌2（GIBCO，产地：南美），Negative control表示为阴性对照；
从图2可以看出，细胞MGC、WNT3、HK2和LO2均能在500bp左右扩增出亮度较高的PCR产物，说明这4株细胞系已被支原体污染。
实施例2 支原体PCR通用引物在支原体药物处理后细胞系支原体检测中的应用
取实施例1中已被支原体污染的细胞系WNT3、LO2、HEK293以及HK2进行支原体药物处理，处理药物为5 μg/ml Plasmocin，处理两周后，得到细胞系WNT3、LO2、HK2；其中HEK293细胞系在Plasmocin处理的过程中，传代为I-G7、4-D7、3-G8、4-D3、1-G10、2-C11、4-D1、 4-E2、2-G4、 3-D7及2-E11细胞系；因此经过Plasmocin处理两周后，得到了WNT3、LO2、HK2、I-G7、4-D7、3-G8、4-D3、1-G10、2-C11、4-D1、 4-E2、2-G4、 3-D7及2-E11细胞系；
收集上述细胞系的上清液于200μL EP管中，然后在100°C下煮沸5min使支原体DNA释放得到其DNA模板，得到所述样品溶液（细胞上清液模板），然后对各细胞上清液模板（样品溶液）进行PCR反应，PCR反应的条件为：95°C预变性1min，然后进行扩增循环，最后在72°C再延伸3min；所述扩增循环的条件为95°C变性1min，55°C退火1min，72°C延伸1min 30sec；共35个循环；。其中采用的PCR体系组成为：10× Taq Buffer 2.5μL，dNTP各0.25mmol/L，一对扩增引物各0.1μmol/L，rTaq plus DNA聚合酶0.2U，DNA模板为煮沸的2μL细胞上清液（即样品溶液），最后用灭菌的DEPC水补足25μL。
PCR扩增产物采用2.5%（质量体积比浓度，单位为g/L）的琼脂糖凝胶检测其大小和亮度，实验结果如图3所示。图3中Negative control表示为阴性对照，marker表示为DNAMarker。
从图3中可以看出，支原体处理后，LO2细胞以及HEK293细胞的11株单克隆已经没有支原体污染，但是WNT3和HK2均还存在支原体污染，分析原因可能是这两株细胞对支原体药物Plasmocin不敏感或者处理时传代细胞密度过大，因此需要加大浓度处理或减少处理细胞密度。
实施例1-2实验结果表明，本发明提供的支原体PCR通用引物扩增结果大小一致，结果稳定，可重复性好，且成本低，可长期用于实验细胞的支原体污染检测。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中新国际联合研究院
<120> 一种支原体PCR通用引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
ggcgaacggg tgagtaacac g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
cggataacgc ttgcgaccta tg 22
Claims (10)
1.一种支原体PCR通用引物，其特征在于，包括正向引物myco-F和反向引物myco-R；所述正向引物myco-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物myco-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用。
3.根据权利要求2所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取将待检测的细胞培养上清溶液进行加热处理，得到样品溶液；
（2）将样品溶液、所述支原体PCR通用引物溶液及PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR扩增处理，得到扩增产物；
（3）将扩增产物使用琼脂糖凝胶进行电泳分离，得到电泳结果图，依据所述电泳结果图上有无出现500bp大小的特异性条带鉴别待检测的溶液中支原体污染情况；如果在电泳结果图上出现500bp大小的特异性条带，表明待检测的溶液含有支原体，如果在电泳结果图上没有出现500bp大小的特异性条带，表明待检测的溶液不含有支原体。
4.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（1）所述加热处理的温度为100℃，加热处理的时间为5min。
5.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（2）所述支原体PCR通用引物溶液包括正向引物myco-F溶液和反向引物myco-R溶液；所述正向引物myco-F溶液为正向引物myco-F与水混合均匀的溶液，所述正向引物myco-F溶液的浓度为200 nm/l；所述反向引物myco-R溶液为反向引物myco-R与水混合均匀的溶液，浓度为200 nm/l。
6.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应体系，按体积份数计，包括：
Taq buffer溶液 2.5份；
dNTP 溶液 2.5份；
正向引物myco-F溶液 0.25份；
反向引物myco-R溶液 0.25份；
rTaq 酶溶液 0.2份；
样品溶液 1-2份；
无菌DEPC水 17.3份。
7.根据权利要求6所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，所述Taq buffer溶液为1X Taq buffer溶液，所述Taq buffer溶液的pH值为8.3；在所述Taq buffer溶液中，Tris-HCl的浓度为10mM，KCl的浓度为50 mM，MgCl2的浓度为1.5mM；所述dNTP 溶液的浓度为10 mM，所述dNTP包括dATP、dCTP、 dGTP及 dTTP；所述rTaq酶溶液的浓度为12.5U。
8.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增处理的条件为：
在95°C条件下预变性1min，然后进行扩展循环，最后在温度为72°C的条件下再延伸3min；
所述扩展循环为：先在温度为95°C的条件下变性1min，然后在温度为55°C的条件下退火1min，接着在温度为72°C的条件下延伸1min 30sec，循环的次数为35。
9.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（3）所述琼脂糖凝胶的质量体积比浓度为2.5g/L。
10.根据权利要求3所述的支原体PCR通用引物在鉴别支原体污染情况中的应用方法，其特征在于，步骤（3）所述电泳分离的条件为：在电压为120 V的条件下，电泳30分钟。
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