CN112646910A

CN112646910A - 一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112646910A
Application number: CN202110090852.4A
Authority: CN
Inventors: 吴森; 王绪敏; 方向东; 单广乐
Original assignee: Beijing Institute of Genomics of CAS
Current assignee: Beijing Institute of Genomics of CAS
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-04-13

Abstract

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物、试剂盒及检测方法。所述的引物组合包括以下核苷酸序列：检测Shigella boydiistr 80的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条核苷酸序列组成；检测Shigella boydiistrATCC9210的引物对由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条核苷酸序列组成；所述的引物组合中SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:4的浓度比为1:1:1:1。本发明提供的引物组合能准确检测出上述两种志贺菌株，所述检测方法具有特异性强、准确性好、操作简便、成本低的优点。

Description

一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

细菌性痢疾是我国多发肠道传染病之一，全年均可发生，以夏秋季多见，主要由志贺菌属(Shigella)引起。在伯杰手册(1984)中，志贺菌属分为4个群(种)：(1)A群：又称痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)，通称志贺氏痢疾杆菌。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。是惟一不能发酵甘露醇的一群志贺菌。(2)B群：又称福氏志贺菌(Shigellaflexneri)，通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型(含亚型及变种)，抗原构造复杂，各型间有交叉反应。(3)C群：又称鲍氏志贺菌(Shigellaboydii)，通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。(4)D群：即宋内志贺菌(Shigellasonnei)。抗原单一，只有一个血清型。是惟一具有鸟氨酸脱羧酶的一群志贺菌，宋内志贺菌有I相和II相两个交叉变异相。I相呈S型菌落，对小鼠有致病力，多自急性期感染病人标本中分离得。II相为R型菌落，对小鼠不致病，常从慢性患者或带菌者检出。

由于志贺菌在感染者的粪便中大量存在，也可能出现于健康携带者的粪便中，易污染食品和水源，可通过土壤、水源及其他媒介在人与人之间、人与动物之间相互传播引起感染或者发病，人群普遍易感，严重影响人类健康。因此，快速检测粪便及其他样品中该类病原菌，对预防、控制疾病的发生和流行至关重要。但常规检测这类致病菌需分离培养、生化和血清学鉴定等多个步骤，操作复杂，周期长(3-7天)，不利于卫生检疫、食品安全的检测监管，迫切需要开发快速、灵敏和特异的快速检测技术。

国内外针对快速检测技术的研究主要包括以下几个方面：(1)检测细菌某些专有的酶或产生的毒素的技术；(2)以检测细菌生化反应为基础的细菌自动鉴定系统；(3)检测细菌所特有的抗原的技术，通过抗原-抗体特异性反应来检测相应的病原菌，例如ELISA、胶体金技术等；(4)检测细菌的核酸：如核酸杂交、PCR(聚合酶链式反应)、基因芯片、脉冲场电泳分型技术等。

虽然这些技术或系统与常规检验方法相比，能够在较短时间内鉴定病原菌，但仍存在局限性：(1)这些技术和系统大多需要细菌的纯培养物进行鉴定，而得到细菌纯培养物，一般需要经过非选择性和/或选择性增菌培养、平板分离、纯培养这几个步骤，需要1-4天时间，仍然不能充分满足病原菌快速检测的需要；(2)某些技术或系统成本高，如全自动微生物分析系统、脉冲场电泳仪、细菌检测芯片系统等，虽然能够较快速和多目标检测，但仪器设备和运行费用昂贵，不利于推广，尽管已有研究致力于降低仪器设备和运行费用，如纳米可视芯片的开发，但实验时间和反应的信噪比有待进一步改善；(3)缺乏能分离富集多种目的菌的样品前处理技术。

中国专利CN102329861A公开了一种福氏志贺菌血清型检测用引物和使用所述引物的多重扩增。其中是根据gtrI、gtrII、oac、gtrIV、gtrV、gtrX、wzx_1-5和gtrIC基因，设计提供了一套(8对)特定性、退火温度一致的引物对待测样品进行多重扩增，定性检测福氏志贺菌血清型。然而，该多重扩增方法并不能区分Xv与X血清型。该专利在区分Xv与X血清型时，仍需进一步采用传统的IV抗血清拨片凝集反应，而玻片凝集法费时，所用抗血清试剂昂贵，且通过目测判断结果会导致错误的结果。此外，该专利公开的方法也不能有效区分Yv与Y血清型、以及4a与4av血清型。

因此，急需建立一种简便、快速、准确、成本低的志贺菌属相关菌种快速鉴定方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一组用于检测志贺菌属相关菌种的引物组合、包含该引物组合的检测试剂盒，以及采用该检测试剂盒对志贺菌属相关菌种进行检测的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供了一组用于检测志贺菌属相关菌种的引物组合，所述的引物组合包括以下核苷酸序列：检测Shigella boydiistr 80的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的两条核苷酸序列组成；检测Shigella boydiistrATCC9210的引物对由SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的两条核苷酸序列组成；所述的引物组合中SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:4的浓度比为1:1:1:1。

上述引物组合能准确检测出上述两种志贺菌株，其中，PCR扩增片段长度132bp的为Shigella boydiistr 80，PCR扩增片段长度270bp的为Shigella boydiistrATCC9210。

因此，本发明还请求保护上述引物组合在制备志贺菌属相关菌种的检测试剂盒和/或制剂中的应用。

另一方面，本发明提供了一种志贺菌属相关菌种的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括上述的引物组合。

进一步地，所述的检测试剂盒还包括PCR试剂，所述的PCR试剂包括MgSO₄、dNTPs、10×KOD-Plus-Neo Buffer和KOD-Plus-Neo。

另一方面，本发明提供了一种志贺菌属相关菌种的检测方法，是采用上述检测试剂盒进行PCR检测。

进一步地，所述的PCR检测的反应体系包括：10ng/μL待测样品基因组DNA 2μL，10μM引物各0.75μL，25mMMgSO₄3μL，2mMdNTPs 5μL，10×KOD-Plus-Neo Buffer 5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，ddH2O补至50μL。

进一步地，所述的PCR检测的反应程序为：94℃预变性90sec；98℃变性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸30sec，25个循环；68℃延伸10min。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的引物组合能准确检测出志贺菌属中的Shigella boydiistr 80和Shigella boydiistrATCC9210两种菌株，检测效率高。

(2)本发明的检测方法通过采用普通PCR技术，可实现志贺菌的快速检测，具有特异性强、准确性好、操作简便、成本低的优点，且对设备要求较低，尤其适用于动物卫生监督、海关检疫部门或医院等场所。

附图说明

图1为实施例2中待测样品的PCR检测结果。其中，泳道1为利用引物组合(Shigellaboydiistr 80引物对：Shigella boydiistrATCC9210引物对＝1：1)与两种菌DNA混合物进行PCR的结果；泳道2为marker，从上到下依次为40、50、75、100、200、300、400、500bp；泳道3为引物组合与DNA模板量加大一倍后的PCR结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

实施例1

引物设计：通过对20种完整的志贺菌株基因组进行比较基因组分析，找到两种志贺菌株的特有基因，选择其长度在100-350bp之间的基因片段进行设计。将二者在同一体系下进行常规PCR，PCR扩增片段长度135bp左右的为Shigella boydiistr 80，PCR扩增片段长度300bp左右的为Shigella boydiistrATCC9210。通过ABI2000基因分析仪进行片段长度确认，长度为132bp为Shigella boydiistr 80；长度270bp为Shigella boydiistrATCC9210。

针对两种菌株，设计的引物序列如下表1所示。

表1 引物序列

实施例2

一种志贺菌属相关菌种的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品基因组DNA；

(2)以样品基因组DNA为模板，利用实施例1中的引物进行PCR检测；

(3)通过PCR结果，判断待测样品的菌株类型。

其中，PCR反应体系如下表2，PCR反应程序如下表3。

表2 PCR反应体系

成分	含量(μL)
		基因组DNA(10ng/μL)	2
F引物(10μM)	0.75
		R引物(10μM)	0.75
MgSO4(25mM)	3
		dNTPs(2mM)	5
10×KOD-Plus-Neo Buffer	5
		KOD-Plus-Neo	1
ddH2O	32.5
		总计	50

表3 PCR反应程序

对两种菌分别进行DNA提取，并利用本发明PCR反应程序以及引物组合对进行混样PCR并进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度1％，

检测结果如图1所示，其中，图1泳道1为利用引物组合(Shigella boydiistr 80引物对：Shigella boydiistrATCC9210引物对＝1：1)与两种菌DNA混合物进行PCR的结果，泳道3为引物组合与DNA模板量加大一倍后的PCR结果，电泳结果显示采用本发明提供的引物组合获得的扩增产物条带清晰，长度区别明显，无弥散现象。

此外，本发明的引物组合的设计依据为志贺菌特有基因序列，该片段仅在志贺菌中存在，而不会出现在其他菌种的基因组中，因而拥有较好的特异性。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）

<120> 一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物、试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agactgtcct cagttgttca ggaatatgg 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcgtagcgt atcaggtgcc gttgtc 26

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcatcgtag ccagaggaat acagataac 29

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctacgatgca gcggtcggta atacac 26

Claims

1.一组用于鉴定志贺菌属相关菌种的引物组合，其特征在于，所述的引物组合包括以下核苷酸序列：检测Shigella boydiistr 80的引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条核苷酸序列组成；检测Shigella boydiistrATCC9210的引物对由SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的两条核苷酸序列组成；所述的引物组合中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4的浓度比为1:1:1:1。

2.权利要求1所述的引物组合在制备志贺菌属相关菌种的检测试剂盒和/或制剂中的应用。

3.一种志贺菌属相关菌种的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括PCR试剂，所述的PCR试剂包括MgSO₄、dNTPs、10×KOD-Plus-Neo Buffer和KOD-Plus-Neo。

5.一种志贺菌属相关菌种的检测方法，其特征在于，是采用权利要求3或4所述的检测试剂盒进行PCR检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR检测的反应体系包括：10ng/μL待测样品基因组DNA 2μL，10μM引物各0.75μL，25mMMgSO₄3μL，2mMdNTPs5μL，10×KOD-Plus-Neo Buffer 5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，ddH₂O补至50μL。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR检测的反应程序为：94℃预变性90sec；98℃变性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸30sec，25个循环；68℃延伸10min。