CN109628618A - 用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1‑20所示的引物和SEQ ID NO.25‑34所示的探针。本公开通过以上所述的引物和探针建立了检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药基因的核酸试剂、试剂 盒、系统及方法。
背景技术
1993年，WHO宣布“全球结核紧急状态”，至今结核病仍是全球面临的最严重传染病威胁。结 核病是全世界十大死因之一。2016年，1040万人患有结核病，170万人因该病死亡(包括40万艾滋 病毒感染者)。耐多药结核病仍然是一项公共卫生危机和卫生安全威胁。世卫组织估计，有60万利福 平(最有效的一线药物)耐药新发病例，其中有49万耐多药结核病患者。2016年，约有6.2％的耐多 药结核病为广泛耐药结核病。
抗结核药物已经使用了几十年，对一种或更多药物产生耐药的菌株已在所调查的每个国家得到记 载。在2000年和2016年期间，估计有5300万人的生命通过结核病诊断和治疗得以挽救。尽管结核 病控制已取得了明显进步，但进展还远不够，特别是耐药结核检测、治疗上存在巨大的缺口。耐药性 是一个自然进化的过程。结核分枝杆菌的耐药性来自于自发的染色体突变，而患者在精心设计的联合 用药方案治疗下将防止耐药菌株的出现对耐药结核病患者早期提供个体化的高效抗痨治疗，可以提高 结核的治愈率。而个体化治疗必须依靠药敏结果作为支撑，所以早期进行结核耐药检测是有效的控制 结核病和结核病患者的一个重要组成部分。
许多国家仍依赖使用已久的被称为痰涂片镜检的方法来诊断结核病。经过培训的实验室技术员在 显微镜下观察痰标本，检查是否存在结核杆菌。利用显微镜仅可发现半数结核病例，不能发现耐药情 况。耐药结核诊断的金标准是采用结核菌液体培养系统联进行快速培养后，再应用罗氏绝对浓度法进 行结核药敏检测从而获取结核杆菌表型药敏结果。此方法耗时较长，平均6-8周的试验时间极易造成 结核治疗的延误，特别是骨关节结核外科手术后，如无法早期进行个体化化疗，会增加术后复发的发 生率。通过分子诊断技术可将时间缩短到2-48小时，其检测时间大幅缩短。这使早期制定个体化化 疗方案进行抗痨成为可能，从而有效防止结核治疗过程中的获得性耐药，并可避免耐药结核的无效化 疗，提高其治愈率。这是分子诊断技术应用于临床的一个巨大优势。但PCR技术无法实现高通量并行分析，受其瓶颈制约。
发明内容
本公开的目的是提供一种快速、准确、高通量的并行检测结核分枝杆菌链霉素、乙胺丁醇、氟喹 诺酮类、氨基糖苷类及环肽类耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法。
为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中， 所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ IDNO.1-20所示的引物和SEQ ID NO.25-34所示的探针。
可选地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-20所示的引物的含量各 自为0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、 0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM、 0.4～0.6μM、0.5～1.0μM和0.1～0.3μM，分别由SEQ ID NO.25-34所示的探针的含量各自为0.1～0.3μM、 0.15～0.35μM、0.2～0.4μM、0.25～0.45μM、0.3～0.5μM、0.2～0.4μM、0.15～0.35μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM 和0.25～0.45μM。
可选地，所述核酸试剂还包括阴性内质控和阳性内质控；
所述阴性内质控含有SEQ ID NO.21-22所示的引物和SEQ ID NO.35所示的探针，所述阳性内质 控含有SEQ ID NO.23-24所示的引物和SEQ ID NO.36所示的探针。
可选地，SEQ ID NO.25-27所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.28-30所示的探针具有第 二荧光标记；SEQ ID NO.31-33所示的探针具有第三荧光标记；SEQ IDNO.34-36所示的探针具有第 四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相 同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧 光标记、ROX荧光标记、CY5荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
可选地，所述结核分枝杆菌耐药性包括结核分枝杆菌链霉素耐药性、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药 性、结核分枝杆菌氟喹诺酮类耐药性、结核分枝杆菌氨基糖苷类耐药性和结核分枝杆菌环肽类耐药性 中的至少一种。
本公开第二方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方 面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP 和水中的至少一种。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试 剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括装载有权利要求4 或5所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通 道、第三荧光通道和第四荧光通道所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述 第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧 光通道、TAMRA荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道和Quasar670荧光通道中的一种；所述计 算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器 中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰 曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶 解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃ 对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值 为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道 有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性； 第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位 耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基 因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖 苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴 性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开第五方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其中，该方法包括：采用权利 要求4或5所述的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括 第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通 道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光 通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；并且进行如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰 曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶 解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃ 对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值 为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道 有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性； 第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位 耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基 因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖 苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴 性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开的有益效果在于：
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测结核分枝杆菌耐药性，避免了涂片、培养及 RT-PCR检测等方法操作时间长及操作繁琐，实现快速、简便、灵敏、特异的自动结果判定，达到如 下的检测效果：
(一)单管多重检测
本公开可以一次性的检测结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL第43、88位、耐药基因rrs第513、 516、905-908位，乙胺丁醇耐药基因embB第306位，氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90、91、94位， 氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1401、1402、1484位，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节 省了时间、人力和试剂成本。
(二)便捷的操作
临床样本可通过采样器直接放置于ParaDNA的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了 昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。
(三)一体化解决方案
本公开针对结核分枝杆菌多种耐药检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的一体 化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光PCR扩增及自动化结果的判定。
(四)灵敏度高
本公开能够实现16个耐药位点的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到 102CFU/ml，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当。
(五)特异性好
本公开的核酸试剂中，所有引物都经过BLAST比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅能 够将检测目标相互区分，而且还能与其他种属相近、生存环境相同的细菌区别开，这包括堪萨斯分枝 杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、 鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶然分枝 杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄 球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于 说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括 分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-20所示的引物和SEQ ID NO.25-34所示的探 针。
本公开通过ParaDNA及Hybeacon探针技术检测结核分枝杆菌耐药性，避免了涂片、培养及 RT-PCR检测等方法操作时间长及操作繁琐，能够快速、准确、高通量的并行检测结核分枝杆菌链霉 素、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、氨基糖苷类及环肽类耐药性。
Hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的Tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对 扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针 在一个反应体系内共扩增的问题，即评估Tm值、目标对应探针的Tm值的差值、GC含量、避免出 现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种肠道病毒， 特异性良好并且覆盖度高。
进一步地，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-20所示的引物的含量 各自可以为0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、 0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、 0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM和0.1～0.3μM，分别由SEQ ID NO.25-34所示的探针的含量各自 可以为0.1～0.3μM、0.15～0.35μM、0.2～0.4μM、0.25～0.45μM、0.3～0.5μM、0.2～0.4μM、0.15～0.35μM、 0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.25～0.45μM。
根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阴性内质控和阳性内质控。进一步地， 所述阴性内质控可以含有SEQ ID NO.21-22所示的引物和SEQ ID NO.35所示的探针，所述阳性内质 控可以含有SEQ ID NO.23-24所示的引物和SEQ ID NO.36所示的探针。这时，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.21-24所示的引物的含量各自可以为0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、 0.5～1.0μM和0.1～0.3μM，分别由SEQ IDNO.35-36所示的探针的含量各自可以为0.1～0.3μM和 0.2～0.4μM。通过加入所述阴性内质控和阳性内质控，既能够准确鉴定结核分枝杆菌，避免造成假阳 性的耐药结果；同时可以有效地提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
进一步地，可以根据探针各自的Tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的 扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，SEQ ID NO.25-27所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.28-30所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.31-33所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.34-36所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标 记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、 VIC荧光标记、TAMRA荧光标记、ROX荧光标记、CY5荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。 作为一种特别优选的实施方式，SEQID NO.25-27所示的探针具有FAM荧光标记；SEQ ID NO.28-30 所示的探针具有TAMRA荧光标记；SEQ ID NO.31-33所示的探针具有JOE荧光标记；SEQ ID NO.34-36所示的探针具有CY5荧光标记。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。 探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基 罗丹明，CY5为5H-吲哚菁，HEX为六氯-6-甲基荧光素，ROX为6-羧基-X-罗丹明，VIC为购自ABI 公司的染料。
根据本公开，所述结核分枝杆菌耐药性可以包括结核分枝杆菌链霉素耐药性、结核分枝杆菌乙胺 丁醇耐药性、结核分枝杆菌氟喹诺酮类耐药性、结核分枝杆菌氨基糖苷类耐药性和结核分枝杆菌环肽 类耐药性中的至少一种。
本公开第二方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方 面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP 和水中的至少一种。
本公开的试剂盒能够实现快速、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对结核分 枝杆菌链霉素、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、氨基糖苷类及环肽类耐药性同时进行检测的敏感性、特异性 和简便性。
本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试 剂盒中的用途。
本公开第四方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括装载有如上所述的 核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧 光通道和第四荧光通道所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通 道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA 荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道和Quasar670荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储 器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机 程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰 曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶 解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃ 对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值 为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道 有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性； 第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位 耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基 因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖 苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴 性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
本公开第五方面：提供一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其中，该方法包括：采用如上 所述的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通 道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第 三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA 荧光通道或CY5荧光通道；并且进行如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰 曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶 解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应 的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃ 对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值 为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道 有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性； 第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位 耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基 因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖 苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴 性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
其中，所述待测样本可以为病人痰液样本。
本公开的方法能在80分钟内敏感特异地实现结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL第43、88位， 耐药基因rrs第513、516、905-908位，乙胺丁醇耐药基因embB第306位，氟喹诺酮类耐药基因gyrA 第90、91、94位，氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1401、1402、1484位的系统筛检，检测流程 简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在Biosearch(USA)公司合成。
实施例
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素， JOE为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表 2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表1
表2
2、样本处理
常规方法采集病人痰液样本后，用NaOH的方法将痰液液化。
使用与ParaDNA配套的采样器采集处理后的痰液样本，直接置于ParaDNA的反应器中即可扩增。
3、构建Hybeacon探针技术检测体系
聚合酶Phire Hot Start II DNA Polymerase(货号F122L)，Mg2+、dNTPS购自ThermoFisher公司， 其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为ParaDNA。
反应体系的配制如下：
按照如下操作配制反应体系：总体系30μL。2×PCR Buffer 15μL，氯化镁溶液3-4mM，dNTPS 为1～1.5mM，上游引物0.4～0.6μM，下游引物0.8～3μM，Hybeacon探针90～120nM，聚合酶1～3μL， 模板5μL，具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。
表3
| SEQ ID NO | 终浓度(μM) | SEQ ID NO | 终浓度(μM) |
| 1 | 1 | 19 | 0.8 |
| 2 | 0.2 | 20 | 0.2 |
| 3 | 0.8 | 21 | 1 |
| 4 | 0.2 | 22 | 0.5 |
| 5 | 0.8 | 23 | 0.8 |
| 6 | 0.25 | 24 | 0.2 |
| 7 | 0.6 | 25 | 0.2 |
| 8 | 0.3 | 26 | 0.3 |
| 9 | 0.8 | 27 | 0.25 |
| 10 | 0.3 | 28 | 0.35 |
| 11 | 0.8 | 29 | 0.4 |
| 12 | 0.3 | 30 | 0.3 |
| 13 | 0.7 | 31 | 0.25 |
| 14 | 0.5 | 32 | 0.2 |
| 15 | 1.0 | 33 | 0.2 |
| 16 | 0.5 | 34 | 0.35 |
| 17 | 1.0 | 35 | 0.2 |
| 18 | 0.5 | 36 | 0.3 |
反应条件：选择FAM、JOE和TAMRA作为报告基团，反应程序如下：98℃，60s，(98℃，10s， 65℃，10s，30～40个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升 率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。
4、特异性验证
选择堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆 菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢 分枝杆菌、偶然分枝杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、 大肠杆菌、表皮葡萄球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等临床样本 (上述样本均来源于国家CDC)作为特异性评估样本，采用系统检测中的采样器采集痰液后，利用 前期建立和优化的反应条件在ParaDNA上进行检测。
反应结果判断：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若FAM荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解 峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；FAM荧光通道有Tm值为70.8℃对应的 溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；FAM荧光通道有Tm值为65.1℃对 应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；TAMRA荧光通道Tm值为65℃ 对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；TAMRA荧光通道有Tm值为 67.6℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；TAMRA荧光通道 有Tm值为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；JOE 荧光通道有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位 耐药性；JOE荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA 第94位耐药性；JOE荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽 类耐药基因rrs第1401-1402耐药性；CY5荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具 有氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；CY5荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲 线判定为阴性内质控合格；CY5荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开的核酸试剂能够 有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。
5、最低检出限验证
评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μL的结核分枝杆菌链霉素耐药基因、乙胺丁醇耐药 基因、氟喹诺酮类耐药基因、氨基糖苷类及环肽类耐药基因的核酸梯度稀释为104拷贝/μL、103拷贝/μL、 102拷贝/μL、10拷贝/μL、100拷贝/μL，作为最低检出限评估的模板。按照以上所述反应体系及反应 程序进行试验。
结果显示本公开试剂盒的最低检出限可达到10拷贝/反应。
6、覆盖度验证
选择痰液样本作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。
结果显示对所检500份痰液样本均可覆盖检测出。
7、试剂盒的保存期试验
分别取强阳性105CFU/mL和弱阳性103CFU/mL的结核分枝杆菌链霉素耐药基因、乙胺丁醇耐药 基因、氟喹诺酮类耐药基因、氨基糖苷类及环肽类耐药基因的核酸模板为评估用检测样本，在第0天 时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、 60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期 至少为一年。
对比例
1、引物、探针合成
按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。探针中FAM为6-羧基荧光素，JOE为 2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，TAMRA为6-羧基四甲基罗丹明，CY5为5H-吲哚菁。表5的探 针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。
表4
表5
2、特异性验证
按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。
3、最低检出限验证
按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。
表6
| 检测目标 | 实施例 | 对比例 |
| rpsL 43 | 10拷贝/反应 | 100拷贝/反应 |
| rpsL 88 | 10拷贝/反应 | 50拷贝/反应 |
| rrs 513 | 10拷贝/反应 | 100拷贝/反应 |
| rrs 516 | 10拷贝/反应 | 50拷贝/反应 |
| rrs 905-908 | 10拷贝/反应 | 10拷贝/反应 |
| embB 306 | 10拷贝/反应 | 10拷贝/反应 |
| gyrA 90/91 | 10拷贝/反应 | 100拷贝/反应 |
| gyrA 94 | 10拷贝/反应 | 50拷贝/反应 |
| rrs1401/1402 | 10拷贝/反应 | 10拷贝/反应 |
| rrs 1484 | 10拷贝/反应 | 50拷贝/反应 |
由表6可知，对于样本中痕量的分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL第43、88位、耐药基因rrs第513、 516、905-908位，乙胺丁醇耐药基因embB第306位，氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90、91、94位， 氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1401、1402、1484位核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测 能力。
4、覆盖度验证
按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。
表7
| 检测目标 | 实施例 | 对比例 |
| rpsL 43 | 10 | 10 |
| rpsL 88 | 10 | 10 |
| rrs 513 | 10 | 10 |
| rrs 516 | 10 | 10 |
| rrs 905-908 | 10 | 8 |
| embB 306 | 10 | 8 |
| gyrA 90/91 | 10 | 9 |
| gyrA 94 | 10 | 10 |
| rrs1401/1402 | 10 | 8 |
| rrs 1484 | 10 | 10 |
由表7可知，本公开试剂盒的检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。
由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出结核分枝杆菌多种耐药基因，特异 性高，最低检出限更低，覆盖度更广。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在 本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开 的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可 以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说 明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其 同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120> 用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂、试剂盒、系统及方法
<130> 12324ABT
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagcgtcgt ggtgtatgca c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaccttccga agcgccgag 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacctgcag gagcactcga t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgatcttgt agcgcacacc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attgacggta ggtggagaag a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacaacgctc gcaccctac 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtggagaag aagcaccgg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taattccgga caacgctcgc a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctaacgcat taagtacccc g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaattaatc cacatgctcc g 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catgtcatcg gcgcgaatt 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agttggacat gtagccggc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtcggttgc cgagaccat 19
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgggccatg cgcacca 17
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
accatgggca actaccacc 19
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaccagggct gggccat 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatcgcagat cagcaacgct 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
accgactttc atgacgtgac g 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaagtcggta acacccgaag c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttccggtacg gctaccttgt t 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tataccttcc tcgccgccga 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acctggatgc ccaggatctc t 21
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tttggacctg cgagcg 16
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcgtgtacac caccactccg aag 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tggtgcgcgg cggccgggtg aag 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctgccaact acgtgccagc agc 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgtgccagca gctgcggtaa ta 22
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg 30
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gacggctaca tcctgggcat g 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acctgcacgg cgacgtgtcg atc 23
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgatgcgtcg atctacgaca g 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttcctgggcc ttgtacacac cg 22
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agctgtcgaa ggtgggatcg gcgattg 27
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtgcacacc ttgatcgcca c 21
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttctgacct gaaggctct 19
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgaagggcag cccgcagcgt c 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
caacttcacg cgggcaacct t 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acaacctgca ggagcactc 19
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgatcttgt agcgcacacc a 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgacggtagg tggagaagaa g 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acgctcgcac cctacgtatt a 21
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaagaagcac cggccaact 19
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
taattccgga caacgctcgc a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tagctaacgc attaagtacc c 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
catcgaatta atccacatgc t 21
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atgtcatcgg cgcgaatt 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atagttggac atgtagccgg c 21
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcggttgccg agaccat 17
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggctgggcca tgcgca 16
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agaccatggg caactacca 19
<210> 52
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
caccagcggg tagcgca 17
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
agtaatcgca gatcagcaac g 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgggtgttac cgactttcat g 21
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aagccagtgg cctaaccctc 20
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acggctacct tgttacgact t 21
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tataccttcc tcgccgc 17
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tggatgccca ggatctct 18
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
atggcggtgt ttgcagattt 20
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gattgatagc aacaactgaa tagccaa 27
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cgtgtacacc accactccga agaagccg 28
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggtgcgcggc ggccgggtga agga 24
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ccggccaact acgtgccagc ag 22
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgtgccagct gccgcggtaa tac 23
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac ggg 33
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gacggctaca tcctgggcat g 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgcatggcga cgcgtcgatc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acgcgtcgat ctacgacagc 20
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ttcccgtgcc ttgtacacac cg 22
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
agctgtcgaa ggtgggatcg gcgattggga 30
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
agtgcacacc ttgatcgc 18
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cctgaaggct ctgcgcggac t 21
Claims (9)
1.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的SEQ ID NO.1-20所示的引物和SEQ ID NO.25-34所示的探针。
2.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，相对于1μM的SEQ ID NO.1所示的引物，分别由SEQ ID NO.2-20所示的引物的含量各自为0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.1～0.3μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.2～0.4μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM、0.4～0.6μM、0.5～1.0μM和0.1～0.3μM，分别由SEQ ID NO.25-34所示的探针的含量各自为0.1～0.3μM、0.15～0.35μM、0.2～0.4μM、0.25～0.45μM、0.3～0.5μM、0.2～0.4μM、0.15～0.35μM、0.1～0.3μM、0.1～0.3μM和0.25～0.45μM。
3.根据权利要求1所述的核酸试剂，其中，所述核酸试剂还包括阴性内质控和阳性内质控；
所述阴性内质控含有SEQ ID NO.21-22所示的引物和SEQ ID NO.35所示的探针，所述阳性内质控含有SEQ ID NO.23-24所示的引物和SEQ ID NO.36所示的探针。
4.根据权利要求3所述的核酸试剂，其中，SEQ ID NO.25-27所示的探针具有第一荧光标记；SEQ ID NO.28-30所示的探针具有第二荧光标记；SEQ ID NO.31-33所示的探针具有第三荧光标记；SEQ ID NO.34-36所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自FAM荧光标记、JOE荧光标记、HEX荧光标记、VIC荧光标记、TAMRA荧光标记、ROX荧光标记、CY5荧光标记和Quasar670荧光标记中的一种。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的核酸试剂，其中，所述结核分枝杆菌耐药性包括结核分枝杆菌链霉素耐药性、结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性、结核分枝杆菌氟喹诺酮类耐药性、结核分枝杆菌氨基糖苷类耐药性和结核分枝杆菌环肽类耐药性中的至少一种。
6.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、DNA聚合酶、镁离子、dNTP和水中的至少一种。
7.权利要求1～5中任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒中的用途。
8.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的系统，该系统包括装载有权利要求4或5所述的核酸试剂的PCR仪、计算装置和输出装置，所述PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、HEX荧光通道、VIC荧光通道、TAMRA荧光通道、ROX荧光通道、CY5荧光通道和Quasar670荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性；第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
9.一种用于检测结核分枝杆菌耐药性的方法，其中，该方法包括：采用权利要求4或5所述的核酸试剂，对待测样本的DNA进行PCR扩增；进行所述PCR扩增的PCR仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自FAM荧光通道、JOE荧光通道、TAMRA荧光通道或CY5荧光通道；并且进行如下的判别：
空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若第一荧光通道有Tm值为70.4℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第43位耐药性；第一荧光通道有Tm值为70.8℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rpsL第88位耐药性；第一荧光通道有Tm值为65.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第513位耐药性；第二荧光通道Tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第516位耐药性；第二荧光通道有Tm值为67.6℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有链霉素耐药基因rrs第905-908位耐药性；第二荧光通道有Tm值为60.2℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有乙胺丁醇耐药基因embB第306位耐药性；第三荧光通道有Tm值为66.3℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第90-91位耐药性；第三荧光通道有Tm值为63.1℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氟喹诺酮类耐药基因gyrA第94位耐药性；第三荧光通道有Tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1401-1402耐药性；第四荧光通道有Tm值为70℃对应的溶解峰曲线判定为样品具有氨基糖苷类及环肽类耐药基因rrs第1484耐药性；第四荧光通道有Tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阴性内质控合格；第四荧光通道有Tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。
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