JP5042725B2 - プライマーおよび該プライマーを用いた細菌の検出方法 - Google Patents
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- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号1で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号2で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号2で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号1で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号3で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号4で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号4で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号5で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号6で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号7で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号8で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、腸内細菌科細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号9で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、腸内細菌科細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号10で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号10で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、シュードモナス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号11で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号11で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、シュードモナス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号12で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号12で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、バチルス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号13で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号13で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、バチルス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(a)配列番号14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号14で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、スタフィロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(c)配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号9で表される塩基配列において1もしくは2個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、スタフィロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
一実施形態において本発明は、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、(a)配列番号1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと(c)配列番号2で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセットに関する。上記プライマーセットにおけるフォワードプライマーとして、(a)のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、配列番号1で表される塩基配列において1もしくは2個、好ましくは1個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(a)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。同様に上記プライマーセットにおけるリバースプライマーとして、(c)のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、(d)配列番号2で表される塩基配列において1もしくは2個、好ましくは1個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて(c)のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において上記プライマーセットをCM1プライマーセットと称する。
本発明はまた、本発明の上記プライマーセットを用いて増幅反応を行って増幅産物を検出することにより該プライマーセットが対象とする細菌、すなわち標的細菌を検出する方法に関する。
本発明はまた、本発明のプライマーセットを用いて細菌を検出することにより、食品中の菌叢を評価する方法に関する。本明細書において食品中の菌叢の評価には、食品中に存在する標的細菌の状態に関する評価全般をさし、被検食品中に存在する細菌属の同定、各細菌属の定量、総生菌数の定量および細菌属の存在比の同定が包含される。食品の汚染評価においては、一般的に、細菌の菌数が1gあたり105を越える場合に、食品が汚染されていると判定される。本発明の細菌の検出方法により、各標的細菌の細菌数をオーダーレベルで測定でき、各細菌の数または総細菌数が1gあたり105を越えるかどうかを迅速かつ簡便に判定できるため、食品の汚染評価に好適である。
本発明はまた、本発明のプライマーセットから選択される少なくとも1つのプライマーセットを含む、食品中の菌叢を評価するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマーセットのうちの1つを含むものでもよいし、複数種のプライマーセットを含むものでもよい。本発明のキットは、前記プライマーセットのほか、必要に応じて遺伝子増幅及び増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、酵素、dNTP、NTP、緩衝液、減菌水、標品(標準菌株、標準DNAなど)等を含んだものとして構成される。
<DNAの調製>
Corynebacterium renale NBRC 15290(C-1株)、Leuconostoc mesenteroides NBRC 3426(L-1株)、Pantoea agglomerans NBRC 12686(Pa-1株)、Pseudomonas putida NBRC 100650(Ps-1株)、Bacillus cereus ATCC13061(B-1株)、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993(S-1株)をそれぞれTryptic Soy Broth (Difco)で35℃、一晩培養して、12,000rpm、5分間の遠心分離によって集菌したものをミリQ水に再懸濁し、菌濃度を103、104、105、106cfu/mLとした。各菌液からDNeasy Tissue Kit(QIAGEN)を用いて、DNA溶液を調製した。
定量的PCR反応は、得られたDNA溶液およびSYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa)を用いて行った。プライマーセットとして、配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号2の塩基配列からなるプライマーとのCM1プライマーセット、配列番号1の塩基配列からなるプライマーと配列番号3の塩基配列からなるプライマーとのCM2プライマーセット、配列番号4の塩基配列からなるプライマーと配列番号5の塩基配列からなるプライマーとのL1プライマーセット、配列番号6の塩基配列からなるプライマーと配列番号7の塩基配列からなるプライマーとのL2プライマーセット、配列番号8の塩基配列からなるプライマーと配列番号9の塩基配列からなるプライマーとのEnプライマーセット、配列番号10の塩基配列からなるプライマーと配列番号11の塩基配列からなるプライマーとのPsプライマーセット、配列番号12の塩基配列からなるプライマーと配列番号13の塩基配列からなるプライマーとのBプライマーセット、ならびに配列番号14の塩基配列からなるプライマーと配列番号9の塩基配列からなるプライマーとのSプライマーセットをそれぞれ用いた。
<DNAの調製>
食品から分離し、同定キットにより同定したCorynebacterium aquaticum (C-2株)、Leuconostoc citreum (L-2株)、Pantoea agglomerans (Pa-2株)、Pseudomonas putida (Ps-2株)をそれぞれTryptic Soy Brothで35℃、一晩培養して、12,000rpm、5分間の遠心分離によって集菌したものをミリQ水に再懸濁し、菌濃度を106cfu/mLとした。各菌液からDNeasy Tissue Kitを用いてDNA抽出液を調製し、これらを鋳型として以下のPCR反応を行った。PCR反応液容量は25μLとし、DNA抽出液2μL、2.5mM dNTP 2μL、25mM MgCl2 1.5 μL、実施例1で用いた10μMフォワードプライマーおよび10μMリバースプライマー各0.5μL 、AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) 0.25μL、×10 PCR buffer II(Applied Biosystems)2.5 μL、の組成で行った。PCR反応条件は、95℃ 10分間の後、95℃ 5秒間の熱変性と60℃ 30秒間のアニーリング処理および伸長反応を1サイクルとして、35サイクル行った。得られたPCR産物を、TOPO TA cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) を用いてTOPO CloningベクターpCR4-TOPOにライゲーションした後、大腸菌DH5αコンピテントセルにトランスフォームした。この大腸菌を培養して、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)を用いてPCR産物を導入した標準プラスミドを回収した。なお、本実施例で用いた菌株のGenBank番号は、C-2株:D45057、L-2株:AF111949、Pa-2株:AY395010、Ps-2株:AY450556である。
得られた各標準プラスミドを、1反応あたり106、105、104、103、102、101コピーとなるように添加して、実施例1と同様に、4つのプライマーセットを用いて定量的PCR反応を行った。1反応あたりのプラスミド量が101〜106コピーの範囲でコピー数とCt値に直線性があることを確認した(図2)。すなわち、本発明のプライマーセットを用いて、該プライマーセットが検出対象とする各細菌の16S rDNAのコピー数を定量できることが示された。
実施例1と同様にして、図3に示す各菌株(標準菌株以外は食品から分離し、市販の同定キットによって属種を同定した)を培養して菌濃度を106 cfu/mL相当とした菌液からDNAを抽出し、定量的PCR反応を行った。結果を図3に示す。判定結果の基準は以下のとおりである。
食品として、市販のキャベツ、キュウリ、タマネギ、ニンジン、レタスを用いた。各食品から細菌汚染が少ない部分を採取して、各食品1gあたり103個、104個、105個、106個程度となるようにC-2株、L-2株、Pa-2株、Ps-2株、B-1株、S-1株をそれぞれ接種した。菌を接種した各食品に9倍量のリン酸緩衝液(pH7.2)を加えてストマッカー処理した。これらの処理液からDNAを抽出し、実施例1と同様にして定量的PCR反応を行った。また、食品毎に各プライマーセットを用いた場合の定量的PCR反応における各菌株の検量線を作成した。その結果、接種した菌量が104log cfu/g以上の食品検体において、食品中の各標的細菌を定量的に検出できることを確認した。キャベツについて作成した検量線を図4に示す。
食品検体として、市販のキャベツ、キュウリ、タマネギ、ニンジン、レタス、ポテトサラダを用いた。各食品検体に9倍量のリン酸緩衝液(pH7.2)を加えてストマッカー処理した。これらの処理液からDNAを抽出し、実施例1と同様にして定量的PCR反応を行った。各検体で得られたCt値から、実施例4で作成した検量線を用いて各検体における各細菌属の菌数を算出した。結果を図5及び図6に示す。平板培養法により求めた各細菌属の菌数を、*印を付して併記した。
Claims (11)
- コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号2で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、コリネバクテリウム属細菌およびミクロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号3で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ロイコノストック属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号4で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - ロイコノストック属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、ロイコノストック属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 腸内細菌科細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、腸内細菌科細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - シュードモナス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、シュードモナス属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号10で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号11で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - バチルス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、バチルス属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号12で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号13で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - スタフィロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の(a)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の(c)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、スタフィロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセット:
(a)配列番号14で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 請求項1〜8に記載のプライマーセットから選択される少なくとも1つのプライマーセットを用いて増幅反応を行って増幅産物を検出することを含む、細菌の検出方法。
- 請求項9に記載の方法を用いて細菌を検出し、定量することを含む、食品中の菌叢を評価する方法。
- 請求項1〜8に記載のプライマーセットから選択される少なくとも1つのプライマーセットを含む、食品中の菌叢を評価するためのキット。
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