CN103353410A - 一种用于水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法 - Google Patents

Abstract

一种用于水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，采集水样后，采用预处理后的微孔玻璃纤维滤膜对所采集的水样进行过滤，富集水样中藻类细胞于滤膜上；将富集截留有藻类细胞的微孔玻璃纤维滤膜放置于具塞比色管中，加入蒸馏水和氧化剂进行消解，消解完毕后过滤并收集滤液至具塞比色管中定容；对定容后的液体同时进行氮磷含量的测试，由于引入新的氧化剂，藻类细胞中的氮和磷可在同一过程中完成消解，不仅减少对样品的需求量，减少了采样的时间需求与采样成本，较少的样品需求量可以有效的减少实验时间，保证样品在短时间内完成分析，避免样品的长期放置导致样品的质量发生变化。这大大提高了实验效率，同时降低了实验的耗材成本与人力成本。

Description

一种用于水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法

技术领域

本发明涉及化学分析领域，尤其是一种对水中藻类细胞内氮磷元素含量测量的前处理方法。 

背景技术

藻类是一种在水中悬浮生活的微小植物，广泛分布于全球海洋与淡水水体中，对生源要素的生物地球化学循环起到了重要的影响。近年来，在淡水生态学与生物地球化学研究中广泛的开展的藻类计量化学的研究工作，需要对水体中藻类细胞开展元素含量或物质组成分析研究，以明确藻类细胞体内元素组成对环境变化的响应过程。氮、磷等营养元素是影响藻类生长的主要物质，是计量化学研究的主要关注对象。 

目前常用的测量藻类细胞内氮磷含量的处理方法通常来自于水域生态系统观测规范（见《水域生态系统观测规范》，中国生态系统研究网络科学委员会编，中国环境科学出版社2007 年出版），该规范认为水体中大部分悬浮物是藻类，通过沉淀与膜滤处理实现水中有机物（主要是藻类细胞）的分离富集。完成藻类分离富集后，使用元素分析仪测量氮素，或基于现行水质监测分析方法（见《水和废水监测分析方法》（第四版），国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会编，中国环境科学出版社2002年出版）分别采用高温消解测量藻类细胞内氮元素含量和磷元素含量。 

目前常用的测试方案对展开水体中藻类细胞内氮磷元素含量的分析研究存在明显的不足： 

1）在实际处理过程中，无论是采用有机元素分析仪测量藻类细胞的氮含量或者选用比色法测量藻类中的氮或磷含量，每种方法都只能测量一种元素的含量，分析中对同一水样通常需要准备2个以上样品满足测试要求。重复取样不仅增加了对样品的需求量，也增加了样品采集和前处理的成本。

2）目前通用氮磷的消解过程所配置的氧化剂是不同的，氮磷的消解需要单独进行，增加了室内前处理的耗材与时间消耗，也增加了人力、物理投入。 

3）在同一区域采集的样品，由于环境的时空变化性，难以保证在分别测量氮、磷含量时取样的完全一致性。因样品本身的非均质性与取样过程中操作带来的差异难以克服，致使氮、磷测量结果容易出现较大偏差。尤其当对氮采用元素分析仪进行微量分析而对磷采用消解测试时，两套指标所使用方法本身的检出限和灵敏度均不在一个数量级，所获结果的误差势必存在数量级上的差别，从而给准确分析藻类细胞内氮磷含量造成了较大障碍。 

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种样品需求少，处理成本低，能够同时完成藻类细胞内氮磷的消解，测量结果准确可靠的一种水体中藻类细胞内氮磷元素含量测量的前处理方法。 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种用于水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，采集水样后，采用预处理后的微孔玻璃纤维滤膜对所采集的水样进行过滤，富集水样中藻类细胞于滤膜上；将富集截留有藻类细胞的微孔玻璃纤维滤膜放置于具塞比色管中，加入蒸馏水和氧化剂进行消解，消解完毕后过滤并收集滤液至具塞比色管中定容；对定容后的液体同时进行氮磷含量的测试。

所述水样采集步骤中，对于取自自然界水体中的水样，可对水样进行预沉淀去除密度较大的无机泥沙等颗粒，进而使用浮游动物网过滤水样，去除浮游动物等，最后使用微孔玻璃纤维滤膜过滤水样，将藻类细胞截留于滤膜表面。 

所述水样采集步骤中，对于取自室内培养的水样，由于不含浮游动物和大颗粒无机泥沙，可直接使用微孔玻璃纤维滤膜过滤，以截留藻类。 

水样过滤后，使用蒸馏水对富集截留藻类细胞的滤膜进行过滤以清洗残留于滤膜上藻类细胞外表层的氮磷物质。 

所述氧化剂为质量比2∶1的过硫酸钾和硼酸溶于1.5M的氢氧化钠溶液中配制而成，配置后氧化剂溶液中的过硫硫酸、硼酸和氢氧化钠的质量比为150∶75∶42。该氧化剂在20℃时的初始pH为11.2~11.5。 

消解的条件是：将富集截留有藻类细胞的微孔滤膜装入具塞比色管，将具塞比色管的试管塞旋紧，放置在温度120℃、压力1.1~1.3kg/cm²条件下消解30分钟，自然冷却，使用经预处理后的微孔玻璃纤维滤膜过滤消解后的水样，去除悬浮物，收集滤液至具塞比色管中用蒸馏水进行定容。经过此步骤后，藻类的氮元素与磷元素在一次消解过程中转化为了硝酸盐与磷酸盐。 

所述微孔玻璃纤维滤膜的孔径为0.7μm，其预处理方法具体为： 

1）微孔滤膜在450℃条件下烘焙4小时，去除滤膜上含有的有机杂质

2）冷却至室温后用10％的盐酸漂洗，后用蒸馏水清洗滤膜；

3）在65℃干燥48h后存放于干燥器或低温冷冻保存。

本发明的积极效果是： 

引入新的氧化剂，藻类细胞中的氮和磷可在同一过程中完成消解。不仅减少对样品的需求量，减少了采样的时间需求与采样成本。较少的样品需求量可以有效的减少实验时间，保证样品在短时间内完成分析，避免样品的长期放置导致样品的质量发生变化。这大大提高了实验效率，同时降低了实验的耗材成本与人力成本。

氮磷的消解在一次实验过程中完成，避免了藻类在环境中分布的时空异质性与取样过程给样品均质性带来的影响，有效的提高了实验结果的准确性，也避免了传统方法分别对氮、磷测量做前处理时为提高实验的准确性而必须进行多次前处理导致的实验耗材消耗。 

附图说明

图1为使用专利方法与传统方法（气相色谱法）分别对藻类细胞进行前处理后，测量得到的细胞氮元素含量对比图； 

图2为使用专利方法与传统方法（分光光度法）分别对藻类细胞进行前处理后，测量得到的细胞磷元素含量对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。 

一种水体中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其步骤为： 

1.水样采集与预处理

水样采集，并对采集的水样进行预处理以提纯藻类；

对于野外水样，若野外采集的水样悬浮物浓度较高且主要为无机泥沙颗粒（水体浑浊且偏黄），可静置沉淀1小时，去除易沉降的大颗粒泥沙后滤过64μm 浮游动物网（25# 浮游动物网），以去除浮游动物和其他有机碎屑。使用预处理后的孔径0.7μm玻璃纤维滤膜进行过滤，水样过滤后再次使用适量蒸馏水进行过滤，洗去截留于玻璃纤维滤膜上藻类细胞表面的细胞外氮磷物质。对于野外的自然水体水样，通过上述方法可有效地屏蔽水体中非生物大颗粒、大比重悬浮物、浮游动物以及其他有机碎屑的影响，减少干扰。

对于室内水样，室内进行藻类培养水样主要是由藻类生物颗粒组成，在过滤之前无需进行特殊的处理，直接使用预处理后的玻璃纤维滤膜进行过滤即可，过滤之后使用蒸馏水冲洗，去除吸附于藻类细胞表面氮、磷，避免影响实验测量。水样的采集量根据实验单个样品的重复次数以及培养液中藻类的浓度进行确定。 

本发明采用孔径0.7μm玻璃纤维滤膜（如：Whatman Gf/F）来收集藻类，为了消除滤膜中可能含有的氮磷物质对实验带来的影响，实验前需要对滤膜进行预处理。具体步骤为： 

1）微孔滤膜在450℃条件下烘焙4小时，去除滤膜上含有的有机杂质

2）冷却至室温后用10％的盐酸漂洗，后用蒸馏水清洗滤膜；

3）在65℃干燥48h后存放于干燥器或低温冷冻保存。

2．取样与消解前准备 

具塞比色管在使用前必须确保洁净，该具塞比色管清洁的步骤如下：

1）用10％的盐酸浸泡具塞比色管以除去管中微量有机物；

2）将不含水样的具塞比色管在120℃下消解30min，冷却后待用。

本发明中提到的具塞比色管均为经预处理过的具塞比色管。 

将富集截留有藻类细胞的滤膜放入洁净的50ml具塞比色管中，向具塞比色管中加入20ml蒸馏水，淹没滤膜。空白样只需将预处理后的滤膜放入具塞比色管中，加入上述液体即可。 

空白样数量可根据测试样品数量适当增加，防止空白样由于操作失误或者其他不可预知因素对空白值的影响。 

3．制备氧化剂 

将15g过硫酸钾（分析纯）和7.5g硼酸（分析纯）溶于70 ml氢氧化钠（分析纯）溶液（氢氧化钠溶液浓度为1.5M）中，混合均匀后定容至250ml。氧化剂在室温下应存放于棕色试剂瓶中，避光保存。该氧化剂的初始pH值为11.2~11.5，以满足对氮磷物质消解的需求。为保证最佳效果，该药品现配现用。

4．水样的消解及过滤 

向步骤2的获得的水样中添加2.5ml步骤3制作的氧化剂，然后盖紧具塞比色管的盖子，用纱布及纱绳裹紧管塞，防止消解时冲开管塞；将具塞比色管放入消解锅中，在温度120℃、压强为1.1~1.3kg/cm²条件下消解30min。待消解完成水样自然冷却后，此时水样的pH值约为1.5。用孔径0.7μm的玻璃纤维滤膜滤过滤去除消解过程中产生的膜碎片与悬浮的藻类碎屑，收集滤液于新的具塞比色管中，定容至50ml，以备后续使用。

通过以上步骤，藻类的氮元素与磷元素在一次消解过程中转化为了硝酸盐与磷酸盐。后续可以采用流动注射仪或者分光光度法完成对硝酸盐与磷酸盐含量的测定，进而计算藻类细胞内氮磷元素的含量。 

引入新的氧化剂，氮和磷的测量可在同一过程中完成。不仅减少对样品的需求量，较少的样品需求量可以有效的减少实验时间，保证样品在短时间内完成分析，避免样品的长期放置导致样品的质量发生变化，大大提高了实验效率，同时降低了实验的耗材成本与人力成本。 

氮磷的消解在一次实验过程中完成，避免了藻类在环境中分布的时空异质性与取样过程给样品均质性带来的影响，有效的提高了实验结果的准确性，也避免了传统方法分别对氮、磷测量做前处理时为提高实验的准确性而必须进行多次前处理导致的实验耗材消耗。 

实施例：

根据本发明的方法对实验室培养的小球藻细胞内氮、磷元素含量进行测量。在使用本发明的方法对其进行前处理时，同时也采用《水和废水监测分析方法》（第四版）（国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会编，中国环境科学出版社2002年出版），中的方法分别对样品进行前处理。处理完成后，磷酸盐的测量按照《水和废水监测分析方法》（第四版）中磷酸盐的测量方法：钼锑抗分光光度法（A）进行测量。氮元素的含量按照《水和废水监测分析方法》（第四版）中总氮的测量方法：气相分子吸收光谱法（B）进行测量。已验证本发明中给出的前处理方法的有效性。

由于是室内培养的藻类细胞，水样中无泥沙、无浮游动物及其他大颗粒悬浮物，所以未对其进行沉淀与过滤处理。 

具体实验结果如下： 

表1为本发明的方法测得的藻类体内氮磷含量的数据。

  

表1  专利方法与传统方法测得的N、P含量数据

图1和图2分别为专利方法与传统方法对藻类进行前处理后，使用分光光度法（或气相色谱法）测量得到的藻类体内氮、磷含量数据图。数据显示，两种方法的测得的数据很吻合，且所获的结果同Redfield值接近。据此可推断，这种新的前处理方法可以用于藻类体内氮磷元素的含量的检测分析。

本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 

Claims (6)

1.一种用于水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，采集水样后，采用预处理后的微孔玻璃纤维滤膜对所采集的水样进行过滤，富集水样中藻类细胞于滤膜上；将富集截留有藻类细胞的微孔玻璃纤维滤膜放置于具塞比色管中，加入蒸馏水和氧化剂进行消解，消解完毕后过滤并收集滤液至具塞比色管中定容；对定容后的液体同时进行氮磷含量的测试。

2.根据权利要求1所述的水中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，所述水样采集步骤中，对于取自自然界水体中的水样，对水样进行沉淀，使用浮游动物网过滤水样，去除浮游动物和大颗粒悬浮物，最后使用微孔玻璃纤维滤膜过滤水样，以截留藻类；对于取自室内培养的水样，直接使用微孔玻璃纤维滤膜过滤，以截留藻类。

3.根据权利要求1所述的水体中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，水样过滤后，使用蒸馏水对富集截留藻类细胞的滤膜进行过滤以清洗残留于滤膜上藻类细胞外表层的氮磷物质。

4.根据权利要求1所述的水体中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，所述氧化剂为质量比2∶1的过硫酸钾和硼酸溶于1.5M的氢氧化钠溶液中配制而成，配置后氧化剂溶液中的过硫硫酸、硼酸和氢氧化钠的质量比为150∶75∶42。

5.根据权利要求1所述的水体中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，将富集截留有藻类细胞的微孔滤膜装入具塞比色管，将具塞比色管的试管塞旋紧，放置在温度120℃、压力1.1~1.3kg/ cm²条件下消解30分钟，消解完毕后自然冷却；使用经预处理后的微孔玻璃纤维滤膜过滤消解后的水样，去除悬浮物，收集滤液至具塞比色管中用蒸馏水进行定容。

6.根据权利要求3或5所述的水体中藻类细胞内氮磷元素测量的前处理方法，其特征在于，所述微孔玻璃纤维滤膜的孔径为0.7μm，且经过盐酸漂洗与蒸馏水清洗后于65℃下烘干。

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