JPH04158784A

JPH04158784A - 酵母細胞壁溶解酵素の製造法及びその利用

Info

Publication number: JPH04158784A
Application number: JP28448090A
Authority: JP
Inventors: Masamichi Hara; 原　昌道; Makoto Tadenuma; 蓼沼　誠; Shunichi Sato; 俊一佐藤; Haruyuki Ietou; 治幸家藤; Hitoshi Shimoii; 仁下飯; Ryuichi Sugiyama; 隆一杉山; Gakuzo Tamura; 田村　學造
Original assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Current assignee: JOZO SHIGEN KENKYUSHO KK; TAX ADM AGENCY; National Tax Administration Agency
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1990-10-24
Publication date: 1992-06-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）ｆ
ｆｉ　（ＩＩＩ工研菌寄第１１７３７号）に属する酵母
細胞壁溶解酵素生産菌の生産する酵素を用いて酵母細胞
壁を溶解する為の方法及び、該酵素の製造法に関するも
のである。

（従来の技術及び問題点）酵母細胞壁を溶解する酵素に関しては既にいくつかの報
告があり、又、商品化されているものもあり、サツカロ
ミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
）等の子のう菌酵母に対して有効なものが、知られてい
る。ところが、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒυｌａ
）属などの、いわゆる赤色酵母は、市販の細胞壁溶解素
に対しては感受性を示さず、その細胞壁の溶解は困難な
ものとなっている。又１機械的破砕あるいは高熱処理、
強酸・強アルカリ処理等は、菌体内有用成分を消耗、破
壊してしまう事となり好ましくない。

（発明が解決しようとする課題）酵母の中には、抗生物質、酵素、生理活性物質等の有用
成分を菌体内に分泌するものが多数あり。

これらの酵母から菌体内有用成分を変性させることなく
採取するためには、物理的ないし機械的な菌体破砕法は
好ましくなく、マイルドな条件で菌体から細胞壁を効率
的に除去する方法が当業界において強く望まれている。

しかも、上記のように特定の子のう菌酵母のみに有効な
ものでなく、他の酵母にも有効な汎用性のある方法が希
求されている。

また最近の遺伝子工業の進展に伴ない、例えば酵母細胞
から染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを取り出したりする場合、
ないしは細胞融合を行う場合にも、酵母の細胞壁を効率
的に除去する方法の開発が強く待望されている。

（課題を解決するための手段）このような課題を解決するために各方面から検討の結果
、上記した目的に最も良く合致する方法としては、細胞
壁を溶解しうる酵素による方法が最適であるとの観点に
たち、子のう菌酵母のみならず、赤色酵母といった担子
菌類酵母、あるいは不完全菌類酵母に対しても効果的に
溶菌作用を示す溶菌酵素を開発することとした。

そこで１本発明者らは、赤色酵母に対して溶菌作用を示
す微生物を広く自然界より検索した結果。

アクチノミセーテスに属するＹＳ−０１６株を分離取得
するのに成功した。

そして、本菌株ＹＳ−０１６株を液体培養又は固体培養
し、生産された酵母細胞壁溶解酵素を必要に応じて精製
し、子のう菌酵母はもとより、赤色酵母等の担子菌類酵
母や不完全菌類酵母の生菌体に作用させる事により広く
各種酵母の細胞壁を溶解する事を確認し、また、この酵
素処理によっても酵母の菌体内成分はいささかも影響さ
れないことも併せ確認し、本発明を完成するに至った。

本発明において使用する例示菌株ＹＳ−０１６株の菌学
的性質は、次のとおりである。

Ａ、形態的特徴（１）形態：培養初期から中期にかけて菌糸状を呈し、
その後、断裂により短桿菌状から球菌状に分裂する。その平均の大きさは０．３〜０．６　Ｘ　１．０〜３．０に　テ、
Ｉ）る。

（２）気菌糸：なしく３）運動性：あり（４）胞子の有無：なしく５）鞭毛：極鞭毛（６）ダラム染色：陽性（７）抗酸性：なしＢ、培養的性質（１）肉汁寒天平板培養生育：適度形状二円形表面：平滑周縁：金縁隆起：僅かに隆起粘性：バター状光沢：あり色素：淡黄色（２）肉汁寒天斜面培養生育：適度色素：淡黄色光沢：あり形状：やや太い糸状粘性：バター状（３）肉汁液体培養混濁の程度は適度。

表面の生育は無し。

自機黄色の沈渣を生じる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養層状の液化が認められ、その部分に良好な生育が認めら
れた。

（５）リドマス・ミルク酸性、液化する。

Ｃ０生理学的性質（１）硝酸塩の還元：＋（２）脱窒反応ニー（３）ＭＲテスト：＋（４）ＶＰテストニー（５）インドールの生成ニー（６）硫化水素の生成ニー（７）デンプン加水分解：＋（８）クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒ培地；− Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地；− （９）無機窒素源の利用：硝酸塩；＋アンモニウム塩；＋（１０）色素の生成ニー（■１）ウレアーゼ二十（１２）オキシダーゼニー（１３）カタラーゼ：＋（１４）生育し得る条件：ｐＨ：６〜９温度；１５〜４２℃ 嫌気条件でも生育し得る。

（１５）　Ｏ−Ｆテスト：０．Ｆいずれも酸を生成する
。

（１６）キサンチンの分解：＋（１７）フォスファターゼ：＋（１８）カゼインの分解：＋（１９）ＤＮＡの分解：＋（２０）糖から酸及びガスの生成：酸　　　　ガスＤ−グルコース　　　　十　　　　　−Ｄ−マンノース
　　　　＋　　　　− Ｄ−フラクトース　　　＋　　　　　−ラクトース　　
　　　　十　　　　　−セロビオース　　　　　十　　
　　　−ラフィノース　　　　　−− イノシトール　　　　　−　　　　− マンニトール　　　　　−− グリセロール　　　　　＋　　　　− スターチ　　　　　　　＋　　　　− Ｄ、化学分類学的性質（１）　ＤＮＡのＧ−Ｃ含量：　７３．５％（２）キノ
ンの主成分：メナキノン−７（３）細胞壁中の二塩基性
アミノ酸：リジン以上の菌学的性質に従い、本発明の菌
株ＹＳ−０１６株の分類学的地位をバーシーズ・マニュ
アル・オブ・システマテインク・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）等に基づ
いて検索した結果１本菌株は、■ダラム陽性桿菌、■胞
子を形成しない、■好気性、■極鞭毛を有し運動性があ
る、■抗酸性を示さない、■細胞壁中の二塩基性アミノ
酸がリジンである、■Ｇ−Ｃ含量が７３．５％、■形態
的特徴等から、オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ
）属に含まれる菌であると同定し、これをオエルスコフ
ィア　エスピーＹＳ−０１６（Ｏｅｒｓｋｉｖｉａ　ｓ
ｐ、　ＹＳ−０１６）と命名し、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＮ　Ｐ−１１７３７として寄託した
。

本発明に係る酵母細胞壁溶解酵素は、該物質生産菌（例
えば０ｅｒｓｋｏｖｉａ　ｓｐ、　ＹＳ−０１６、ＦＥ
ＲＮ　Ｐ−１１７３７）を資化しうる炭素源を含む栄養
培地中に接種し、通気攪拌培養、振どう培養、静置培養
等の液体培養法、もしくは固体培養法により生産せしめ
ることができる。

炭素源としては、グルコース、シュークロース。

澱粉、フラクトース、グリセリ、ンその他の炭水化物を
使用するのが好ましい。

窒素源としては、オートミール、イーストエキストラク
ト、ペプトン、カザミノ酸、グルテンミール、綿実粉、
大豆ミール、コーンステイープリカー、乾燥イースト、
小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するの
が好ましいが、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿
素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使
用することができる。

これらの炭素源及び窒素源は、併用するのが有利である
が、純粋なものを必らずしも使用する必要はない、純粋
でないものには、生長因子や微量要素が含まれているか
らである。

必要ある場合には１例えば次のような無機塩類を培地に
添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン
酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マグネ
シウム塩、銅塩、コバルト塩等、また、アミノ酸、ミネ
ラル、ビタミン等の生育必要因子や生育促進物質を必要
に応じて添加する。

特に、培地が強く発泡するのであれば、必要あるときに
、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シリコン
等を添加してよい。

目的酵素を大量に工業生産するには、他の発酵生産物の
場合と同様に１通気攪拌培養するのが好ましい、少量生
産の場合は、フラスコを用いる振どう培養が好適である
。

また、培養を大きなタンクで行う場合、酵素の生産工程
において菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的
少量の培地に生産菌を接種培養した後１次に培養物を大
きな生産タンクに移してそこで生産培養するのが好まし
い、この場合、前培養に使用する培地及び生産培養に使
用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし
必要があれば両者を変えてもよい。

培養温度は１本酵素生産菌が本酵素を生産する範囲内で
適宜変更しうるが、通常は１０〜４５℃、好ましくは２
５〜３５℃で培養するのがよい、培養時間は、培養条件
や培養量によっても異なるが１通常は約１５〜１５０時
間である。培地のｐＨは、５〜８に調整しておき、滅菌
して使用する。

このようにして、酵母細胞壁を溶解する能力を有する微
生物及びその培養物が得られる。なおこの際、本菌は誘
導条件により誘導される酵素生産パターンが変化するの
で被溶解菌となる酵母の生菌体、死菌体、細胞壁その他
菌体成分などを添加する事は、−層効果的である。

本発明でいう酵母細胞壁溶解酵素としては、上記培養に
よって得られるオエルスコフィア属菌体のほか、その培
養物が包含される。培養物としては、該菌体を含む培養
液、それから菌体を濾過、遠心分離、傾しゃ等によって
除去した培養液、及び／又はその処理物が広く包含され
る。処理物としては、上記培養液を濃縮、抽呂、限外濾
過、透析、溶媒沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィーなどの既知の精製方法を、車用又は併用して
得られるものすべてを包含する。また希望するのであれ
ば、これら各種の精製工程を更に実施することにより、
＃素のみを単離、精製することもできる。

本発明においては、上記のような方法で得られた酵母細
胞壁を溶解する能力を有する微生物及び／又はその培養
物を酵母に作用させる事により細胞壁を溶解させること
が出来る。

本発明に従って酵母細胞壁を溶解するには上記のように
、オエルスコフィア属菌及び／又はその培養物からなる
酵素液を酵母に作用させれば良く、例えば両者を各種の
方法で接触させればよい、その態様としては、該オエル
スコフィア属菌を培養する際に、被溶解酵母を添加して
該酵母の存在下で該菌を培養することにより、該酵母を
溶菌する方法、あるいは、該菌及び／又はその培養物を
緩衝液中等で被溶解酵母と混合接触せしめ、好適には更
にインキニーベートする方法その他がある。

後者の具体的態様としては、たとえば、酵母菌体に水に
ＭＦｓさせ、これに浸透圧調整剤を含む緩衝液及び上記
酵素液を加えて３０”Ｃ前後で３０分〜２時間程度作用
させ、その反応液を水で希釈することで、酵母菌体は生
菌体、死菌体を問わず容易に溶菌することが出来る、尚、木切１１ｉｌ書において、本菌株の生産する酵母細
胞壁溶解酵素の活性は次のように測定している。

すナワチ、ｗ母懸濁液１　ｒｍＱ　（ＯＤ、、。＝　８
−１３）、２０ｍＭクエン酸緩衝液（Ｐ）１６．３．２
Ｍソルビトール。

５００ｐｐｍ＋アジ化ナトリウム）１■ρ、酸素液２ｍ
Ｑを加え３０℃で１時間反応させ、その反応液ＩＩに蒸
留水３ｔ１を添加し、　６６０ｎｍの濁度を測定し、反
応前後での６６０ｒ＋＋ｗの濁度の減少を百分率で表示
する６以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ＹＥＡＳＴ　ＮｌＴＲ□ＧＥＮ　ＢＡＳＥ　ｗｈｏ　Ａ
＊ｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　ａｎｄＡｍｍｏｎｉｕｍ　５ｕ
ｌｆａｔｅ　Ｏ，１７％、寒天２％　を加圧滅菌し、放
冷後、予めＹＭ培地にて１７時間培養、集菌、洗浄して
おいた。以下に示す各種の酵母生菌体を添加しよく混合
してからプレートに固めた。

次いで、０ｅｒｓｋｏｖｉａ　ｓｐ、　ＹＳ−０１６（
ＦＥＲＮ　Ｐ−１１７３７）を塗布し３０℃で培養し、
生じる溶菌斑を確認したところ、以下の結果が得られた
。

」Ｌ」二　　　　　　　　　　−混遁矢−Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ　　　　　ＩＦＯ０８７０＋Ｒ
ｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｍ１ｎｕｔａ　　　　ＩＦＯ０
３８７＋Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ
　　　ＩＦＯ０９４３＋５ｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　
ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ　　ＩＦＯ６９０３＋Ｒｈｏｄｏｓ
ｐｏｒｉｄｉｕＩｌｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ　ＩＦＯ０４
１３＋Ｓｃｈｉｚｏｇａｃｃｈａｒｏｉｙｃｅｓ　ｐｏ
ｆｆｉｂｅ　ＩＦＯ０３４２＋Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＦＯ０２０３＋Ｓａｃｃａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　　ＫＹＯＫ
ＡＩ−７＋Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ａｎｏｍａｌａ　　　
　　ＩＦＯ０１２２＋Ｐｉｃｈｉａ　＋ｕｅｍｂｒａｎ
ａｅｆａｃｉｅｎｓ　　ＩＦＯ０１２８＋Ｐｉｃｈｉａ
　ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ　　　　　ＩＦＯ１１２４＋実
施例２市販栄養培地からなる滅菌シード培地を含むＬ字管に、
　０ｅｒｓｋｏｖｉａ　ｓｐ、　ＹＳ−０１６（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１１７３７）を１白金耳液種し、３０℃で２４
時間振どう培養した。

一方、乾燥酵母（和光純薬社製５−級）２％、硫酸マグ
ネシウム０．０５％、リン酸１カリウム０．１％。

塩化ナトリウム０．０１％、塩化カルシウム０．０１％
、硝酸カリウム０．８％からなる培地をｐＨ７に調整し
た後、その５０社を５００腸Ｑ容坂ロフラスコに入れ滅
菌しておき、これに上記シード培養物１鳳Ｑを加え、３
０℃で２４時間振どう培養を行った。

この培養液を遠心分離により除去して酵素液とし、これ
を１７時間培養した以下に示す各種酵母生菌体に対し１
時間作用させた時の細胞壁溶解活性を測定したところ、
以下の結果を得た。

５ａｃｃｈａｒｏｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
　ＫＹＯＫＡＩ−７４５，０Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｌｌｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＩＦＯ０３４２４７，
９Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ａｎｏｍａｒａ　　　　　　
　　　　　　ＩＦＯ０１２２４９，７Ｐｉｃｈｉａ　ｆ
ｅｒｋ３ｎｔａｎｓ　　　　　ＩＦＯ１１２４１１，４
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ　　　　　ＩＦｏ
　０８７０　　２０．７実施例３市販栄養培地からなる滅菌シード培地を含むＬ字管に、
　０ｅｒｓｋｏｖｉａ　ｓｐ、　ＹＳ−０１６（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１１７３７）を１白金耳液種し、３０℃で２４
時間振どう培養した。

一方、ＢＡＣＴＯ−ＰＥＰＴＯＮＥ　１％、塩化ナトリ
ウム０．７５％からなる滅菌培地２００ｍＱを含む５０
０ｍＤ容坂ロフラスコに、予めＹＭ培地にて１７時間培
養後、集菌、洗浄しておいた赤色酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒ
ｕｌａ　ｒｕｂｒａ　ＩＦＯ０８７０の生菌体を培地の
ＯＤ、、ｏが３．５となるように無菌的に添加しておき
、これに上記シード培養物３ｍＮを加え、３０℃で５日
間振どう培養を行った。

この培養液を遠心分離により除菌して酵素液とし、これ
を１７時間培養した赤色酵母生菌体に対し１時間作用さ
せた時の細胞壁溶解活性を測定したところ、以下の結果
を得た。

Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ　　　　　　ＩＦ
Ｏ０８７０２６，９Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｐａｌｌ
ｉｄａ　　　　ＩＦＯ０７１５１０，４Ｒｈｏｄｏｔｏ
ｒｕｌａ　ｔｉ、ｎｕｔａ　　　　ＩＦＯ０３８７２９
，５Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１Ｉａｃｅｒａｎｓ　
　　ＩＦＯ０９４３２８，０Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕ
ｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ　　ＩＦＯ６９０３５０，４Ｒ
ｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ　
ＩＦＯ０４１３５０，２実施例４実施例２で得られた酵素液２ｍ１２に、予めＹＭ培地で
１７時間培養した赤色酵母を集菌、洗浄した酵母生菌体
懸濁液１ｍＱ、　３．２Ｍソルビトールを含む２０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ρ）１６．０）　Ｉ　ＩＩｎをＬ字管
に入れ。

３０℃で２時間ゆるく振とうし、反応を行った０反応後
、ＩＭソルビトールを含む高張液にて充分洗浄し、遠沈
する。これについて、デービスらの方法（Ｄａｖｉｓ、
　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　６５　、　ｐｐ４０４　、１９７９）に従い
ＤＮＡの調製を行い、アガロース電気泳動に供したとこ
ろ、２３にベースより大きい箇所にスポットが認められ
、簡単にＤＮＡが調製出来た。

（発明の効果）本発明によってはじめて、子のう菌酵母はもとより、赤
色酵母についても、菌体内容物を破壊したり変性したり
することなくその細胞壁のみを選択的に溶解することに
成功したものである。

したがって本発明は、各種発酵工業において、酵素、抗
生物質、生理活性物質等菌体内有用成分を分離、回収す
るのに極めて有益であるばかりでなく、細胞融合やＤＮ
Ａ等の分取等遺伝子工学の技術分野においても非常に重
要な役割を果すものである。

代理人　弁理士　戸　１）親　夫

Claims

【特許請求の範囲】

（１）オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）属に属
し酵母細胞壁溶解酵素生産能を有する微生物及び／又は
その培養物を酵母に作用せしめることを特徴とする酵母
細胞壁の溶解法。
（２）オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）属に属
し酵母細胞壁溶解酵素生産能を有する微生物及び／又は
その培養物が、目的とする被溶解酵母の生菌体、死菌体
、細胞壁及び／又は菌体成分と接触させてなることを特
徴とする請求項第１項に記載の溶解法。
（３）該微生物の培養物が、菌体を含む培養液、菌体を
除去した培養液及び／又はその処理物であることを特徴
とする請求項第１項又は第２項に記載の溶解法。
（４）オエルスコフィア（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ）属に属
し酵母細胞壁溶解酵素生産能を有する微生物を培養する
ことを特徴とする酵母細胞壁溶解酵素の製造法。
（５）被溶解酵母が、子のう菌酵母、担子菌類酵母及び
／又は不完全菌類酵母であることを特徴とする請求項第
１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。