JPH0380085A - ２―ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、２−ハロ酸デハロゲナーゼの遺伝情報をコー
ドしている２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子に関
するものである。

（従来の技術） ２−ハロ酸デハロゲナーゼ（ＥＣ３，８，１，２＞は。

２−ハロ酸の脱ハロゲン反応を触媒する酵素であり９本
酵素が特定の微生物に存在すること及び本酵素の理化学
的諸性質については、既に報告されている〔アグリカル
チュラル　アンド　バイオロジカル　ケミストリー（八
ｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　　）第４
６巻、第８３７〜８３８頁、　１９８２年〕。

Ｄ体の２−ヒドロキシ酸を生皮させるという性質を有し
ている。そのため９本酵素を用いて、農薬等として使用
される２−ハロ酸をＤ体とＬ体に分別定量する方法（特
開昭５８−２０１９９８号公報）や医薬中間体等として
有用な光学活性２−ヒドロキシ酸を製造する方法（特開
昭６３−１７３５９８号公報）等が開発され提案されて
いる。

このような２−ハロ酸デハロゲナーゼを取得するための
手段としては、２−へロ酸デハロゲナゼ生産菌株を培養
し、得られた培養物から本酵素を単離・精製する方法が
知られている。

（発明が解決しようとする課題） ２−ハロ酸デハロゲナーゼは；誘導物質の存在により生
合成される誘導酵素であるため２本酵素を生産するため
には、誘導物質である２−ハロ酸等を炭素源として含む
培地を用いて、２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産菌株を培
養しなければならなかった。このことは、２−ハロ酸デ
ハロゲナーゼ生産菌株の生育にとって好ましい栄養源を
含む培地を用いることができないことを意味し、従って
。

菌の生育が悪く、また培養に長時間を要した。さらに、
２−ハロ酸を資化するに伴い、培地は酸性に傾くため、
培養管理上も問題があった。

また、得られた培養物中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ含
有量も満足できるものではなかった。

上記のように、従来の２−へロ酸デハロゲナーゼの生産
方法は１本酵素の実用的な生産上大きな問題があった。

本発明は、２−ハロ酸デハロゲナーゼの生産性を実用レ
ベルにまで向上させるために、遺伝子工学の手法が応用
できうる２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を提供
することを目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意検討した
結果、２−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子の採取並びにそ
の塩基配列の解明に成功し１本発明に到達した。

すなわち１本発明は、下記塩基配列 ＧＧＣＣＡＧＧＧＴＧ 八ＧＧＣＣＡＴＣＴＣ ＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧ ＣＡ［：ＴＣＧＧＡＣ八 ＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣ ＡＴＴＣＧ八ＣＣ八へ ＧＡ八へＡＡＡＣＣＡ ＴＧＧ［’：Ｃ八ＴへＣＣ ＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧ を有することを特徴とする２−ハロ酸デハロゲナーゼ生
産性遺伝子を要旨とするものである。

以下１本発明の詳細な説明する。

本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子は、上
記の塩基配列で特定されるものであるが。

その発現産物である２−ハロ酸デハロゲナーゼは。

アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカルケミスト
リー（Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、、　
　）第４６巻第８３７〜８３８頁、　１９８２年に記載
された理化学的性質を備えている。すなわち、２−ハロ
酸デハロゲナーゼの理化学的性質は、以下の通りである
。

（１）作用 水の存在下に、２−へ口酸に作用してハロゲン原子を遊
離し、２−ヒドロキシ酸を生成する。

（２）基質特異性 Ｌ−２−クロルプロピオン酸を１００とした場合の基質
に対する相対活性と生成物を次の表に示す。

モノフルオロ酢酸、トリクロル酢酸、クロルアセトアミ
ド、クロルアセトアルデヒド。

Ｄ−２−クロルプロピオン酸、３−クロルプロピオン酸
、ＤＬ−２−ブロモイソ酢酸、ＤＬ−２−ブロモ−ｎ−
吉草酸等には作用しない。

（３）至適ｐＨ：　約１０．５ （４）最適温度：　約４５℃ （５）安定ｐＨ ｐＨ６〜１１において、３７℃で１０分間安定である。

（６）熱安定性 ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）中、各温度で１５
分間処理した後の残存活性は。

４０℃；■００％、４５℃；９０％。

５０℃；　８０％、５５℃；５０％。

６０℃；　２５％である。

（７）分子量 ＳＤＳ電気泳動法により求めた分子量は。

約２５．０００である。

次に本発明の２−ノ、＼ロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝
子の取得方法を説明する。

２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産能を有する微生物から周
知の方法によりＤＮＡを分離精製し、適当な制限酵素あ
るいは超音波等を用いて切断する。

一方、適当な発現ベクターを、同様な方法で切断して■
木調にした後、これと先のＤＮＡ断片とを。

それぞれのＤＮＡ鎮の平滑又は接着末端部においてＤＮ
ＡＵガーゼ等により接合閉環させ１組換えＤＮＡベクタ
ーを作製する。このようにして得られた組換えＤＮＡベ
クターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクター
のマーカーと２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性とを指標と
して１組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を選択す
る。選択された形質転換株を培養し、その培養菌体から
組換えＤＮＡベクターを分離精製し９次いで、該ベクタ
ーから２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子であるＤ
ＮＡを採取することができる。

本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子の供与
体としては、２−八口酸デハロゲナーゼ０ 生産能を有する微生物であればいかなるものでもよいが
、好ましい例としては、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　　１０９株があげ
られ１本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１０２６２号（ＦＥＲＭ　　Ｐｌ　０２
６２）として寄託されている。

本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を含む
ＤＮＡは、供与体である微生物から周知の方法〔例えば
、モレキュラー　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　）　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｍａｎｕａｌ　　第９０〜９１頁、　１９８２年
に記載の方法〕に従い採取することができる。すなわち
、供与微生物を１例えば、液体培地で約１〜２日間好気
的に培養し得られた微生物菌体を溶菌させることによっ
て２−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を
得る。溶菌方法としては１例えば、リゾチームやβ−グ
ルカナーゼ等を用いた酵素処理、ラウリル硫酸す）　Ｕ
ラムやトリトン等を用いた界面活性剤処理、ＥＤＴΔと
酵素、界面活性剤との併用凍結融解、フレンチプレス又
は機械的磨砕等の物理的処理があげられる。このように
して得られた溶菌物から１例えば、フェノール抽出によ
る除タンパク処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアー
ゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離等の方法を組合わせ
ることによりＤＮＡを分離精製することができる。

分離精製された微生物ＤＮＡを切断する方法としては９
例えば、超音波処理、制限酵素処理等により行うことが
できるが、得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容
易にするため、制限酵素。

とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する１例えば、　
　５ａｌｌ、　ＥｃｏＲＩ、　ＨＩｎｄ　ｍ、　　Ｂａ
ｍＨＩ等の■型制限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖し得
るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構
築されたものが適しており、大腸菌（Ｂ、　ｃｏｌ　ｉ
）を宿主とする場合には、ファージとしては９例えば、
λｇｔ−λＣ１λｇｔ・λＢ等が、また、プラスミドと
しては１例えば、　　ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５，ｐ
ＡｃＹｃ１８４．ｐＵＣ１２，ｐＵｃ１３．ｐＵｃ１８
．ｐＵｃ１９等が使用できる。このようなベクターを、
先に述べた２−ハロ酸デハロゲナーゼ遺伝子を含む微生
物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切
断して、ベクター断片を得ることが好ましい。

微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる方法と
しては、公知のＤＮＡ！Ｊガーゼを用いる方法であれば
いかなる方法でもよく１例えば、微生物ＤＮＡの接着末
端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適
当なりＮＡリガーゼの作用により、微生物ＤＮＡ断片と
ベクター断片との組換えＤＮＡベクターが作製できる。

宿主微生物としては１組換えＤＮＡベクターが安定かつ
自律的に増殖可能で、さらに外来遺伝子の形質が発現で
きるものであればいかなるものでもよく、宿主微生物と
して大腸菌を用いる場合には１例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ
　ＤＨ１、Ｃ０ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１Ｂ、　ｃｏｌｉ
　Ｗ３１１０．　Ｂ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００等が利用でき
る。

宿主微生物に組換えＤＮＡベクターを移入する３ 方法としては１例えば、宿主微生物が大腸菌の場合には
、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡベクターを
移入することができ、宿主微生物への目的組換えＤＮＡ
ベクター移入の有無については、用いたベクターの薬剤
耐性マーカーと２−へロ酸デハロゲナーゼ活性とを同時
に発現する微生物を検索すればよい。このようにして得
られた形質転換株である微生物から１組換えＤＮＡベク
ターを採取し、制限酵素により分解後、電気泳動にて分
離して２本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝
子を得ることができる。

上述の方法により得られた２−ハロ酸デハロゲナーゼ遺
伝子の塩基配列は、塩基配列の決定方法として現在広く
用いられているジデオキシ法〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　）第２１４巻、第１２０５〜１２１０頁、　１９
８１年〕で解読することができる。

本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子は１周
知の遺伝子工学の手法により、適当な宿主微生物に組込
むことができ、得られた組換え微生物を培養することに
よって、２−ハロ酸デノ＼口４ ゲナーゼの実用的な生産を可能にするものである。

形質転換株である宿主微生物を培養するには宿主微生物
の生理的性質を考慮して条件を設定すればよく１通常液
体培養が採用され、工業的には深部通気攪拌培養が有利
である。用いる培地の栄養源としては、微生物培養に通
常用いられるものが広く利用できる。炭素源としては、
宿主微生物が利用可能な炭素化合物であればいかなるも
のでもよく９例えば、グルコース、シュークロース。

ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜等が使用
できる。窒素源としては、同じく利用可能なものであれ
ばいかなるものでもよく１例えば。

ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー及び硫安、硝安等の無機窒素化合物が使用できる。

その他、リン酸塩、炭素塩、硫酸塩。

マグネシウム、カリウム、カルシウム、鉄、マンガン、
亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン等を必
要に応じて添加してもよい。

培養温度としては、菌が生育する範囲であればいかなる
温度でもよく、宿主が大腸菌の場合、好ましくは２５〜
４０℃程度である。培地のｐＨとしては、宿主が生育可
能な範囲であればいかなるｐＨでもよく、好ましくはｐ
Ｈ６〜８の範囲に調整すればよい。培養時間としては、
培養条件によって異なるが、菌体中の２−ハロ酸デハロ
ゲナーゼ活性が最高に達する時期に培養を終了すればよ
く９通常１２〜４８時間程度である。

以上のようにして培養した後、培養物から本発明の遺伝
子産物である２−ハロ酸デハロゲナーゼを採取するには
、以下の方法を採用すればよい。

すなわち、得られた培養物から遠心分離等により菌体を
分離し９次いで、この菌体を機械的方法又はリゾチーム
等の酵素法、また、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート
剤及び界面活性剤等を添加して細胞破砕し、２−ハロ酸
デハロゲナーゼを可溶化して細胞破片等を除き、粗抽出
液を得る。さらに精製を行うにあたっては、酵素の一般
的な精製法、すなわち、除核酸、硫安塩析、有機溶媒に
よる分別沈澱及びイオン交換クロマト、吸着クロマト、
疎水クロマト等の各種カラムクロマトグラフィー、さら
にゲル濾過、電気泳動等の処理を施せばよい。

（実施例） 次に、実施例によって１本発明をさらに具体的に説明す
る。

なお、実施例中の２−ハロ酸デノ＼ロゲナーゼの活性値
は、３０℃で１分間に１μｍｏｌの）％ロゲンイオンを
遊離する酵素量を１ユニツトとしたものであり、基質は
、ＤＬ−２−クロルプロピオン酸を用いた。ハロゲンイ
オンは、チオシアン酸水銀と硫酸鉄アンモニウムを用い
る比色定量法〔プリテン　ケミカル　ソサイエテイー　
オブ　シャツくン（Ｂｕｌｌ、［：ｈｅｍ、　Ｓａｃ、
　Ｊｐｎ、、　）第２９巻、第８６０〜８６４頁、　１
９５６年〕にて求めた。

また、実施例中の％は、すべてＷ／Ｖ％を表す。

実施例１ シュードモナス　プチダ　１０９株（微工研菌寄第１０
２６２号）を培養し、２−ノ＼ロ酸デノ＼ロゲナーゼ生
産性遺伝子を含むＤＮＡを、モレキュラー　クローニン
グ（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　）　ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第９０〜９１頁、　
１９８２年に記載の方法に従い、以下のようにして得た
。

０．３％ＤＬ−２−クロルプロピオン酸、０．５％硫安
、０．１％リン酸１カリウム、０．１％リン酸２ナトリ
ウム、０．０１％硫酸マグネシウム、　　ｐＨ７の培地
が１００ｍＡ入った５　００ｍ１１容三角フラスコ５本
にシュードモナス　プチダ　１０９株を植菌し、３０℃
で２４時間回転振盪培養後、遠心分離により集菌した。

この菌体を、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）。

１０ｍＭＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍｌリゾチームの混合液１
０ｍ１に懸濁し、室温で５分間処理した後。

２０ｍｊ２の１％ＳＤＳを含んだ０．２ＮＮａＯＨを添
加し、ゆるやかに攪拌後、氷水中に１０分間放置した。

次いで、１５ｍｊ！の氷冷した５Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ
４，８）溶液を添加して、すばやく攪拌し、氷水中に１
０分間放置後、遠心分離し、上澄みを集め、この上澄液
に、上澄液の０．６容量のイソプロパツールを添加して
、攪拌し、１５分間８ 放置した。遠心分離により沈澱物を集め、７０％エタノ
ールで洗浄後、０．１ｍＭＥ、ＤＴＡを含む１０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した。

次に、２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を含むＤ
ＮＡを切断し、ベクタープラスミドに挿入し２組換えプ
ラスミドを作製した。すなわち。

上記で得られたＤＮＡ約１μｇにＥｃｏＲＩを８ユニツ
ト添加し、３７℃で１晩反応後、６５℃で５分間熱処理
した。これに２倍量のエタノールを添加し、−７０℃に
冷却して生じた沈澱を遠心分離により集め９分解ＤＮＡ
を得た。この分解ＤＮＡを、２５ｍＭＥＤＴＡ、８９ｍ
Ｍはう酸、８９ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８Ｊ）、０．５
ｍｇ／ｊ！ｘチジウムブロマイド、８ｍｇ／ｍＡアガロ
ースからなるゲルを用いて、７ボル）　／　ｃ　ｍの定
電圧で電気泳動により分離し、それぞれのＤＮＡ断片を
ゲルから抽出した。一方、約１μｇのｐＢＲ３２２に８
ユニツトのＥｃｏＲＩを添加し、３７℃で一晩反応後、
６５℃で５分間熱処理した。これに２倍量のエタノール
を添加し、−７０℃に冷却して生じた沈澱を遠心分離に
より集めた。このようにして得られたＥｃｏＲＩにより
切断されたｐＢＲ３２２と、同じ＜ＥｃｏＲＩにより切
断され、電気泳動により分離されたＤＮＡ断片とを、６
６ｍＭ）ＩＪス緩衝液（ｐＨ７，６）、６；６ｍＭ　　
ＭｇＣｊ２２゜１０ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＡＴＰ、約
１０００．、：ＬニットのＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを含む
総容量５０μｌの混合液に溶解し、１２〜１３℃で一晩
反応させた。

このようにして得られた組換えプラスミドを用いて、以
下のようにしてＢ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００の形質転換を
行った。１００ｍｊ！のＬ−ブロス（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ，ｉ！。

ｐＨ７，５）にＢ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００株を接種し、３
７℃で２〜４時間振盪培養後、冷却して遠心分離により
集菌した。５０ｍｌ２の滅菌カルシウム溶液［５０ｍＭ
ＣａＣｊ２２．１０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，０＞：
］に懸濁し、１５分間水冷後、遠心分離して上澄みを捨
て、７ｍｌ１の滅菌カルシウム溶液に懸濁した。この懸
濁液０．２ｍｊ！に対し組換えプラスミド４０ｎｇを加
え、氷水中に３０分。

４２℃の温水に２分間浸漬後、１ｍＡのＬ−ブロスを添
加し、３７℃に１時間放置した。次いで。

０．３％ＤＬ−２−クロルプロピオン酸を含むＬ寒天培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス。

１％ＮａＣｊ！、１．５％寒天、ｐＨ７，５）上に塗布
し、３７℃で一晩培養したところ、２．８ｋｂのＤＮＡ
断片を組込んだプラスミド保持株が形質転換され、上記
培地上で生育することがわかった。

このようにして得られた形質転換株が保持する２−ハロ
酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を、以下のようにして特
定した。形質転換株からプラスミドを分離精製し、電気
泳動で挿入断片を分離した。

すなわち、２．５ｍＭＥＤＴＡ、８９ｍＭはう酸。

８９ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，３）に、０．５ｍｇ／
ｌエチジウムブロマイドを含む、８ｍ、１２／ｍＩｌの
アガロースゲルを用い、これにＥｃｏＲＩ処理したプラ
スミドと分子量マーカーとを同時に７ボル）　／　ｃ　
ｍの定電圧で３〜４時間泳動後、ＵＶう１ ンプを照射し、２．８ｋｂのバンドを確認してその部分
のゲルを切り出し、６０℃で、５分間処理してアガロー
スを溶解させ、フェノール処理、エタノール沈澱を行っ
てＤＮＡを回収した。

次に、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて１回収したＤＮＡ
をＭ１３ファージベクターに結合させ、生物化学実験法
１８．核酸の塩基配列決定法（学会出版センター）、第
６１〜１１４頁に記載の方法に従って塩基配列を決定し
た。２−ハロ酸デハロゲナーゼのポリペプチドをコード
する領域は、２ハロ酸デハロゲナーゼのＮ末端１０個の
アミノ酸配列に対応するＤＮＡ塩基配列と、開始コドン
（ＡＴＧ）と終止コドン（ＴＧＡ）により決定した。

以上のような方法により得られたＤＮＡの塩基配列は、
前記した通りの塩基配列を示した。

参考例１ 実施例１で得られた本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ
生産性遺伝子が挿入された組換えプラス２ ミドを保持するＢ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００株の２−へ〇
酸デハロゲナーゼ生産性を調べた。

１００ｍｊ！のＬ−ブロスに、形質転換されたＢｃｏ１
ｉｃ６００株を接種し、３７℃で８時間回転振盪培養し
、得られた培養物中の２−ハロ酸デハロゲナーゼ活性を
測定したところ、約３８０ユニツトであった。

なお、比較のため１本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ
生産性遺伝子の供与微生物であるシュードモナス　プチ
ダ　１０９株の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性を調べ
たどころ、シュードモナスプチダ　１０９株をＬ−ブロ
スで培養して得られた培養物中には、２−ハロ酸デハロ
ゲナーゼ活性は検出できなかった。そこで、０．３％Ｄ
Ｉ、２タロルプロピオン酸、０．５％硫安、０．１％リ
ン酸１カリウム、０．１％リン酸２ナトリウム、０．０
１％硫酸マグネシウムからなる培地１００ｍ、ｉ！にシ
ュードモナス　プチダ　１０９株を接種し、３０℃で８
時間回転振盪培養し、得られた培養物中の２−ハロ酸デ
ハロゲナーゼ活性を測定したところ。

約２５ユニツトであった。

すなわち１本発明の遺伝子を用いて得られる形質転換株
を培養することにより、２−ハロ酸デハロゲナーゼの生
産性が著しく向上したことがわかった。

（発明の効果） 本発明の２−ハロ酸デハロゲナーゼ生産性遺伝子を用い
、遺伝子工学の手法を適用することにより、医薬中間体
の台底や分析用試薬等に用いられる。有用な２−ハロ酸
デハロゲナーゼを多量に生産することが可能となり１本
酵素の工業的実用生産が達成できる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記塩基配列 【遺伝子配列があります】 を有することを特徴とする２−ハロ酸デハロゲナーゼ生
   産性遺伝子。