WO2012105495A1 - フェニルピルビン酸還元酵素並びに本酵素を用いた光学活性フェニル乳酸及び4-ヒドロキシ-フェニル乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと60%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(d)配列番号6,7又は8に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(e)配列番号4に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
(f)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び
(g)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
〔2〕フェニルピルビン酸を基質としてD-フェニル乳酸を生成するフェニルピルビン酸還元酵素であって、
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む、フェニルピルビン酸還元酵素。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
(1)本発明のPPRの酵素学的性質
(2)本発明のPPRのアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子
(3)本発明のPPRの取得方法
2.光学活性3-フェニル乳酸の製造方法
(1)本発明のPPRによる光学活性フェニル乳酸の製造方法
(2)本発明のPPRをコードする遺伝子を有する微生物による光学活性3-フェニル乳酸の製造方法
3.光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法
(1)本発明のPPRによる光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法
(2)本発明のPPRをコードする遺伝子を有する微生物による光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法
本発明のフェニルピルビン酸還元酵素は、新規酵素であり、以下の酵素学的性質並びにアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子を有するものである。このPPRは、ホモ二量体を形成しているものが好適である。
〔作用〕
本発明のPPRは、フェニルピルビン酸及び4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質とし、これに高い親和性を有し且つ作用して光学活性フェニル乳酸(D-3-フェニル乳酸)及び4-ヒドロキシフェニル乳酸(D-4-ヒドロキシフェニル乳酸)を生成するものである。エナンチオ選択的にD-3-フェニル乳酸及びD-4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成するのが好適である。
4-ヒドロシキフェニルピルビン酸、3-フェニルピルビン酸、グリオキシル酸及びヒドロキシピルビン酸から選ばれる1種以上のものを原料(基質)とし、還元反応を触媒する。なお、ピルビン酸及びオキザロ酢酸を基質としないのが望ましい。
Tris-HCl緩衝液(pH7~8)及びリン酸緩衝液(pH5~7)の緩衝液で各pH(25℃)に調整した後、pH以外は上記〔作用〕記載の測定条件にて酵素活性を求めた場合、p6~7、特にpH6.5~7で高い活性を示す。
pH6.5の20~40℃にて良好なフェニルピルビン酸還元反応を示す。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Lammli等の方法)における測定で、本発明のPPRは、分子量30,000~50,000ダルトン、特に分子量40,000ダルトンを示す。
2)金属イオンと阻害剤の影響
Cu2+、Zn2+、Fe2+、WO2-、Hg2+から選ばれる1種以上の金属イオンによって、PPR活性が強阻害される(90~100%程度阻害)。Ni2+、Co2+から選ばれる1種以上の金属イオンによってやや強く阻害される(30~40%程度阻害)。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Mo2+、から選ばれる1種以上の金属イオンによって、殆ど阻害されないか或いは全く阻害されない(15~0%程度阻害)。
本発明のPPRは、少なくとも以下のN末端アミノ酸配列及び/又は内部アミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有するものが好適である。なお、この部分アミノ酸配列は、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入されていてもよい。
N末端側のアミノ酸残基の配列:N末端側のMKKPQVLILGRIの12アミノ酸残基の配列(配列番号1)である。
トリプシン消化ペプチドのアミノ酸残基の配列:NIQAIYGNWGGLASFGGFKの19アミノ酸残基の配列(配列番号2)及びVAFAALDVFEEEPFIHPGLIGRの22アミノ酸残基の配列(配列番号3)を有する。
本発明のPPRには、次の(a)、(b)及び(c)のタンパク質が包含される。
(i)本発明のPPRは、ウィッケルハミア属(Wickerhamia)酵母若しくはその変異株、又は前記PPRをコードする遺伝子若しくはその断片を導入した形質転換体(好適には微生物)によって生産、取得することが可能である。
配列番号9に示す塩基配列。
形状:レモン形、卵形、長卵形
増殖形式:増殖は両極出芽により、出芽部位は広く、偽菌糸の形成。
糖発酵性:D-グルコース(+)、サッカロース(+)、D-ガラクトース(W)、マルトース(-)
炭素源資化性:D-グルコース(+)、サッカロース(+)、D-ガラクトース(+)、マルトース(-)、イノシトール(-)
窒素源資化性:硝酸塩(-)
なお、前記酵母菌TK1は、2007年11月頃、日本国筑波県つくば市内の環境中の土壌や水を40種採取し、適宜希釈後、YPD寒天培地(後記実施例1参照)に塗布した。28℃で2~4日培養後、現れたコロニーを適宜希釈後、新たなYPD寒天培地に接種することを繰り返し行い、純粋分離した。
また、本発明によれば、PPRをコードするポリヌクレオチド又はppr遺伝子を含む組換えベクターを適用することが可能となる。これにより、形質転換体を得、この形質転換体の培養等によって、PPRを遺伝子工学的に製造することが可能となる。
本発明によれば、上述にて得られた組換えベクターを用いて宿主(好適には微生物)を形質転換し、形質転換体を得ることができる。
本発明の光学活性3-フェニル乳酸の製造方法は、フェニルピルビン酸からD-3-フェニル乳酸を生成できる製造工程(酵素反応系:上述のスキーム1参照)を少なくとも有していればよい。
本発明のPPRを用いて、酵素基質から、光学活性3-フェニル乳酸を生産し、これを回収することが可能である。なお、上述のようにPPR以外の酵素も併用することによって連続的に光学活性3-フェニル乳酸を得てもよい。
本発明の光学活性フェニル乳酸の製造方法は、次の(a)、(b)又は(c)のタンパク質からなるフェニルピルビン酸還元酵素をコードする遺伝子を含む微生物を用いて培養し、微生物基質から光学活性フェニル乳酸を生成させ、これを回収するのが好適である。
(b)配列番号5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、フェニルピルビン酸還元活性を有し、フェニルピルビン酸に対する高い親和性を有するタンパク質
(c)配列番号5で示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、フェニルピルビン酸還元活性を有し、フェニルピルビン酸に対する高い親和性を有するタンパク質。
本発明の光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸(D-4-ヒドロキシフェニル乳酸)の製造方法は、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸から光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成できる製造工程(酵素反応系:上述のスキーム2参照)を少なくとも有していればよい。
(1)本発明の酵素PPRによる光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法
本発明のPPRを用いて、酵素基質から、光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸を生産し、これを回収することが可能である。なお、上述のように本発明のPPR以外の酵素も併用することによって連続的に光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸を得てもよい。
本発明の光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法は、本発明のPPRをコードする遺伝子を含む微生物を用いて培養し、微生物基質から光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成させ、これを回収するのが好適である。
(1)D-3-フェニル乳酸を生産するTK1菌株の取得
日本国の茨城県つくば市内の環境中の土壌や水を数十箇所で採取し、適宜希釈後、YPD寒天培地(2%酵母抽出液、1%ポリペプトン、1%D-グルコース/蒸留水 1L)に塗布した。28℃で2日から4日培養後、現れたコロニーを適宜希釈後、新たなYPD寒天培地に接種することにより、純粋分離した。さらに分離した菌株1白金耳を表1に示すMinimum medium(以下、「MM」ともいう)液体培地に植菌し、好気条件にて、28℃で2日から4日培養した。
1)ガスクロマトグラフィー質量分析計(GC/MS)を用いた3-フェニル乳酸の定性
試料を、1% NaOH 200 μL、Methanol 167 μL、Pyridine 34 μLに完全に懸濁する。これに、Methyl chlorocarbonateを20 μL加え、激しく攪拌することにより試料をメチル化する。Methyl chlorocarbonateを加え攪拌する操作を繰り返した後、Chloroformを400 μL加え、攪拌する。次に、50 mM Sodium bicarbonateを加え、攪拌後の水層を除去する。得られたChloroform層に0.1gのSodium sulfateを加えることによりChloroform層を完全に脱水し、得られた溶液に含まれる有機酸をGC/MS(GCMS-QP2010 Plus、Shimadzu)を用いて測定する。このGC/MS分析の条件を以下に示す。
カラム:DB-5(0.32 mm x 30 m)
カラム温度:60 ℃ (2 min)-8℃/min-180℃ (5 min)-40℃/min-220℃ (5 min)
インターフェイス温度:230℃
イオンソース温度:250℃
キャリアガス:He
流量:30 mL/min
2)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた3-フェニル乳酸の定量
試料中の3-フェニル乳酸の定量はHPLCを用いて、以下の分析条件にて、分析する。
カラム:TSKgel ODS-80(登録商標) (4.6 × 150 mm, Tosoh, Tokyo, Japan)
カラム温度:28℃
流速:1.0 mL/min
移動相:20 mm potassium phosphate buffer (pH 2.5): methanol (6:4, v/v)
3)HPLCを用いたキラル分析
試料(酵素反応液)中の3-フェニル乳酸の光学異性を、HPLCを用いて、以下の分析条件にて、決定する。なお、培養液を分析する場合には、培養液から濾過や遠心分離等により菌体を除去した培養上清を試料として使用する。
カラム:Nucleosil Chiral-1 (Macherey-Nagel)
カラム温度:60℃
流速:1.2 mL/min
移動相:0.5 mM CuSO4
全容50 mLの試験管に分注したYPD培地 10 mLに、予め菌体を生育させたYPD寒天培地から、菌体を一白金耳植菌し、30℃で2日間、120 rpmで振とう培養した。
抽出からサイクルシーケンスまでの操作は、DNA抽出(物理的破壊およびMarmur(1961))、PCR(puReTaq Ready-To-Go PCR beads(Amersham Biosciences, NJ, USA))、サイクルシーケンス BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems, CA, USA)、使用プライマー (NL1およびNL4 (O’Donnell, 1993))、シーケンス (ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System (Applied Biosystems, CA, USA))、相同性検索および簡易分子系統解析(ソフトウェア アポロン2.0 (テクノスルガラボ), データベース アポロン DB-FU3.0 (テクノスルガラボ), 国際塩基配列データベース (GeneBank/DDBJ/EMBL))の各プロトコルに従った。
試験方法はBarnett et al. (2000)およびKurtzman and Fell (1998)に準拠し、培養は温度耐性試験を除き25℃で行った。表3に示す生理性状の試験を行った。その結果を表3に示す。
光学顕微鏡(BX オリンパス、東京)を用いて簡易形態観察を行った。その結果を図1に示す。なお、バーは、5μmである。
アポロンDB-FUに対するBLAST(Altschul, S.F. et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.)を用いた塩基配列の相同性検索の結果、Strain TK1菌株の26S rDNA- D1/D2塩基配列は、子嚢菌酵母の一種であるWickerhamia fluorescens の基準株である NRRL YB-4819のそれと100%の相同性を示した。GenBank/DDBJ/EMBLなどの国際塩基配列データベースに対しする相同性検索においても、Strain TK1菌株の26S rDNA-D1/D2塩基配列は、W. fluorescensのNRR YB-4819菌株に対して、100%の高い相同性を示した。
W. fluorescens TK1菌株が生産する3-フェニル乳酸の光学異性を決定した。培養上清を、上述の如きキラル分析(Nucleosil Chiral-1カラム)に供した(図2)。その結果、生産されていた3-フェニル乳酸はD-3-フェニル乳酸と同一の保持時間を示し、L-3-フェニル乳酸とは異なるピークを与えた。このことより、W. fluorescens TK1菌株はエナンチオ選択的にD-3-フェニル乳酸を生産することが明らかとなった(図2)。
W. fluorescens TK1菌株を初期菌体濃度を0.2(O.D.600)に合わせ、MM培地を用いて好気条件下で5日間振とう培養(羽根付きフラスコ、100 mL)し、経時的に培養上清をサンプリングした。その結果、菌体の増殖は培養開始24時間以降には定常期に入った。D-3-フェニル乳酸の生産量は定常期に入っても増え続け、培養開始96時間目には培地中に0.1 mMのD-3-フェニル乳酸を生産していた(図3)。
W. fluorescens TK1菌株を初期菌体濃度を0.2(O.D.600)に合わせ、MM培地に、フェニルピルビン酸を添加したGPAMM培地(表4)と、L-フェニルアラニンを添加したGPMM培地(表5)をそれぞれ用いて好気条件下でそれぞれ2日間および3日間振とう培養(羽根付きフラスコ、100 mL)し、経時的に培養液をサンプリングし、本菌によるD-3-フェニル乳酸の生産量を測定した(図4及び5)。
湿菌体重量1.0 gあたり酸化アルミニウム2.5 gとプロテアーゼ阻害剤phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)、N-tosyl-L-phenylalanylchlormethyl ketone(TPCK)各0.2 mM、10%グリセロールと1 mM dithiothreitol(DTT)を含んだ20 mMのリン酸緩衝液を加えて、菌体を乳棒と乳鉢を用いて破砕した。破砕液に菌体と同量の同緩衝液を加え、15000×gで遠心分離した。得られた培養上清を無細胞抽出液とした。以上の操作は氷中にて行った。
フェニルピルビン酸のD-3-フェニル乳酸への還元を触媒する酵素(フェニルピルビン酸還元酵素)である本酵素PPRをW. fluorescens TK1菌株の無細胞抽出液から精製するのに先立って、本菌の本培養の培養時間と無細胞抽出液中のPPR活性の関係を検討した。GPMM培地を用いて培養開始4、12、48時間後の菌体より無細胞抽出液を調製したところ、培養時間12時間でのPPR活性が4時間、48時間に比べそれぞれ1.8、3.4倍高かった(図6)。
pH 5.5~8のTris-HCl緩衝液(pH 7, 7.5, 8)、リン酸緩衝液(pH 5.5, 6, 6.5, 7)の各pH緩衝液を反応液に用いてPPR活性を測定し、本酵素PPRの反応の至適pHを検討した。pH 6.5で最も高いPPR活性が検出された(図7)。このことから、本酵素PPRの至適pHは6.5であり、以後の活性測定のpHは6.5で行った。
上述の如く、無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液を100,000×gで1時間遠心分離した。
遠心分離後の無細胞抽出液に、20%となるように硫安を添加した。wash buffer(10% glycerol, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20 mMのリン酸緩衝液, 20% (NH4)2SO4, pH7)をカラム容積の5倍量流しカラムの平衡化を行った。このカラムに調製したサンプルをのせ硫酸アンモニウムの直線濃度勾配(20%-0%)により溶出を行い、活性画分を得た。
上記で得られた活性画分を、透析buffer(10% glycerol, 1 mM DTT, 20 mMリン酸緩衝液, pH7)に対して一晩透析を行った。このサンプルを、wash buffer(10%glycerol, 1 mM DTT, 20 mMリン酸緩衝液, pH7)を5倍量流し平衡化を行った2’5’-ADP-Sepharoseカラムに供した。溶出はelution buffer(10% glycerol, 1 mM DTT, 0.1-1 mM NADP+, 20 mMリン酸緩衝液, pH7)にて行い、活性画分を得た。
上記で得られた活性画分を、equilibration buffer(10% glycerol, 1 mM DTT, 20 mMリン酸緩衝液, pH7)で平衡化したMonoQ HR 5/5カラム(GE Healthcare)に供し、NaCl直線濃度勾配(0%-15%)により溶出を行った。
PPRの活性測定は、酵素反応液として50 mM リン酸緩衝液(pH 6.5)、2 mM フェニルピルビン酸、0.1 mM NADPHを用い、これに試料(酵素液や無細胞抽出液など)を加えることにより反応を開始する。反応温度は25℃。活性は、反応に伴い生成されるNADPHの持つ340nmの波長の吸収の減少を紫外・可視分光時計(Beckman-Coulter DU-800)を用いて測定することによって定量する。NADPHの340 nm の波長の吸収のモル吸光係数は、6.2 mM-1・cm-1とする。
PATの活性測定は、酵素反応液として50 mMリン酸緩衝液(pH 6.5)、10 mM L-フェニルアラニン、2.5 mM 2-オキソグルタル酸、12.5 μM Pridoxal phosphateを用い、これに試料(酵素液や無細胞抽出液など)を加えることにより反応を開始する。反応温度は37℃、反応時間30分とする。2 N NaOHを800 μL添加することで反応を終了させた。活性は、反応に伴い生成されるフェニルピルビン酸の持つ320 nmの波長の吸収の増加を測定することによって定量した。なおフェニルピルビン酸のモル吸光係数は17.5 mM-1・cm-1(Whitaker RJ., et al. J. Biol. Chem. (1982) 257, 3550-3556.)とする。
PPRの分子量の測定は、12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGE及び/又はゲルろ過法により行う。
〔PPRの酵素学的解析〕
本酵素PPRはNADPH依存的に、フェニルピルビン酸と反応し、D-3-フェニル乳酸を生産することが、上述のHPLCの測定方法により確認できた。
各金属イオンと各阻害剤をそれぞれ終濃度1 mMで反応系に添加し、PPR活性を測定した。Cu2+ , Zn2+ , Fe2+, WO2-, Hg2+ の金属イオンにより、本酵素PPR活性の低下が見られたことから(表8)、これらがPPR活性を阻害することが示された。
D-3-フェニル乳酸生産菌を検索した結果、子嚢菌酵母であるW. fluorescens TK1菌株が培養上清中にD-3-フェニル乳酸を0.1 mM生産していたことから、新規D-3-フェニル乳酸生産菌をスクリーニングすることができたと考えられた。また、L-フェニルアラニンを培地に添加し同様に培養した際のD-3-フェニル乳酸の生産量は5.7 mM生産していた。3-フェニル乳酸の生産の報告があるG. candidumではTSBYE培地を用いてジャーファーメンターを用いて培養することで3.6~6.0 mM(非特許文献2)、乳酸菌ではMRS培地を用いることで0.57 mM(J. Biochem. 2005 138, 741-74915))の3-フェニル乳酸が生産されることが報告されている。また、Lactobacillus. Sp. SK007が3-フェニル乳酸の前駆体であるフェニルピルビン酸を培地に6 mM添加した際に5.2 mMの3-フェニル乳酸を生産し(Li, X. et al., Biotechnol. Lett (2007) 29, 593-597,)、L. plantarum TMW1.468、L. sanfranciscensis DSM20451では培地に50 mMのフェニルアラニンを添加した場合0.04~0.08 mMの生産がみられた(Vermeulen, N. et al. J. Agric. Food Chem. (2006) 54, 3832- 3839)。以上の結果は、W. fluorescens TK1菌株がジャーファーメンターなどを用いて培養条件を精密にコントロールしなくて比較的高いD-3-フェニル乳酸を生産する能力をもつことを示しものである。
(1)使用菌株
3-フェニル乳酸生産菌W. fluorescens TK1菌株を用いた。
全容50 mLの試験管に分注した上述のYPD培地10 mLに、予め菌体を生育させたYPD寒天培地から、菌体を一白金耳植菌し、30℃で2日間、120 rpmで振とう培養した。前培養液から菌体を遠心分離により集菌し、その沈殿を生理食塩水で洗浄した。これを150 mLのGPMM培地を含む全容500 mLの羽根つきフラスコに植菌した。これを30℃、12時間、120 rpm、好気条件下で振とう培養した。
〔ブロッティング〕
濾紙をA溶液(0.3 M Tris、5%メタノール)に2枚、B溶液(25 mM Tris、5%メタノール)に1枚、C溶液(25 mM Tris、40mM 6-アミノカプロン酸、5%メタノール)に3枚それぞれ浸した。精製した本酵素PPRをSDS-PAGEで電気泳動した後、ゲルをそれぞれの溶液に浸した濾紙を重ね、転写装置(ホライズブロットAE - 6670P/N、ATTO)を用いて電気的にPolyVinylidene DiFluoride(PVDF)膜(AE-6665、ATTO)に転写した。
乾燥させたPVDF膜より目的のバンドを切り出し、アミノ酸配列分析装置(Applied Biosystems Procise 492 cLC)に供した。
SDS-PAGEに泳動した精製した本酵素PPRをゲルより切り出し、トリプシンによりゲル内消化した。トリプシン消化ペプチドをMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of Flight (MALDI-TOF/MS) (AXIMA(登録商標), AXIMA(登録商標)-QIT Shimazu)に供し、得られたフラグメント情報を基にアミノ酸配列を決定した。
GPMM培地で培養したW. fluorescens TK1菌株を破砕バッファー(500 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM EDTA, 1% SDS)に懸濁し、半量のガラスビーズと等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール(25:24:1)を加えた(フェノクロ処理)。ボルテックスで攪拌したのち遠心分離し、上清を回収し、DNase処理し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出を2回繰り返して、2.5倍量のエタノールと1/10倍量の3 M酢酸ナトリウムを添加した(エタノール沈殿)。遠心分離後、沈殿をRLC (RNeasy(登録商標) Plant Mini Kitに付属のもの) 450 μL、2-メルカプトエタノール4.5 μLに懸濁した 。以降のステップは RNeasy(登録商標) Plant Mini Kitのプロトコルに従った。調整したRNAとPrimeScript(登録商標)Reverse Transcriptaseを用いてcDNAを合成した。
YPD培地で一夜培養したW. fluorescens TK1菌株を破砕バッファー(100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH8.0)、1 mM EDTA、2% TritonX-100)に懸濁し、半量のガラスビーズと等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール(25:24:1)を加えた(フェノクロ処理)。ボルテックスで攪拌したのち遠心分離し、上清を回収し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出を2回繰り返して、2.5倍量のエタノールと1/10倍量の3 M酢酸ナトリウムを添加した(エタノール沈殿)。遠心分離後、沈殿を70%エタノールで洗浄した。70%エタノールを捨てアスピレータで乾燥させ、RNaseを加えた適量の滅菌水に懸濁した。
〔PCR法〕
50 μLのPCR反応系に、得られたcDNAを鋳型として1 μL、10×KOD -Plus- buffer(TOYOBO) 5 μL、各2.5 mM dNTP 4 μL、プライマーNP (5'-ATGAARAARCCNCAGGT-3')(配列番号10)、Oligo dT (5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3') (配列番号11)、KOD -Plus- DNA Polymerase(TOYOBO) 1 μL、25 mM MgSO4 2 μLを加えた。この反応系に対して、96℃ 30 s、50℃ 30 s、68℃ 3 minの処理を35回行った後、68℃ 5 min伸長反応させた(一次PCR)。さらに、PCR産物をテンプレート1 μL、10×Ex Taq buffer(TaKaRa) 5 μL、各2.5 mM dNTP 4 μL、プライマーNP(配列番号10)、プライマー2427P (5'-GGYTCYTCYTCRAANACRTT-3') (配列番号12)、Ex Taq Polymerase (TaKaRa) 0.5 μLを加えた。96℃ 15 s、56℃ 20 s、72℃ 1 minの処理を35回行い、72℃ 5 min伸長反応させた(二次PCR)。
調製した全RNAをもとに、5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE), Version 2.0 (Invitrogen Co., CA)を用いてPPRの5’-末端のcDNAを合成した。得られたcDNAをテンプレートとして、kit付属のアダプターオリゴヌクレオチドとPPRをコードする遺伝子に特異的なプライマー(GSP1(5'-TGAAAATGCGTTAGTATGTGGAT-3') (配列番号13)、GSP2 (5'-TGCCTTTGCTGCTTTGAATGTAT-3') (配列番号14))を用いてnested PCRした。PCRの反応条件は、96℃ 15 s、56℃ 20 s、72℃ 1 minの処理を35回行い、72℃ 5 min伸長反応させた。PCRで得られた200 kpのDNA断片をアガロース電気泳動により回収し、pGEM(登録商標)-T easy (Promega, Madison, WI)にクローニングした。得られたプラスミドの挿入断片のDNA配列を決定した。
DNAの配列解析は全自動 DNAシーケンサー(CEQ2000, Beckman Coulter)を用いて解析した。方法は、プロトコルに従って行った。
W. fluorescens TK1菌株を、MM培地、GPMM培地、GPAMM培地を用いて30℃ 、8時間培養し、得られた各培地の菌体からRNAを調製した。これを鋳型としてoligo-dT19プライマー、Reverse Transcriptase M-MLV (TAKARA BIO, Inc., Japan)を用いて逆転写反応を行った。得られた一本鎖cDNAを鋳型として、iQ(登録商標) SYBR(登録商標) Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., CA)を用いてMiniOpticon(登録商標)version 3.1 (Bio-Rad Laboratories Inc., CA)に供した。それぞれの菌体でpprA遺伝子の発現量を、18S ribosomal RNAの発現量との比として表した。
*CTは増幅産物が蓄積し、検出可能な蛍光シグナルが得られたサイクル数。
〔形質転換体の作製〕
W. fluorescens TK1菌株のRNAから調製した一本鎖cDNAとプライマーNde-PPR(5'-GGGTTTCATATGAAAAAGCCTCAG-3')(配列番号21)、Xho-PPR(5'-CCGCTCGAGAACTACAAGATT-3')(配列番号22)を用いて、PCR反応によりpprA遺伝子のcDNA断片を増幅した。これをNdeI, XhoIで処理したものをpCWoriを予め同じ制限酵素で処理したものに連結して構築したプラスミド(pCW-PPR)をE. coli ATCC31882(ATCCより取得)に導入した(図9及び図10参照)。
得られた組換え体を終濃度100 μg/L アンピシリンナトリウムを含んだLB培地(LA) 10 mLで37℃、12 時間前培養した。この全量を150 mL LAに植菌した。120 rpm, 37℃、2時間培養後、終濃度1 mMのIPTGを添加し、50 rpm、室温で8時間培養した。
培養した菌体を集菌し、buffer A (20 mM potassium phosphate (pH 7.0), 10% glycerol, 0.1 mM DTT)に懸濁して、超音波破砕した。破砕液を15,000 rpm, 30 分間遠心分離して上清(無細胞抽出液)を回収した。予めNi2+を吸着させた後、300 mM NaClを含んだbuffer A (buffer C)で平衡化したchelating Sepharose column (Amersham)に無細胞抽出液を供した。500 mM imidazoleを含んだbuffer Cで溶出した画分を回収し、buffer Aに対して透析し、以降の解析に用いた。
〔アミノ酸配列のアライメント〕
クローニングしたpprA遺伝子の推定アミノ酸配列と相同性のある配列をNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベース内で検索した。この際、BLASTを用いた。得られた配列情報を利用してClustalWによるマルチプルアライメント解析を行った。
系統樹の作成にはMEGA 4を用いた。系統樹の作製に用いたアミノ酸配列はNCBIより入手した。系統樹の作成は近隣接合法により行い、枝上にブートストラップ反復推定値を示した。
精製した本酵素PPR(1μg)をPVDF膜に電気的にブロッティングし、本酵素PPRのN末端のアミノ酸配列を分析した。その結果、MKKPOVLILGRIからなる本酵素PPRの12残基のN末端アミノ酸配列を決定することができた(配列番号1)。
SDS-PAGE後の本酵素PPRをゲルより切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。得られたトリプシン消化ペプチドをMALDI-TOF MS解析した。MALDI-TOF MS解析により得られたペプチドピーク中から、m/z 2000.00とm/z 2427.27の二つのペプチドを選び、MALDI-QIT-TOF MSを用いたMS/MS解析を行った(図11)。得られた質量フラグメントピークの情報をもとにトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列のde novoシーケンスを行った結果、m/z 2000.00を示すペプチドは19アミノ酸残基からなるNIQAIYGNWGGLASFGGFKのアミノ酸配列(配列番号2)、m/z 2427.27を示すペプチドは22アミノ酸残基からなるVAFAALDVFEEEPFIHPGLIGRのアミノ酸配列(配列番号3)をそれぞれ得ることができた(図12)。
N末端アミノ酸配列(配列番号1)と内部アミノ酸配列m/z 2427.27(配列番号3)の情報を基に、プライマーNP(配列番号10)、プライマー2427P(配列番号12)をそれぞれ設計した。W. fluorescens TK1菌株より調製したcDNAを鋳型とし、プライマーNP(配列番号10)、プライマーOligo dT(配列番号11)を用いてPCRを行った。さらに、PCR産物を鋳型として、プライマーNP(配列番号10)、プライマー2427P(配列番号12)を用いてPCRを行った。その結果、935 bpの目的のDNA断片が増幅された(図13)。
W. fluorescens TK1菌株のゲノム上に存在するpprA遺伝子のコピー数を確認するためにサザンブロット解析を行った(図15)。制限酵素(HindIII、EcoRI、PstI、BamHI)で処理したW. fluorescens TK1菌株の全DNAに対して、pprA遺伝子の配列を含むDNA断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、いずれの制限酵素処理した全DNAを用いた場合でもバンドは一本のみ検出された。このことより、ゲノム上に存在するpprA遺伝子は1コピーのみであり、精製した本酵素PPRはpprA遺伝子が発現したものであることが示された。
GPMM培地(D-グルコース及びL-フェニルアラニンを含む)、GPAMM培地(D-グルコース及びフェニルピルビン酸を含む)、MM培地(D-グルコースを含む)をそれぞれ用いてW. fluorescens TK1菌株を10時間、30℃でそれぞれ培養して得られた菌体の無細胞抽出液中のPPR活性を上述の〔PPR活性の測定法〕に従って測定した。その結果、L-フェニルアラニンを添加したGPMM培地を用いて得られた菌体の無細胞抽出液中のPPR活性は0.22 μmol/min/mgであり、MM培地を用いて培養した際の活性に比べ3.6倍であった。また、フェニルピルビン酸を添加したGPAMM培地を用いた際のそれと比べ3.0倍高かった(図16)。同様の条件下でW. fluorescens TK1菌株を8時間培養して得られた菌体のpprA遺伝子の転写量をリアルタイムPCRを用いて測定した。その結果、5 mMフェニルアラニンを添加したGPMM培地を用いて培養した菌体でのpprA遺伝子の発現量がMM培地を用いた条件に比べ40倍、GPAMM培地を用いて培養した条件に比べ18倍増加していた(図16)。以上の結果から、pprA遺伝子の発現は、フェニルアラニンによって誘導されることが示された。
〔酵素rPPRの精製〕
大腸菌Origami B株にpET21aにpprA遺伝子のcDNAを組込んだプラスミドを導入した。N末端にHisを付加させた本酵素PPRを発現させた後、chelating Sepharoseカラムを用いて精製した(図17)。その結果、40 kDaに単一バンドが得られたことから、酵素rPPRを精製できたことが示された。
精製した酵素rPPRはW. fluorescens TK1菌株の酵素PPRと同様に、NADPHを補酵素として利用可能であり、フェニルピルビン酸、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸、グリオキシル酸およびヒドロキシピルビン酸を基質とした際のkcat/Km値はフェニルピルビン酸を基質としたときが最も高かった(表10)。また、ピルビン酸とオキサロ酢酸を基質とした活性は検出されなかった(データ示さず)。これらのことより、大腸菌を用いて発現させた酵素rPPRも、W. fluorescens TK1菌株由来の酵素PPRと同様の基質特異性を示すことが明らかとなった。
〔酵素PPRのアライメント解析〕
酵素PPRの推定アミノ酸配列は、相同性が最も高かったCandida dubliniensis の機能未知遺伝子の推定アミノ酸配列と54%の相同性しか示さなかった。また、機能が明らかとなっているタンパク質のアミノ酸配列では L. plantarum 由来のD-lactate dehydrogenase(DLDH)と20%、R. etli CFN 42の組換えGRHPRと25%、Solenostemon scutellarioide由来のhydroxyphenylpyruvate reductase(HPPR)と27%の相同性を示したのみであった。
GRHPR、HPPR、DLDH、formate dehydrogenase(FDH)、L-lactate dehydrogenase(LLDH)およびmalate dehydrogenase(MDH)ファミリーに属する既知の酵素と、本酵素PPRと相同性の高かった機能未知タンパク質のアミノ酸配列を選抜し、分子系統樹を作製した。その結果、PPRはLLDH、MDH superfamily とは異なるクラスターに属しておりD-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase superfamilyに分類された。
本研究において、D-3-フェニル乳酸及び光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸を生産可能な子嚢菌酵母W. fluorescens TK1菌株を新たに見出した。さらに供試菌よりD-3-フェニル乳酸及びD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の生産に関与する本酵素PPRを精製し、その遺伝子であるpprA遺伝子をクローニングした。今までにD-3-フェニル乳酸及びD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の生産に直接関わる酵素を精製し、その遺伝子をクローニングしたという報告はなく、本研究は初めての例である。また、本酵素PPRは3-フェニル乳酸の生産に関与しているとして報告のあった乳酸菌のDLDHとは酵素学的解析、分子系統解析のいずれの結果からも異なる酵素であることが示された。系統解析より、本酵素PPRはD-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase superfamilyの既存のファミリーには分類されず、子嚢菌酵母の機能未知タンパク質と同じグループにマッピングされた。このことより、本酵素PPRはD-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase superfamilyに属する新規酵素であり、その機能は子嚢菌酵母に保存されている可能性が示唆された。
(1)ppr遺伝子を導入したフェニルアラニン生産性大腸菌の調製
D-3-フェニル乳酸の生産株は、LB培地{10.0 g/L tryptone、5.0 g/L yeast extract、10.0 g/L NaCl}で一晩培養した後に、滅菌したグリセロールを全量の20%添加し、-80℃で保存した。
本フェニル乳酸生産株を、50 mLのフェニル乳酸生産培地(表11及び12)に20 g/Lのグルコースと50 mg/Lのカナマイシンを加えたものを用いて、1/100量の前述した前培養液を接種し、500 mL容羽根付き三角フラスコで、37℃、120 rpm、24時間振とう培養した。
培地中に生産されたD-フェニル乳酸は、有機溶媒を用いた抽出法と再結晶法を用いて精製された。抽出溶媒は、メタノールとヘキサンの混合溶媒(混合比1:1)を用いた。
(1)ppr遺伝子を導入したL-チロシン生産性大腸菌の調製
光学活性4-ヒドロキシフェニル乳酸の生産株は、LB培地{10.0 g/L tryptone、5.0 g/L yeast extract、10.0 g/L NaCl}で一晩培養した後に、滅菌したグリセロールを全量の20% 添加し、-80℃で保存した。
PPRを有する光学活性ヒドロキシフェニル乳酸生産株を、50 mLのD-ヒドロキシフェニル乳酸生産培地(表14及び表15)に20 g/Lのグルコースと50 mg/Lのカナマイシンを加えたものを用いて、1/100量の前述した前培養液を接種し、500 mL容羽根付き三角フラスコで、37℃、120 rpm、24時間振とう培養した。
培地中に生産されたD-4-ヒドロキシフェニル乳酸は、有機溶媒を用いた抽出法と再結晶法を用いて精製された。抽出溶媒は、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒(混合比1:1)を用いた。
本菌が、培地に添加したチロシンを4-ヒドロキシフェニル乳酸に変換可能であることを示した。本菌は、グルコースを原料として、シキミ酸経路、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を経由して4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成すると考えられた。生産される4-ヒドロキシフェニル乳酸は光学活性体(D-4-ヒドロキシフェニル乳酸)であった。
試料中のヒドロキシフェニル乳酸の定量はHPLCを用いて、以下の分析条件にて、分析する。
カラム:TSKgel ODS-80(登録商標) (4.6 × 150 mm, Tosoh, Tokyo, Japan)
カラム温度:28℃
流速:0.8 mL/min
移動相:20 mm potassium phosphate buffer (pH 2.5): methanol (6:4, v/v)
<ガスクロマトグラフィー質量分析計(GC/MS)を用いた4-ヒドロキシフェニル乳酸の定性>
培養液5 mLを、1% NaOHを用いてpH を9から10に調整し、遠心エバポレーターを用いて減圧乾燥した。得られた沈殿を、1% NaOH 200 μL、Methanol 167 μL、Pyridine 34 μLに完全に懸濁した。これに、Methyl chlorocarbonateを20 μL加え、激しく攪拌することにより試料をメチル化した。Methyl chlorocarbonateを加え攪拌する操作を繰り返した後、Chloroformを400 μL加え、攪拌した。次に、50 mM Sodium bicarbonateを加え、攪拌後の水層を除去した。得られたChloroform層に0.1gのSodium sulfateを加えることによりChloroform層を完全に脱水し、得られた溶液に含まれる有機酸をGC/MS(GCMS-QP2010 Plus、Shimadzu)を用いて測定した。分析の条件を以下に示す。
カラム:DB-5(0.32 mm x 30 m)
カラム温度:60 ℃ (2 min)-8℃/min-180℃ (5 min)-40℃/min-220℃ (5 min)
インターフェイス温度:230℃
イオンソース温度:250℃
キャリアガス:He
流量:30 ml/min
<生産した4-ヒドロキシフェニル乳酸の光学異性>
〔HPLCを用いたキラル分析〕
培養液中の4-ヒドロキシフェニル乳酸の光学異性を、HPLCを用いて、以下の分析条件にて、決定する。なお、培養液から濾過や遠心分離等により菌体を除去した培養上清を試料として使用する。
カラム:Nucleosil Chiral-1 (Macherey-Nagel)
カラム温度:60℃
流速:1.2 mL/min
移動相:0.5 mM CuSO4
<生産した4-ヒドロキシフェニル乳酸の光学異性>
培養上清を回収し適宜メタノールで希釈したものを分析試料とする。ヒドロキシフェニル乳酸濃度の測定は、HPLCを用いて、以下の分析条件にて決定する。
カラム:ODS-column (5C18-MS-II : COSMSIL)
カラム温度:28℃
流速: 0.8 mL/ min
移動相:20mM リン酸:メタノール=4:6
以上、本発明の酵素PPRを利用すると、チロシンをD-4-ヒドロキシフェニル乳酸に変換可能である。更に、シキミ酸経路及びヒドロキシフェニルピルビン酸を経由するような形質転換体を利用することで、グルコースを原料としてD-4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成することが可能である。
Claims (13)
- フェニルピルビン酸を基質としてD-フェニル乳酸を生成するフェニルピルビン酸還元酵素をコードするポリヌクレオチドであって、
(a)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(c)配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと60%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(d)配列番号6,7又は8に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(e)配列番号4に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
(f)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び
(g)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。 - フェニルピルビン酸を基質としてD-フェニル乳酸を生成するフェニルピルビン酸還元酵素であって、
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
のいずれかを含む、フェニルピルビン酸還元酵素。 - 請求項1に記載のヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項4に記載の形質転換体。
- 前記微生物が大腸菌又はフェニルアラニン若しくはチロシン生産性組換微生物である請求項5に記載に形質転換体。
- 次の(a)、(b)又は(c)のタンパク質からなるフェニルピルビン酸還元酵素を用いて、フェニルピルビン酸又は4-ヒドロキシフェニルピルビン酸を基質としてD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成させ、これを回収することを特徴とするD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法:
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 前記フェニルピルビン酸還元酵素の反応条件が、反応温度20~40℃、pH6~7であることを特徴とする請求項7に記載のD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法。
- 次の(a)、(b)又は(c)のタンパク質からなるフェニルピルビン酸還元酵素をコードする遺伝子を含む微生物を用いて培養し、微生物基質からD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸を生成させ、これを回収することを特徴とするD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法:
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 前記微生物が、ウィッケルハミア属酵母若しくはこれを親株とした変異株又は請求項4又は5に記載の形質転換体であることを特徴とする請求項9に記載のD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法。
- 前記微生物基質がD-グルコース、L-フェニルアラニン、L-チロシン、フェニルピルビン酸及び4-ヒドロキシフェニルピルビン酸から選ばれる1種以上の基質であることを特徴とする請求項9に記載のD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法。
- ウィッケルハミア属酵母が、Wicherhamia fluorescensである請求項10に記載のD-フェニル乳酸又はD-4-ヒドロキシフェニル乳酸の製造方法。
- ウィッケルハミア フルオレセンス(Wicherhamia fluorescens)TK1と命名され、FERM AP-22048として寄託された微生物。
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