JPH05344881A - 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック
制御を受ける酵素を脱感作し、これらフィードバック阻
害の解除された酵素をコードする遺伝子が導入された形
質転換株を培養することにより、Ｌ−フェニルアラニン
の発酵生産の生産性を高める。 【構成】 ＤＳ、ＣＭ−ＰＤの１ないしそれ以上のアミ
ノ酸の変異により実質的にＬ−フェニルアラニンによる
フィードバック阻害が解除された酵素をコードするＤＮ
Ａ断片と、そしてＳＫをコードするＤＮＡ断片を含む組
換えベクターで、ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ欠失のエシェリヒ
ア・コリ微生物を形質転換して得られる形質転換体、及
び該形質転換体を培養することにより培地中に生産され
たＬ−フェニルアラニンを取得することを特徴とする発
酵法によるＬ−フェニルアラニンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】Ｌ−フェニルアラニンは甘味料ア
スパルテームの原料として近年需要が急増しているアミ
ノ酸である。本発明は、Ｌ−フェニルアラニンの生産に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】微生物を用いてＬ−フェニルアラニンを
発酵生産する製造法としては、組換え体エシェリヒア・
コリを用いるものに、特開昭５６−１８９０、特開昭５
７−１７０１８４、特開昭５８−１０３３９８、特開昭
６１−９２５６５、特開平１−１０４１６０、国際公開
ＷＯ８７／００２０２がある。またＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−チロシンの製造法としては、コリネバクテ
リウム属の変異株を用いるものに、特開昭６１−１２８
８９７があり、組換え体コリネバクテリウムを用いるも
のに、特開昭６０−３４１９７、特開昭６０−２４１９
２、特開昭６１−２６０８９２、特開昭６１−１２４３
７５が知られている。

【０００３】通常、Ｌ−フェニルアラニン生合成経路に
おいては、その中心的役割を果たすキーエンザイムが最
終産物により、フィードバック阻害を受ける。上記従来
技術では、このフィードバック阻害の解除がなされたキ
ーエンザイムを有する微生物を用いることにより、Ｌ−
フェニルアラニンの生産を行うことを原理としている。

【０００４】従来技術において、フィードバック阻害解
除の対象となるキーエンザイムとしては、３−デオキシ
−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ
（以下、「ＤＳ」と略する）や、プレフェン酸デヒドラ
ターゼ（以下、「ＰＤ」と略する）などがある。

【０００５】このうちまずＤＳについてであるが、エシ
ェリヒア・コリにおいては、ＤＳには３種類のアイソザ
イムが存在することが知られている。これらは、ａｒ ｏ
Ｆ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨと呼ばれる遺伝子にコードさ
れ、それぞれＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ
−トリプトファンによるフィードバック阻害を受ける。

【０００６】これらの遺伝子に関する塩基配列及びアミ
ノ酸配列は、既に報告されている［ａｒｏＦ：Hudson,
G.S. and Davidson, B.E., J. Mol. Biol., 180, 1023
(1984)／ａｒｏＧ：Davies, W.D. and Davidson, B.E.,
Nucleic Acids Res., 13, 4045 (1982)／ａｒｏＨ：Ra
y, J.M. et al, J. Bacteriol., 170, 5500 (1988)］。

【０００７】芳香族アミノ酸を効率的に生産するために
は、これらＤＳを改良することが不可欠である。３種類
のＤＳ遺伝子のうち、ａｒｏＨにコードされるＤＳにつ
いては、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害
が解除された変異型ａ ｒｏＨが報告されている［Ray,
J.M. et al, J. Bacteriol., 170, 5500 (1988)］。し
かしながら、本来、ａｒｏＨ由来のＤＳ活性は、他のＤ
Ｓ活性に比して非常に低いため、組換えＤＮＡ技術によ
る改良には適さず、ａｒｏＦ、ａｒｏ Ｇにコードされる
ＤＳをフィードバック阻害解除したもの利用がより効率
的であると考えられる。

【０００８】Ｌ−チロシンによるａｒｏＦのフィードバ
ック阻害解除変異の例としてはウェーバーとハーマンに
よる報告［Weaver, L.M. and Herrmann, K.M., J. Bact
eriol., 172, 6581 (1990)］があり、Ｎ末端より１４８
番目のＬ−プロリン残基がＬ−ロイシン残基に置換して
いる。

【０００９】フィードバック阻害が解除されたＤＳのう
ち、変異部位が明示されたものが芳香族アミノ酸の発酵
生産に応用された例としては、以下に示す２、３の例が
知られるのみである。エドワーズらが、ａｒｏＦにコー
ドされるＤＳの１５２番目のＬ−グルタミン残基をＬ−
イソロイシン残基に置換することでＬ−チロシンによる
フィードバック阻害を解除し、Ｌ−フェニルアラニンの
発酵生産に利用している［国際公開ＷＯ８７／００２０
２］。また、シネンキらはａｒｏＧにコードされるＤＳ
の７６番目のＬ−ロイシン残基をＬ−バリン残基に置換
することにより、Ｌ−フェニルアラニンによるフィード
バック阻害を解除したＤＳ（ａｒｏＧ）を取得してＬ−
フェニルアラニンの発酵生産に利用している［特開昭５
８−１０３３９８］。しかしながら、本報告では、Ｌ−
フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解除され
たＤＳの酵素活性のデータ及びＬ−フェニルアラニンの
生産量は記載されていない。

【００１０】次にＰＤについてであるが、エシェリヒア
・コリにおいては、コリスミン酸ムターゼ（以下、「Ｃ
Ｍ」と略する）およびＰＤ活性を有する２機能酵素（Ｃ
Ｍ−ＰＤ）の存在が知られ、該酵素活性はフェニルアラ
ニンによりフィードバック阻害を受ける。尚、該酵素は
ｐｈｅＡと呼ばれる遺伝子にコードされており、ハドソ
ンとデビッドソンにより、該遺伝子の塩基配列および該
酵素のアミノ酸配列が報告されている［Hudson, G.S. a
nd Davidson, B.E., J. Mol. Biol., 180, 1023 (198
4)］。フェニルアラニンを効率的に生産するためには、
このＣＭ−ＰＤのフェニルアラニンによるフィードバッ
ク阻害を解除することが肝要であり、その方法におい
て、アミノ酸レベルで解析されたものはいくつか知られ
ている。例えば、ゲッシングとデビットソンは、ＣＭ−
ＰＤの２個(Ｎ末端より２２６番目と３３８番目）のト
リプトファン残基をジメチル［２−ヒドロキシ−５−ニ
トロベンジルスルフォニウムブロマイド］で修飾する
と、フィードバック阻害に耐性の酵素ができることを報
告している［Gething, M.J.H. and Davidson, B.E., Eu
r.J. Biochem., 78, 111 (1977)］。また、バックマン
らは、ＣＭ−ＰＤのＮ末端側より３３８番目のトリプト
ファン残基以降を欠失させるか、あるいはこの残基をア
ルギニン−グリシンに置換することによりフィードバッ
ク阻害の解除された酵素ができることを見いだしている
［特開平１−２３５５９７］。さらに、エドワーズら
は、やはり３３８番目のトリプトファン残基の位置にト
リプトファン−アルギニン−セリン−プロリンのアミノ
酸配列を挿入することにより、同様にフィードバック阻
害を解除した［国際特許ＷＯ８７／００２０２］。これ
らはすべて、３３８番目のトリプトファン残基について
注目したものであり、その他の残基についての知見はな
かった。

【００１１】一方、コリネ型細菌においては、ＰＤ単独
の活性を有する酵素（ＰＤ）があり、この反応もフェニ
ルアラニンによってフィードバック阻害を受けているこ
とが知られている。

【００１２】該酵素をコードする遺伝子のうち、尾崎ら
［Ozaki, A. e t al., Agric. biol.chem., 49, 2925 (1
986)］、及び伊藤ら［Ito, H. et al., Appl. Microbio
l.Biotechnol., 33, 190 (1989)］はフェニルアラニン
によるフィードバック阻害が解除された遺伝子について
報告している。また、フォレッチーとシンスキーは、天
然型のＰＤ遺伝子の塩基配列を報告しており、エシェリ
ヒア・コリＫ−１２のｐｈｅＡ遺伝子との相同性を指摘
している［Follettie, M.T. and Sinsky, A.J., J. Bac
teriol., 167, 695 (1986)］。しかしながら、コリネ型
細菌においてフィードバック阻害が解除された酵素遺伝
子の塩基配列に関する知見はなかった。ましてや、塩基
配列レベルでの変換、それに伴うアミノ酸置換による阻
害解除の試みは実施されていなかった。

【００１３】Ｌ−フェニルアラニンの生合成系のもう１
つのキーエンザイムにシキミ酸キナーゼ（以下、ＳＫと
略する。）があるが、エシェリヒア・コリのＳＫ遺伝子
ａｒｏＬはデフェイターらによりクローニングされ［J.
Bacteroil., 165, 226 (1986)］その塩基配列が決定さ
れている［J. Bacteriol., 165, 233 (1986)］。しかし
ながらエシェリヒア・コリにおいてＳＫをＬ−フェニル
アラニンの発酵生産に利用した具体的例はまだ報告され
ておらず、コリネ型細菌において報告があるのみである
（特開昭６２−１４３６８２）。

【００１４】またエシェリヒア・コリにおいては、芳香
族アミノ酸が過剰に生産されるとＴｙｒＲというタンパ
ク質が活性化され、芳香族アミノ酸生合成経路中の２種
類のＤＳ（遺伝子としてａｒｏＦ、ａｒｏＧ）、ＳＫ
（遺伝子としてａｒｏＬ）、そしてチロシンアミノトラ
ンスフェラーゼ（遺伝子としてｔｙｒＢ）の遺伝子の発
現を抑制する、いわゆるフィードバック抑制機構が存在
することが知られている［J. Bacteriol., 108, 400 (1
971)］。このＴｙｒＲタンパク質の遺伝子（ｔｙｒＲ）
が欠失したエシェリヒア・コリを用いてＬ−フェニルア
ラニンを発酵生産させている具体的な例としてはチョイ
とトライブらの例［Biotechnol. Lett., 4, 223 (198
2)］、［特開昭５７−１７０１８４］が知られている。
この例ではｔｙｒＲ遺伝子の欠失したエシェリヒア・コ
リに導入する遺伝子としてはａｒｏＦとｐｈｅＡの２つ
だけが具体的に挙げられている。

【００１５】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ
−フェニルアラニンを、効率よく発酵生産する方法を提
供することである。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率よく
Ｌ−フェニルアラニンを発酵生産する方法を開発するこ
とを目的として研究を重ねた結果、本発明を完成するに
至った。

【００１７】即ち本発明は、１ないしそれ以上のアミノ
酸残基を他のアミノ酸に置換する、あるいは欠失するな
どの変異を加えることにより得られる、フィードバック
阻害が解除されたＤＳおよびＰＤをコードするＤＮＡ断
片、さらにＳＫをコードするＤＮＡ断片を含む組換えベ
クターで形質転換された、ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子の
欠失したエシェリヒア属に属する微生物、及び該微生物
を培養することにより、多量のＬ−フェニルアラニンを
生成取得することを特徴とする、Ｌ−フェニルアラニン
の製造法である。

【００１８】さらに本願発明は、エシェリヒア属にする
微生物であって、宿種がｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子を欠
失したものであり、かつ、フィードバック阻害が解除さ
れたエシェリヒア属由来のＤＳであって、ａｒｏＦにコ
ードされるもののＮ末端より１４７番目のアスパラギン
酸残基がアスパラギン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＦ
にコードされるもののＮ末端より１８１番目のセリン残
基がフェニルアラニン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧ
にコードされるもののＮ末端より１５０番目のプロリン
残基がロイシン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧにコー
ドされるもののＮ末端より２０２番目のアラニン残基が
スレオニン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧにコードさ
れるもののＮ末端より１４６番目のアスパラギン酸残基
がアスパラギン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧにコー
ドされるもののＮ末端より１４７番目のメチオニン残基
がイソロイシン残基に置換され３３２番目のグルタミン
酸残基がリジン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧにコー
ドされるもののＮ末端より１４７番目のメチオニン残基
がイソロイシン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏＧにコー
ドされるもののＮ末端より１５７番目のメチオニン残基
がイソロイシン残基に置換され２１９番目のアラニン残
基がスレオニン残基に置換されたＤＳ、の内から選ばれ
るいずれか１つをコードするＤＮＡ断片と、フィードバ
ック阻害が解除されたエシェリヒア属由来のＣＭ−ＰＤ
であって、３３０番目のセリン残基がプロリン残基に置
換されたＣＭ−ＰＤ、３３０番目のセリン残基がアスパ
ラギン酸残基に置換されたＣＭ−ＰＤ、３３０番目のセ
リン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤ、の内から選ばれる
いずれか１つをコードするＤＮＡ断片と、ＳＫをコード
するＤＮＡ断片がエシャリヒア属細菌用ベクターに挿入
されて得られる組換えベクターを保持するものであり、
および該微生物を用いることを特徴とする発酵法による
Ｌ−フェニルアラニンの製造法である。

【００１９】本発明者らは、まずエシェリヒア・コリの
天然型ＤＳ遺伝子をクローニングし、これを変異させる
ことによりフィードバック阻害が解除されたＤＳをコー
ドする新規遺伝子を取得した。また、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの天然型ＰＤ遺伝子をクロー
ニングし、また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌よりフィ
ードバック阻害が解除されたＰＤをコードする遺伝子を
取得し、変異点を決定した。さらに、エシェリヒア・コ
リの天然型ＣＭ−ＰＤ遺伝子をクローニングし、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムにおける変異点を
基にこれを変異させることによりフィードバック阻害が
解除されたＣＭ−ＰＤをコードする新規遺伝子を取得し
た。またＳＫをコードする遺伝子は通常の方法でクロー
ニングした。

【００２０】次に、ＤＳをコードする遺伝子とＰＤをコ
ードする遺伝子を組み合わせてｔｙｒＲ遺伝子、ｔｙｒ
Ａ遺伝子の欠失したエシェリヒア・コリに導入した時よ
りも、ＤＳをコードする遺伝子とＰＤをコードする遺伝
子、さらにはＳＫをコードする遺伝子を組み合わせた時
の方がＬ−フェニルアラニンの発酵生産がよいことを見
いだし、本発明を完成するに至った。

【００２１】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２２】本発明における、フィードバック阻害が解
除されたＤＳをコードする新規遺伝子の取得は、以下の
ようにして行なうことができる。

【００２３】先ず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ
１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の染色体ＤＮＡより
ＰＣＲ法を用いてａｒｏＦ、ａｒｏ Ｇ遺伝子をクローニ
ングし、ヒドロキシルアミンを用いて目的の遺伝子を変
異させた。

【００２４】ａｒｏＦ及びａｒｏＧとは、Ｌ−チロシ
ン、Ｌ−フェニルアラニンでそれぞれフィードバック阻
害を受けるＤＳをコードする遺伝子をいい、遺伝的多系
性などによる変異型も含む。尚、遺伝的多系性とは、遺
伝子上の自然突然変異により蛋白質のアミノ酸配列が一
部変化している現象をいう。

【００２５】遺伝子に変異を生じさせるには、リコンビ
ナントＰＣＲ法［PCR Technology,Stockton press (198
9)］、部位特異的変異法［Kramer, W. and Frits, H.
J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)］や当該
遺伝子を保有する菌株を紫外線照射する方法もしくは化
学薬剤処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、
亜硝酸など）する方法、更に目的遺伝子を化学合成する
方法がある。

【００２６】ＤＳにおいて、他のアミノ酸に置換される
アミノ酸残基とは、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、あるいはＬ−トリプトファンによるフィードバック
阻害のメカニズムに関わるアミノ酸配列領域に存在する
アミノ酸残基をいう。例えばａｒｏＦによってコードさ
れるＤＳでは、Ｎ末端側より１４７番目のアスパラギン
酸残基、１８１番目のセリン残基をいい、これらは表１
にまとめられている。

【００２７】ＤＳにおける他のアミノ酸残基への置換と
は、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、あるいはＬ
−トリプトファンによるフィードバック阻害が解除され
るような他のアミノ酸残基への置換をいい、表１にまと
めたとうりである。

【００２８】

【表１】

【００２９】本発明における、フィードバック阻害が解
除されたＰＤ、即ちブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムにおいてはＰＤ、エシェリヒア・コリにおいて
はＣＭ−ＰＤをコードする新規遺伝子の取得は、以下の
ようにして行った。

【００３０】まず、Ｌ−フェニルアラニンを良好に生産
するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの、Ｌ
−フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解除さ
れたＰＤ遺伝子の塩基配列を決定、解析することによ
り、生産株では野生株と比べて１アミノ酸が置換してい
ることを見いだした。次に、本知見に基づきエシェリヒ
ア・コリＫ−１２におけるＣＭ−ＰＤの相同領域に同じ
アミノ酸置換、すなわち、３３０番目のセリン残基をプ
ロリン残基に置換したところ、フィードバック阻害の解
除したＣＭ−ＰＤを取得することができた。あるいは該
３３０番目のセリン残基をアスパラギン酸残基に置換し
たＣＭ−ＰＤおよび該３３０番目のセリン残基以降が欠
失したＣＭ−ＰＤを造成したところ、該酵素がフィード
バック阻害解除されていることが判明した。

【００３１】本発明でいうＰＤ活性を有する酵素とは、
コリネ型細菌などの微生物由来で単独の該活性を有する
もの、さらにエシェリヒア・コリなどの微生物由来でＣ
Ｍ−ＰＤといった２機能の活性を有するものをいう。

【００３２】ＰＤにおいて、他のアミノ酸に置換され
る、あるいは欠失されるアミノ酸残基とは、Ｌ−フェニ
ルアラニンによるフィードバック阻害のメカニズムに関
わるアミノ酸配列領域に存在するアミノ酸残基をいう。
例えば、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムの
ＰＤにおいてはＮ末端側より２３５番目、エシェリヒア
・コリのＣＭ−ＰＤにおいてはＮ末端側より３３０番目
のセリン残基の置換であり、また、エシェリヒア・コリ
のＣＭ−ＰＤのＮ末端側より３３０番目のセリン残基以
降の欠失をいう。

【００３３】ＰＤにおいて、他のアミノ酸残基への置換
とは、Ｌ−フェニルアラニンによるフィードバック阻害
が解除されるような他のアミノ酸への置換をいい、たと
えばブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムのＰＤ
においてはＮ末端側より２３５番目、エシェリヒア・コ
リのＣＭ−ＰＤにおいてはＮ末端側より３３０番目のセ
リン残基のプロリン残基への置換をさす。さらにはエシ
ェリヒア・コリＫ−１２の該３３０番目のセリン残基を
アスパラギン酸残基に置換したものをいう。

【００３４】ＳＫ遺伝子についてはエシェリヒア・コリ
Ｋ−１２のＭＣ１０６１株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法
を用いてａｒｏＬ遺伝子をクローニングした。クローニ
ングの方法についてはＰＣＲ以外の、従来より行われて
いるエシェリヒア・コリの遺伝子ライブラリーより取得
する方法でもよい。

【００３５】以上の方法で取得される組換えＤＮＡと
は、フィードバック阻害を解除したＤＳ、ＰＤそしてＳ
Ｋをコードする有用遺伝子をパッセンジャーとして、プ
ラスミドやファージＤＮＡのベクターに組み込んだもの
をいう。その際、該有用遺伝子の発現を効率的に実施す
るために、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等のエシェリヒア・コ
リで働くプロモーターを用いてもよい。尚、ここでいう
組換えＤＮＡには、該有用遺伝子をトランスポゾン［Be
rg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (198
3)］、Ｍｕファージ［特開平２−１０９９８５］または
相同性組換え［Experiments in Molecular Genetics, C
old Spring Habor Lab. (1972)］を用いた方法で染色体
に組み込んだものも含まれる。

【００３６】ｔｙｒＲ遺伝子の欠失したエシェリヒア・
コリの取得は、先ずｔｙｒＲ遺伝子のクローニングより
行った。エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６１株
の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてｔｙｒＲ遺伝子を
クローニングした。このｔｙｒＲ遺伝子を適当な制限酵
素で処理することにより欠失ｔｙｒＲ遺伝子を構築し、
この欠失ｔｙ ｒＲ遺伝子をエシェリヒア・コリの染色体
上の正常なｔｙｒＲと入れ換えること、つまり相同性組
換えを利用した遺伝子置換の手法によりｔｙ ｒＲの欠失
したエシェリヒア・コリを造成した。尚、欠失ｔｙｒＲ
遺伝子の構築には制限酵素処理で欠失させる他、先に述
べたような化学薬剤処理やリコンビナントＰＣＲ法、部
位特異的変異法、更に欠失ｔｙｒＲ遺伝子を化学合成す
る方法が考えられる。またエシェリヒア・コリを紫外線
照射する方法もしくは化学薬剤処理（Ｎ−メチル−Ｎ’
−ニトロソグアニジン、亜硝酸など）する方法などによ
り、ｔｙｒＲ遺伝子の欠失したエシェリヒア・コリを直
接造成することもできる。

【００３７】ｔｙｒＡ遺伝子の欠失したエシェリヒア・
コリの取得もｔｙｒＲの場合と同様にして達成される。
ｔｙｒＡ遺伝子はプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子である。該酵素はプレフェン酸からＬ−チ
ロシンを合成する経路の反応を触媒するものであり、こ
れを欠損した株ではプレフェン酸がＬ−フェニルアラニ
ンへと効率よく変換される。

【００３８】以上の方法で取得した、フィードバック阻
害が解除されたＤＳおよびＰＤ遺伝子、そしてＳＫ遺伝
子を含む組換えＤＮＡで形質転換されたｔｙｒＲ、ｔｙ
ｒＡ遺伝子が欠失したエシェリヒア・コリを培養し、培
養液にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを
採取した。

【００３９】使用するＬ−フェニルアラニン生産用の培
地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその
他の有機成分を含有する通常の培地である。

【００４０】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。

【００４１】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００４２】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量
含有させることが望ましい。

【００４３】これらの他に、必要に応じて、リン酸カリ
ウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等
が少量添加される。

【００４４】培養は好気的条件下で１６〜７２時間実施
するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐ
Ｈは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。

【００４５】発酵液からのＬ−フェニルアラニンの採取
は通常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を
組み合わせることにより実施できる。

【００４６】以上に述べた方法により、フィードバック
阻害が解除されたＤＳおよびＰＤ、そしてＳＫを有する
ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子の欠失したエシェリヒア・コ
リ形質転換株を培養すると、Ｌ−フェニルアラニン生産
性について大幅な向上がみられた。このことは本発明の
有用性を実証したものである。

【００４７】以下、実施例に基づき更に具体的に説明す
る。

【００４８】

【実施例】

実施例１ フィードバック阻害が解除されたＤＳをコー
ドする新規遺伝子の取得 （１）エシェリヒア・コリのａｒｏＦ由来変異型ＤＳ遺
伝子の取得 エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６１株から、通
常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。一方、公知
の文献［J. Mol. Biol., 180, 1023 (1984)］に記載さ
れているａｒｏＦ遺伝子の塩基配列に基づいて配列番号
１及び２に示すような合成ＤＮＡプライマー２本を通常
の方法で合成した。 配列番号１ GCTAACCAGT AAAGCCAACA 配列番号２ CCCACTTCAG CAACCAGTTC これらはそれぞれａｒｏＦ遺伝子の上流及び下流に相同
な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライマー
を用いてエルリッチらの方法［PCR Technology,Stockto
n press (1989)］に従ってＰＣＲ反応を行ない、１．５
ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図１の左側に示すよ
うに、この断片を制限酵素ＥｃｏＲＶとＥｃｏ４７ＩＩ
Ｉで切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＳｍ
ａＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。こ
の反応混合物でエシェリヒア・コリＫ−１２のＪＭ１０
９株（宝酒造社製）を形質転換し、生育したクロラムフ
ェニコール耐性株の中でａｒｏＦ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラ
スミドｐＨＳＧ−ａｒｏＦを取得した。更にｐＨＳＧ−
ａｒｏＦを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断
することにより得たａｒｏＦ遺伝子含有ＤＮＡ断片を、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼでプラスミドｐＴＳ１（特願平２−
１９２１６２）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラ
グメントと連結した。この反応混合物でエシェリヒア・
コリＫ−１２のＤＳ欠損（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒ ｏ
Ｈ）株ＡＢ３２５７を形質転換した（ＡＢ３２５７株
は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック
センターより入手した）。生育したアンピシリン耐性株
の中でＬ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリ
プトファンの要求性が消失した株からプラスミドを抽出
し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦを取得した。

【００４９】次に、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＦをヒド
ロキシルアミンを用いた方法［J. Mol. Biol., 175, 33
1 (1984)］によって変異処理を行なった後、ＡＢ３２５
７株に形質転換し、アンピシリン耐性株を取得後、１ｍ
ＭのＬ−チロシン添加の最少培地に生育した株を２株選
択し、これらの菌株よりフィードバック阻害が解除され
たａｒｏＦ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏ
Ｆ１５及びｐＴＳ−ａｒｏＦ３３を得た。フィードバッ
ク阻害が解除されていないａｒｏＦを含むプラスミドを
保有するＡＢ３２５７株は、図２に示す通り最少培地に
１ｍＭのＬ−チロシンを加えると、該ＤＳ活性がフィー
ドバック阻害を受け、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−トリ
プトファンといった芳香族アミノ酸を合成できず、生育
することができなくなる。

【００５０】（２）エシェリヒア・コリのａｒｏＧ由来
変異型ＤＳ遺伝子の取得ａｒｏＦ 遺伝子の場合と同様にして、変異型ａｒｏＧ遺
伝子を取得した。公知の文献［Nucleic Acids Res., 1
0, 4045 (1982)］に記載されているａｒｏＧ遺伝子の塩
基配列に基づいて配列番号３及び４に示すような合成Ｄ
ＮＡプライマー２本を合成した。 配列番号３ GTATTTACCC CGTTATTGTC 配列番号４ ACTCCGCCGG AAGTGACTAA 該プライマーとＭＣ１０６１株の染色体ＤＮＡを用い
て、ＰＣＲ反応を行ない、２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を
得た。以下、図１の右側に示すように、この断片を制限
酵素ＳａｌＩとＥｃｏ４７ＩＩＩで切断した後、ｐＨＳ
Ｇ３９８（宝酒造社製）のＳａｌＩとＳｍａＩ切断物を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合物
でＪＭ１０９株を形質転換し、生育したクロラムフェニ
コール耐性株の中でａｒｏＧ遺伝子が挿入されたプラス
ミドを保有する菌株からプラスミドを抽出し、プラスミ
ドｐＨＳＧ−ａｒｏＧを取得した。さらにｐＨＳＧ−ａ
ｒｏＧを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨ ｉｎｄＩＩＩで切断す
ることにより得られたａｒｏＧを含有するＤＮＡ断片
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、ｐＴＳ１のＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ切断フラグメントと連結した。この反応混
合物でＡＢ３２５７株（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏ
Ｈ）を形質転換し、生育したアンピシリン耐性株の中で
Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトフ
ァンの要求性が消失している株からプラスミドを抽出
し、プラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧを取得した。

【００５１】次に、このプラスミドをａｒｏＦの場合と
同様にヒドロキシルアミンによる変異処理を行なった
後、ＡＢ３２５７株に形質転換し、アンピシリン耐性株
を取得した。これらの菌株から１０ｍＭのＬ−フェニル
アラニン添加の最少培地に生育した菌株を６株選択し、
これらの菌株よりフィードバック阻害が解除されたａ ｒ
ｏＧ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＳ−ａｒｏＧ４、
ｐＴＳ−ａｒｏＧ８、ｐＴＳ−ａｒｏＧ１５、ｐＴＳ−
ａｒｏＧ１７、ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９、ｐＴＳ−ａｒｏ
Ｇ４０を得た。フィードバック阻害が解除されていない
ａｒｏＧを含むプラスミドを保有するＡＢ３２５７株
は、図３に示す通り最少培地に１０ｍＭのＬ−フェニル
アラニンを添加すると、該ＤＳ活性がフィードバック阻
害を受け、Ｌ−トリプトファンやＬ−チロシンといった
芳香族アミノ酸を合成できず、生育することができなく
なる。

【００５２】（３）ＤＳ酵素活性の測定 上述の変異型ａｒｏＦ（２種類）及び変異型ａｒｏＧ
（６種類）を含有するプラスミドを、ＤＳ活性を有しな
いエシェリヒア・コリＡＢ３２５７株に導入して形質転
換株を取得し、それぞれをＡＪ１２５９８（ＡＢ３２５
７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ１５）、ＡＪ１２５９９（ＡＢ３
２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＦ３３）、ＡＪ１２５６２（Ａ
Ｂ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４）、ＡＪ１２６００
（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ８）、ＡＪ１２５６
３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏ Ｇ１５）、ＡＪ１２
６０１（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ１７）、ＡＪ
１２６０２（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ２９）及
びＡＪ１２６０３（ＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ４
０）と命名した。これらの内、代表株としてＡＪ１２５
６３、ＡＪ１２６０３をそれぞれ、エシェリヒア・コリ
ＦＥＲＭ ＢＰ−３５６７、 ＦＥＲＭ ＢＰ−３５
６８として微工研に寄託した。尚、比較のため、天然型
の遺伝子を含有するプラスミドも同株に導入した。

【００５３】これらの菌株を既知のＬ−フェニルアラニ
ン生産培地［Sugimoto, S. et al.,J. Biotechnol., 5,
237 (1989)］を用いて２４時間培養した。この培養菌
体より超音波破砕によって粗酵素液を調製し、通常の方
法［Gollub, E. et al., Methods Enzymol., 17, 349］
に従って、ａｒｏＦの場合はＬ−チロシン存在下で、ａ
ｒｏＧの場合はＬ−フェニルアラニン存在下でＤＳの酵
素活性を測定した。その結果、図２と図３に示すよう
に、天然型のもの（エシェリヒア・コリＡＢ３２５７／
ｐＴＳ−ａｒｏＦ）ではＬ−チロシンの存在下で酵素活
性が強く阻害されているのに対し、それぞれの変異型の
ものではＬ−チロシンによるフィードバック阻害が解除
されていた。同様に、もう一方の天然型のもの（エシェ
リヒア・コリＡＢ３２５７／ｐＴＳ−ａｒｏＧ）では、
Ｌ−フェニルアラニンの存在下で酵素活性が強く阻害さ
れるのに対し、それぞれの変異型のものではＬ−フェニ
ルアラニンによるフィードバック阻害が解除されてい
た。さらに変異型のうちＡＪ１２５６２株のＤＳは、Ｌ
−フェニルアラニンによるフィードバック阻害が解除さ
れているだけではなく、Ｌ−フェニルアラニンの濃度に
従って、酵素活性が上昇した。

【００５４】（４）フィードバック阻害が解除されたＤ
Ｓの変異点の決定 フィードバック阻害が解除されたＤＳの遺伝子であるａ
ｒｏＦ１５、ａｒｏＦ３３、ａｒｏＧ４、ａｒｏＧ８、
ａｒｏＧ１５、ａｒｏＧ１７、ａｒｏＧ２９、ａｒｏ Ｇ
４０の塩基配列を通常の方法［Molecular Cloning (Sec
ond Edition),Cold Spring Harbor Press (1989)］に従
って決定した。具体的なアミノ酸配列上の置換部位及び
その対応塩基配列上の変異点を表１に示す。これらの配
列はすべて、これまでに報告のないものであった。

【００５５】実施例２ フィードバック阻害が解除され
たＰＤをコードする新規遺伝子の取得 （１）ブレビバクテリウム変異型ＰＤの変異点の決定 まず、既知のコリネバクテリウムのＰＤ遺伝子［Follet
tie, M.T. and Sinsky, A.J., J. Bacteriol., 167, 69
5 (1986)］との相同性を指標として、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム野生株のＰＤ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＡＪ１６中のＮｃｏＩ断片の塩基配列をダイ
デオキシ法により決定した。配列を配列表の配列番号５
に示す。尚、該プラスミドは、ブレリバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ１２１２５（ＦＥＲＭ−Ｐ７５
４６）に保持される。尚、該アミノ酸配列はコリネバク
テリウムのものと比べて、わずか１アミノ酸残基異なっ
ていた。次に、同じくプラスミドｐＰＨ１４上にあるブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムのフェニルア
ラニン生産株のＰＤをコードする遺伝子の塩基配列を決
定したところ、配列表の配列番号６に示すような配列が
得られた。尚、該プラスミドはブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムＡＪ１２２５９（ＦＥＲＭ Ｐ−３
５６５）株に保有されるものを使用した。野生株とフィ
ードバック阻害解除がなされた株で比較したところ２３
５番目のセリン残基がプロリン残基に変異していた。

【００５６】（２）エシェリヒア・コリの変異型ＣＭ−
ＰＤをコードする新規遺伝子の構築 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＲＲ１株から、通
常の方法に従って、染色体ＤＮＡを抽出した。

【００５７】一方、公知の文献［Hudson, G.S. and Dav
idson, B.E., J. Mol. Biol., 180,1023 (1984)］に記
載されているｐｈｅＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、以
下に示すような合成ＤＮＡプライマー４本（配列番号７
−１０）を通常の方法で化学合成した。 配列番号７ TCAACAAGCT GGAACGGACG 配列番号８ CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 配列番号９ CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 配列番号10 ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G ７と８はそれぞれｐｈｅＡ遺伝子の上流および下流に相
同な配列を持つ。９と１０はたがいに相補的であり、Ｔ
（チミン塩基）がＣ（シトシン塩基）に置換した１塩基
のみ異なる以外、３３０番目のセリン残基近傍の配列と
相同性を持つ。エシェリヒア・コリＫ−１２のＣＭ−Ｐ
Ｄとブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＰＤ
とは高い相同性を有し、特にエシェリヒア・コリＫ−１
２のＣＭ−ＰＤのＮ末端より３３０番目のセリン残基
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＰＤの
Ｎ末端より２３５番目のセリン残基に相当するものであ
る。該配列番号９、１０は、３３０番目のセリン残基が
プロリン残基となるよう合成されている。

【００５８】次に、染色体ＤＮＡ１μｇと、配列番号７
および１０のプライマーおのおの３００ｎｇ、または配
列番号８および９のプライマーおのおの３００ｎｇを用
いて、ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１．３Ｋｂｐと０．
５ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。該ＰＣＲの方法は、エル
リッチらの方法[Erlich, H.A., ed., PCR Technology,
Stockton press (1989)]にしたがって、連続複製反応装
置（Thermal cycler,Perkin Elmer Cetus社製）を用い
て９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間の反応を
１サイクルとして２０サイクル行なった。これらのＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動し、ＤＮＡ回収キット
（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ，フナコシ社製）をもちいて回
収し、更にこれらの断片と配列番号７と８のプライマー
を用いてＰＣＲ反応を行い、１．８ＫｂｐのＤＮＡ断片
を得た。この断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切
断した後、１．７ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により回収し、更にこの断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ切断
物をＴ４リガーゼを用いて連結した。これをエシェリヒ
ア・コリＫ−１２のＫＡ１９７株（ｐｈｅＡ）に形質転
換し、クロラムフェニコール耐性株の中で、フェニルア
ラニン要求性が消失している株からプラスミドを回収
し、ｐＰＨＡＢと命名した。塩基配列を決定することに
より該プラスミドが、３３０番目のセリン残基がプロリ
ン残基に置換した変異型ＣＭ−ＰＤ酵素遺伝子を保有す
ることを確認した。

【００５９】（３）エシェリヒア・コリＫ−１２のｔｙ
ｒＡ遺伝子欠損性Ｗ３１１０株の造成 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株（国
立遺伝研究所より入手）をストレプトマイシンを含む平
板培地に塗布することにより、ストレプトマイシン耐性
株を取得した。次に、この株とエシェリヒア・コリＫ−
１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ４５、ｔｈｉ、ｒｅ
ｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕｎｇ−１、ｎａｄ
Ｂ）（国立遺伝研究所より入手）の培養液を混合し、３
７℃で１５分間放置して接合伝達を行わせた後、ストレ
プトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ−チロシンを含む
平板培地に塗布し、生じたコロニー即ちエシェリヒア・
コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）株を取得した。
この株に、（２）で得たプラスミドｐＰＨＡＢを形質転
換により導入した。尚、エシェリヒア・コリＫ−１２の
該形質転換株［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］
は微工研に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ
−３５６６である。

【００６０】（４）ＰＤ酵素活性の測定 エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）
／（ｐＰＨＡＢ）株の菌体を、Ｌ培地を用いて３７℃、
１５時間培養した培養液を遠心分離することにより集菌
した。次いで、該菌体を生理食塩水にて２回洗浄し、氷
冷下０．５ｍＭジチオスレイトールを含む２５０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、３０秒
間、４回の超音波（２０ｋＨｚ）破砕することにより粗
酵素液を調製した。

【００６１】ＰＤ酵素活性測定は、常法[Cotton, R.G.
H. and Gibson, F., Meth. in Enzymol., 17, 564 (197
0)]に従った。すなわち、粗酵素液を用いて、１ｍＭプ
レフェン酸バリウムおよび０．５ｍＭチロシンを含む５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）存在下、３７℃
１０分反応させ、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて反応を
停止後、生成したフェニルピリビン酸を３２０ｎｍの吸
光波長にて測定した。蛋白定量法はプロテイン アッセ
イキット（Bio Rad社製）を用い、そのプロトコールに
従った。結果は第４図に示すように、野生型ＣＭ−ＰＤ
では０．５ｍＭＬ−フェニルアラニン存在下で強く酵素
反応が阻害されるのに対し、変異型ＣＭ−ＰＤは５ｍＭ
Ｌ−フェニルアラニンでもほとんど阻害を受けなかっ
た。

【００６２】さらにＬ−フェニルアラニンの非存在下で
の野生型酵素遺伝子を保有するプラスミドの場合は、
３．５×１０²Ｕ／ｍｇ蛋白で、変異型の場合は１．５
×１０⁴Ｕ／ｍｇ蛋白と、より高い酵素活性を示した。
このことにより、当該変異を導入することにより、Ｌ−
フェニルアラニンによるフィードバック阻害解除のみな
らず、酵素量または酵素活性が４０倍増大させることが
できた。

【００６３】（５）エシェリヒア・コリの変異型ＣＭ−
ＰＤをコードする新規遺伝子の構築 また（２）同様に、配列番号１１−１４の合成ＤＮＡを
作製し、これを用いて３３０番目のセリン残基がアスパ
ラギン酸残基に置換したＣＭ−ＰＤおよび３３０番目の
セリン残基以降が欠失したＣＭ−ＰＤをコードする遺伝
子を構築した。これらの遺伝子を含有するプラスミドは
それぞれｐＰＨＡＤ，ｐＰＨＡＴｅｒｍと命名した。 配列番号 １１ ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣＣＧＣ
ＣＣＧＡ Ｔ 配列番号 １２ ＡＴＣＧＧＧＣＧＧＴ ＣＴＴＣＣＡ
ＧＡＣＧ Ｇ 配列番号 １３ CCGTCTGGAA TGACGCCCGA T 配列番号 １４ ATCGGGCGTC ATTCCAGACG G

【００６４】更に、このプラスミドをＷ３１１０（ｔｙ
ｒＡ）株に通常の形質転換法を用いて導入した。なお、
Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ，Ｗ３１１０（ｔ
ｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍはそれぞれ微工研に寄託さ
れており、寄託番号はそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−３６５
２とＦＥＲＭ ＢＰ−３６５３である。

【００６５】（６）ＰＤ酵素活性の測定 エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０（ｔｙｒＡ）
／ｐＰＨＡＤ株、Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴ
ｅｒｍ株の菌体を、Ｌ培地を用いて３７℃、１５時間培
養した培養液を遠心分離することにより集菌した。次い
で（４）と同様にして、ＰＤ酵素活性の測定を行った。
結果は（４）と同様であり、変異型ＣＭ−ＰＤは５ｍＭ
Ｌ−フェニルアラニンでもほとんど阻害を受けなかっ
た。

【００６６】さらに、Ｌ−フェニルアラニンの非存在下
でのこれら２種の変異型酵素の活性は１．５×１０⁴Ｕ
／ｍｇ蛋白であった。このことにより、当該変異を導入
することによっても、Ｌ−フェニルアラニンによるフィ
ードバック阻害解除のみならず、酵素量または酵素活性
が４０倍増大させることができた。

【００６７】実施例３ ＳＫ遺伝子の取得 まず、エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６１株か
ら、通常の方法に従って、染色体ＤＮＡを抽出した。

【００６８】一方、公知の文献［J. Bacteriol., 165,
233 (1986)］に記載されているａｒｏＬ遺伝子の塩基配
列に基づいて、以下に示すような合成ＤＮＡプライマー
２本（配列番号１５−１６）を通常の方法で化学合成し
た。 配列番号１５ GCGGAGCTCG AGAAGTGGTG 配列番号１６ ACTCAGAATT CCTTCCGAGC １５と１６はそれぞれａｒｏＬ遺伝子の上流及び下流に
ほぼ相同な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプ
ライマーを用いてエルリッチらの方法［PCR Technolog
y, Stockton press (1989)］に従ってＰＣＲ反応を行な
い、１．０ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下、図５に示
すように、この断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで
切断した後、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造社製）のＥｃｏＲ
ＩとＳａｃＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
してｐＨＳＧ−ａｒｏＬを得た。

【００６９】実施例４ ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子が欠
失したエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株の造
成 エシェリヒア・コリＫ−１２のＭＣ１０６１株から、通
常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。一方、公知
の文献［J. Biol. Chem., 261, 403 (1986)］に記載さ
れているｔｙｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて配列番号
１７及び１８に示すような合成ＤＮＡプライマー２本を
通常の方法で合成した。 配列番号１７ GGATTAAAGC TTTGGAGCTT 配列番号１８ GTGGATGAAT TCACCACCGA これらはそれぞれｔｙｒＲ遺伝子の上流及び下流にほぼ
相同な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライ
マーを用いてエルリッチらの方法［PCR Technology, St
ockton press (1989)］に従ってＰＣＲ反応を行ない、
１．９ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、ｐＴＳ１の
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの切断物とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結しｐＴＳ−ｔｙｒＲを得た。

【００７０】次にｐＴＳ−ｔｙｒＲを制限酵素ＢｇｌＩ
Ｉで切断しｔｙｒＲ遺伝子内の約３００ｂｐの断片を欠
失させ、残りの断片をＤＮＡブランティングキット（宝
酒造社製）で平滑末端化した後、再び環状化させｐＴＳ
−ΔｔｙｒＲを構築した。構築したｐＴＳ−Δｔｙｒ Ｒ
をエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株（国立遺
伝研究所より入手）に導入して、相同性組換えを起こし
て染色体上の正常なｔｙｒＲ遺伝子と、導入したΔｔｙ
ｒＲ遺伝子が置換した株を３−フルオロチロシン耐性に
より選択し、ｔｙｒＲ遺伝子が欠失したエシェリヒア・
コリＫ−１２のＷ３１１０株を造成した。

【００７１】次に、造成したｔｙｒＲ遺伝子の欠失した
エシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０株をストレプ
トマイシンを含む平板培地に塗布することにより、スト
レプトマイシン耐性株を取得した。次に、この株とエシ
ェリヒア・コリＫ−１２のＭＥ８４２４株（ＨｆｒＰＯ
４５、ｔｈｉ、ｒｅｌＡ１、ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｕ
ｎｇ−１、ｎ ａｄＢ）（国立遺伝研究所より入手）の培
養液を混合し、３７℃で１５分間放置して接合伝達を行
わせた後、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、Ｌ
−チロシンを含む平板培地に塗布し、生じたコロニー即
ちｔｙｒＲ、ｔｙ ｒＡ遺伝子の欠失したエシェリヒア・
コリＫ−１２のＷ３１１０株を取得した。

【００７２】実施例５ Ｌ−フェニルアラニンの発酵生
産 （１）フィードバック阻害が解除されたＤＳおよびＣＭ
−ＰＤ、そしてＳＫを保有するｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝
子の欠失したエシェリヒア・コリＫ−１２のＷ３１１０
株の造成 実施例１で得られた、フィードバック阻害が解除された
ＤＳ遺伝子を含有するｐＴＳ−ａｒｏＧ４を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでａｒｏＧ４部分を切り出
し、この断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断部位に挿入してプラスミドｐＢＲ−ａｒｏＧ４
（アンピシリン耐性マーカー）を取得した。また、実施
例２で得られたフィードバック阻害が解除されたＣＭ−
ＰＤ遺伝子を含有するｐＰＨＡＢを、制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化しＣＭ−ＰＤ遺伝子含有フラ
グメントを切り出し、この断片をｐＢＲ−ａｒｏＧ４の
ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入してプラス
ミドｐＢＧＡ１を構築した。さらにｐＢＧＡ１をＥｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩで消化してａｒｏＧ４−ｐｈｅＡ断片
を切り出し、この断片をｐＭＷ１９（和光純薬社製）の
ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位に挿入してプラスミド
ｐＭＧＡ１を構築した。

【００７３】さらにｐＨＳＧ−ａｒｏＬをＥｃｏＲＩと
ＳａｃＩでａｒｏＬ断片を切り出し、この断片をｐＭＧ
Ａ１のＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ切断部位に挿入してプラス
ミドｐＭＧＡＬ１を構築した。

【００７４】次にｐＭＧＡ１またはｐＭＧＡＬ１をｔｙ
ｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子の欠失したエシェリヒア・コリＫ
−１２のＷ３１１０株にそれぞれ導入し、形質転換株Ｗ
３１１０（ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ）／ｐＭＧＡ１および形
質転換株Ｗ３１１０（ｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ）／ｐＭＧＡ
Ｌ１を造成した。該形質転換株はそれぞれＡＪ１２７４
０株、ＡＪ１２７４１株と命名し、微工研に寄託（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１２９９９、ＦＥＲＭ Ｐ−１３０００）し
た。

【００７５】（２）Ｌ−フェニルアラニン生産性 前項で記載した形質転換株ＡＪ１２６０４をＬ−フェニ
ルアラニン生産用培地（グルコース２０ｇ、リン酸水素
２ナトリウム２９．４ｇ、リン酸２水素カリウム６ｇ、
塩化ナトリウム１ｇ、塩化アンモニウム２ｇ、クエン酸
ナトリウム１０ｇ、グルタミン酸ナトリウム０．４ｇ、
硫酸マグネシウム７水和物３ｇ、塩化カルシウム０．２
３ｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、チロシン７５ｍｇを水
１Ｌに含む）を用いて、３７℃で２４時間培養した。そ
の結果を表２に示す。尚、定量は高速液体クロマトグラ
フィーで実施した。

【００７６】

【表２】

【００７７】

【発明の効果】Ｌ−フェニルアラニンの発酵生産におい
て、効率のよい新規生産菌及び該菌株を用いるＬ−フェ
ニルアラニンの製造法を提供する。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCTAACCAGT AAAGCCAACA 20 配列番号：2 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCACTTCAG CAACCAGTTC 20 配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GTATTTACCC CGTTATTGTC 20 配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACTCCGCCGG AAGTGACTAA 20 配列番号：5 配列の長さ：948 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(B
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12125(FERM P-7546) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA TCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Ser Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：6 配列の長さ：948 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(B
revibacteriumlactofermentum) 株名：AJ12259(FERM P-3565) 配列 ATG AGC GAC GCA CCA ATT GTT GTG GCC TAT TTG GGG CCT GCC GGA ACC 48 Met Ser Asp Ala Pro Ile Val Val Ala Tyr Leu Gly Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 TTC ACC GAA GAA GCC CTC TAC AAA TTT GCC GAC GCC GGC GTA TTC GGC 96 Phe Thr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys Phe Ala Asp Ala Gly Val Phe Gly 20 25 30 GAC GGT GAG ATC GAG CAG CTA CCA GCC AAA TCG CCA CAA GAA GCT GTC 144 Asp Gly Glu Ile Glu Gln Leu Pro Ala Lys Ser Pro Gln Glu Ala Val 35 40 45 GAC GCG GTC CGC CAC GGC ACC GCC CAG TTC GCG GTG GTC GCC ATC GAA 192 Asp Ala Val Arg His Gly Thr Ala Gln Phe Ala Val Val Ala Ile Glu 50 55 60 AAC TTC GTC GAC GGC CCC GTC ACC CCC ACC TTC GAC GCC CTT GAC CAG 240 Asn Phe Val Asp Gly Pro Val Thr Pro Thr Phe Asp Ala Leu Asp Gln 65 70 75 80 GGC TCC AAC GTG CAA ATC ATC GCC GAA GAA GAA CTC GAT ATT GCC TTT 288 Gly Ser Asn Val Gln Ile Ile Ala Glu Glu Glu Leu Asp Ile Ala Phe 85 90 95 TCC ATC ATG GTC CGG CCA GGG ACT TCG CTT GCC GAC GTC AAA ACC CTC 336 Ser Ile Met Val Arg Pro Gly Thr Ser Leu Ala Asp Val Lys Thr Leu 100 105 110 GCC ACC CAC CCG GTT GGG TAC CAA CAA GTG AAA AAC TGG ATG GCA ACC 384 Ala Thr His Pro Val Gly Tyr Gln Gln Val Lys Asn Trp Met Ala Thr 115 120 125 ACC ATT CCG GAC GCC ATG TAT CTT TCA GCA AGC TCC AAC GGC GCC GGC 432 Thr Ile Pro Asp Ala Met Tyr Leu Ser Ala Ser Ser Asn Gly Ala Gly 130 135 140 GCA CAA ATG GTT GCC GAA GGA ACC GCC GAC GCA GCC GCA GCG CCC TCC 480 Ala Gln Met Val Ala Glu Gly Thr Ala Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser 145 150 155 160 CGC GCA GCC GAA CTC TTC GGA CTG GAA CGC CTT GTT GAT GAT GTC GCC 528 Arg Ala Ala Glu Leu Phe Gly Leu Glu Arg Leu Val Asp Asp Val Ala 165 170 175 GAC GTC CGC GGC GCC CGC ACC CGC TTC GTT GCA GTC CAA GCC CAA GCA 576 Asp Val Arg Gly Ala Arg Thr Arg Phe Val Ala Val Gln Ala Gln Ala 180 185 190 GCC GTT TCC GAA CCG ACC GGC CAC GAC CGC ACC TCC GTC ATT TTC TCC 624 Ala Val Ser Glu Pro Thr Gly His Asp Arg Thr Ser Val Ile Phe Ser 195 200 205 CTA CCG AAT GTG CCA GGC AGC CTC GTG CGC GCC CTC AAC GAA TTC GCC 672 Leu Pro Asn Val Pro Gly Ser Leu Val Arg Ala Leu Asn Glu Phe Ala 210 215 220 ATC CGT GGC GTC GAC CTC ACC CGC ATC GAA CCC CGC CCC ACC CGC AAA 720 Ile Arg Gly Val Asp Leu Thr Arg Ile Glu Pro Arg Pro Thr Arg Lys 225 230 235 240 GTC TTC GGA ACC TAC CGC TTC CAC CTG GAC ATA TCC GGA CAT ATC CGC 768 Val Phe Gly Thr Tyr Arg Phe His Leu Asp Ile Ser Gly His Ile Arg 245 250 255 GAC ATC CCC GTC GCC GAA GCC CTC CGC GCA CTC CAC CTC CAA GCC GAA 816 Asp Ile Pro Val Ala Glu Ala Leu Arg Ala Leu His Leu Gln Ala Glu 260 265 270 GAA CTC GTA TTC GTC GGT TCC TGG CCC TCC AAC CGT GCA GAA GAC AGC 864 Glu Leu Val Phe Val Gly Ser Trp Pro Ser Asn Arg Ala Glu Asp Ser 275 280 285 ACG CCC CAA ACC GAC CAA CTA GCT AAC GTA CAC AAG GCG GAC GAA TGG 912 Thr Pro Gln Thr Asp Gln Leu Ala Asn Val His Lys Ala Asp Glu Trp 290 295 300 GTT CGC GCA GCA AGC GAA GGA AGG AAA CTT AAC TAG 948 Val Arg Ala Ala Ser Glu Gly Arg Lys Leu Asn 305 310 315 配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TCAACAAGCT GGAACGGACG 20 配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CGCCGATTTA CCGCCTTGAG 20 配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA CCACGCCCGA T 21 配列番号：10 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGTG ATTCCAGACG G 21 配列番号：11 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＣＧＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣＣＧＣＣＣＧＡ Ｔ
２１ 配列番号：１２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGGT CTTCCAGACG G 21 配列番号：13 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGTCTGGAA TGACGCCCGA T 21 配列番号：14 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCGGGCGTC ATTCCAGACG G 21 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGGAGCTCG AGAAGTGGTG 20 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACTCAGAATT CCTTCCGAGC 20 配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGATTAAAGC TTTGGAGCTT 20 配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴ ＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡ
２０

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＴＳ−ａｒｏＦ、ｐＴＳ−ａｒｏＧの構築

【図２】天然型及び変異型ａｒｏＦのＤＳ活性におけ
る、Ｌ−チロシンによる阻害度を示すものである。

【図３】天然型及び変異型ａｒｏＧのＤＳ活性におけ
る、Ｌ−フェニルアラニンによる阻害度を示すものであ
る。

【図４】野生型および変異型のコリスミン酸ムターゼー
プレフェン酸デヒドラターゼの、フェニルアラニンによ
るプレフェン酸デヒドラターゼ活性の阻害を表したもの
である。

【図５】ｐＭＧＡ１及びｐＭＧＡＬ１の構築

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エシェリヒア属に属する微生物であって、
   宿主がｔｙｒＲ、ｔｙｒＡ遺伝子を欠失したものであ
   り、かつ、フィードバック阻害が解除されたエシェリヒ
   ア属由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−
   ７−リン酸シンターゼ（以下ＤＳと略す）であって、ａ
   ｒｏＦにコードされるもののＮ末端より１４７番目のア
   スパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されたＤ
   Ｓ、ａｒｏＦにコードされるもののＮ末端より１８１番
   目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換されたＤ
   Ｓ、ａｒｏＧにコードされるもののＮ末端より１５０番
   目のプロリン残基がロイシン残基に置換されたＤＳ、ａ
   ｒｏＧにコードされるもののＮ末端より２０２番目のア
   ラニン残基がスレオニン残基に置換されたＤＳ、ａｒｏ
   ＧにコードされるもののＮ末端より１４６番目のアスパ
   ラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されたＤＳ、ａ
   ｒｏＧにコードされるもののＮ末端より１４７番目のメ
   チオニン残基がイソロイシン残基に置換され３３２番目
   のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されたＤＳ、ａ
   ｒｏ ＧにコードされるもののＮ末端より１４７番目のメ
   チオニン残基がイソロイシン残基に置換されたＤＳ、ａ
   ｒｏＧにコードされるもののＮ末端より１５７番目のメ
   チオニン残基がイソロイシン残基に置換され２１９番目
   のアラニン残基がスレオニン残基に置換されたＤＳ、の
   内から選ばれるいずれか１つをコードするＤＮＡ断片
   と、フィードバック阻害が解除されたエシェリヒア属由
   来のコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラター
   ゼ（以下ＣＭ−ＰＤと略す）であって、３３０番目のセ
   リン残基がプロリン残基に置換されたＣＭ−ＰＤ、３３
   ０番目のセリン残基がアスパラギン酸残基に置換された
   ＣＭ−ＰＤ、３３０番目のセリン残基以降が欠失したＣ
   Ｍ−ＰＤ、の内から選ばれるいずれか１つをコードする
   ＤＮＡ断片と、シキミ酸キナーゼ（以下ＳＫと略する）
   をコードするＤＮＡ断片がエシャリヒア属細菌用ベクタ
   ーに挿入されて得られる組換えベクターを保持するも
   の。
2. 【請求項２】微生物がエシェリヒア・コリAJ12741であ
   る特許請求の範囲第１項記載の微生物。
3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載の微生物を用い
   ることを特徴とする発酵法によるＬ−フェニルアラニン
   の製造法。