KR20130107355A - 페닐피루브산 환원 효소와 본 효소를 이용한 광학 활성 페닐젖산 및 4-히드록시-페닐젖산의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 효율적으로 얻을 수 있는 페닐피루브산 환원 효소 및 그것을 코드하는 유전자 및 이들을 이용한 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산의 제조방법을 제공한다.

Description

페닐피루브산 환원 효소와 본 효소를 이용한 광학 활성 페닐젖산 및 4-히드록시-페닐젖산의 제조방법{PHENYLPYRUVATE REDUCTASE AND METHOD FOR MANUFACTURING OPTICALLY-ACTIVE PHENYLLACTIC ACID AND 4-HYDROXYL-PHENYLLACTIC ACID USING SAME ENZYME}

본 발명은, 페닐피루브산 환원 효소와 그 유전자 및 이들을 이용하는 광학 활성 페닐젖산 및 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법에 관한 것이다.

3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산은, 모두 유산균으로부터 단리된 항균 물질이다(비특허문헌 1∼4).

3-페닐젖산의 항균 활성은 아스페르질루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 페니실륨 로퀘포티(Penicillium roqueforti), 페니실륨 시트리눔(Penicillium citrinum)등의 곰팡이뿐만 아니라(비특허문헌 5), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 0157 등과 같은 유해한 그램 음성, 양성 세균에 대해서도 폭넓다(비특허문헌 1, 2, 5∼7). 이 폭넓은 항균 활성에 의해 3-페닐젖산은 식품 첨가물로서의 이용 가능성이 시사되고 있다. 또한, 그 이외의 의약, 농약 및 그 중간체, 방향족 바이오폴리머·플라스틱, 액정 등의 기능성 재료, 생체 적합성 (의료) 재료 등으로서도 이용할 수 있는 유용한 화합물이다.

4-히드록시페닐젖산도, 3-페닐젖산과 마찬가지로 유산균 유래인 점에서, 식품 첨가물로서의 이용 가능성이 시사될 뿐만 아니라, 그 이외의 용도에서의 항균성 첨가물, 또한 의약, 농약 및 그 중간체로서 기대되고 있다.

이들 화합물의 제조방법에 관해, 광학 활성 3-페닐젖산에 있어서는 유기 화학 합성에 의한 제조를 시도하고 있다는 보고가 다수 이루어져 있지만(특허문헌 1), 환경 문제나 비용의 관점에서 이러한 화학 물질을 사용하지 않는 새로운 합성 방법이 요구되고 있다. 또한, 4-히드록시페닐젖산에 있어서는, 고순도로 대량 생산하는 기술이 확립되어 있지 않고, 유기 화학 합성에 의해, 라세미체가 주된 생산물, 즉 D체 및 L체가 혼재된 상태를 시험 시약으로서 소량 시판하고 있는 것이 현상황으로, 보다 생성 효율이 높은 합성 방법이 갈망되고 있다.

이들 과제의 잠재적 해결 수단으로서, 촉매나 유기 용매 등의 화학 물질을 사용하지 않고 원하는 화합물을 대량 생산할 수 있는 미생물 배양이나 효소에 의한 광학 활성 3-페닐젖산 혹은 4-히드록시페닐젖산의 합성 방법을 들 수 있다.

3-페닐젖산의 생산균으로서 자낭균 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum)(비특허문헌 2), 프로피온산 생산 세균 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이(Propionibacterium freudenreichii)(비특허문헌 8), 여러가지 유산균(비특허문헌 5, 9∼11)이 알려져 있다.

그러나, 3-페닐젖산의 생산에 관련된 효소의 분자 레벨에서의 연구에 관해서는, 2008년이 되어 락토바실루스(Lactobacillus) sp SK007의 D,L-젖산데히드로게나아제(D,L-Lactate dehydrogenase)가 정제(비특허문헌 12)되었을 뿐이었다. 또한, 3-페닐젖산의 전구체인 것으로 예상되는 페닐피루브산에 대하여 효소 활성을 갖는 효소의 유전자가 클로닝된 예로는, 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) SK002 유래의 재조합 D,L-젖산데히드로게나아제(D,L-Lactate dehydrogenase)(비특허문헌 13), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli) CFN 42 유래의 재조합 글리옥실산 리덕타아제/히드록시피루브산 환원 효소(Glyoxylate reductase/Hydroxypyruvate reductase)(비특허문헌 16)의 두가지 예뿐인데, 이들이 3-페닐젖산의 생산에 관여하는지의 여부는 불명확하다.

또한, 특허문헌 2 및 3에는, 광학 활성 3-페닐젖산 생산균의 보고가 있지만, 이들은 R체와 S체가 혼재되어 있어, 바람직하지 않다.

특허문헌 4에는, PF1022 물질 생산균의 사상균 미셀리아 스테릴리아(Mycelia sterilia)(FERM BP-2671)의 산생 효소가, 페닐피루브산에 작용하여 이것을 환원하고, (R)-2-히드록시-3-페닐프로피온산으로 변환하는 것이 보고되어 있다.

그러나, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산을 효율적으로 얻기에는 이르지 못한 것이 실상이다.

이상과 같이, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 대량으로 얻는 것이 가능한 제조방법은 아직 확립되어 있지 않고, 그 개발이 강하게 요구되고 있다.

특허문헌 1 : 일본 특허 공개 제2003-192633호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공개 평9-37792호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 제2000-300284호 공보 특허문헌 4 : 국제 공개 제2001/81563호 팜플렛

비특허문헌 1 : Lavermicocca, P.; Valerio, F.; Evidente, A.; Lazzaroni, S.; Corsetti, A.; Gobbetti, M., Appl. Environ. Microbiol. 2000 66 4084-4090 비특허문헌 2 : Dieuleveux, V.; Van Der Pyl, D.; Chataud, J.; Gueguen, M., Appl. Environ. Microbiol. 1998 64 800-803 비특허문헌 3 : Paola La et al.,"Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough 락토바실루스 플란타룸 strain 21B", Applied and Environmental Microbiology (2000), 66(9), 4084-4090. 비특허문헌 4 : Wanmeng Mu et al., "Production of 4-hydroxyphenyllactic acid by 락토바실루스 sp. SK007" fermentation Journal of Bioscience and Bioengineering (2010), 109(4), 369-371. 비특허문헌 5 : Ohhira, I.; Kuwaki, S.; Morita, H.; Suzuki, T.; Tomita, S.; Hisamatsu, S.; Sonoki, S.; Shinoda, S., Biocontrol Sci. 2004 9 77-81 비특허문헌 6 : Dieuleveux, V.; Gueguen, M.; J. Food Prot. 1998 61 1281-1285 비특허문헌 7 : Dieuleveux, V.; Lemarinier, S.; Gueguen, M.; Int. J. Food Microbiol. 1998 40 177-183 비특허문헌 8 : Thierry, A.; Maillard, M. ,2002 82 17-32 비특허문헌 9 : Strom, K.; Sjogren, J.; Broberg, A.; Schnurer, Appl. Environ. Microbiol. 2002 68 4322-4327 비특허문헌 10 : Magnusson, J.; Strom, K.; Roos, S.; Sjogren, J.; Schnurer, Microbiol. Lett. 2003 219 129-135 비특허문헌 11 : Valerio, F.; Lavermicocca, P.; Pascale, M.; Visconti, A., Microbiol. Lett. 2004 233 289-295 비특허문헌 12 : Li, X.; Pan,. Mu, W. & Zhang, T. (2008)., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56 7 2392-399 비특허문헌 13 : Jianghua, J.; Wanmeng, M.; Tao, Z.; Bo.;, Appl. Biochem. Biotechnol. 2009 (in press) 비특허문헌 14 : Ishikura, Y.; Tsuzuki, S.; Takahashi, O.; Tokuda, C.; Nakanishi, R.; Shinoda, T.; Taguchi, H., J. Biochem. 2005 138, 741-749

본 발명은, 이러한 문제점과 실상을 감안하여, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 효율적으로 얻을 수 있는 페닐피루브산 환원 효소 및 그것을 코드하는 유전자 및 이들을 이용한 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산의 합성 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명자는, 이미 알려진 유산균뿐만 아니라, 보다 광범위한 미생물로부터 시행 착오를 거듭한 결과, 글루코오스로부터 광학 활성 페닐젖산을 대량으로 생산하는 신규한 효모균을 발견했다. 그리고, 광학 활성 페닐젖산을 대량 생산하는 것은, 상기 효모균이, 특히 페닐피루브산을 기질로 하고, 이것에 높은 친화성을 가지며 작용하여 오로지 광학 활성 페닐젖산을 생성한다는 신규하고 특수한 페닐피루브산 환원 효소(이하, 「PPR」이라고도 함)를 갖는 것이며, 상기 PPR이 새로운 효소인 것도 알아냈다. 또한, 이 신규하고 특이한 PPR을 코드하는 유전자(이하, 「ppr 유전자」라고도 함)를 클론화하고, 이 형질전환체를 이용함으로써 특이한 신규 PPR을 유전자 공학적으로 제조할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 이 형질전환체에 의해서도 글루코오스로부터 광학 활성 페닐젖산이 얻어지는 것도 알아냈다.

또한, 본 발명자는, 본 발명의 PPR이 4-히드록시페닐피루브산에 대해서도 친화성을 갖고 있어, 4-히드록시페닐피루브산을 기질로 하고, 이것으로부터, 고순도의 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을, 구체적으로는 고순도의 D-4-히드록시페닐젖산을 선택적으로 생산할 수 있는 것을 알아냈다. 더구나, 그 원재료(기질)로서 저렴하고 안정적으로 입수 가능한 D-글루코오스를 이용해도 대량으로 생산할 수 있는 고순도의 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법도 확립할 수 있는 것을 알아냈다.

덧붙여서, 본 발명의 PPR은, 특허문헌 1에 기재된 효소와는 24%의 동일성밖에 없고, 또한, 종래 알려져 있는 효소와도 약 40% 정도의 동일성밖에 없는 신규한 효소이다. 더구나, 하기 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 PPR은, 기존의 HPPR 또는 GRHPR 패밀리에는 속해 있지 않고, 신규 패밀리를 형성하는 것이기도 하다. 게다가, 본 발명의 PPR은, 종래의 PPR보다 효소 활성이 수십배나 높아, 산업상의 이용 가능성도 높은 것이다. 또한, 이와 같은 특이한 효소를 생산하고, 또한 글루코오스로부터 광학 활성 페닐젖산을 생산하는 본 발명의 신규 효모균도 중요한 유전자원인 것도 명백하다.

즉, 본 발명은 이하의 발명에 관련된 것이다.

〔1〕페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산을 생성하는 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서,

(a) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(b) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,

(c) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 60% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(d) 서열번호 6, 7 또는 8로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,

(e) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(f) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및

(g) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.

〔2〕페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산을 생성하는 페닐피루브산 환원 효소로서,

(a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열,

(b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열, 또는

(c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열

중 어느 것을 포함하는, 페닐피루브산 환원 효소.

〔3〕〔1〕에 기재된 뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.

〔4〕〔3〕에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.

〔5〕숙주가 미생물인 〔4〕에 기재된 형질전환체.

〔6〕상기 미생물이 대장균 또는 페닐알라닌 혹은 티로신 생산성 재조합 미생물인 〔5〕에 기재된 형질전환체.

〔7〕다음의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 포함하는 페닐피루브산 환원 효소를 이용하고, 페닐피루브산 또는 4-히드록시페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산을 생성시키고, 이것을 회수하는 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법:

(a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는

(c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

〔8〕상기 페닐피루브산 환원 효소의 반응 조건이, 반응 온도 20∼40℃, pH 6∼7인 것을 특징으로 하는 〔7〕에 기재된 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.

〔9〕다음의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 포함하는 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물을 이용하여 배양하고, 미생물 기질로부터 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산을 생성시키고, 이것을 회수하는 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법:

(a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는

(c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

〔10〕상기 미생물이, 윅커하미아속 효모 혹은 이것을 친주로 한 변이주 또는 〔4〕또는〔5〕에 기재된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 〔9〕에 기재된 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.

〔11〕상기 미생물 기질이 D-글루코오스, L-페닐알라닌, L-티로신, 페닐피루브산 및 4-히드록시페닐피루브산으로부터 선택되는 1종 이상의 기질인 것을 특징으로 하는 〔9〕에 기재된 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.

〔12〕윅커하미아속 효모가, 윅커하미아 플루오레센스(Wickerhamia fluorescens)인 〔10〕에 기재된 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.

〔13〕윅커하미아 플루오레센스(Wickerhamia fluorescens) TK1이라고 명명되고, FERM AP-22048로서 기탁된 미생물.

본 발명에 의하면, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 효율적으로 얻는 것이 가능해진다.

도 1은 윅커하미아 플루오레센스 TK1 균주의 광학 현미경상.
도 2는 「L-페닐젖산과 D-페닐젖산의 HPLC 프로필」. (a)는 D-3-페닐젖산 및 L-3-페닐젖산의 표품/L-페닐젖산은 22.4분에서 최초의 피크로서 용출되고, D-페닐젖산은 31.7분에서 용출되었다. ; (b)는 W. 플루오레센스 TK1의 MM 배지 배양 후의 상청 ; (c)는 W. 플루오레센스 TK1의 GPAMM 배지 배양 후의 상청 ; (d)는 본 균주로부터 얻어진 효소로 페닐피루브산의 기질을 처리한 것이다.
도 3은 W. 플루오레센스 TK1 균주의 배양중의 균체량과 광학 활성 페닐젖산의 생산량을 도시하는 것이다.
도 4는 W. 플루오레센스 TK1 균주의 배양중의 균체량, 광학 활성 페닐젖산(PLA)의 생산량, 페닐피루브산(PPA)의 생산량을 도시하는 것이다.
도 5는 W. 플루오레센스 TK1 균주의 배양중의 균체량과 광학 활성 페닐젖산(PLA)의 생산량, L-페닐알라닌(Phe)의 생산량을 도시하는 것이다.
도 6은 W. 플루오레센스 TK1 균주의 배양 시간(2, 12, 48시간)마다의 페닐피루브산 환원 효소 활성을 도시하는 것이다.
도 7은 W. 플루오레센스 TK1 균주의 PPR의 각 pH〔Tris-HCl 완충액(pH 7, 7.5, 8), 인산 완충액(pH 5.5, 6, 6.5, 7)〕마다의, pH 6.5의 PPR 활성을 100으로 했을 때의 각 PPR 활성(상대비)을 도시하는 것이다.
도 8은 「PPR의 분자량」. (a)는 본 효소 PPR의 SDS-PAGE 전기 영동 분석(우측) ; (b)는 본 효소 PPR의 겔 여과 분석(검정 마름모꼴)을 도시하는 것이다.
도 9는 본 발명의 ppr 유전자(pprA 유전자)를 포함하는 플라스미드 벡터의 제작의 예시이다.
도 10은 본 발명의 ppr 유전자(pprA 유전자)를 포함하는 형질전환체의 예시이다.
도 11은 「PPR 유래의 트립신펩티드의 하나에 대한 MALDI-TOF의 MS 스펙트라 및 MALDI-QIT-TOF의 MS² 스펙트라/W. 플루오레센스 NRRLYB-4819 유래의 PPR의 양이온 MALDI-TOF 매스 스펙트라」. 본 발명의 내부 아미노산 서열의 MALDI-TOF에 의한 MS 스펙트라이다.
도 12는 「PPR 유래의 트립신펩티드의 하나에 대한 MALDI-TOF의 MS 스펙트라 및 MALDI-QIT-TOF의 MS² 스펙트라/패널 중에 나타난 m/z 2000.0(a) 및 2427.3(b)에서의 매스 이온 피크의 MS/MS 스펙트라」. 본 발명의 내부 아미노산 서열의 MALDI-TOF에 의한 MS 스펙트라이다. (a)는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 ; (b)는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열.
도 13은 「nested PCR 산물의 아가로오스 겔 전기 영동」. N 말단 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 아미노산 서열(서열번호 3)의 정보를 기초로, 얻어진 935 bp의 DNA 단편의 아가로오스 겔 전기 영동을 도시한다. 1 : pprA의 PCR 산물 M : DNA 마커
도 14는 「W. 플루오레센스 TK1 PPR 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 그 추정 아미노산 서열」. W. 플루오레센스 TK1 균주 유래의 ppr 유전자 및 그 아미노산 서열을 도시한다. MALDI-QIT-TOF MS 분석으로 결정된 PPR의 내부 아미노산 서열을 테두리로 도시한다. Primer NP와 Oligo dT의 위치를 화살표로 도시한다. nested 프라이머 2427P를 점선 화살표로 도시한다. 종지 코돈을 별표로 도시한다.
도 15는 「pprA를 프로브로서 이용한 전DNA의 서던 블롯 분석」. 제한 효소(HindIII, EcoRI, PstI, BamHI)로 처리한 W. 플루오레센스 TK1 균주의 전DNA에 대하여, pprA 유전자의 서열을 포함하는 DNA 단편을 프로브로 한 서던 하이브리다이제이션을 도시한다. W. 플루오레센스 TK1 균주의 전DNA를 제한 효소 HindIII, EcoRI, PstI, BamHI로 소화하고, 전기 영동하여, Zeta-Probe(등록 상표) 블로팅 멤브레인(Bio-Rad) 상에 블로팅하고, 프로브를 이용하여 하이브리다이제이션을 행했다.
도 16은 「PPR 활성 및 유전자 발현에서의 페닐알라닌의 효과」. W. 플루오레센스 TK1 균주를 GPMM 배지(+Phe), GPAMM 배지(+PPA), MM 배지(Glc)에서 배양했을 때의 PPR 활성 및 ppr 유전자(pprA 유전자) 발현량을 도시한다. (A) 30℃에서 10시간 배양한 W. 플루오레센스 TK1의 무세포 추출액 중에서의 PPR의 비(比)활성. 56 mM 글루코오스(Glc), 56 mM 글루코오스+5 mM 페닐알라닌(+Phe) 또는 56 mM 글루코오스+5 mM 페닐피루브산(+PPA)을 포함하는 MM 배지 중에서 세포를 배양했다. (B) pprA 전사물의 정량적 PCR. W. 플루오레센스 NRRLYB-4819를 상기한 바와 같이 배양했다. 막대선은 리얼 타임 PCR로 결정한 상대적 발현 비율을 도시한다.
도 17은 「정제 rPPR(recombinant PPR)의 SDS-PAGE」. ppr 유전자를 포함하는 대장균이 생산하는 효소 rPPR의 SDS-PAGE의 결과를 도시한다. Lane 1 : 정제 rPPR; M : 분자량 표준(Bio-Rad Precision Protein Standard kit) 분자량을 좌단에 도시한다.
도 18은 「W. 플루오레센스 TK1 유래의 PPR과 다른 미생물 유래의 PPR의 추정 아미노산 서열 멀티플 얼라이먼트」. W. 플루오레센스 TK1 균주 유래의 효소 PPR과, 다른 미생물의 효소(DLDH, GRHPR, HPPR)의 아미노산 서열을 이용한 얼라이먼트 해석 결과를 도시한다. CLUSTALX를 이용하여 단백질의 1차 구조의 얼라이먼트를 행했다. 서열은, C. 두블리니엔시스(C. dubliniensis)(Accession No.:XP_002418129), E. 콜라이(E. coli)(P37666), S. 스쿠텔라리오이드(S. scutellarioide)(Q65CJ7) 및 L. 플란타룸(L. plantarum)(BAA14352)의 PPR 관련 단백질이다. 별표는 동일 아미노산을 도시한다. 도트 및 콜론은 보존 아미노산에 의한 치환을 도시한다. 대시는, 컴퓨터에 의해 생성된 갭을 도시한다. 테두리는 NAD 결합 모티브의 보존 서열을 도시한다.
도 19는 W. 플루오레센스 TK1 균주에서의 D-3-페닐젖산의 생합성계를 도시한다.
도 20은 ppr 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생산성 미생물이 생산하는 페닐젖산을 도시한다.
도 21은 pprA 유전자를 포함하는 페닐알라닌 생산성 미생물(ATCC31882주/pHSGpprA)의 D-글루코오스를 기질로 했을 때의 균체 농도 및 페닐젖산 생산량을 도시한다.
도 22는 tyrA 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도시한다.
도 23은 4-히드록시페닐젖산의 HPLC 분석. 표준 물질(Standard); D,L-4-히드록시페닐젖산(좌측 ; L-4-히드록시페닐젖산/우측 ; D-4-히드록시페닐젖산) ; NST-ldhA 균주의 L-4-히드록시페닐젖산 ; NST-pprA 균주 생성의 D-4-히드록시페닐젖산.

1. 본 발명의 페닐피루브산 환원 효소

(1) 본 발명의 PPR의 효소학적 성질

(2) 본 발명의 PPR의 아미노산 서열 및 이것을 코드하는 유전자

(3) 본 발명의 PPR의 취득 방법

2. 광학 활성 3-페닐젖산의 제조방법

(1) 본 발명의 PPR에 의한 광학 활성 페닐젖산의 제조방법

(2) 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 갖는 미생물에 의한 광학 활성 3-페닐젖산의 제조방법

3. 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법

(1) 본 발명의 PPR에 의한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법

(2) 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 갖는 미생물에 의한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법

<1. 본 발명의 페닐피루브산 환원 효소>

본 발명의 페닐피루브산 환원 효소는, 신규 효소로서, 이하의 효소학적 성질 및 아미노산 서열 및 이것을 코드하는 유전자를 갖는 것이다. 이 PPR은, 호모 2량체를 형성하고 있는 것이 적합하다.

본 발명의 PPR에 의해, 고순도의 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산을 얻을 수 있다. 광학 활성 페닐젖산 또는 4-히드록시페닐젖산을 직접 생성하는 것이 가능해지기 때문에, 종래의 유기 합성물과 같은 거의 등량 혼재하는 D체 L체를 각각으로 분리하거나, 어느 한쪽을 제거하거나 하는 분리 정제 공정을 회피함으로써 작업 효율도 개선할 수 있고, 또한 고순도화도 용이하다. 고순도화된 광학 활성 페닐젖산 및 히드록시페닐젖산이 용이하게 얻어지기 때문에, 여러가지 용도, 특히 의약, 식품 첨가물, 농약 등과 같은 고순도화가 요구되는 기술 분야에 이용하기 쉬워진다.

(1) 효소학적 성질

〔작용〕

본 발명의 PPR은, 페닐피루브산 및 4-히드록시페닐피루브산을 기질로 하고, 이것에 높은 친화성을 가지며 작용하여 광학 활성 페닐젖산(D-3-페닐젖산) 및 4-히드록시페닐젖산(D-4-히드록시페닐젖산)을 생성하는 것이다. 에난티오 선택적으로 D-3-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산을 생성하는 것이 적합하다.

또한, 기질은, 페닐피루브산 및 히드록시피루브산에 한정되지 않고, 그 밖에, 글리옥실산을 환원하는 것이 바람직하다. 이 중, 페닐피루브산을 기질로 했을 때에 k_cat/K_m값이 가장 크다.

또한, 보효소로서, NADH 및 NADPH를 이용하는 것이 가능하지만, NADPH에 대한 특이성이 높다.

페닐피루브산 및 NADPH에서의 k_cat/K_m값(특이도 상수)이, 300∼500 s^-1mM^-1(Km값 0.40±0.07 mM)이 되는 것과 같은 효소가 바람직하지만, 이 특이도 상수에 특별히 한정되는 것은 아니다. 또, 특이도 상수 k_cat/K_m값은, 효소가 기질을 생성물로 변환할 때의 효율을 나타내는 것이다.

이 때의 측정 조건으로는, 이하와 같은 수법을 들 수 있다. 효소 반응액으로서 50 mM 인산 완충액(pH 6.5), 2 mM 페닐피루브산, 0.1 mM NADPH를 이용하고, 이것에 효소를 첨가하여, 온도 25℃에서 반응을 행하고, 자외·가시 분광 광도계(340 nm)를 이용하여 정량한다. NADPH의 340 nm 파장의 흡수의 몰 흡광 계수는, 6.2 mM^-1·cm^-1로 한다.

또한, 기질인 페닐피루브산 1몰과 보효소인 NADPH 1몰에 의해, 광학 활성 페닐젖산(D-3-페닐젖산)을 생성하는 것이 바람직하다.

이 때의 D-3-페닐젖산 : L-3-페닐젖산의 몰비는, 100∼90 : 0∼10, 보다 100∼95 : 0∼5, 더욱 100∼98 : 0∼2인 것이 바람직하고, 또한, 광학 순도 99% 이상의 D-3-페닐젖산(광학 활성 페닐젖산)인 것이 적합하다.

또한 이 반응은 불가역 반응인 것이 바람직하다. 여기서 불가역 반응이란, D-3-페닐젖산, L-3-페닐젖산, NAD⁺, NADP⁺의 조합을 기질로 한 경우의 효소 반응이 일어나지 않거나 혹은 페닐피루브산을 검출할 수 없는 것을 말한다.

〔기질〕

4-히드록시페닐피루브산, 3-페닐피루브산, 글리옥실산 및 히드록시피루브산으로부터 선택되는 1종 이상의 것을 원료(기질)로 하여, 환원 반응을 촉매한다. 또, 피루브산 및 옥살로초산을 기질로 하지 않는 것이 바람직하다.

〔최적 반응 pH〕

Tris-HCl 완충액(pH 7∼8) 및 인산 완충액(pH 5∼7)의 완충액으로 각 pH(25℃)로 조정한 후, pH 이외에는 상기 〔작용〕에 기재된 측정 조건으로 효소 활성을 구한 경우, pH 6∼7, 특히 pH 6.5∼7에서 높은 활성을 나타낸다.

〔반응 온도〕

pH 6.5의 20∼40℃에서 양호한 페닐피루브산 환원 반응을 나타낸다.

〔분자량〕

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(Lammli 등의 방법)에서의 측정으로, 본 발명의 PPR은, 분자량 30,000∼50,000 돌턴, 특히 분자량 40,000 돌턴을 나타낸다.

또한, 겔 여과법에서의 측정으로, 분자량 70,000∼90,000, 특히 분자량 80,000을 나타낸다.

이 때의 겔 여과의 측정 분석에는, 효소를 미리 용출 완충액(10% 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 20 mM 인산 완충액, 0.15 mM NaCl pH 7)으로 평형화시킨 슈퍼로스 겔 여과 컬럼(Superose 6 10/300)에 제공하여, 컬럼 용량의 1배의 용출 완충액으로 용출한다.

표준 단백질로서, 소혈청 알부민(M.W. 67,000), 키모트립시노겐(M.W. 25,000), α-아밀라아제(M.W. 45,000), β-아밀라아제(M.W. 200,000)를 이용한다.

〔금속 이온 및 저해제의 영향〕

2) 금속 이온과 저해제의 영향

Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, WO^2-, Hg²⁺로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온에 의해, PPR 활성이 강하게 저해된다(90∼100% 정도 저해). Ni²⁺, Co²⁺로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온에 의해 약간 강하게 저해된다(30∼40% 정도 저해). Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mo²⁺로부터 선택되는 1종 이상의 금속 이온에 의해, 거의 저해되지 않거나 혹은 전혀 저해되지 않는다(15∼0% 정도 저해).

트윈 80(Tween : 등록 상표), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)로부터 선택되는 1종 이상의 저해제에 의해, 그다지 저해되지 않는다(30∼50%). 트리톤 X-100(tritonX), 에틸렌디아민사초산(EDTA)으로부터 선택되는 1종 이상의 저해제에 의해, 거의 저해되지 않는다(10∼20% 정도).

또, 금속 이온 및 저해제 모두, 각 물질이 1 mM이 되도록 첨가한 것 이외에는, 상기 〔작용〕에 기재된 측정 조건으로 효소 활성을 구한다.

〔부분 아미노산 서열〕

본 발명의 PPR은, 적어도 이하의 N 말단 아미노산 서열 및/또는 내부 아미노산 서열의 부분 아미노산 서열을 갖는 것이 적합하다. 또, 이 부분 아미노산 서열은, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입되어 있어도 좋다.

〔부분 아미노산 서열 : N 말단 아미노산 서열〕

N 말단측의 아미노산 잔기의 서열 : N 말단측의 MKKPQVLILGRI의 12 아미노산 잔기의 서열(서열번호 1)이다.

또, N 말단측의 아미노산 잔기의 서열은, 공지된 수법(Edman, P. (1950) Acta Chem. Scand. 4: 283-293)으로 얻으면 된다. 일례로서, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동법으로 효소를 영동하고, 얻어진 효소 밴드를 전기적으로 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF)막 등에 이동시킨 후에, 프로테인 시퀀서로 분석함으로써 결정할 수 있다.

〔부분 아미노산 서열 : 내부 아미노산 서열〕

트립신 소화 펩티드의 아미노산 잔기의 서열 : NIQAIYGNWGGLASFGGFK의 19 아미노산 잔기의 서열(서열번호 2) 및 VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR의 22 아미노산 잔기의 서열(서열번호 3)을 갖는다.

또, 트립신 소화 펩티드는, 공지된 수법(Shimizu, M., et al. (2009) Proteomics 9, 7-19)으로 얻으면 된다. 일례로서, SDS-PAGE에 영동한 정제된 본 발명의 PPR을 겔로부터 잘라내고, 트립신(온도 36∼38℃, pH 8∼9, 4∼18시간)에 의해 겔내 소화하여 얻어지는 것이다. 또한, 시판품인 트립신 소화 펩티드 키트로 행하면 되고, 구체적으로는, Trypsin Profile IGD Kit : 겔내 소화 키트(SIGMA-ALDORICH사) 등을 들 수 있다.

(2) 본 발명의 PPR의 아미노산 서열 및 이것을 코드하는 유전자(염기 서열)

본 발명의 PPR에는, 다음의 (a), (b) 및 (c)의 단백질이 포함된다.

(a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질.

(c) 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질.

본 발명의 서열번호 4로 표시되는 PPR의 아미노산 서열과 이미 알려진 페닐피루브산 환원 효소의 아미노산 서열의 동일성을 비교한 결과, 어떠한 이미 알려진 것과도 동일성이 약 20%∼50% 정도로 매우 낮아, 본 발명의 PPR은 신규한 효소이고, 새로운 효소군을 형성하는 것이 시사되고 있다. 또한, 본 발명의 ppr 유전자는, 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 포함하는 점에서, 신규한 유전자이다.

본 발명에 있어서, 아미노산 서열 및 염기 서열의 동일성은, Lipman-Person법(Science, 227, 1435, (1985)) 등의 공지된 알고리즘에 의해 계산되고, 또한 이것에 의해 서열을 비교함으로써 행할 수 있다. 구체적으로는, 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-ver 8.1(소프트웨어 개발 : 제네틱스사)의 호몰로지 해석(Search homology) 프로그램의 서치 호몰로지나 맥심 매칭 프로그램을 이용하여, 동일성을 산출할 수 있다. 예컨대, Unit size to compare(ktup)를 2로 하여 해석을 행함으로써 산출된다.

또한, 본 발명에 있어서, 전사 개시 영역은, 프로모터 및 전사 개시점을 포함하는 영역이고, 리보솜 결합 부위는 개시 코돈과 함께 번역 개시 제어 영역을 형성하는 Shine-Dalgarno(SD) 서열(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463(1974))에 상당하는 부분이다.

여기서, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 서열이란, 서열번호 4와 각각 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 의미하고, 1개 또는 수개, 바람직하게는 1∼6개, 보다 바람직하게는 1∼3개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 아미노산 서열로서, 여전히, 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 유지하는 서열을 말한다. 또한, 부가에는, 양말단에 대한 1개 또는 수개, 바람직하게는 1∼6개, 보다 바람직하게는 1∼3개의 아미노산의 부가도 포함된다.

상기 기능적으로 등가인 아미노산이란, 적어도 페닐피루브산 환원 활성 및 4-히드록시페닐피루브산 환원 활성을 갖는 효소이면 되고, 더욱 부가적인 성질을 갖고 있어도 좋다. 게다가, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 것이 적합하다. 또한, 서열번호 5로 표시되는 ppr 유전자에 의해 코드되는 단백질과 실질적으로 동일한 기능, 구체적으로는 전술한 본 발명의 PPR의 기능을 갖는 것이 적합하다.

여기서, 페닐피루브산 환원 활성 및 4-히드록시페닐피루브산 환원 활성을 갖는다란, 전술한 식 1 및 2와 같이, 페닐피루브산 및 4-히드록시페닐피루브산을 각각 D-3-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산으로 하는 것을 의미하는데, 그 활성의 정도는, 그 기능을 발휘하는 한, 기능의 고저는 특별히 제한되지 않고, 즉 서열번호 4로 나타내는 단백질과 동일한 정도의 것뿐만 아니라, 이보다 높은 것 또는 낮은 것이어도 좋다.

또한, 부가적인 성질이란, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 비해, 안정성이 우수한 성질, 반응 온도나 pH가 상이한, 광범위한 성질 등을 들 수 있다.

또한, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 적합하다.

하기 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 PPR의 발견에 의해 신규한 효소군도 발견한 것으로부터, 본 발명의 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질과, 전술한 바와 같이 페닐피루브산 환원 활성이고 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 적어도 갖는다는 기능적으로 등가인 효소로서, 또한 60% 정도 이상의 동일성의 범위 내에 있는 것이면, 이 신규한 효소군에 포함되는 것으로 예측된다. 일반적으로, 60% 이상의 상동성을 나타내는 단백질은 유사한 효소의 특이성을 갖는 경우가 많다고 여겨지기 때문에, 이러한 상동성을 나타내는 것은 동일한 효소군에 포함되는 것으로 생각되고 있다.

본 발명의 ppr 유전자는, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 아미노산 서열과 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 유전자인데, 다음의 (a)∼(d)의 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 이 중, 다음의 (a)∼(d)가 바람직하다.

(a) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.

(b) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한 페닐피루브산 환원 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(c) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(d) 서열번호 6, 7 또는 8로 표시되는 염기 서열을 포함하며, 또한 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

서열번호 5로 표시되는 염기 서열에 있어서, 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열이 적합하다.

즉, 본 발명의 ppr 유전자에는, 서열번호 5의 염기 서열로 나타내는 폴리뉴클레오티드(DNA 등)에 있어서, 변이제 처리, 랜덤 변이, 특정 부위 돌연 변이, 결손 혹은 삽입 등에 의해 부분적으로 염기 서열이 변화된 것이어도, 이들 DNA 변이체가 서열번호 5의 염기 서열로 나타내는 DNA와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하며, 또한 적어도 페닐피루브산 환원 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 포함하는 것이다. 예컨대, 1개 또는 수개(예컨대 2∼3개)의 염기 서열이, 치환, 결실 혹은 부가된 염기 서열 등을 들 수 있다. 또한, 부가에는, 양말단에의 부가도 포함된다. 여기서 「1개 또는 수개」란, 1∼6개, 바람직하게는 1∼3개 정도를 말한다.

여기서 「스트린젠트한 조건」이란, 예컨대 Molecular cloning-a laboratory manual, 2^nd edition(Sambrook et al, 1989)에 기재된 조건을 들 수 있다. 즉, 6XSSC(1XSSC의 조성 : 0.15 M 염화나트륨, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 0.5% SDS, 5X 덴하르트 및 100 mg/mL 청어 정자 DNA를 포함하는 용액에 프로브와 함께 65℃에서 8∼16시간 항온하고, 하이브리다이즈시키는 조건 등을 들 수 있다.

또한, 상기 (b)∼(d)에서 나타내는 유전자는, 예컨대, (a)에서 나타내는 유전자와 비교하여, mRNA의 발현량이 많고, 그 mRNA의 안정성이 높고, 번역되는 단백질의 안정성이 우수한 등의 부가적인 성질을 갖고 있어도 좋다.

또한, 이들 (a)∼(d) 유전자의 상류에, 전사 개시 제어 영역, 번역 개시 제어 영역 또는 분비 시그널 영역 중 어느 하나 이상의 영역을 결합시켜도 좋다.

또, 본 발명에 있어서, 전사 개시 영역은, 프로모터 및 전사 개시점을 포함하는 영역이고, 리보솜 결합 부위는, 개시 코돈과 함께 번역 개시 제어 영역을 형성하는 Shine-Dalgarno(SD) 서열(Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974))에 상당하는 부위이다.

또한, 본 발명에 있어서, 유전자의 상류 또는 하류란, 복제 개시점으로부터의 위치가 아니고, 상류란 대상으로서 파악하고 있는 유전자 또는 영역의 5'측에 계속되는 영역을 나타내고, 한편, 하류란 대상으로서 파악하고 있는 유전자 또는 영역의 3'측에 계속되는 영역을 나타낸다.

(3) 본 발명의 PPR(페닐피루브산 환원 효소)의 취득 방법

(i) 본 발명의 PPR은, 윅커하미아속(Wickerhamia) 효모 혹은 그 변이주, 또는 상기 PPR을 코드하는 유전자 혹은 그 단편을 도입한 형질전환체(적합하게는 미생물)에 의해 생산, 취득하는 것이 가능하다.

상기 윅커하미아속 효모는, 자낭균 효모이며, 또한 전술한 효소 PPR을 코드하는 유전자를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 페닐피루브산으로부터 D-3-페닐젖산을 생산하는 기능 및/또는 D-글루코오스로부터 페닐피루브산을 거쳐 이로부터 광학 활성 페닐젖산(D-3-페닐젖산)을 생산하는 기능을 갖는 것이 적합하다.

이 효모로는, 예컨대, 윅커하미아 플루오레센스 및 이것과 동등한 균학적 성질 및 생리학적 성질을 갖는 균을 들 수 있다.

또한, W. 플루오레센스 TK1(FERM AP-22048) 균주(이하, 「효모균 TK1」이라고도 함) 및 이것과 동등한 균, 및 그 변이주를 들 수 있다. 여기서 변이주란, 야생주의 효모균 TK1주를, 자외선, 전리 방사선, 아질산, 니트로소구아니딘, 에틸메탄술포네이트 등의 처리라는 공지된 수법에 의해 얻을 수 있다. 또, 변이주에는, 야생주로부터의 변이주를 더욱 변이시킨 것도 포함한다.

상기 W. 플루오레센스 TK1(FERM AP-22048) 균주의 균학적 성질 및 생리학적 성질을 이하에 나타낸다.

(a) 26S rDNA-D1/D2 염기 서열

서열번호 9로 표시되는 염기 서열.

(b) 형태학적 특징

형상 : 레몬형, 알형, 긴 알형

증식 형식 : 증식은 양극 출아에 의함, 출아 부위는 넓음, 위균사의 형성.

포자 형성 : 자낭에 스포츠 모자형의 자낭 포자의 형성.

(c) 생리·생화학적 성상

당 발효성 : D-글루코오스(+), 사카로오스(+), D-갈락토오스(W), 말토오스(-)

탄소원 자화성(資化性) : D-글루코오스(+), 사카로오스(+), D-갈락토오스(+), 말토오스(-), 이노시톨(-)

질소원 자화성 : 질산염(-)

또, 상기 효모균 TK1은, 2007년 11월경, 일본 츠쿠바현 츠쿠바시 내의 환경 중의 토양이나 물을 40종 채취하여, 적절하게 희석 후, YPD 한천 배지(하기 실시예 1 참조)에 도포했다. 28℃에서 2∼4일 배양 후, 나타난 콜로니를 적절하게 희석 후, 새로운 YPD 한천 배지에 접종하는 것을 반복해서 행하여, 순수 분리했다.

또한 분리한 균주 1 백금이(platinum loop)를, D-글루코오스 첨가 MM 액체 배지(표 1 참조)에 식균(植菌)하고, 28℃에서 2일 내지 4일 배양했다. 각 균주의 배양 상청을 공지된 수법으로 취득하고, 이 배양 상청 중의 광학 활성 페닐젖산을 공지된 측정법(예컨대 ODS 액체 크로마토 분석, 가스 크로마토 분석 등)으로 측정하고, 광학 활성 페닐젖산의 생산량이 양호한 것을 선발하여, 토양으로부터 채취된 본 균주 TK1을 얻었다.

또한, 본 균주의 균학적 성질 및 생리학적 성질로부터, W. 플루오레센스에 귀속되는 것으로 추정되어, 본 균주를 W. 플루오레센스 TK1주라고 명명했다. 이 윅커하미아 플루오레센스 TK1주는, 전술한 점으로부터 신규한 미생물로서, 2010년 12월 13일, 일본 (우) 305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츠쿠바 센터 츄오 제6, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD)에, 윅커하미아 플루오레센스 TK1(FERM AP-22048)로서 기탁했다.

효모균 TK1 균주로부터 본 발명의 PPR을 생산하기 위해서는, 일반적인 효모 배양용의 배지에 식균하고, 적당한 온도에서 배양하면 된다. 배양액으로부터의 본 발명의 PPR의 생성은, 통상법에 따라 행할 수 있다. 구체적으로는, 배양액을 원심 분리하고, 균체를 제거한 후, 무세포 추출액으로부터 공지된 효소 분리 정제법을 이용하여 농축이나 회수할 수 있다. 분리 정제법으로는, 예컨대, 겔 여과 크로마토나 한계 여과막 등의 여과법, 또한 황산암모늄 첨가에 의한 효소 침전법 등을 들 수 있다.

본 발명의 PPR은, 전술한 바와 같이 자연계에서 얻는 것이 가능하지만, 그 유전자를 전술한 미생물(적합하게는 자낭 효모균)의 염색체 DNA로부터 클로닝하여, 상기 PPR을 대량으로 생산, 회수할 수도 있다.

ppr 유전자의 클로닝 방법으로는, 예컨대, 상기 유전자를 안정적으로 증폭시킬 수 있는 DNA 벡터에 연결시키거나, 혹은 상기 유전자를 유지할 수 있는 염색체 DNA 상에 도입시키는 등의 방법으로 본 발명의 PPR을 코드하는 DNA를 안정적으로 증폭시키고, 또한 상기 유전자를 안정적으로 또한 효율적으로 발현시키는 것이 가능한 숙주에 도입하여, 본 발명의 PPR을 생산시키는 방법을 채용할 수 있다.

또, 본 발명의 ppr 유전자는, 공지된 수법(예컨대, 「Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY」참조)으로 취득하면 된다. 일례로서, PPR 산생 균주로부터 게놈 DNA를 추출하여, 적당한 제한 효소로 절단 후, 파지 벡터를 이용하여, PPR 산생 균주의 게놈 DNA를 포함하는 라이브러리를 제작한다. 혹은, PPR 산생 균주로부터 전RNA를 추출하고, 올리고 dT를 프라이머로 한 역전사 효소 반응으로 mRNA에 대응한 cDNA를 조제 후, 파지 벡터를 이용하여, PPR 산생 균주의 cDNA를 포함하는 라이브러리를 제작한다.

전술한 바와 같은 N 말단 아미노산 서열 및 내부 아미노산 서열을 기초로, 적당한 프라이머를 합성하고, 그것을 이용하여 PPR 산생 균주 유래의 게놈 DNA 또는 cDNA를 주형으로 한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR)을 행하여, ppr 유전자의 DNA 단편을 증폭시킨다. 이 DNA 단편을 프로브로서 이용하여, 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 행한다. 이와 같이 하여 ppr 유전자의 전영역 또는 발현에 필요한 영역을 단리하는 것이 가능해진다. 이들 DNA 단편의 염기 서열을 결정한 후, 번역 개시 코돈의 상류 및 번역 종결 코돈의 하류에, PCR 등의 수법에 의해 적합한 제한 효소 절단 부위를 도입하여, 본 발명의 ppr 유전자만을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 유전자 단편을 얻는 것이 가능해진다.

〔재조합 벡터 및 그 제작 방법〕

또한, 본 발명에 의하면, PPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 ppr 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 적용하는 것이 가능해진다. 이에 따라, 형질전환체를 얻고, 이 형질전환체의 배양 등에 의해, PPR을 유전자 공학적으로 제조하는 것이 가능해진다.

본 발명 재조합 벡터의 구축 순서 및 방법은, 유전자 공학 분야에서 관용되고 있는 것을 이용할 수 있다(Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 벡터로는, 숙주 염색체 DNA에 삽입되는 것이나, 자기 복제 가능한 자율적 복제 서열을 갖는 벡터를 숙주 세포 내에서 플라스미드 상태로 존재시키는 것을 들 수 있다. 이 플라스미드 벡터로는, 예컨대, 대장균을 숙주로 하는 경우, pUC18, pBR322(다카라 바이오) 등을 들 수 있고, 코리네 세균(corynebacterium)을 이용하는 경우에는 pPK4 등을 들 수 있다. 또, 숙주 세포 내에 존재하는 유전자의 카피수는, 1 또는 복수 카피 중 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 재조합 벡터는, 예컨대, PPR을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류에 프로모터(제어 영역)를, 또한 하류에 터미네이터를 각각 작동 가능하게 연결하고, 경우에 따라서는, 유전자 마커 및/또는 다른 제어 서열을 작동 가능하게 연결함으로써 제작하는 것이 가능하다.

본 발명의 유전자에 대한 프로모터나 터미네이터의 연결 및 발현 유닛의 벡터에 대한 삽입은, 공지된 방법(Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)으로 행하는 것이 가능하다.

여기서, 본 발명에 이용하는 프로모터 및 터미네이터는, 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 3-포스포글리세린산키나아제, 글루타르알데히드-3-인산데히드로게나아제 등의 해당계(解糖系) 효소 유전자의 제어 서열 ; 트립토판신타아제 등의 아미노산 합성계 효소 유전자의 제어 서열 ; 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제 등의 가수분해 효소 유전자의 제어 서열 ; 질산 환원 효소, 오로티딘-5'-인산 탈수 효소, 알콜 탈수 효소 등의 산화 환원 효소 유전자의 제어 서열 등을 들 수 있다. 또, 각 제어 서열이란, 각 제어 영역에서, 원하는 기능을 발휘할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 것을 의미한다.

또, 본 발명의 유전자를 다른 단백질의 번역 영역을 코드하는 외래 유전자와 연결시켜 융합 단백질로서 발현시켜도 좋다.

또한, 재조합 벡터에 대한 유전자 마커의 도입은, 예컨대, 제어 서열에 PCR법에 의해 적당한 제한 효소 절단 부위를 도입하고, 이것을 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 약제 내성 유전자 및/또는 영양 요구성 상보 유전자 등의 선택 마커 유전자를 연결함으로써 행할 수 있다.

선택 마커는, 형질전환체의 선택 수법에 따라 적절하게 선택하는 것이 가능한데, 예컨대, 약제 내성을 코드하는 유전자나 영양 요구성을 상보하는 유전자를 사용할 수 있다.

이 약제 내성 유전자로는, 데스토마이신, 베노밀, 올리고마이신, 하이그로마이신, G418, 블레오마이신, 포스피노트리신, 암피신, 카나마이신 등의 약제에 대한 유전자를 들 수 있다.

또한, 이 영양 요구성을 상보하는 유전자로는, argB 유전자, pyr4 유전자, trpC 유전자, TRP1 유전자, niaD 유전자, LEU2 유전자, URA3 유전자 등을 들 수 있다.

〔본 발명의 재조합 벡터를 도입한 형질전환체〕

본 발명에 의하면, 상기에서 얻어진 재조합 벡터를 이용하여 숙주(적합하게는 미생물)를 형질 전환하여, 형질전환체를 얻을 수 있다.

사용되는 숙주는, 유전자 재조합의 숙주로서 사용 가능한 것, 바람직하게는 미생물이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 사용할 수 있는 숙주로는, 예컨대 임의의 세균류나 진균류 등의 미생물을 들 수 있고, 이 중, 대장균, 코리네균, 유산균, 방선균, 효모, 사상균, 구체적으로는, 에셰리키아(Escherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속, 바실루스(Bacillus)속, 세라티아(Serratia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아세토박터(Acetobacter)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 미생물 및 이들의 변이주 등을 이용하는 것이 적합하다. 재조합이 용이한 점에서, 보다 바람직하게는 대장균 또는 이 변이주이다.

이 때, 이들 미생물은, 광학 활성 페닐젖산 또는 4-히드록시페닐젖산이 생산되기 쉽도록, 유전자의 치환, 삽입, 결실, 불활화 등의 변이를 실시한 재조합 미생물인 것이 적합하고, 이 재조합 미생물로는, 페닐알라닌 산생균(페닐알라닌 생산성 재조합 미생물) 및 티로신 산생균(티로신 생산성 재조합 미생물)이 적합하다.

전술한 바와 같이 유전자에 변이를 발생시키는 수법으로는, 예컨대, 리콤비넌트 PCR법〔PCR Technology, Stockton press (1989)〕, 부분 특이적 변위법〔Kramer, W. and Frits, H., J. Methods in Enzymology, 154,350 (1987)〕, SOE(splicing by overlap extension)-PCR법〔Gene, 77, 61,(1987)〕에 의해 조제된 DNA 단편을 이용하는 이중 교차법, 화학 약제 처리(N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 아질산 등)하는 방법, 목적 유전자를 화학 합성하는 방법 등을 들 수 있다.

또한, 페닐알라닌 생산균은, 공지 기술을 이용하여, L-페닐알라닌을 대량 생산(바람직하게는 D-글루코오스를 기질로 하여 L-페닐알라닌을 대량 생산)할 수 있도록, 유전자를 변이시킨 미생물이면 된다. 그 페닐알라닌 생산성 재조합 미생물로는, 피드백 저해가 해제된 3-데옥시-D-아라비노헵 툴론산-7-인산 신타아제 및 프레펜산 데히드로게나아제를 코드하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 tryR 유전자 및 tyrA 유전자가 결실된 에셰리키아속 미생물 등을 들 수 있다.

보다 구체적인 미생물로는, 예컨대, ATCC31882주, ATCC3188주3, ATCC31884주(American Type Culture Collection 분양)나 AJ12740주(FERM P-12999), AJ12741주(FERM P-13000)(일본 특허 공개 제1993-344881호 공보) 등의 페닐알라닌 생산성 재조합 대장균 등을 들 수 있고, 그 밖의 페닐알라닌 생산성 재조합 미생물로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등도 들 수 있다.

또한, 티로신 생산균은, 공지 기술을 이용하여, L-티로신을 대량 생산(바람직하게는 D-글루코오스를 기질로 하여 L-티로신을 대량 생산)할 수 있도록, 유전자를 변이시킨 미생물이 적합하다. 그 티로신 생산성 재조합 미생물로는, 페닐알라닌 생산균(예컨대, E. 콜라이 ATCC31882(ATCC로부터 입수))에, tyrA 유전자(서열번호 24 : YP_002927556)를 공지된 수법으로 도입하여 얻어진 재조합 대장균 ; L-티로신 생산능을 가지며, 또한 L-피드백 저해가 해제된 변이형 프레펜산 데히드로게나아제를 유지하는 에셰리키아속 미생물 등을 들 수 있다(예컨대, 일본 특허 공개 제2006-311833호 공보 및 일본 특허 공개 제2007-325592호 공보 등 참조).

본 발명의 형질전환체(미생물)는, 전술한 바와 같이 제작된 유전자 발현용의 재조합 벡터를, 통상법에 따라 상기 숙주에 도입함으로써 얻는 것이 가능하다.

이 도입법으로는, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 폴리에틸렌글리콜법, 아그로박테리움법, 캄피턴트법(competent process), 초산리튬법 및 염화칼슘법 등을 들 수 있다. 사용하는 숙주 세포에 따라 적절하게 선택하면 된다.

원래, 이미 알려진 페닐피루브산 환원 효소에 의해 생성하는 페닐젖산의 광학 이성의 지견은 매우 적다. 또한, 그 중에서, 생성된 페닐젖산이 라세미체라는 보고가 이루어져 있다. 이러한 상황에서는, 광학 활성 페닐젖산을 고농도로, 즉 고순도화된 광학 활성 페닐젖산을 공업적으로 얻는 것이 곤란하다고 생각된다.

이러한 상황에서, 본 발명의 PPR은 매우 고순도로 광학 활성 페닐젖산을 생성하는 것이 가능하고, 에난티오머끼리 생리 활성이 상이할 가능성도 매우 낮거나 거의 없다. 더구나, 불가역적 반응이므로, 광학 활성 페닐젖산을 고농도로 축적해도 좋기 때문에, 회수 효율의 면에서도 유리하다. 또한, 본 발명의 PPR은, 페닐피루브산에 높은 친화성을 가지면서, 그 이외에, 4-히드록시페닐피루브산, 글리옥실산, 히드록시피루브산 등 폭넓은 것을 기질로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 PPR의 k_cat/K_m값은, 이미 알려진 페닐피루브산 환원 효소의 k_cat/K_m값의 수십배나 높은 점에서, 본 발명의 PPR은, 광학 활성 페닐젖산을 대량 생성하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 PPR은, 이것을 코드하는 유전자를 이용한 형질전환체에 의해 이 효소의 대량 생산이 가능하기 때문에, 또한 얻어진 PPR을 이용하여 광학 활성 페닐젖산을 공업적으로 대량 생산하는 것도 가능하다.

<2. 광학 활성 3-페닐젖산의 제조방법>

본 발명의 광학 활성 3-페닐젖산의 제조방법은, 페닐피루브산으로부터 D-3-페닐젖산을 생성할 수 있는 제조 공정(효소 반응계 : 전술한 식 1 참조)을 적어도 갖고 있으면 된다.

또한, D-글루코오스나 L-페닐알라닌 등의 원료로부터 페닐피루브산을 생성하는 제조 공정을 갖는 것이, 제조 비용이나 입수가 용이하기 때문에 적합하다.

D-글루코오스로부터 페닐피루브산을 생성하는 제조 공정으로는, 특별히 한정되지 않고, 유기 합성법이나 발효법(생합성 반응) 등을 들 수 있는데, 예컨대, 시키미산 경로(Shikimate pathway)를 들 수 있다.

또한, D-글루코오스로부터 L-페닐알라닌을 생성하는 제조 공정으로는, 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 일본 특허 공개 평5-344811호 공보나 미국 특허 4681852호 공보 등의 공지된 수법을 들 수 있다. 또한, L-페닐알라닌으로부터 페닐피루브산을 생성하는 제조 공정은, 아미노트랜스퍼라아제 등의 아미노기 전이 효소를 이용하는 효소 반응계를 들 수 있다.

이 때, D-글루코오스나 L-페닐알라닌 등의 원료로부터 페닐피루브산을 생성할 수 있는 제조 공정(예컨대 효소나 미생물 등의 발효법에 의한 반응계)을, 본 발명의 광학 활성 3-페닐젖산 제조법에 내포시키고 있는 것이 적합하다.

즉, 본 발명의 PPR 및/또는 본 발명의 미생물을 이용하여, 기질로부터 광학 활성 3-페닐젖산을 생산하고, 광학 활성 3-페닐젖산을 회수하는 것이 적합하다.

이 때, 본 발명의 PPR의 효소가 적어도 포함되어 있는 것을 이용하면 되고, 예컨대, 본 발명의 미생물을 배양한 배양액이나 이로부터 미생물을 제거한 배양액, 미생물 파쇄액이나 파쇄물을 제거한 무세포 추출액 등을 이용해도 좋다. 이들에, 시키미산 경로의 반응을 위한 일련의 효소군(구체적으로는, 7-포스포-2-데히드로-3-데옥시아라비노헵톤산 알돌라아제, 3-데히드로키나산 신타아제, 3-데히드로키나산 데히드라타아제, 시키미산 데히드로게나아제, 시키미산 키나아제, 3-포스포시키미산1-카르복시비닐 트랜스퍼라아제(5-에놀피루빌시키미산-3-인산 신타아제), 코리스미산 신타아제, 코리스미산 뮤타아제 등)이나 페닐알라닌 합성계의 효소군(구체적으로는, 프레펜산 데히드로게나아제, 티로신 아미노트랜스퍼라아제 등) 등이 포함되어 있어도 좋다.

또한, 보효소로서, NADPH 및/또는 NADH를 이용하는 것이 적합하고, 이 중, NADPH가 광학 활성 페닐젖산의 수율이 높아지기 때문에 바람직하다.

본 발명의 광학 활성 3-페닐젖산 제조법의 반응 형식은, 특별히 한정되지 않고, 배치식으로 행해도 좋고, 연속 유통식으로 행해도 좋다.

또한, 본 발명의 PPR이나 본 발명의 미생물은, 고정화되어 있어도 좋다. 이 고정화의 수법은, 공지된 수법이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 수불용성의 담체에 미생물·효소를 물리적 흡착, 이온 결합, 유결합(organic bonding)을 통해 고정화하는 담체 결합법 ; 글루타르알데히드 등의 2가성 관능기를 갖는 시약으로 가교 고정화하는 가교법 ; 메시 구조를 갖는 겔이나, 반투성막 안에 미생물·효소를 가두는 포괄법 등을 들 수 있다.

또한, 반응에 이용하는 용매는, 극성 또는 비극성 용매 중 어느 것이어도 좋지만, 물 및/또는 수용성 용매가 바람직하고, 90∼100 질량%의 물이 특히 바람직하다. 여기서, 수용성 유기 용매란, 벤젠고리를 갖는 화합물을 용해시키기 쉬운 것이 바람직하고, 예컨대, 직쇄 또는 분기쇄 등의 알콜류나 아세톤 등을 들 수 있다. 이 저급 알콜류(적합하게는 탄소수 1∼5)로는, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 1가 알콜류, 1,3-부탄디올 등의 2가 또는 다가 알콜류를 들 수 있고, 이들을 적절하게 조합해도 좋다.

(1) 본 발명의 효소 PPR에 의한 광학 활성 페닐젖산의 제조방법

본 발명의 PPR을 이용하여, 효소 기질로부터 광학 활성 3-페닐젖산을 생산하고, 이것을 회수하는 것이 가능하다. 또, 전술한 바와 같이 PPR 이외의 효소도 병용함으로써 연속적으로 광학 활성 3-페닐젖산을 얻어도 좋다.

여기서, 효소 기질로는, 페닐피루브산으로 하는 것이, 광학 활성 페닐젖산의 수율이 높아지기 때문에 적합하다.

또한, 반응 온도는, 바람직하게는 5∼50℃, 보다 바람직하게는 10∼40℃, 더욱 바람직하게는 20∼40℃로 하는 것이 적합하다.

또한, 반응 시간(1턴)은, 바람직하게는 12시간∼1주일, 보다 바람직하게는 2∼4일간으로 하는 것이 적합하다.

또한, 반응 pH는, 바람직하게는 5∼8, 보다 바람직하게는 6∼7로 하는 것이 적합하다. 이 때의 pH 조정은, 인산 완충액 등과 같은 공지된 pH 조정제로 행하면 된다.

(2) 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 갖는 미생물에 의한 광학 활성 3-페닐젖산의 제조방법

본 발명의 광학 활성 페닐젖산의 제조방법은, 다음의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 포함하는 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물을 이용하여 배양하고, 미생물 기질로부터 광학 활성 페닐젖산을 생성시켜, 이것을 회수하는 것이 적합하다.

(a) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입된 아미노산 서열을 포함하고, 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질

(c) 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 페닐피루브산 환원 활성을 갖고, 페닐피루브산에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질.

여기서, 이 미생물은, 전술한 야생주(TK1 균주) 및 그 변이주, 또는 전술한 형질전환체 등을 말하며, 호기·혐기 중 어느 것이어도 좋다.

이 때 미생물 기질로는, D-글루코오스, L-페닐알라닌, 페닐피루브산 등으로부터 선택되는 1종 이상의 것이 바람직하다.

또한, 미생물 기질을 D-글루코오스로 한 경우, 저렴하고 입수 가능하며, 또한 대량으로 광학 활성 페닐젖산을 생산하는 것이 가능하기 때문에 적합하고, 더구나 단순한 당인 글루코오스로부터 방향족 화합물, 더구나 광학 활성인 3-D-페닐젖산을 대량 생산하는 것이 가능한 ppr 유전자를 발견한 것은 산업상 매우 유익하다. 이러한 경우, 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 L-페닐알라닌 생산성 미생물에 도입한 재조합 미생물이 바람직하다.

또, 미생물로 광학 활성 페닐젖산을 제조하는 경우, 전술한 바와 같은 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물 이외에, 상기 미생물 기질을 생산시키기 위해, 시키미산 경로의 반응을 위한 일련의 효소군을 코드하는 유전자를 갖는 미생물이나 페닐알라닌 합성계의 효소군을 코드하는 유전자를 갖는 미생물 등의 상기 미생물 기질을 생산하는 미생물을 이용해도 좋다.

예컨대, 상기 미생물 기질을 생산시키는 미생물을 이용하여 전(前)배양한 후, 본 발명의 미생물을 이용하여 본(本)배양하는 것 ; 이들 미생물을 동시에 사용하여 배양하는 것 등을 들 수 있다.

미생물 배양에 사용하는 배지로는, 각 미생물의 생육에 이용되는 영양 배지에, 적어도 상기 미생물 기질을 포함한 것이 적합하다. 이 때 상기 미생물 기질은, 배지 중, 바람직하게는 0.01∼20%(질량/용량), 보다 바람직하게는 0.1∼3%(질량/용량), 더욱 바람직하게는 1∼2%(질량/용량)로 하는 것이 적합하다.

상기 영양 배지는, 예컨대 미생물이 효모인 경우, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 0∼5 g ; NaNO₃ 5∼7 g ; KCl 0.4∼0.6 g ; MgSO₄·7H₂O 0.4∼7 g ; KH₂PO₄ 1∼2 g ; 허트너 미량 원소(Hutner's Trace elements) 1∼3 mL ; 증류수를 포함하는 MM 배지를 들 수 있다. 허트너 미량 원소에 관해서는 후술하는 실시예와 같다. 또한 적절하게 효모 엑기스 0∼3%, 폴리펩톤 0∼2%로 해도 좋다.

또한, 예컨대 미생물이 대장균인 경우, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 0∼5 g ; Na₂PO₄ 5∼7 g ; KH₂PO₄ 2∼4 g ; NaCl 9∼11 g ; NH₄Cl 5∼7 g ; MgSO₄·7H₂O 0.4∼7 g ; CaCl₂·H₂O 0.02∼0.04 g ; 티아민 HCl 0.04∼0.05 g ; 트립신 0.2∼0.4 g ; 트립토판 0.2∼0.4 g ; 허트너 미량 원소 1∼3 mL ; 증류수를 포함하는 M9 배지를 들 수 있다.

또한, 대장균의 경우, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 0∼5 g ; Na₂HPO₄, 11∼13 g ; KH₂PO₄ 5∼7 g ; NaCl 0.4∼0.6 g ; NH₄Cl 0.9∼1.1 g ; MgSO₄·7H₂O 0.2∼0.4 g ; CaCl₂·2H₂O 0.01∼0.02 g ; 티아민 HCl 0.01∼0.02 g ; 트립톤 9∼11 g ; 5.00 g/L 효모 엑기스 4∼6 g ; 미량 원소 2 1∼3 mL ; 증류수를 포함하는 페닐젖산 생산 배지를 들 수 있다.

또, 허트너 미량 원소 및 미량 원소 2에 관해서는, 후술하는 실시예와 같다(표 2 및 표 12 참조).

또한, 트립신 9∼11 g, 효모 엑기스 4∼5 g을 첨가하는 것이 적합하다.

배양 조건은 사용하는 미생물에 따라 적절하게 설정하면 된다.

배양 온도는, 바람직하게는 5∼50℃, 보다 바람직하게는 10∼40℃, 더욱 바람직하게는 20∼40℃로 하는 것이, 미생물 생육이 양호함과 동시에 기질 및 생성물을 석출시키지 않기 때문에 적합하다.

또한, 배양 기간(1턴)은, 바람직하게는 0.5일∼2주일 정도, 보다 바람직하게는 1주일 정도, 더욱 바람직하게는 3∼5일 정도로 하는 것이 적합하다.

또한, 배양 pH는, 바람직하게는 4∼9, 보다 바람직하게는, 효모의 경우 6∼7로 하는 것이 적합하고, 대장균의 경우 6∼8로 하는 것이 적합하다. 배양 pH 조정은 적절한 pH 조정제로 소정의 범위 내가 되도록 제어하면 된다.

또한, 교반은, 바람직하게는 100∼1000 rpm, 보다 바람직하게는 400∼600 rpm으로 행하는 것이 적합하다.

또한, 공기를 이용하여 통기 배양을 하는 경우, 바람직하게는 0.01∼1 L/분, 보다 바람직하게는 0.1∼0.3 L/분으로 하는 것이 적합하다.

또한, 상기 배양 기질의 배양 기간 내의 배지 중의 농도는, 소정의 농도 내가 되도록 조정하는 것이 생산 효율의 면에서 적합하고, 예컨대 500 g/L의 D-글루코오스 용액을, 바람직하게는 0.1∼5 g/L/h, 보다 바람직하게는 1∼2 g/L/h로, 연속적으로 또는 불연속적으로 첨가해도 좋다.

3-D-페닐젖산의 회수법으로는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 분리 정제 방법을 이용하면 된다. 균체의 제거 수단으로서, 원심 분리나 여과 등의 공지된 수단을 들 수 있다. 또한, 3-D-페닐젖산의 분리·정제 수단으로는, 정석(crystallization), 초여과, 이온 교환, 활성탄 처리, 크로마토 분리 등의 공지된 수단을 들 수 있다.

크로마토 분리로는, 예컨대 ODS 컬럼 크로마토를 이용하는 수법 등을 들 수 있다. 또한 정석으로는, 유기 용매에 의한 추출 및 재결정의 수법 등을 들 수 있다. 적합한 일례로서, 메탄올 및 헥산(=2 : 1∼1 : 2)의 혼합 용매 : 물=2 : 1∼1 : 2로 추출하는 것이 적합하다.

<3. 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법>

본 발명의 광학 활성 4-히드록시페닐젖산(D-4-히드록시페닐젖산)의 제조방법은, 4-히드록시페닐피루브산으로부터 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생성할 수 있는 제조 공정(효소 반응계 : 전술한 식 2 참조)을 적어도 갖고 있으면 된다.

기질이 되는 4-히드록시페닐피루브산은, 페닐알라닌 및 티로신의 대사 중간체의 하나인 점에서, 이들 대사계를 이용한 제조 공정으로 하면 된다.

또한, D-글루코오스나 L-티로신 등의 원료로부터 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생성하는 제조 공정을 갖는 것이, 제조 비용이나 입수가 용이하기 때문에 적합하다.

D-글루코오스로부터 L-티로신을 생성하는 제조 공정으로는, 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 일본 특허 공개 제2006-311833호 공보 등의 공지된 수법을 들 수 있다. 또한, L-페닐알라닌으로부터 티로신, 계속해서 4-히드록시페닐피루브산을 생성하는 제조 공정은, 페닐알라닌 히드록실라아제나 티로신 아미노트랜스퍼라아제 등을 이용하는 효소 반응계를 들 수 있다. D-글루코오스로부터 4-히드록시페닐피루브산을 생성하는 제조 공정으로는, 특별히 한정되지 않고, 유기 합성법이나 발효법(생합성 반응) 등을 들 수 있는데, 예컨대, 시키미산 경로(Shikimate pathway)를 들 수 있다.

이 때, D-글루코오스나 L-티로신 등의 원료로부터 4-히드록시페닐피루브산을 생성할 수 있는 제조 공정(예컨대 효소나 미생물 등의 발효법에 의한 반응계)을, 전술한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산 제조법에 내포시키고 있는 것이 적합하다.

즉, 전술한 생체 촉매(적합하게는, 효소 및/또는 미생물)를 이용하여, 기질로부터 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생산하고, 여기에서 광학 활성 4-히드록시페닐젖산(적합하게는 D-4-히드록시페닐젖산)을 회수하는 것이 적합하다.

이 때, 상기 효소가 적어도 포함되어 있는 것을 이용하면 되고, 예컨대, 상기 미생물을 배양한 배양액이나 이로부터 미생물을 제거한 배양액, 미생물 파쇄액이나 파쇄물을 제거한 무세포 추출액 등을 이용해도 좋다. 이들에, 시키미산 경로의 반응을 위한 일련의 효소군(구체적으로는, 7-포스포-2-데히드로-3-데옥시아라비노헵톤산 알돌라아제, 3-데히드로키나산 신타아제, 3-데히드로키나산 데히드라타아제, 시키미산 데히드로게나아제, 시키미산 키나아제, 3-포스포시키미산-1-카르복시비닐 트랜스퍼라아제(5-에놀피루빌시키미산-3-인산 신타아제), 코리스미산신타아제, 코리스미산 뮤타아제 등) ; 페닐알라닌 합성계의 효소군(구체적으로는, 프레펜산 데히드로게나아제, 티로신 아미노트랜스퍼라아제 등) ; 페닐알라닌 히드록실라아제 등이 포함되어 있어도 좋다.

또한, 보효소로서, NADPH 및/또는 NADH를 이용하는 것이 적합하고, 이 중, NADPH가 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 수율이 높아지기 때문에 바람직하다.

본 발명의 광학 활성 4-히드록시페닐젖산 제조법의 반응 형식은, 특별히 한정되지 않고, 배치식으로 행해도 좋고, 연속 유통식으로 행해도 좋다.

또한, 상기 효소나 상기 미생물은, 고정화되어 있어도 좋다. 이 고정화의 수법은, 공지된 수법이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 수불용성의 담체에 미생물·효소를 물리적 흡착, 이온 결합, 유결합을 통해 고정화하는 담체 결합법 ; 글루타르알데히드 등의 2가성 관능기를 갖는 시약으로 가교 고정화하는 가교법 ; 메시 구조를 갖는 겔이나, 반투성막 안에 미생물·효소를 가두는 포괄법 등을 들 수 있다.

또한, 반응에 이용하는 용매는, 극성 또는 비극성 용매 중 어느 것이어도 좋지만, 물 및/또는 수용성 용매가 바람직하고, 90∼100 질량%의 물이 특히 바람직하다. 여기서, 수용성 유기 용매란, 벤젠고리를 갖는 화합물을 용해시키기 쉬운 것이 바람직하고, 예컨대, 직쇄 또는 분기쇄의 알콜류나 아세톤을 들 수 있다. 이 저급 알콜류로는, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 1가 알콜류(적합하게는 탄소수 1∼3), 1,3-부탄디올 등의 2가 또는 다가 알콜류를 들 수 있고, 이들을 적절하게 조합해도 좋다.

(1) 본 발명의 효소 PPR에 의한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법

본 발명의 PPR을 이용하여, 효소 기질로부터 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생산하고, 이것을 회수하는 것이 가능하다. 또, 전술한 바와 같이 본 발명의 PPR 이외의 효소도 병용함으로써 연속적으로 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 얻어도 좋다.

여기서, 효소 기질로는, 4-히드록시페닐피루브산으로 하는 것이, 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 수율이 높아지기 때문에 적합하다.

또한, 반응 온도는, 바람직하게는 5∼50℃, 보다 바람직하게는 10∼40℃, 더욱 바람직하게는 20∼40℃로 하는 것이 적합하다.

또한, 반응 시간(1턴)은, 바람직하게는 12시간∼1주일, 보다 바람직하게는 2∼4일간으로 하는 것이 적합하다.

또한, 반응 pH는, 바람직하게는 5∼8, 보다 바람직하게는 6∼7로 하는 것이 적합하다. 이 때의 pH 조정은, 인산 완충액 등과 같은 공지된 pH 조정제로 행하면 된다.

(2) 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 갖는 미생물에 의한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법

본 발명의 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 제조방법은, 본 발명의 PPR을 코드하는 유전자를 포함하는 미생물을 이용하여 배양하고, 미생물 기질로부터 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생성시켜, 이것을 회수하는 것이 적합하다.

여기서, 이 미생물은, 전술한 야생주 및 그 변이주, 또는 전술한 형질전환체 등을 말하며, 호기·혐기 중 어느 것이어도 좋다. 예컨대, 4-히드록시페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 균주, PPR 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 균주, 및 ATCC 균주 등을 들 수 있다.

이 때 미생물 기질로는, D-글루코오스, L-티로신, 4-히드록시페닐피루브산으로부터 선택되는 1종 이상의 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 효소를 사용할 때에, 다른 효소를 조합하여 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생산하는 것도 가능하다.

또한, 미생물 기질을 D-글루코오스로 한 경우, 저렴하고 입수 가능하며, 또한 대량으로 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생산하는 것이 가능하기 때문에 적합하고, 더구나 단순한 당인 글루코오스로부터 방향족 화합물, 더구나, D-4-히드록시페닐젖산을 선택적으로 고순도로 대량 생산하는 것이 가능한 ppr 유전자에 착안하여 이용한 것은 산업상 매우 유익하다. 이러한 경우, 상기 효소를 코드하는 유전자를 벡터 등을 통해 L-티로신 생산균에 도입한 재조합 미생물이 바람직하다.

또, 미생물로 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 제조하는 경우, 전술한 바와 같은 상기 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물 이외에, 상기 미생물 기질을 생산시키기 위해 시키미산 경로의 반응을 위한 일련의 효소군을 코드하는 유전자를 갖는 미생물이나 페닐알라닌 합성계의 효소군을 코드하는 유전자, 페닐알라닌 히드록실라아제를 코드하는 유전자를 갖는 미생물 등의 상기 미생물 기질을 생산하는 미생물을 이용해도 좋다.

예컨대, 상기 미생물 기질을 생산시키는 미생물을 이용하여 전배양한 후, 본 발명의 미생물을 이용하여 본배양하는 것 ; 이들 미생물을 동시에 사용하여 배양하는 것 등을 들 수 있다.

미생물 배양에 사용하는 배지로는, 각 미생물의 생육에 이용되는 영양 배지에, 적어도 상기 미생물 기질을 포함한 것이 적합하다. 이 때 상기 미생물 기질은, 배지 중, 바람직하게는 0.01∼20%(질량/용량), 보다 바람직하게는 0.1∼3%(질량/용량), 더욱 바람직하게는 1∼2%(질량/용량)로 하는 것이 적합하다.

상기 영양 배지는, 예컨대 미생물이 효모인 경우, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 0∼5 g ; NaNO₃ 5∼7 g ; KCl 0.4∼0.6 g ; MgSO₄·7H₂O 0.4∼7 g ; KH₂PO₄ 1∼2 g ; 허트너 미량 원소 1∼3 mL ; 증류수를 포함하는 MM 배지를 들 수 있다. 허트너 미량 원소에 관해서는 후술하는 실시예와 같다. 또한 적절하게 효모 엑기스 0∼3%, 폴리펩톤 0∼2%로 해도 좋다.

또한, 예컨대 미생물이 대장균인 경우, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 6∼24 g ; Na₂HPO₄ 3∼12 g ; KH₂PO₄ 0.5∼1 g ; NaCl 0.5∼2 g ; NH₄Cl 0.05∼0.05 g ; MgSO₄·7H₂O 0.015∼0.030 g ; CaCl₂·H₂O 0.015∼0.050 g ; 티아민 HCl 0.050∼0.10 g ; 트립토판; 허트너 미량 원소 1∼2 mL를 포함하는 M9 배지를 들 수 있다.

또한, 배지 1 L 중, D-글루코오스 1∼30 g ; 글루코오스 이외의 미생물 기질 6∼24 g ; Na₂HPO₄ 3∼12 g ; KH₂PO₄ 0.5∼1 g ; NaCl 0.5∼1.0 g ; NH₄Cl 0.05∼1 g ; MgSO₄·7H₂O 0.015∼0.03 g ; CaCl₂·2H₂O 0.015∼0.05 g ; 티아민 HCl 1∼10 g ; 트립톤 0∼1.5 g ; 5.00 g/L 효모 엑기스 0.5∼5 g ; 미량 원소 2 1∼3 mL ; 증류수를 포함하는 히드록시페닐젖산 생산 배지(페닐젖산 생산 배지)를 들 수 있다.

또한, 트립톤 5∼20 g(바람직하게는 9∼11 g), 효모 엑기스 4∼7 g을 첨가하는 것이 적합하다.

배양 조건은 사용하는 미생물에 따라 적절하게 설정하면 된다.

배양 온도는, 바람직하게는 5∼50℃, 보다 바람직하게는 10∼40℃, 더욱 바람직하게는 20∼40℃로 하는 것이, 미생물 생육이 양호함과 동시에 기질 및 생성물을 석출시키지 않기 때문에 적합하다.

또한, 배양 기간(1턴)은, 바람직하게는 0.5일∼2주일 정도, 보다 바람직하게는 1주일 정도, 더욱 바람직하게는 3∼5일 정도로 하는 것이 적합하다.

또한, 배양 pH는, 바람직하게는 4∼9, 보다 바람직하게는, 효모의 경우 6∼7로 하는 것이 적합하고, 대장균의 경우 6∼8로 하는 것이 적합하다. 배양 pH 조정은 적절한 pH 조정제로 소정의 범위 내가 되도록 제어하면 된다.

또한, 교반은, 바람직하게는 100∼1000 rpm, 보다 바람직하게는 400∼600 rpm으로 행하는 것이 적합하다.

또한, 공기를 이용하여 통기 배양을 하는 경우, 바람직하게는 0.01∼1 L/분, 보다 바람직하게는 0.1∼0.3 L/분으로 하는 것이 적합하다.

또한, 상기 배양 기질의 배양 기간 내의 배지 중의 농도는, 소정의 농도 내가 되도록 조정하는 것이 생산 효율의 면에서 적합하고, 예컨대 500 g/L의 D-글루코오스 용액을, 바람직하게는 0.1∼5 g/L/h, 보다 바람직하게는 1∼2 g/L/h로, 연속적으로 또는 불연속적으로 첨가해도 좋다.

또한, pH는, 6∼8 부근이면 된다.

전술한 제조방법으로 얻어지는 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 회수법으로는, 특별히 한정되지 않고, 공지된 분리 정제 방법을 이용하면 된다. 균체의 제거 수단으로서, 원심 분리나 여과 등의 공지된 수단을 들 수 있다. 또한, 광학 활성 4-히드록시페닐젖산(D-4-히드록시페닐젖산)의 분리·정제 수단으로는, 정석, 초여과, 이온 교환, 활성탄 처리, 크로마토 분리 등의 공지된 수단을 들 수 있다.

크로마토 분리로는, 예컨대 ODS 컬럼 크로마토를 이용하는 수법 등을 들 수 있다.

또한 정석으로는, 유기 용매에 의한 추출 및 재결정의 수법 등을 들 수 있다. 일례로서, 초산에틸 및 헥산(=2 : 1∼1 : 2)의 혼합 용매 : 물=2 : 1∼1 : 2로 추출하는 것이 적합하다. 이 때, 염산 등의 산으로 pH 2∼4로 하는 등에 의해 산성화하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 제조방법을 이용하면, 라세미체가 아니라 고순도의 D-4-히드록시페닐젖산을 얻을 수도 있고, 분리 정제의 공정을 간략화할 수 있기 때문에, 본 기술은 공업적 생산에는 적합하다. 더구나, 이것에 알맞은 효소 및 미생물을 용이하게 얻을 수 있기 때문에, 이러한 점에서도 본 기술은 공업적 생산에 적합하다.

또, 고순도로서, 어느 한쪽의 비율이 높은 것이 유리하고, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상인 것이 유리하다.

실시예

이하에 구체적인 실시예를 설명하지만, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> D-3-페닐젖산의 생산균의 스크리닝 및 그것이 생산하는 페닐피루브산 환원 효소(PPR)의 정제

(1) D-3-페닐젖산을 생산하는 TK1 균주의 취득

일본의 이바라키현 츠쿠바시 내의 환경 중의 토양이나 물을 수십 개소에서 채취하여, 적절하게 희석 후, YPD 한천 배지(2% 효모 추출액, 1% 폴리펩톤, 1% D-글루코오스/증류수 1 L)에 도포했다. 28℃에서 2일 내지 4일 배양 후, 나타난 콜로니를 적절하게 희석 후, 새로운 YPD 한천 배지에 접종함으로써, 순수 분리했다. 또한 분리한 균주 1 백금이를 표 1에 나타내는 최소 배지(Minimum medium)(이하, 「MM」이라고도 함) 액체 배지에 식균하고, 호기 조건에서, 28℃에서 2일 내지 4일 배양했다.

광학 활성 페닐젖산의 생산량이 양호한 것을, 이하의 측정 방법으로 선발하고, 그 중 하나를 TK1 균주로 했다.

〔3-페닐젖산의 정성 및 정량 방법〕

1) 가스 크로마토그래피 질량 분석계(GC/MS)를 이용한 3-페닐젖산의 정성

시료를, 1% NaOH 200 μL, 메탄올 167 μL, 피리딘 34 μL에 완전히 현탁시킨다. 이것에, 메틸 클로로카보네이트를 20 μL 첨가하고, 격렬하게 교반함으로써 시료를 메틸화한다. 메틸 클로로카보네이트를 첨가하고 교반하는 조작을 반복한 후, 클로로포름을 400 μL 첨가하고 교반한다. 다음으로, 50 mM 중탄산나트륨을 첨가하고, 교반 후의 수층을 제거한다. 얻어진 클로로포름층에 0.1 g의 황산나트륨을 첨가함으로써 클로로포름층을 완전히 탈수하고, 얻어진 용액에 포함되는 유기산을 GC/MS(GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu)를 이용하여 측정한다. 이 GC/MS 분석의 조건을 이하에 나타낸다.

또, 배양액을 분석하는 경우, 배양액 5 mL를, 1% NaOH를 이용하여 pH를 9에서 10으로 조정하고, 원심 에바포레이터(centrifugal evaporator)를 이용하여 감압 건조시키고, 이것을 시료로서 사용한다.

분석기 : GC/MS-QP2010 Plus(Shimadzu)

컬럼: DB-5(0.32 mm×30 m)

컬럼 온도 : 60℃(2 min)-8℃/min-180℃(5 min)-40℃/min-220℃(5 min)

인터페이스 온도 : 230℃

이온 소스 온도 : 250℃

캐리어 가스 : He

유량 : 30 mL/min

2) 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 3-페닐젖산의 정량

시료 중의 3-페닐젖산의 정량은 HPLC를 이용하여, 이하의 분석 조건으로 분석한다.

또, 배양액을 분석하는 경우에는, 여과나 원심 분리 등에 의해 균체를 제거한 배양 상청을 시료로서 사용한다.

분석기 : HP-1100(Hewlett-Packard)

컬럼 : TSKgel ODS-80(등록 상표)(4.6×150 mm, Tosoh, Tokyo, Japan)

컬럼 온도 : 28℃

유속 : 1.0 mL/min

이동상 : 20 mm 인산칼륨 완충액(pH 2.5) : 메탄올(6 : 4, v/v)

3) HPLC를 이용한 키랄 분석

시료(효소 반응액) 중의 3-페닐젖산의 광학 이성을, HPLC를 이용하여, 이하의 분석 조건으로 결정한다. 또, 배양액을 분석하는 경우에는, 배양액으로부터 여과나 원심 분리 등에 의해 균체를 제거한 배양 상청을 시료로서 사용한다.

분석기 : HP-1100(Hewlett-Packard)

컬럼 : Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)

컬럼 온도 : 60℃

유속 : 1.2 mL/min

이동상 : 0.5 mM CuSO₄

(2) TK1 균주의 동정

전용량 50 mL의 시험관에 나누어 주입한 YPD 배지 10 mL에, 미리 균체를 생육시킨 YPD 한천 배지로부터, 균체를 1 백금이 식균하고, 30℃에서 2일간, 120 rpm으로 진탕 배양했다.

전(前)배양액 2.5 mL로부터 균체를 원심 분리에 의해 집균(集菌)하고, 그 침전을 생리 식염수로 세정했다. 이것을 10 mL의 MM 액체 배지 전용량 50 mL의 시험관에 식균하고, 30℃에서 2일간, 120 rpm으로 진탕 배양했다. 또, 혐기 조건하에서 배양할 때에는, 시험관의 기상을 질소로 치환하여 부틸 고무 마개를 끼우고, 이것을 30℃, 6일간, 120 rpm으로 진탕 배양했다.

〔26S rDNA-D1/D2 염기 서열 해석〕

추출부터 사이클 시퀀스까지의 조작은, DNA 추출(물리적 파괴 및 Marmur(1961)), PCR(puReTaq Ready-To-Go PCR beads(Amersham Biosciences, NJ, USA)), 사이클 시퀀스 BigDye Terminator v3.1 Kit(Applied Biosystems, CA, USA), 사용 프라이머(NL1 및 NL4 (O'Donnell, 1993)), 시퀀스(ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer System(Applied Biosystems, CA, USA)), 상동성 검색 및 간이 분자 계통 해석(소프트웨어 아폴론 2.0(테크노 스루가 라보), 데이터베이스 아폴론 DB-FU3.0(테크노 스루가 라보), 국제 염기 서열 데이터베이스(GeneBank/DDBJ/EMBL))의 각 프로토콜에 따랐다.

〔생리 성상 시험〕

시험 방법은 Barnett et al. (2000) 및 Kurtzman and Fell (1998)에 준거하고, 배양은 온도 내성 시험을 제외하고 25℃에서 행했다. 표 3에 나타내는 생리 성상의 시험을 행했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

〔간이 형태 관찰〕

광학 현미경(BX 올림푸스, 동경)을 이용하여 간이 형태 관찰을 행했다. 그 결과를 도 1에 도시한다. 또, 바(bar)는 5 ㎛이다.

〔TK1 균주의 동정〕

아폴론 DB-FU에 대한 BLAST(Altschul, S.F. et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.)를 이용한 염기 서열의 상동성 검색의 결과, Strain TK1 균주의 26S rDNA-D1/D2 염기 서열은, 자낭균 효모의 일종인 윅커하미아 플루오레센스의 기준주인 NRRL YB-4819의 그것과 100%의 상동성을 나타냈다. GenBank/DDBJ/EMBL 등의 국제 염기 서열 데이터베이스에 대한 상동성 검색에 있어서도, Strain TK1 균주의 26S rDNA-D1/D2 염기 서열은, W. 플루오레센스의 NRR YB-4819 균주에 대하여, 100%의 높은 상동성을 나타냈다.

또한 간이 형태 관찰의 결과, Strain TK1 균주의 영양 세포는, 레몬형, 알형, 긴 알형이고, 증식은 양극 출아에 의하고, 출아 부위는 넓으며, 위균사의 형성이 확인되었다(도 1). 또한, 배양 개시 19일째에는, 자낭에 스포츠 모자형의 자낭 포자를 형성되는 것이 확인되었다. 이들의 형태학 관찰은 W. 플루오레센스의 형태학적 특징과 일치한다(Kurtzman C.P., Fell J.W. The Yeasts: A Taxonomic Study, 4th edition Elsevier, Amsterdam, Netherlands.).

생리·생화학적 성상 시험의 결과, Strain TK1 균주는 당 발효성을 나타내고, 탄소원으로서 이노시톨을 자화하지 않고, 질소원으로서 질산염을 자화하지 않았다(표 3). 이들은 윅커하미아속의 특징과 일치한다(Kurtzman C.P., Fell J.W. The Yeasts: A Taxonomic Study, 4th edition. Elsevier, Amsterdam, Netherlands.).

이상의 생리 성상 시험, 간이 형태 관찰의 결과는 26S rDNA-D1/D2 염기 서열의 결과를 지지하는 것이었다. 이러한 점에서, Strain TK1 균주는, W. 플루오레센스에 귀속되는 것으로 추정되어, 본 균주를 W. 플루오레센스 TK1이라고 명명했다. 신규한 미생물로서, 2010년 12월 13일, 우편 305-8566 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츠쿠바 센터 츄오 제6, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(IPOD)에, 윅커하미아 플루오레센스 TK1(FERM AP-22048)로서 기탁했다.

(3) W. 플루오레센스 TK1 균주가 생산하는 3-페닐젖산의 광학 이성

W. 플루오레센스 TK1 균주가 생산하는 3-페닐젖산의 광학 이성을 결정했다. 배양 상청을, 전술한 바와 같은 키랄 분석(Nucleosil Chiral-1 컬럼)에 제공했다(도 2). 그 결과, 생산되어 있던 3-페닐젖산은 D-3-페닐젖산과 동일한 유지 시간을 나타내고, L-3-페닐젖산과는 상이한 피크를 부여했다. 이러한 점에서, W. 플루오레센스 TK1 균주는 에난티오 선택적으로 D-3-페닐젖산을 생산하는 것이 분명해졌다(도 2).

또, 도 2의 (a)는 D-3-페닐젖산 및 L-3-페닐젖산의 표품 ; (b)는 본 균주의 MM 배지 배양 후의 상청 ; (c)는 본 균주의 GPAMM 배지 배양 후의 상청 ; (d)는 본 균주로부터 얻어진 효소로 페닐피루브산의 기질을 처리한 것이다.

(4) MM 배지(최소 배지)를 이용하여 W. 플루오레센스 TK1 균주로 배양했을 때의 D-3-페닐젖산의 생산성

W. 플루오레센스 TK1 균주를 초기 균체 농도를 0.2(O.D.600)에 맞추고, MM 배지를 이용하여 호기 조건하에서 5일간 진탕 배양(날개 부착 플라스크, 100 mL)하고, 시간 경과적으로 배양 상청을 샘플링했다. 그 결과, 균체의 증식은 배양 개시 24시간 이후에는 정상기에 들어갔다. D-3-페닐젖산의 생산량은 정상기에 들어가도 계속해서 증가하여, 배양 개시 96시간째에는 배지 중에 0.1 mM의 D-3-페닐젖산을 생산하고 있었다(도 3).

또, 도 3∼5의 「세포 밀도」는 균체량을 나타내고, 「PLA」는 D-3-페닐젖산의 농도를 나타내고, 또한「PPA」는 페닐피루브산의 농도를 나타내고, 「Phe」는 L-페닐알라닌을 나타낸다.

(5) D-3-페닐젖산의 생산에 대한 페닐알라닌과 페닐피루브산의 영향

W. 플루오레센스 TK1 균주를 초기 균체 농도를 0.2(O.D.600)에 맞추고, MM 배지에, 페닐피루브산을 첨가한 GPAMM 배지(표 4)와, L-페닐알라닌을 첨가한 GPMM 배지(표 5)를 각각 이용하여 호기 조건하에서 각각 2일간 및 3일간 진탕 배양(날개 부착 플라스크, 100 mL)하고, 시간 경과적으로 배양액을 샘플링하여, 본 균에 의한 D-3-페닐젖산의 생산량을 측정했다(도 4 및 5).

그 결과, W. 플루오레센스 TK1 균주는 배지에 L-페닐알라닌을 첨가하면, 첨가하지 않을 때와 비교하여, 균체량은 5.1배가 되고, D-3-페닐젖산을 57.5배 생산했다. 또한, 페닐피루브산을 첨가하면 균체량은 1.5배가 되고, D-3-페닐젖산을 8.9배 생산했다.

배지에 5 mM의 L-페닐알라닌을 첨가한 경우, 배양 24시간 후에는 L-페닐알라닌은 검출되지 않게 되고, 대신에 동레벨(5.7 mM)의 D-3-페닐젖산이 축적되었다. 이러한 점에서, 본 균에 의해 L-페닐알라닌이 D-3-페닐젖산으로 변환된 것으로 생각되었다. 즉, 본 균주는, 광학 활성 페닐젖산을 생성하는 효소를 갖는 것으로 생각되었다.

또한, L-페닐알라닌의 감소와 D-3-페닐젖산의 생산에 따른 균체의 증식이 보였다. L-페닐알라닌을 첨가한 GPMM 배지(도 4), L-페닐알라닌을 첨가하지 않은 MM 배지를 이용한 배양(도 3), 페닐피루브산을 첨가한 GPAMM 배지(도 4)를 이용한 배양에서의 균체의 증식량을 비교하면, L-페닐알라닌을 첨가한 GPMM 배지를 이용한 배양에서 가장 많았다.

이것은, L-페닐알라닌의 아미노기로부터 유리되는 암모니아가 질소원으로서 이용되기 때문에 본 균의 증식이 촉진되었기 때문인 것으로 생각된다.

(6) W. 플루오레센스 TK1 균주가 생산하는 효소를 포함하는 무세포 추출액의 조제 습균체 중량 1.0 g당 산화알루미늄 2.5 g과 프로테아제 저해제 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF), N-토실-L-페닐알라닐클로르메틸 케톤(TPCK) 각 0.2 mM, 10% 글리세롤과 1 mM 디티오트레이톨(DTT)을 포함한 20 mM의 인산 완충액을 첨가하고, 균체를 막자와 막자사발을 이용하여 파쇄했다. 파쇄액에 균체와 동량의 동완충액을 첨가하고, 15000×g에서 원심 분리했다. 얻어진 배양 상청을 무세포 추출액으로 했다. 이상의 조작은 얼음 중에서 행했다.

(7) 무세포 추출액으로부터의 본 효소 PPR 회수 조건의 검토

페닐피루브산의 D-3-페닐젖산으로의 환원을 촉매하는 효소(페닐피루브산 환원 효소)인 본 효소 PPR을 W. 플루오레센스 TK1 균주의 무세포 추출액으로부터 정제하기에 앞서, 본 균의 본배양의 배양 시간과 무세포 추출액 중의 PPR 활성의 관계를 검토했다. GPMM 배지를 이용하여 배양 개시 4, 12, 48시간 후의 균체로부터 무세포 추출액을 조제한 바, 배양 시간 12시간에서의 PPR 활성이 4시간, 48시간과 비교하여 각각 1.8, 3.4배 높았다(도 6).

이상의 결과로부터, 정제에 이용하는 균체는 12시간 배양한 것을 이용하는 것으로 했다. 또, 배양 개시 12시간 후는 3-페닐젖산의 생산이 이루어지는 시간과 일치하는 점에서, 본 효소 PPR은 3-페닐젖산의 생산에 관여하고 있을 가능성이 시사되었다.

(8) 본 효소 PPR의 지적 pH의 검토

pH 5.5∼8의 Tris-HCl 완충액(pH 7, 7.5, 8), 인산 완충액(pH 5.5, 6, 6.5, 7)의 각 pH 완충액을 반응액에 이용하여 PPR 활성을 측정하고, 본 효소 PPR의 반응의 지적 pH를 검토했다. pH 6.5에서 가장 높은 PPR 활성이 검출되었다(도 7). 이러한 점에서, 본 효소 PPR의 지적 pH는 6.5이고, 이후의 활성 측정의 pH는 6.5에서 행했다.

(9) W. 플루오레센스 TK1 균주 유래의 본 효소 PPR의 조제

전술한 바와 같이, 무세포 추출액을 조제하고, 이 무세포 추출액을 100,000×g에서 1시간 원심 분리했다.

또한, 이하에 나타내는 바와 같이, 원심 분리 후의 무세포 추출액으로부터, 부틸 세파로오스 컬럼, 2'5'-ADP-세파로오스 컬럼, 계속해서 MonoQ HR 5/5 컬럼의 각종 크로마토그래피로 분리 정제를 행하여, 본 효소 PPR을 얻었다.

〔부틸 세파로오스 컬럼〕

원심 분리 후의 무세포 추출액에, 20%가 되도록 황산암모늄을 첨가했다. 세척 완충액(wash buffer)(10% 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 20 mM의 인산 완충액, 20% (NH₄)₂SO₄, pH 7)를 컬럼 용적의 5배량 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 이 컬럼에 조제한 샘플을 올려놓고 황산암모늄의 직선 농도 구배(20%-0%)에 의해 용출을 행하여, 활성 분획을 얻었다.

〔2'5'-ADP-세파로오스 컬럼〕

상기에서 얻어진 활성 분획을, 투석 완충액(10% 글리세롤, 1 mM DTT, 20 mM 인산 완충액, pH 7)에 대하여 하룻밤 투석을 행했다. 이 샘플을, 세척 완충액(10% 글리세롤, 1 mM DTT, 20 mM 인산 완충액, pH 7)를 5배량 흘려 평형화시킨 2'5'-ADP-세파로오스 컬럼에 제공했다. 용출은 용출 완충액(elution buffer)(10% 글리세롤, 1 mM DTT, 0.1-1 mM NADP⁺, 20 mM 인산 완충액, pH 7)으로 행하여, 활성 분획을 얻었다.

〔MonoQ HR 5/5 컬럼〕

상기에서 얻어진 활성 분획을, 평형화 완충액(equilibration buffer)(10% 글리세롤, 1 mM DTT, 20 mM 인산 완충액, pH 7)로 평형화시킨 MonoQ HR 5/5 컬럼(GE Healthcare)에 제공하고, NaCl 직선 농도 구배(0%-15%)에 의해 용출을 행했다.

〔PPR 활성의 측정법〕

PPR의 활성 측정은, 효소 반응액으로서 50 mM 인산 완충액(pH 6.5), 2 mM 페닐피루브산, 0.1 mM NADPH를 이용하고, 이것에 시료(효소액이나 무세포 추출액 등)를 첨가함으로써 반응을 개시한다. 반응 온도는 25℃. 활성은, 반응에 따라 생성되는 NADPH가 갖는 340 nm 파장의 흡수의 감소를 자외·가시 분광 시계(Beckman-Coulter DU-800)를 이용하여 측정함으로써 정량한다. NADPH의 340 nm 파장의 흡수의 몰 흡광 계수는, 6.2 mM^-1·cm^-1로 한다.

〔페닐알라닌 아미노트랜스퍼라아제(PAT)의 활성 측정〕

PAT의 활성 측정은, 효소 반응액으로서 50 mM 인산 완충액(pH 6.5), 10 mM L-페닐알라닌, 2.5 mM 2-옥소글루타르산, 12.5 μM 인산피리독살(Pyridoxal phosphate)를 이용하고, 이것에 시료(효소액이나 무세포 추출액 등)를 첨가함으로써 반응을 개시한다. 반응 온도는 37℃, 반응 시간 30분으로 한다. 2 N NaOH를 800 μL 첨가함으로써 반응을 종료시켰다. 활성은, 반응에 따라 생성되는 페닐피루브산이 갖는 320 nm 파장의 흡수의 증가를 측정함으로써 정량했다. 또 페닐피루브산의 몰 흡광 계수는 17.5 mM^-1·cm^-1(Whitaker RJ., et al. J. Biol. Chem. (1982) 257, 3550-3556.)로 한다.

〔PPR의 분자량의 정량〕

PPR의 분자량의 측정은, 12.5% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS-PAGE 및/또는 겔 여과법에 의해 행한다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법을 이용할 때에는, Laemmli 등의 방법에 따라 행한다.

또한, 겔 여과법을 이용할 때에는, 폴리에틸렌 글리콜 20,000을 이용하여 농축한 정제 본 효소 PPR 샘플 등을 미리 용출 완충액(10% 글리세롤, 1 mM DTT, 20 mM 인산 완충액, 0.15 mM NaCl pH 7)으로 평형화시킨 Superose 6 10/300에 제공하고, 컬럼 용량의 1배의 용출 완충액으로 용출한다.

표준 단백질로서, 소혈청 알부민(M.W. 67,000), 키모트립시노겐(M.W. 25,000), α-아밀라아제(M.W. 45,000), β-아밀라아제(M.W. 200,000)를 이용한다.

균체 30 g으로부터 조제한 무세포 추출액 중의 총단백량은 592.2 mg이고, D-3-페닐젖산의 생산의 총활성은 190.8 μmol/mL였다. 즉, 페닐피루브산 환원 효소가 무세포 추출액 중에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

이것을 원심 분리하여 얻어진 가용성 분획을, 전술한 바와 같이, 부틸-세파로오스(소수 컬럼), 2'5'-ADP-세파로오스(어피니티 컬럼), Mono Q HR 5/5(강음이온 교환 컬럼)에 순차 제공한 결과, 본 효소 PPR의 비활성을 2260배까지 농축시킬 수 있고, 수율 41%로 본 효소 PPR을 정제할 수 있었다(표 6).

정제한 본 효소 PPR을 SDS-PAGE에 제공한 결과, 단일 밴드인 것이 밝혀지고, 또한 그 분자량은 40,000이었다(도 8). 겔 여과법에 의해, 정제한 본 효소 PPR 효소의 분자량은 80,000으로 예측된 점에서 본 효소 PPR은 호모 2량체를 형성하고 있는 것이 분명해졌다(도 8).

(10) W. 플루오레센스 TK1 균주 유래로 생성되는 효소의 여러 성질

〔PPR의 효소학적 해석〕

본 효소 PPR은 NADPH 의존적으로, 페닐피루브산과 반응하여, D-3-페닐젖산을 생산하는 것을, 전술한 HPLC의 측정 방법에 의해 확인할 수 있었다.

또한, 2 mM의 페닐피루브산과 2 mM의 NADPH로부터, 2 mM의 3-페닐젖산이 생산되는 것이 확인된 점에서, 이 반응에는, 이하의 화학양론이 성립하는 것이 밝혀졌다(식 1).

D-3-페닐젖산, L-3-페닐젖산, NAD⁺, NADP⁺의 조합을 기질로서 이용했을 때의 효소 반응은 일어나지 않은 점에서, 본 효소 PPR에 의한 반응은 불가역 반응인 것이 밝혀졌다.

또한, 본 효소 PPR은 NADPH를 보효소로서 이용하여 페닐피루브산, 4-히드록시페닐피루브산, 글리옥실산 및 히드록시피루브산을 환원했다(식 1 및 식 2).

이 때 k_cat/Km값은 페닐피루브산을 기질로 했을 때에 가장 크고, 373 s^-1mM^-1이었다(표 7).

또한, NADH를 보효소로 했을 때의 k_cat/Km값은 330 s^-1mM^-1로 NADPH를 보효소로 했을 때(10143 s^-1mM^-1)의 1/31이라는 낮은 값이 되었다. 그 때문에 본 효소는, 보효소로서 NADH와 NADPH를 이용 가능하지만, NADPH에 대한 특이성이 높은 것이 밝혀졌다.

〔금속 이온과 저해제의 영향〕

각 금속 이온과 각 저해제를 각각 최종 농도 1 mM로 반응계에 첨가하고, PPR 활성을 측정했다. Cu^{2 +} , Zn^{2 +} , Fe^{2 +}, WO^{2 -}, Hg^{2 +}의 금속 이온에 의해, 본 효소 PPR 활성의 저하가 보인 점에서(표 8), 이들이 PPR 활성을 저해하는 것이 밝혀졌다.

〔D-3-페닐젖산 생산균 및 그것이 생산하는 PPR의 여러 성질〕

D-3-페닐젖산 생산균을 검색한 결과, 자낭균 효모인 W. 플루오레센스 TK1 균주가 배양 상청 중에 D-3-페닐젖산을 0.1 mM 생산하고 있었던 점에서, 신규 D-3-페닐젖산 생산균을 스크리닝할 수 있었던 것으로 생각되었다. 또한, L-페닐알라닌을 배지에 첨가하고 동일하게 배양했을 때의 D-3-페닐젖산은 5.7 mM의 생산량으로 생산되고 있었다. 3-페닐젖산 생산의 보고가 있는 G. 칸디둠(G. candidum)에서는 TSBYE 배지를 이용하고 자 발효기(jar fermentor)를 이용하여 배양함으로써 3.6∼6.0 mM(비특허문헌 2), 유산균에서는 MRS 배지를 이용함으로써 0.57 mM(J.Biochem. 2005 138, 741-74915))의 3-페닐젖산이 생산되는 것이 보고되어 있다. 또한, 락토바실루스. Sp. SK007이 3-페닐젖산의 전구체인 페닐피루브산을 배지에 6 mM 첨가했을 때에 5.2 mM의 3-페닐젖산을 생산하고(Li, X. et al., Biotechnol. Lett (2007) 29, 593-597), L. 플란타룸(L. plantarum) TMW1.468, L. 샌프란시센시스(L. sanfranciscensis) DSM20451에서는 배지에 50 mM의 페닐알라닌을 첨가한 경우 0.04∼0.08 mM의 생산이 보였다(Vermeulen, N. et al. J. Agric. Food Chem. (2006) 54, 3832-3839). 이상의 결과는, W. 플루오레센스 TK1 균주가 자 발효기 등을 이용하여 배양 조건을 정밀히 컨트롤하지 않고 비교적 높은 D-3-페닐젖산을 생산하는 능력을 갖는 것을 나타내는 것이다.

또한, W. 플루오레센스 TK1 균주는 D-3-페닐젖산을 에난티오 선택적으로 생산하고 있었다. 화학 제품, 의약품은, 탈리도마이드로 대표되듯이 에난티오머끼리 생리 활성이 상이한 경우가 있다. 그 때문에, 키랄 분자의 에난티오 선택적인 제조가 요구되고 있다. 따라서, 본 균이 높은 에난티오 선택성을 갖고 D-3-페닐젖산을 생산하고 있는 것은, 본 화합물의 의약품 원료 등에의 이용을 생각하는 데에 있어서 대단히 의의가 있다고 생각된다.

또한, 정제한 본 균의 PPR 활성은, 페닐피루브산을 기질로 했을 때의 kcat/Km값이 373 s^-1mM^-1이었다. 이 값은, 현재까지 보고가 있는 어느 락토바실루스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) JCM1558(비특허문헌 15), 락토바실루스. 플란타룸 ATCC 8041의 DLDH(Taguchi, H.; Ohta, T. J. Biol. Chem. (1991) 266, 12588-12594), 리조븀 에틀리 CFN 42의 GRHPR(Fauvart, M. et al. Biochimica et Biophysica Acta 1774 (2007) 1092-1098)의 분자 활성보다 높은 값이다(표 9).

또한, 지금까지 유일하게 정제된 진균 유래의 페닐피루브산을 기질로 하는 효소인 칸디다 말토사(Candida maltosa) L4의 D-4-히드록시페닐락테이트 데히드로게나아제는, W. 플루오레센스 TK1 균주의 PPR과 동일하게 페닐피루브산과 4-히드록시페닐피루브산에 대하여 높은 친화성을 나타내고 있다. 그러나, D-4-히드록시페닐락테이트 데히드로게나아제는 Mn²⁺를 보인자로서 필요로 하고, 분자량 250,000-280,000과 본 균 PPR의 분자량과 비교하면 매우 크다. 또한, 본 효소 PPR이 페닐피루브산에 대한 친화성이 가장 높았던 반면, D-4-히드록시페닐락테이트 데히드로게나아제는 4-히드록시페닐피루브산에 대한 친화성 쪽이 높았던 점에서도, 양자는 별도의 효소인 것으로 생각된다.

<실시예 2> ppr 유전자의 클로닝 및 대장균에서의 발현

(1) 사용 균주

3-페닐젖산 생산균 W. 플루오레센스 TK1 균주를 이용했다.

E. 콜라이 Origami B(DE3)를, PPR 발현용의 숙주로서 이용했다. 플라스미드의 구축시에는, E. 콜라이 JM109주를 이용했다.

(2) 배양 방법

전용량 50 mL의 시험관에 나누어 주입한 전술한 YPD 배지 10 mL에, 미리 균체를 생육시킨 YPD 한천 배지로부터, 균체를 1 백금이 식균하고, 30℃에서 2일간, 120 rpm으로 진탕 배양했다. 전배양액으로부터 균체를 원심 분리에 의해 집균하고, 그 침전을 생리 식염수로 세정했다. 이것을 150 mL의 GPMM 배지를 포함하는 전용량 500 mL의 날개 부착 플라스크에 식균했다. 이것을 30℃, 12시간, 120 rpm, 호기 조건하에서 진탕 배양했다.

(3) 본 효소 PPR의 N 말단 아미노산 서열 해석

〔블로팅〕

여과지를 A 용액(0.3 M Tris, 5% 메탄올)에 2장, B 용액(25 mM Tris, 5% 메탄올)에 1장, C 용액(25 mM Tris, 40 mM 6-아미노카프론산, 5% 메탄올)에 3장 각각 침지했다. 정제한 본 효소 PPR을 SDS-PAGE에서 전기 영동한 후, 겔을 각각의 용액에 침지한 여과지를 중첩시키고, 전사 장치(호라이즈 블롯 AE-6670P/N, ATTO)를 이용하여 전기적으로 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막(AE-6665, ATTO)에 전사했다.

〔프로테인 시퀀스〕

건조시킨 PVDF막으로부터 원하는 밴드를 잘라내어, 아미노산 서열 분석 장치(Applied Biosystems Procise 492 cLC)에 제공했다.

(4) 본 효소 PPR의 내부 아미노산 서열의 결정

SDS-PAGE에 영동한 정제된 본 효소 PPR을 겔로부터 잘라내고, 트립신에 의해 겔내 소화했다. 트립신 소화 펩티드를 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of Flight(MALDI-TOF/MS)(AXIMA(등록 상표), AXIMA(등록 상표)-QIT Shimazu)에 제공하고, 얻어진 프래그먼트 정보를 기초로 아미노산 서열을 결정했다.

(5) cDNA의 조제

GPMM 배지에서 배양한 W. 플루오레센스 TK1 균주를 파쇄 버퍼(500 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM EDTA, 1% SDS)에 현탁시키고, 반량의 글래스 비드와 등량의 페놀·클로로포름·이소아밀알콜(25 : 24 : 1)을 첨가했다(페노클로 처리). 보텍스로 교반한 후 원심 분리하고, 상청을 회수하여, DNase 처리하고, 페놀·클로로포름·이소아밀알콜 추출을 2회 반복하고, 2.5배량의 에탄올과 1/10배량의 3 M 초산나트륨을 첨가했다(에탄올 침전). 원심 분리 후, 침전을 RLC(RNeasy(등록 상표) Plant Mini Kit에 부속된 것) 450 μL, 2-메르캅토에탄올 4.5 μL에 현탁시켰다. 이후의 스텝은 RNeasy(등록 상표) Plant Mini Kit의 프로토콜에 따랐다. 조정한 RNA와 PrimeScript(등록 상표) Reverse Transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성했다.

(6) 전DNA의 조제

YPD 배지에서 하룻밤 배양한 W. 플루오레센스 TK1 균주를 파쇄 버퍼(100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 2% TritonX-100)에 현탁시키고, 반량의 글래스 비드와 등량의 페놀·클로로포름·이소아밀알콜(25 : 24 :1)을 첨가했다(페노클로 처리). 보텍스로 교반한 후 원심 분리하고, 상청을 회수하여, 페놀·클로로포름·이소아밀알콜 추출을 2회 반복하고, 2.5배량의 에탄올과 1/10배량의 3 M 초산나트륨을 첨가했다(에탄올 침전). 원심 분리 후, 침전을 70% 에탄올로 세정했다. 70% 에탄올을 버리고 아스피레이터(aspirator)로 건조시키고, RNase를 첨가한 적량의 멸균수에 현탁시켰다.

(7) 클로닝

〔PCR법〕

50 μL의 PCR 반응계에, 얻어진 cDNA를 주형으로 하여 1 μL, 10×KOD-Plus-완충액(TOYOBO) 5 μL, 각 2.5 mM dNTP 4 μL, 프라이머 NP(5'-ATGAARAARCCNCAGGT-3')(서열번호 10), Oligo dT(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')(서열번호 11), KOD-Plus-DNA Polymerase(TOYOBO) 1 μL, 25 mM MgSO₄ 2 μL를 첨가했다. 이 반응계에 대하여, 96℃ 30 s, 50℃ 30 s, 68℃ 3 min의 처리를 35회 행한 후, 68℃ 5 min 신장 반응시켰다(1차 PCR). 또한, PCR 산물을 템플릿 1 μL, 10×Ex Taq 완충액(TaKaRa) 5 μL, 각 2.5 mM dNTP 4 μL, 프라이머 NP(서열번호 10), 프라이머 2427P(5'-GGYTCYTCYTCRAANACRTT-3')(서열번호 12), Ex Taq Polymerase(TaKaRa) 0.5 μL를 첨가했다. 96℃ 15 s, 56℃ 20 s, 72℃ 1 min의 처리를 35회 행하고, 72℃ 5 min 신장 반응시켰다(2차 PCR).

〔PPR 유전자의 전체 길이 해석〕

조제한 전RNA를 기초로, 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE), Version 2.0(Invitrogen Co., CA)을 이용하여 PPR의 5'-말단의 cDNA를 합성했다. 얻어진 cDNA를 템플릿으로 하여, kit 부속의 어댑터 올리고뉴클레오티드와 PPR을 코드하는 유전자에 특이적인 프라이머(GSP1(5'-TGAAAATGCGTTAGTATGTGGAT-3')(서열번호 13), GSP2(5'-TGCCTTTGCTGCTTTGAATGTAT-3')(서열번호 14))를 이용하여 nested PCR했다. PCR의 반응 조건은, 96℃ 15 s, 56℃ 20 s, 72℃ 1 min의 처리를 35회 행하고, 72℃ 5 min 신장 반응시켰다. PCR에서 얻어진 200 kp의 DNA 단편을 아가로오스 전기 영동에 의해 회수하고, pGEM(등록 상표)-T easy(Promega, Madison, WI)에 클로닝했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 단편의 DNA 서열을 결정했다.

3'-말단은 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen Co., CA)에 의해 합성한 cDNA를 템플릿으로 하여, 프라이머 GSP(5'-AACTACGAGGTGCTGCC-3')(서열번호 15), 프라이머 GSP nest(5'-GTCCTCCCCAGTTACCATATATAGC-3')(서열번호 16)를 이용하여 상기와 동일하게 PCR을 행하고, 얻어진 270 kb의 단편의 염기 서열을 결정했다.

〔DNA 서열 해석〕

DNA의 서열 해석은 전자동 DNA 시퀀서(CEQ2000, Beckman Coulter)를 이용하여 해석했다. 방법은, 프로토콜에 따라 행했다.

(8) 리얼 타임 PCR

W. 플루오레센스 TK1 균주를, MM 배지, GPMM 배지, GPAMM 배지를 이용하여 30℃, 8시간 배양하고, 얻어진 각 배지의 균체로부터 RNA를 조제했다. 이것을 주형으로 하여 oligo-dT19 프라이머, Reverse Transcriptase M-MLV(TAKARA BIO, Inc., Japan)를 이용하여 역전사 반응을 행했다. 얻어진 1본쇄 cDNA를 주형으로 하여, iQ(등록 상표) SYBR(등록 상표) Green Supermix(Bio-Rad Laboratories Inc., CA)를 이용하여 MiniOpticon(등록 상표) version 3.1(Bio-Rad Laboratories Inc., CA)에 제공했다. 각각의 균체에서 pprA 유전자의 발현량을, 18S 리보솜 RNA의 발현량과의 비로서 나타냈다.

발현의 비율(pprA/18SrDNA)=2^{CT ( pprA )- CT (18S 리보솜)}

* C_T는 증폭 산물이 축적되고, 검출 가능한 형광 시그널이 얻어진 사이클수.

또, 이용한 효소 pprA(pprART F(5'-ATTTAGCCGCGATGAAAGAAC-3')(서열번호 17), pprART R(5'-TCGGCAAAGGCACATCC-3')(서열번호 18)) 및 18S 리보솜의 프라이머(18SRT F(5'-ACCAGGTCCAGACACAATAAGG-3')(서열번호 19), 18SRT R(5'-AAGCAGACAAATCACTCCACC-3')(서열번호 20))는 프라이머 제작 소프트웨어 primer 3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)을 이용하여 설계했다.

(9) 대장균을 이용한 재조합 PPR(rPPR)의 발현, 정제

〔형질전환체의 제작〕

W. 플루오레센스 TK1 균주의 RNA로부터 조제한 1본쇄 cDNA와 프라이머 Nde-PPR(5'-GGGTTTCATATGAAAAAGCCTCAG-3')(서열번호 21), Xho-PPR(5'-CCGCTCGAGAACTACAAGATT-3')(서열번호 22)을 이용하여, PCR 반응에 의해 pprA 유전자의 cDNA 단편을 증폭시켰다. 이것을 NdeI, XhoI로 처리한 것을 pCWori를 미리 동일한 제한 효소로 처리한 것에 연결하여 구축한 플라스미드(pCW-PPR)를 E. 콜라이 ATCC31882(ATCC로부터 취득)에 도입했다(도 9 및 도 10 참조).

〔발현의 유도〕

얻어진 재조합체를 최종 농도 100 ㎍/L 암피실린나트륨을 포함한 LB 배지(LA) 10 mL에서 37℃, 12시간 전배양했다. 이 전량을 150 mL LA에 식균했다. 120 rpm, 37℃, 2시간 배양 후, 최종 농도 1 mM의 IPTG를 첨가하고, 50 rpm, 실온에서 8시간 배양했다.

〔rPPR의 정제〕

배양한 균체를 집균하고, buffer A(20 mM 인산칼륨(pH 7.0), 10% 글리세롤, 0.1 mM DTT)에 현탁시켜, 초음파 파쇄했다. 파쇄액을 15,000 rpm, 30분간 원심 분리하여 상청(무세포 추출액)을 회수했다. 미리 Ni²⁺를 흡착시킨 후, 300 mM NaCl을 포함한 버퍼 A(버퍼 C)로 평형화시킨 킬레이팅 세파로오스 컬럼(Amersham)에 무세포 추출액을 제공했다. 500 mM 이미다졸을 포함한 버퍼 C로 용출한 분획을 회수하고, 버퍼 A에 대하여 투석하여, 이후의 해석에 이용했다.

(10) 분자 계통 해석

〔아미노산 서열의 얼라이먼트〕

클로닝한 pprA 유전자의 추정 아미노산 서열과 상동성이 있는 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 데이터베이스 내에서 검색했다. 이 때, BLAST를 이용했다. 얻어진 서열 정보를 이용하여 ClustalW에 의한 멀티플 얼라이먼트 해석을 행했다.

〔계통수의 작성〕

계통수의 작성에는 MEGA 4를 이용했다. 계통수의 제작에 이용한 아미노산 서열은 NCBI로부터 입수했다. 계통수의 작성은 근린 접합법에 의해 행하고, 가지 상에 부트스트랩 반복 추정치를 나타냈다.

(11) 본 효소 PPR의 N 말단 아미노산 서열의 결정

정제한 본 효소 PPR(1 ㎍)을 PVDF막에 전기적으로 블로팅하고, 본 효소 PPR의 N 말단의 아미노산 서열을 분석했다. 그 결과, MKKPOVLILGRI로 이루어지는 본 효소 PPR의 12 잔기의 N 말단 아미노산 서열을 결정할 수 있었다(서열번호 1).

(12) 본 효소 PPR의 내부 아미노산 서열의 취득

SDS-PAGE 후의 본 효소 PPR을 겔로부터 잘라내고, 트립신을 이용하여 겔내 소화를 행했다. 얻어진 트립신 소화 펩티드를 MALDI-TOF MS 해석했다. MALDI-TOF MS 해석에 의해 얻어진 펩티드 피크 중에서, m/z 2000.00과 m/z 2427.27의 2개의 펩티드를 선택하고, MALDI-QIT-TOF MS를 이용한 MS/MS 해석을 행했다(도 11). 얻어진 질량 프래그먼트 피크의 정보를 기초로 트립신 소화 펩티드의 아미노산 서열의 de novo 시퀀스를 행한 결과, m/z 2000.00을 나타내는 펩티드는 19 아미노산 잔기로 이루어지는 NIQAIYGNWGGLASFGGFK의 아미노산 서열(서열번호 2), m/z 2427.27을 나타내는 펩티드는 22 아미노산 잔기로 이루어지는 VAFAALDVFEEEPFIHPGLIGR의 아미노산 서열(서열번호 3)을 각각 얻을 수 있었다(도 12).

(13) pprA 유전자의 클로닝

N 말단 아미노산 서열(서열번호 1)과 내부 아미노산 서열 m/z 2427.27(서열번호 3)의 정보를 기초로, 프라이머 NP(서열번호 10), 프라이머 2427P(서열번호 12)를 각각 설계했다. W. 플루오레센스 TK1 균주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하고, 프라이머 NP(서열번호 10), 프라이머 Oligo dT(서열번호 11)를 이용하여 PCR을 행했다. 또한, PCR 산물을 주형으로 하고, 프라이머 NP(서열번호 10), 프라이머 2427P(서열번호 12)를 이용하여 PCR을 행했다. 그 결과, 935 bp의 원하는 DNA 단편이 증폭되었다(도 13).

증폭된 DNA의 염기 서열을 기초로 프라이머를 설계하고, RACE법에 의해 pprA 유전자의 양말단의 염기 서열을 해석했다. 그 결과, pprA 유전자는 364 잔기의 아미노산을 코드하는 1,095 bp의 염기쌍을 포함하는 것이 밝혀졌다(도 14 : 서열번호 4 및 5). 이 추정 아미노산 서열 중에는, 상기에서 결정한 PPR의 N 말단 및 내부 아미노산 서열을 함께 발견할 수 있었다. 또한, 게놈 DNA로부터 증폭된 서열과 cDNA로부터 증폭된 서열을 비교한 바, pprA 유전자에는 인트론(intron)이 존재하지 않는 것이 분명해졌다.

(14) pprA 유전자의 염색체 상에서의 카피수

W. 플루오레센스 TK1 균주의 게놈 상에 존재하는 pprA 유전자의 카피수를 확인하기 위해 서던 블롯 해석을 행했다(도 15). 제한 효소(HindIII, EcoRI, PstI, BamHI)로 처리한 W. 플루오레센스 TK1 균주의 전DNA에 대하여, pprA 유전자의 서열을 포함하는 DNA 단편을 프로브로 하여 서던 하이브리다이제이션을 행했다. 그 결과, 어떠한 제한 효소 처리한 전DNA를 이용한 경우라도 밴드는 1개만 검출되었다. 이러한 점에서, 게놈 상에 존재하는 pprA 유전자는 1 카피뿐이고, 정제한 본 효소 PPR은 pprA 유전자가 발현된 것임이 밝혀졌다.

(15) L-페닐알라닌에 의한 본 효소 PPR의 발현 제어

GPMM 배지(D-글루코오스 및 L-페닐알라닌을 포함함), GPAMM 배지(D-글루코오스 및 페닐피루브산을 포함함), MM 배지(D-글루코오스를 포함함)를 각각 이용하여 W. 플루오레센스 TK1 균주를 10시간, 30℃에서 각각 배양하여 얻어진 균체의 무세포 추출액 중의 PPR 활성을 전술한 〔PPR 활성의 측정법〕에 따라 측정했다. 그 결과, L-페닐알라닌을 첨가한 GPMM 배지를 이용하여 얻어진 균체의 무세포 추출액 중의 PPR 활성은 0.22 μmol/min/mg이고, MM 배지를 이용하여 배양했을 때의 활성과 비교하여 3.6배였다. 또한, 페닐피루브산을 첨가한 GPAMM 배지를 이용했을 때의 그것과 비교하여 3.0배 높았다(도 16). 동일한 조건하에서 W. 플루오레센스 TK1 균주를 8시간 배양하여 얻어진 균체의 pprA 유전자의 전사량을 리얼 타임 PCR을 이용하여 측정했다. 그 결과, 5 mM 페닐알라닌을 첨가한 GPMM 배지를 이용하여 배양한 균체에서의 pprA 유전자의 발현량이 MM 배지를 이용한 조건과 비교하여 40배, GPAMM 배지를 이용하여 배양한 조건과 비교하여 18배 증가해 있었다(도 16). 이상의 결과로부터, pprA 유전자의 발현은, 페닐알라닌에 의해 유도되는 것이 밝혀졌다.

(16) 대장균을 이용한 효소 rPPR의 발현, 정제

〔효소 rPPR의 정제〕

대장균 Origami B주에 pET21a에 pprA 유전자의 cDNA를 삽입한 플라스미드를 도입했다. N 말단에 His를 부가시킨 본 효소 PPR을 발현시킨 후, 킬레이팅 세파로오스 컬럼을 이용하여 정제했다(도 17). 그 결과, 40 kDa에 단일 밴드가 얻어진 점에서, 효소 rPPR을 정제할 수 있었던 것이 밝혀졌다.

〔효소 rPPR의 효소학적 여러 성질〕

정제한 효소 rPPR은 W. 플루오레센스 TK1 균주의 효소 PPR과 동일하게, NADPH를 보효소로서 이용 가능하고, 페닐피루브산, 4-히드록시페닐피루브산, 글리옥실산 및 히드록시피루브산을 기질로 했을 때의 k_cat/Km값은 페닐피루브산을 기질로 했을 때가 가장 높았다(표 10). 또한, 피루브산과 옥살로초산을 기질로 한 활성은 검출되지 않았다(데이터 개시 생략). 이러한 점에서, 대장균을 이용하여 발현시킨 효소 rPPR도, W. 플루오레센스 TK1 균주 유래의 효소 PPR과 동일한 기질 특이성을 나타내는 것이 분명해졌다.

(17) 본 효소 PPR의 분자 계통 해석

〔효소 PPR의 얼라이먼트 해석〕

효소 PPR의 추정 아미노산 서열은, 상동성이 가장 높았던 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis)의 기능 미지 유전자의 추정 아미노산 서열과 54%의 상동성밖에 나타내지 않았다. 또한, 기능이 분명해진 단백질의 아미노산 서열에서는 L. 플란타룸 유래의 D-락테이트 데히드로게나아제(DLDH)와 20%, R. 에틀리(R. etli) CFN 42의 재조합 GRHPR과 25%, 솔레노스테몬 스쿠텔라리오이드(Solenostemon scutellarioide) 유래의 히드록시페닐피루브산 환원 효소(hydroxyphenylpyruvate reductase)(HPPR)와 27%의 상동성을 나타냈을 뿐이었다.

C. 두블리니엔시스(C. dubliniensis)의 기능 미지 유전자, L. 플란타룸 유래의 DLDH, R. 에틀리 CFN 42의 재조합 GRHPR, S. 스쿠텔라리오이드(S. scutellarioide) 유래의 HPPR 및 W. 플루오레센스 TK1 균주의 추정 아미노산 서열을 이용하여 얼라이먼트 해석을 행했다.

W. 플루오레센스 TK1 균주의 추정 아미노산 서열 상의 185-331번째에는 NADH/NADPH 결합 도메인이 보였다. 또한 NADH/NADPH 결합 모티브로 생각되는 서열 -G-X-G-X-X-G-가 PPR의 추정 아미노산 서열에 보였다(도 18). 또한, 인간 유래 GRHPR(Booth MP, et al. J Mol Biol. (2006) 360, 178-189.))의 기질 결합 부위로서 동정되어 있는 기질의 카르복실기의 산소 원자와 수소 결합하는 86번째의 발린(V)(GRHPR 중 V83), 87번째의 글리신(G)(GRHPR : G274), 기질의 카르복실기와 카르보닐기의 산소 원자와 수소 결합하는 282번째의 아르기닌(R)(GRHPR : R269) 잔기가 효소 PPR에 보존되어 있었다. 산염기 촉매인 329번째의 히스티딘(H)(GRHPR : H329) 잔기와 H329 잔기의 이미다졸 고리와 수소 결합하는 311번째의 글루타민산(E)(GRHPR : E311) 잔기도 보존되어 있었다. DLDH와 GRHPR은 D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리에 속하는 효소인 점에서, 본 공시균의 PPR도 동패밀리에 속하는 것이 시사되었다.

〔계통수〕

GRHPR, HPPR, DLDH, 포르메이트 데히드로게나아제(formate dehydrogenase; FDH), L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase; LLDH) 및 말레이트 데히드로게나아제(malate dehydrogenase; MDH) 패밀리에 속하는 이미 알려진 효소와, 본 효소 PPR과 상동성이 높았던 기능 미지 단백질의 아미노산 서열을 선발하여, 분자 계통수를 제작했다. 그 결과, PPR은 LLDH, MDH 슈퍼패밀리와는 상이한 클러스터에 속해 있고 D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리로 분류되었다.

더욱 상세한 계통 해석을 행하기 위해, D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리에 속하는 HPPR 또는 GRHPR 패밀리에 속하는 효소와, 본 효소 PPR 및 본 효소 PPR과, 상동성을 나타낸 기능 미지 단백질의 아미노산 서열을 선택하여, 계통수를 제작했다. 그 결과, 본 균의 PPR은 기존의 HPPR 또는 GRHPR 패밀리에는 속해 있지 않고, 자낭균 효모의 기능 미지 단백질과 새로운 클러스터를 형성하고 있었다. 이러한 점에서, PPR은 D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리에 속하는 신규 패밀리를 형성하는 것이 분명해졌다. 그 패밀리는 계통수 상에서 HPPR과 GRHPR 패밀리의 근린에 위치해 있고, 이것은 본 효소 PPR이, HPPR 또는 GRHPR 패밀리의 효소와 동일하게 페닐피루브산, 4-히드록시페닐피루브산, 글리옥실산 및 히드록시피루브산을 기질로서 인식한다는 점과 상관을 나타냈다.

〔본 효소 PPR의 기능성〕

본 연구에 있어서, D-3-페닐젖산 및 광학 활성 4-히드록시페닐젖산을 생산 가능한 자낭균 효모 W. 플루오레센스 TK1 균주를 새롭게 발견했다. 또한 공시균으로부터 D-3-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산의 생산에 관여하는 본 효소 PPR을 정제하고, 그 유전자인 pprA 유전자를 클로닝했다. 지금까지, D-3-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산의 생산에 직접 관여하는 효소를 정제하고, 그 유전자를 클로닝했다는 보고는 없어, 본 연구는 최초의 예이다. 또한, 본 효소 PPR은 3-페닐젖산의 생산에 관여하고 있는 것으로서 보고가 있었던 유산균의 DLDH와는 효소학적 해석, 분자 계통 해석의 어느 결과로부터도 상이한 효소인 것이 밝혀졌다. 계통 해석으로부터, 본 효소 PPR은 D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리의 기존의 패밀리로는 분류되지 않고, 자낭균 효모의 기능 미지 단백질과 동일한 그룹에 맵핑되었다. 이러한 점에서, 본 효소 PPR은 D-이성체 특이적 2-히드록시산 데히드로게나아제 슈퍼패밀리에 속하는 신규 효소이고, 그 기능은 자낭균 효모에 보존되어 있을 가능성이 시사되었다.

본 연구에 의해 분명해진 W. 플루오레센스 TK1 균주에서의 D-3-페닐젖산의 생산 기구(mechanism)의 모델을 도 19에 도시한다. 글루코오스를 탄소원으로 한 경우에는 시키미산 경로에 의해 공급되는 페닐피루브산이 본 효소 PPR에 의해 환원되어 D-3-페닐젖산이 생성되는 것으로 생각되었다. 또한, 페닐알라닌을 배지에 첨가한 경우에는, 페닐알라닌은 아미노트랜스퍼라아제에 의해 아미노기의 탈리가 되어 페닐피루브산으로 변환된다. 또한, 본 효소 PPR에 의해 페닐피루브산으로부터 NADPH를 보효소로 하여 환원적으로 D-3-페닐젖산이 생산된다. 또한, pprA 유전자는 페닐알라닌의 존재하에서 전사 레벨에서의 발현량이 증대되어 있었다. 실제로 단백질 레벨에서도 PPR 활성은 3.6배, D-3-페닐젖산의 생산량도 페닐알라닌 첨가시에서는 첨가하지 않았을 때와 비교하여 58배까지 증가했다.

유산균에서의 3-페닐젖산의 생산은, 피루브산으로부터 젖산으로 변환을 촉매하는 LDH가 페닐알라닌의 대사 중간체인 페닐피루브산에도 촉매 작용을 나타냈기 때문에 부차적으로 생산되는 것으로 생각되고 있다(Valerio F. et al., (2004) FEMS Microbiol Letters, 233, 289-295). 그러나, 본 공시균의 본 효소 PPR은 LDH 활성을 나타내고 있지 않고, 기질로서 인식하는 2-케토산 중에서 페닐피루브산에 대한 친화성이 가장 높았다. 이것은, 본 효소 PPR의 기능이 통상의 유산균의 LDH와는 상이하다는 것을 나타낸다.

또한, 본 효소 PPR은, 4-히드록시페닐피루브산으로부터 D-4-히드록시페닐젖산을 생성하는 것이 분명해졌다.

이러한 점에서, 본 공시균에서는, 3-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산의 생산은 부차적인 것이 아니라, 본 효소 PPR에 의해 특이적으로 생산되고 있었던 것을 알 수 있다.

본 연구에서는, 대장균의 pET 시스템을 이용함으로써 재조합 PPR의 발현과 정제에 성공했다.

또한, 본 연구에 의해, 방향족 화합물의 생합성에 관한 신규한 효소 PPR의 정제, 그 유전자의 클로닝과 이종 생물에서의 발현계를 구축하는 것에 성공했다. 이 성과는, 앞으로의 방향족계 화합물의 발효 생산을 위해 도움이 될 것으로 생각된다. 3-페닐젖산은 폭넓은 항균 활성을 나타내는 항균 물질인데, 그와 동시에 방향족계 폴리머의 소재로서의 가능성도 기대되고 있다(Tsuji H. et al., J. Appl. Polymer Sci., 110, 3954-3962 (2008)). 방향족계 폴리머는 베이클라이트(Bakelite)로 대표되는 페놀 수지나 폴리페닐렌옥사이드가 있고, 일반적으로 내열성, 내약품성 등이 우수한 물성이 있다.

그러나, 그 원료의 공급은 주로 석유 유래이고, 순환형 사회가 주장되는 현재에서는, 바이오매스 유래의 원료로의 변환이 요구되고 있다. 현재까지, 바이오폴리머로서 실용화가 검토되고 있는 것의 주류는 폴리젖산일 것이다. 폴리젖산은 원료인 젖산을 락티드 중합이나 직접 중합에 의해 얻을 수 있다(Yin, M.; Baker, G. L. Macromolecules 1999, 32, 7711.). 폴리젖산의 실용화가 진행되고 있는 이유로는, 원료인 젖산이 대사의 기간 산물이고, 유산균에 의한 젖산 발효라고 하는 바이오 베이스에서의 생산 연구가 잘 이루어지고 있기 때문이다. 만일 방향족계의 대사 산물의 발효 생산 기술이 확립되면, 안정적인 원료의 공급이 가능해져 바이오매스 유래의 방향족계 폴리머의 제조가 가능해질 것으로 생각된다. 본 연구에 의해 D-3-페닐젖산의 생산 기구를 해명한 것에 의해, 지금까지 연구가 곤란했던 D-3-페닐젖산을 이용한 바이오폴리머의 기능 해명을 위한 돌파구가 될 것으로 생각된다.

<실시예 3> D-3-페닐젖산 생산 시스템의 구축

(1) ppr 유전자를 도입한 페닐알라닌 생산성 대장균의 조제

D-3-페닐젖산의 생산주는, LB 배지{10.0 g/L 트립톤, 5.0 g/L 효모 추출액, 10.0 g/L NaCl}에서 하룻밤 배양한 후에, 멸균한 글리세롤을 전량의 20% 첨가하고, -80℃에서 보존했다.

전배양은, 시험관에 5.0 mL의 LB 배지를 넣고, 배지에 대하여 1/100량의 글리세롤 보존 용액을 접종하여, 37℃, 120 rpm으로 약 6시간 진탕 배양했다.

처음에, 페닐알라닌 생산성인 ATCC31882주(ATCC로부터 입수)에, 전술한 수법에 준하여 플라스미드를 제작하고, 이것을 이용하여 ppr 유전자를 도입하고, 형질 전환한 신규 페닐젖산 생산주를 조제했다.

(2) 신규 페닐젖산 생산주에 의한 배양

본 페닐젖산 생산주를, 50 mL의 페닐젖산 생산 배지(표 11 및 12)에 20 g/L의 글루코오스와 50 mg/L의 카나마이신을 첨가한 것을 이용하여, 1/100량의 전술한 전배양액을 접종하고, 500 mL 용량의 날개 부착 삼각 플라스크에서, 37℃, 120 rpm, 24시간 진탕 배양했다.

그 결과를 도 20 및 표 13에 나타냈다. 또, D-3-페닐젖산 및 L-페닐알라닌의 정량은, RP-18 컬럼(MERCK사 제조)을 이용하여, HPLC(HEWLETT PACKARD사 제조 SERIES1100)로 행했다.

페닐젖산의 광학 활성은, 배지 중의 페닐젖산을 재결정법에 의해 정제하고, 그 샘플을 전술한 바와 같이 NUCLEOSIL Chiral-1 컬럼(MACHEREY-NAGEL사 제조)에 제공하여 결정했다.

D-글루코오스의 정량은, 글루코오스 CII 테스트 키트(Wako사 제조)를 이용하여 행했다.

pprA 유전자를 페닐알라닌 생산주인 ATCC31882주에 각각 도입함으로써, 99% 이상 D-3-페닐젖산을 각각 생산하는 유용주(ATCC31882/pHSGpprA)를 제작하는 것에 성공했다.

계속해서 실용화를 목표로, ATCC31882 pHSGpprA주를 이용하여, 자 발효기에 의한 D-3-페닐젖산 생산을 행했다(도 21).

400 mL의 전술한 페닐젖산 생산 배지를 1.0 L 용량의 자 발효기에 넣고, 1/100량의 전배양액을 접종하고, 37℃, 500 rpm, 0.2 L/min(0.5 vvm)의 공기를 통기시키고, 또한, 5 N의 NaOH를 이용하여 pH를 7.0으로 제어하여, 96시간 배양했다. 배양 환경의 안정화를 위해, 적량의 소포제를 첨가했다.

또, 탄소원인 D-글루코오스는, 페리스태틱 펌프를 이용하여, 500 g/L의 D-글루코오스 용액을 1.50 g/L/h의 속도가 되도록 배지 중에 첨가했다.

또한, 영양 요구 성분인 L-티로신과 L-트립토판은, 장기 배양에 의한 결핍을 방지하기 위해, 미리 페닐젖산 생산 배지에 각각 0.50 g/L 첨가했다.

최종적으로, 배양 96시간에서 D-3-페닐젖산을 15.5 g/L(대당수율 10.8%) 생산할 수 있었다. 또, 대당수율은, D-3-페닐젖산의 생성량(g)/D-글루코오스의 총첨가량(g)으로 산출했다.

(4) 생산된 D-3-페닐젖산의 정제

배지 중에 생산된 D-페닐젖산은, 유기 용매를 이용한 추출법과 재결정법을 이용하여 정제되었다. 추출 용매는, 메탄올과 헥산의 혼합 용매(혼합비 1 : 1)를 이용했다.

우선, 원심 분리하여 균체를 제거한 배양 상청에 염산을 첨가하여 산성화하고, 그것에 추출 용매를 등량 첨가하여, 30분간 완만하게 교반하고, 추출 작업을 행했다.

그 후, 유기 용매층을 회수하고, 배양액에 다시 새로운 추출 용매를 첨가하여, 전술한 공정을 행했다. 이들 공정을 2회 행하고, 회수한 유기 용매층을 에바포레이터에 의해 증발 건고시켜, D-3-페닐젖산을 함유하는 분말 고체를 얻었다.

얻어진 분말 고체로부터 고순도의 D-3-페닐젖산을 얻기 위해, 톨루엔을 첨가하여, 90∼100℃에서 분말을 충분히 용해시키고, 그 후, 천천히 냉각시킴으로써 톨루엔 용액 중에 백색 결정을 얻을 수 있었다.

톨루엔을 제거하고, 세정한 백색 결정을 키랄 컬럼과 GC/MS(GC-2010 SHIMADZU사 제조)에 제공한 결과, 백색 결정이 고순도의 D체의 3-페닐젖산인 것이 확인되었다.

이상, 본 발명의 PPR을 이용함으로써, 광학 활성 D-3-페닐젖산의 발효 생산을 행하여, 생산물인 D-3-페닐젖산을 고순도로 얻을 수 있는 기술이 확립되었다. 또한, 그 생산량도 기보에 비해 각별히 많아, 다음 항의 산업 용도에 있어서 유익하다.

<실시예 4> PPR을 코드하는 유전자를 이용한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산 생산 시스템의 구축

(1) ppr 유전자를 도입한 L-티로신 생산성 대장균의 조제

광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 생산주는, LB 배지{10.0 g/L 트립톤, 5.0 g/L 효모 추출액, 10.0 g/L NaCl}에서 하룻밤 배양한 후에, 멸균한 글리세롤을 전량의 20% 첨가하고, -80℃에서 보존했다.

전배양은, 시험관에 5.0 mL의 LB 배지를 넣고, 배지에 대하여 1/100량의 글리세롤 보존 용액을 접종하여, 37℃, 120 rpm으로 약 6시간 진탕 배양했다.

처음에, 페닐알라닌 생산성인 ATCC31882주(ATCC로부터 입수)에, 전술한 수법에 준하여 플라스미드 pTyrA를 제작하고(도 22), 이것을 이용하여 서열번호 24로 표시되는 염기 서열의 779 염기째의 C를 T로 바꿈으로써 260번째의 Thr을 Ile로 치환시킨 tyrA 유전자(서열번호 23)를 도입하여, L-티로신 생산균을 얻었다. 이 L-티로신 생산균에, 전술한 수법에 준하여 플라스미드(pCWpprA 또는 pHSGpprA)를 제작하고, 이것을 이용하여 더욱 ppr 유전자를 도입하여, 형질 전환한 신규 광학 활성 히드록시페닐젖산 생산주(NST-pprA 생산주)를 조제했다.

(2) PPR을 갖는 신규 광학 활성 히드록시페닐젖산 생산주의 배양

PPR을 갖는 광학 활성 히드록시페닐젖산 생산주를, 50 mL의 D-히드록시페닐젖산 생산 배지(표 14 및 표 15)에 20 g/L의 글루코오스와 50 mg/L의 카나마이신을 첨가한 것을 이용하여, 1/100량의 전술한 전배양액을 접종하고, 500 mL 용량의 날개 부착 삼각 플라스크에서, 37℃, 120 rpm, 24시간 진탕 배양했다.

얻어진 형질전환체를 글루코오스를 탄소원으로 한 배지를 이용하여 배양했을 때에, 배지 중에 4-히드록시페닐젖산이 검출되었다. 생산되는 4-히드록시페닐젖산은 D-4-히드록시페닐젖산이었다. 현재까지, 2.5 g/L의 D-4-히드록시페닐젖산의 발효 생산(대당수율 8%)이 가능해졌다(표 16).

(3) PPR을 코드하는 유전자를 포함하는 미생물이 생산한 광학 활성 4-히드록시페닐젖산의 정제

배지 중에 생산된 D-4-히드록시페닐젖산은, 유기 용매를 이용한 추출법과 재결정법을 이용하여 정제되었다. 추출 용매는, 초산에틸과 헥산의 혼합 용매(혼합비 1 : 1)를 이용했다.

우선, 원심 분리하여 균체를 제거한 배양 상청에 염산을 첨가하여 산성화(pH 2.5∼3.5)하고, 그것에 추출 용매를 등량 첨가하여, 30분간 완만하게 교반하고, 추출 작업을 행했다.

그 후, 유기 용매층을 회수하고, 배양액에 다시 새로운 추출 용매를 첨가하여, 전술한 공정을 행했다. 회수한 유기 용매층을 에바포레이터에 의해 증발 건고시켜, D-4-히드록시페닐젖산을 함유하는 분말 고체를 얻었다.

얻어진 분말 고체로부터 고순도의 D-4-히드록시페닐젖산을 얻기 위해, 톨루엔을 첨가하여, 90∼100℃에서 분말을 충분히 용해시키고, 그 후, 천천히 냉각시킴으로써 톨루엔 용액 중에 백색 결정을 얻을 수 있었다.

톨루엔을 제거하고, 세정한 백색 결정을 키랄 컬럼과 GC/MS(GC-2010 SHIMADZU사 제조)에 제공한 결과, 백색 결정이 고순도의 광학 활성의 D-4-히드록시페닐젖산(순도 약 99%)인 것이 확인되었다(도 23 참조).

<실시예 5> 효모 W. 플루오레센스 TK1주를 이용한 D-4-히드록시페닐젖산의 발효 생산

본 균이, 배지에 첨가한 티로신을 4-히드록시페닐젖산으로 변환 가능한 것을 나타냈다. 본 균은, 글루코오스를 원료로 하여, 시키미산 경로, 4-히드록시페닐피루브산을 경유하여 4-히드록시페닐젖산을 생성하는 것으로 생각되었다. 생산되는 4-히드록시페닐젖산은 광학 활성체(D-4-히드록시페닐젖산)였다.

<고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 4-히드록시페닐젖산의 정량>

시료 중의 히드록시페닐젖산의 정량은 HPLC를 이용하여, 이하의 분석 조건으로 분석한다.

또, 배양액을 분석하는 경우에는, 여과나 원심 분리 등에 의해 균체를 제거한 배양 상청을 시료로서 사용한다.

분석기 : HP-1100(Hewlett-Packard)

컬럼 : TSKgel ODS-80(등록 상표)(4.6×150 mm, Tosoh, Tokyo, Japan)

컬럼 온도 : 28℃

유속 : 0.8 mL/min

이동상 : 20 mm 인산칼륨 완충액(pH 2.5) : 메탄올(6 : 4, v/v)

<가스 크로마토그래피 질량 분석계(GC/MS)를 이용한 4-히드록시페닐젖산의 정성>

배양액 5 mL를, 1% NaOH를 이용하여 pH를 9에서 10으로 조정하고, 원심 에바포레이터를 이용하여 감압 건조시켰다. 얻어진 침전을, 1% NaOH 200 μL, 메탄올 167 μL, 피리딘 34 μL에 완전히 현탁시켰다. 이것에, 메틸 클로로카보네이트를 20 μL 첨가하고, 격렬하게 교반함으로써 시료를 메틸화했다. 메틸 클로로카보네이트를 첨가하고 교반하는 조작을 반복한 후, 클로로포름을 400 μL 첨가하고 교반했다. 다음으로, 50 mM 중탄산나트륨을 첨가하고, 교반 후의 수층을 제거했다. 얻어진 클로로포름층에 0.1 g의 황산나트륨을 첨가함으로써 클로로포름층을 완전히 탈수하고, 얻어진 용액에 포함되는 유기산을 GC/MS(GCMS-QP2010 Plus, Shimadzu)를 이용하여 측정했다. 분석의 조건을 이하에 나타낸다.

분석기 : GC/MS-QP2010 Plus(Shimadzu)

컬럼 : DB-5(0.32 mm×30 m)

컬럼 온도 : 60 ℃(2 min)-8℃/min-180℃(5 min)-40℃/min-220℃(5 min)

인터페이스 온도 : 230℃

이온 소스 온도 : 250℃

캐리어 가스 : He

유량 : 30 ml/min

<생산한 4-히드록시페닐젖산의 광학 이성>

〔HPLC를 이용한 키랄 분석〕

배양액 중의 4-히드록시페닐젖산의 광학 이성을, HPLC를 이용하여, 이하의 분석 조건으로 결정한다. 또, 배양액으로부터 여과나 원심 분리 등에 의해 균체를 제거한 배양 상청을 시료로서 사용한다.

분석기 : HP-1100(Hewlett-Packard)

컬럼 : Nucleosil Chiral-1(Macherey-Nagel)

컬럼 온도 : 60℃

유속 : 1.2 mL/min

이동상 : 0.5 mM CuSO₄

<생산한 4-히드록시페닐젖산의 광학 이성>

배양 상청을 회수하여 적절하게 메탄올로 희석한 것을 분석 시료로 한다. 히드록시페닐젖산 농도의 측정은, HPLC를 이용하여, 이하의 분석 조건으로 결정한다.

분석기 : HP-1100(Hewlett-Packard)

컬럼 : ODS-컬럼(5C18-MS-II : COSMSIL)

컬럼 온도 : 28℃

유속 : 0.8 mL/min

이동상 : 20 mM 인산 : 메탄올=4 : 6

이상, 본 발명의 효소 PPR을 이용하면, 티로신을 D-4-히드록시페닐젖산으로 변환 가능하다. 또한, 시키미산 경로 및 히드록시페닐피루브산을 경유하는 형질전환체를 이용함으로써, 글루코오스를 원료로 하여 D-4-히드록시페닐젖산을 생성하는 것이 가능하다.

그리고, 본 발명의 효소 PPR 및 이것을 코드하는 유전자를 이용하면, D-4-히드록시페닐젖산을 선택적으로 제작하는 것도 가능하다.

따라서, D-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산의 발효 생산을 행하여, 생산물인 D-페닐젖산 및 D-4-히드록시페닐젖산을 고순도로 얻을 수 있는 기술이 확립되었다. 또한, 그 생산량도 기보에 비해 각별히 많아, 다음 항의 산업 용도에 있어서 유익하다.

독자적으로 발견한 신규한 D-3-페닐젖산 생산균으로부터, 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 효율적으로 얻는 것이 가능해지는 본 발명의 PPR 및 이것을 코드하는 pprA 유전자를 얻었다. pprA 유전자를 도입한 형질전환체에 의해, 저렴한 글루코오스를 원료로 하여 고순도의 광학 활성 3-페닐젖산 및 4-히드록시페닐젖산을 효율적으로 얻고, 유전자 공학적 제조도 가능하다.

이 광학 활성 3-페닐젖산은, 광범위한 분야에서 주목되고 있으며, 예컨대, 폴리알로마계 플라스틱 원료, 생체 적합성 재료, 기능성 재료, 의약 농업 중간체로서의 이용이 기대되고 있다. 마찬가지로, 광학 활성 4-히드록시페닐젖산도, 식품 첨가물, 의약, 농약 등으로서의 이용이 기대되고 있다. 또한, 종래 곤란하다고 알려져 있는 방향족계 화합물의 발효 생산 기술 구축을 위한 돌파구가 될 가능성을 갖고 있다.

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11466 20101213

SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kasei Chemicals Corporation <120> PPR enzyme and ppr-gene <130> F111236-WO <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Wickerhamia fluorescens <400> 1 Met Lys Lys Pro Gln Val Leu Ile Leu Gly Arg Ile 1 5 10 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Wickerhamia fluorescens <400> 2 Asn Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Asn Trp Gly Gly Leu Ala Ser Phe Gly 1 5 10 15 Gly Phe Lys <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Wickerhamia fluorescens <400> 3 Val Ala Phe Ala Ala Leu Asp Val Phe Glu Glu Glu Pro Phe Ile His 1 5 10 15 Pro Gly Leu Ile Gly Arg 20 <210> 4 <211> 364 <212> PRT <213> Wickerhamia fluorescens <400> 4 Met Lys Lys Pro Gln Val Leu Ile Leu Gly Arg Ile Lys Glu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Glu Tyr Val Ser Phe Gln Thr Lys Phe Glu Cys Ile Arg Tyr Thr 20 25 30 Ala Ser Ser Val Asp Gln Leu Ile Lys Asp Phe Ser Ser Ser Leu Arg 35 40 45 Asn Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Asn Trp Gly Gly Leu Ala Ser Phe Gly 50 55 60 Gly Phe Lys Gly Lys Leu Leu Glu Ala Ala Pro Arg Ser Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ile Cys Gln Val Gly Tyr Asp Glu Phe Asp Leu Ala Ala Met 85 90 95 Lys Glu Arg Gly Ile Ile Leu Thr Asn Val Pro Thr Pro Leu Ala Phe 100 105 110 Glu Ala Val Ala Asp Leu Val Leu Tyr Asn Thr Leu Met Ala Phe Arg 115 120 125 Asn Phe Lys Leu Tyr Glu Asn Asn Met Ser Pro Thr Leu Asn Asn Thr 130 135 140 Asn Leu Leu Arg Asn Ser Leu Val Asn Gly Gln Phe Asp Gln Glu Thr 145 150 155 160 Gly Lys Cys Ile Val Pro Pro Ile Val Gly Cys Ala Phe Ala Asp Ser 165 170 175 Val Cys Glu Arg Glu Asn Leu Ser Pro Arg Gly His Asn Ala Val Ile 180 185 190 Ile Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys Leu Ala Ala Gln Arg Leu Asn Ala 195 200 205 Ile Gly Met Asn Ile His Tyr Val Lys Arg Thr Gln Cys Ser Pro Glu 210 215 220 Val Glu Gln Glu Leu Ser Phe Pro Val Thr Tyr His Lys Ser Ile Glu 225 230 235 240 Glu Ala Gly Arg Ile Ala Asp Leu Leu Val Ile Cys Cys Pro Gly Thr 245 250 255 Pro Ser Thr Lys His Leu Ile Asn Ser Asp Thr Leu Asp Lys Met Glu 260 265 270 Lys Gln Ile Arg Ile Ile Asn Ile Gly Arg Gly Thr Val Ile Asp Glu 275 280 285 Asn Ala Leu Val Cys Gly Leu Lys Ser Asp Lys Val Ala Phe Ala Ala 290 295 300 Leu Asp Val Phe Glu Glu Glu Pro Phe Ile His Pro Gly Leu Ile Gly 305 310 315 320 Arg Gln Asp Val His Leu Thr Pro His Ile Gly Ser Ser Thr Ser Glu 325 330 335 Leu Phe Asn Tyr Thr Ala Lys Gln Ala Met Gln Asn Ile Ser Thr Ala 340 345 350 Leu Tyr Asn Thr Asn Glu Glu Met Asn Leu Val Val 355 360 <210> 5 <211> 1095 <212> DNA <213> Wickerhamia fluorescens <220> <221> CDS <222> (1)..(1095) <400> 5 atg aaa aag cct cag gtc ctt ata ctt gga aga ata aag gaa tcc ttg 48 Met Lys Lys Pro Gln Val Leu Ile Leu Gly Arg Ile Lys Glu Ser Leu 1 5 10 15 ccc gaa tac gtt tca ttc caa act aag ttt gaa tgc att cgc tat act 96 Pro Glu Tyr Val Ser Phe Gln Thr Lys Phe Glu Cys Ile Arg Tyr Thr 20 25 30 gca tct tca gta gat cag cta atc aag gac ttc tca tct agt tta cgt 144 Ala Ser Ser Val Asp Gln Leu Ile Lys Asp Phe Ser Ser Ser Leu Arg 35 40 45 aat ata cag gct ata tat ggt aac tgg gga gga ctc gcc tca ttt ggt 192 Asn Ile Gln Ala Ile Tyr Gly Asn Trp Gly Gly Leu Ala Ser Phe Gly 50 55 60 ggc ttc aaa ggc aag tta ttg gag gca gca cct cgt agt tta aaa att 240 Gly Phe Lys Gly Lys Leu Leu Glu Ala Ala Pro Arg Ser Leu Lys Ile 65 70 75 80 att gca att tgt cag gtt ggg tat gat gag ttt gat tta gcc gcg atg 288 Ile Ala Ile Cys Gln Val Gly Tyr Asp Glu Phe Asp Leu Ala Ala Met 85 90 95 aaa gaa cgt gga att att tta acc aat gtc cct act cca ttg gca ttt 336 Lys Glu Arg Gly Ile Ile Leu Thr Asn Val Pro Thr Pro Leu Ala Phe 100 105 110 gaa gca gtt gca gac ttg gtt ttg tac aat acg ttg atg gca ttt aga 384 Glu Ala Val Ala Asp Leu Val Leu Tyr Asn Thr Leu Met Ala Phe Arg 115 120 125 aat ttc aaa ctt tac gag aat aat atg agc cct acc ctt aat aac acc 432 Asn Phe Lys Leu Tyr Glu Asn Asn Met Ser Pro Thr Leu Asn Asn Thr 130 135 140 aac ctt tta aga aat tca ttg gtc aat ggt cag ttt gat caa gaa aca 480 Asn Leu Leu Arg Asn Ser Leu Val Asn Gly Gln Phe Asp Gln Glu Thr 145 150 155 160 gga aaa tgc atc gtc cct cct ata gtg gga tgt gcc ttt gcc gac tct 528 Gly Lys Cys Ile Val Pro Pro Ile Val Gly Cys Ala Phe Ala Asp Ser 165 170 175 gtg tgt gag aga gaa aac tta tcc cca agg ggt cat aat gct gtt ata 576 Val Cys Glu Arg Glu Asn Leu Ser Pro Arg Gly His Asn Ala Val Ile 180 185 190 ata gga ttt gga aga att gga aag ttg gca gcg caa cgc tta aat gca 624 Ile Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys Leu Ala Ala Gln Arg Leu Asn Ala 195 200 205 att ggc atg aat att cat tat gtc aaa aga acc cag tgt tct cca gag 672 Ile Gly Met Asn Ile His Tyr Val Lys Arg Thr Gln Cys Ser Pro Glu 210 215 220 gtg gaa cag gaa ctc tct ttt cct gtt act tac cac aag tca att gaa 720 Val Glu Gln Glu Leu Ser Phe Pro Val Thr Tyr His Lys Ser Ile Glu 225 230 235 240 gaa gct ggc cgc ata gct gac ttg ttg gtt att tgc tgt cct gga aca 768 Glu Ala Gly Arg Ile Ala Asp Leu Leu Val Ile Cys Cys Pro Gly Thr 245 250 255 ccg tcc act aaa cat ttg atc aat tct gat act ttg gac aaa atg gag 816 Pro Ser Thr Lys His Leu Ile Asn Ser Asp Thr Leu Asp Lys Met Glu 260 265 270 aag caa att aga att att aat att gga cgt ggt aca gtt att gat gaa 864 Lys Gln Ile Arg Ile Ile Asn Ile Gly Arg Gly Thr Val Ile Asp Glu 275 280 285 aat gcg tta gta tgt gga tta aaa tct gac aaa gtt gcc ttt gct gct 912 Asn Ala Leu Val Cys Gly Leu Lys Ser Asp Lys Val Ala Phe Ala Ala 290 295 300 ttg gat gtg ttt gaa gaa gaa cct ttt ata cat cca ggt tta atc ggt 960 Leu Asp Val Phe Glu Glu Glu Pro Phe Ile His Pro Gly Leu Ile Gly 305 310 315 320 agg caa gat gta cat tta act cca cat att ggt tca tct aca agt gag 1008 Arg Gln Asp Val His Leu Thr Pro His Ile Gly Ser Ser Thr Ser Glu 325 330 335 ctt ttt aac tac act gca aag caa gct atg caa aat att tct acg gct 1056 Leu Phe Asn Tyr Thr Ala Lys Gln Ala Met Gln Asn Ile Ser Thr Ala 340 345 350 ttg tat aac aca aac gaa gaa atg aat ctt gta gtt tga 1095 Leu Tyr Asn Thr Asn Glu Glu Met Asn Leu Val Val 355 360 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Wickerhamia fluorescens <220> <223> conserved-1 <400> 6 ataggatttg gaagaattgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Wickerhamia fluorescens <220> <223> conserved-2 <400> 7 attaatattg gacgtggtac 20 <210> 8 <211> 20 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tcggcaaagg cacatcc 17 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 18SRT F <400> 19 accaggtcca gacacaataa gg 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer 18SRT R <400> 20 aagcagacaa atcactccac c 21 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer Nde-PPR <400> 21 gggtttcata tgaaaaagcc tcag 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> primer Xho-PPR <400> 22 ccgctcgaga actacaagat t 21 <210> 23 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> tryA gene from Escherichia coli BW2952 <220> <221> CDS <222> (1)..(1122) <400> 23 atg gtt gct gaa ttg acc gca tta cgc gat caa att gat gaa gtc gat 48 Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp 1 5 10 15 aaa gcg ctg ctg aat tta tta gcg aag cgt ctg gaa ctg gtt gct gaa 96 Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu 20 25 30 gtg ggc gag gtg aaa agc cgc ttt gga ctg cct att tat gtt ccg gag 144 Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly Leu 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gcg att gag ttg ctg gag cag ggc gat aag 1008 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys 325 330 335 cag gcg ttt att gac agt ttc cgc aag gtg gag cac tgg ttc ggc gat 1056 Gln Ala Phe Ile Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp 340 345 350 tac gca cag cgt ttt cag agt gaa agc cgc gtg tta ttg cgt cag gcg 1104 Tyr Ala Gln Arg Phe Gln Ser Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gln Ala 355 360 365 aat gac aat cgc cag taa 1122 Asn Asp Asn Arg Gln 370

Claims (13)

1. 페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산을 생성하는 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드로서,
   (a) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
   (b) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
   (c) 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 60% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
   (d) 서열번호 6, 7 또는 8로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
   (e) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
   (f) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및
   (g) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드
   로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
2. 페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산을 생성하는 페닐피루브산 환원 효소로서,
   (a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열,
   (b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열, 또는
   (c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열
   중 어느 것을 포함하는, 페닐피루브산 환원 효소.
3. 제1항에 기재된 뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
4. 제3항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
5. 제4항에 있어서, 숙주가 미생물인 형질전환체.
6. 제5항에 있어서, 상기 미생물이 대장균 또는 페닐알라닌 혹은 티로신 생산성 재조합 미생물인 형질전환체.
7. 다음의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 포함하는 페닐피루브산 환원 효소를 이용하고, 페닐피루브산 또는 4-히드록시페닐피루브산을 기질로 하여 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산을 생성시키고, 이것을 회수하는 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법:
   (a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
   (b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는
   (c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
8. 제7항에 있어서, 상기 페닐피루브산 환원 효소의 반응 조건이, 반응 온도 20∼40℃, pH 6∼7인 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.
9. 다음의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 포함하는 페닐피루브산 환원 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 미생물을 이용하여 배양하고, 미생물 기질로부터 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산을 생성시키고, 이것을 회수하는 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법:
   (a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
   (b) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는
   (c) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
10. 제9항에 있어서, 상기 미생물이, 윅커하미아속 효모 혹은 이것을 친주로 한 변이주 또는 제4항 또는 제5항에 기재된 형질전환체인 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 미생물 기질이 D-글루코오스, L-페닐알라닌, L-티로신, 페닐피루브산 및 4-히드록시페닐피루브산으로부터 선택되는 1종 이상의 기질인 것을 특징으로 하는 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.
12. 제10항에 있어서, 윅커하미아속 효모가 윅커하미아 플루오레센스(Wickerhamia fluorescens)인 D-페닐젖산 또는 D-4-히드록시페닐젖산의 제조방법.
13. 윅커하미아 플루오레센스(Wickerhamia fluorescens) TK1이라고 명명되고, FERM AP-22048로서 기탁된 미생물.

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