KR20190020121A - 히드록시티로졸을 생산하기 위한 숙주 세포 및 방법 - Google Patents

히드록시티로졸을 생산하기 위한 숙주 세포 및 방법 Download PDF

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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 (a) L-DOPA를 생산할 수 있는 제1 숙주 세포; 및 (b) L-DOPA를 히드록시티로졸(HTy)로 전환시킬 수 있는 변형된 숙주 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포 중 임의의 하나 또는 둘다는 유전적으로 변형된 숙주 세포인 조성물을 제공한다.

Description

히드록시티로졸을 생산하기 위한 숙주 세포 및 방법
관련 특허 출원
본 출원은 미국 가특허 출원 일련 번호 62/354,657(2016년 6월 24일 출원)을 우선권으로 주장하며, 이의 전문은 본원에 참고 인용된다.
정부 지원에 대한 진술
본원에 기술되고 청구되는 본 발명은 계약 번호 DE-AC02-05CH11231 하에서 미에너지국에 의해 제공된 펀드를 이용하여 이루어졌다. 미정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
본 발명의 분야
본 발명은 히드록시티로졸의 생산 분야이다.
방향족 고리의 히드록실화는 파킨슨병 치료용 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-DOPA), 벤질이소퀴놀린 알칼로이드 및 멜라토닌을 비롯한 많은 유용한 화합물의 생산에 사용되는 중요한 반응이다. 유기 용매로 금속 산화제를 자주 사용하는 화학 반응과 비교하여, 미생물에 의한 방향족 고리의 히드록실화는 높은 위치선택성 및 온화한 조건 하에서 단일 단계로 원하는 산물을 합성하는 흥미롭고 유망한 방법이다. 미생물 방향족 히드록실화는 방향족 화합물의 호기성 대사에 관여하고 주로 독성을 완화시키거나 탄소 공급원으로 사용하기 위해 유기산으로 대사시키는 분해 과정 동안 옥시게나아제 및 티로시나아제에 의해 수행된다.
티로시나아제는 산소 담체로서 헤모시아닌을 포함하는 3형 구리 단백질에 속하는 옥시도리덕타아제이다. (Olivares, 2009; Robb, 1984) 이 효소는 산화제로서 분자 산소를 사용하여 L-티로신의 다중 산화 반응을 포함하고; 제1 산화 단계는 L-티로신의 L-DOPA로의 o-히드록실화이며 가장 느린 단계로 알려져 있고, 제2 산화 단계는 o-디페놀로부터 o-퀴논을 생산하며, 이는 신속하게 진행되고 멜라닌 경로에 대한 착색 중간체인 도파크롬으로의 비효소 반응이 이어진다. 티로신의 L-DOPA로의 미생물 전환은 느린 과정이며, 오르쏘-퀴논으로의 과산화는 티로시나아제가 사용되는 경우 피하기가 어렵다. 아스코르브산 등의 환원제의 사용은 발효 브로쓰로부터 산물의 정제를 위한 더 많은 단계가 추가된다.
L-DOPA는 많은 신경전달물질의 전구체로서 사용되기 때문에 특히 동물, 및 동물 뇌의 생세포에 중요한 화합물이며, L-DOPA는 티로신 히드록실라아제(TH)와 보조인자로서의 테트라히드로비오프테린(BH4)에 의해 합성되었다. (Kappock, Chem. Rev. 1996; Fitzpatrick, Ann Rev Biochem 1999; Daubner, Arch Biochem Biophys 2011) 산화 단계 동안 프테린 보조인자의 사용은 TH 및 관련 효소, 예컨대 페닐알라닌 히드록실라아제(PAH) 및 트립토판 히드록실라아제(TPH)의 독특한 특징이며, (Pribat, J. Bacteriol. 2010) 이것은 티로시나아제에 의한 미생물 L-DOPA 생산에 있어서의 문제인 L-티로신의 o-퀴논 산물로의 과산화를 막도록 돕는다(Maass, 2003). 하지만, TH 효소의 미생물 대사 조작에의 적용은 미생물에서 보조효소 BH4의 이용불가능으로 인해 보고된 적이 없었다. BH4는 동물에서 발견되는 독특한 보조인자이며 L-DOPA 또는 관련 대사물질의 생합성에 BH4를 사용하는 박테리아계는 보고된 적이 없었다.
히드록시티로졸(HTy)은 고가치 화합물이고 고순도를 갖는 HTy의 안정적이고 지속가능한 생산에 대한 요구가 증가하고 있다. HTy는 항종양성, 항죽종형성성, 항염증성 및/또는 항혈소판 응집 물질로서 잠재적인 생물학적 기능을 가진 가장 강력한 산화방지제 중 하나이다. 이는 기능성 식품, 식이 보충제, 화장품 및 동물 사료 등의 업계에서 광범위한 범위의 잠재적 적용예를 갖는다.
현재 HTy는 화학적 또는 효소적 가수분해 후 농축된 올리브 추출물로부터 생산된다. 하지만, 이 방법은 추출물이 유사 구조를 갖는 화합물의 복잡한 혼합물이기 때문에 고순도 산물로 적용하기가 어렵다.
본 발명의 요약
본 발명은 (a) L-DOPA를 생산할 수 있는 제1 숙주 세포; 및 (b) L-DOPA에서 히드록시티로졸(HTy)로 전환시킬 수 있는 제2 숙주 세포를 포함하는 조성물로서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포 중 어느 하나 또는 둘다는 유전적으로 변형된 숙주 세포인 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제1 숙주 세포이고, 제2 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제2 숙주 세포이다.
일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR), 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD), 및 티로신 히드록실라아제(TH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DHPR, PCD 및 TH 중 하나 이상은 제1 숙주 세포에 대해 이종성이다.
일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 비조작 세포에 비해 티로신을 과생산하도록 조작되고, 제1 숙주 세포는 티로신 히드록실라아제(TH) 또는 이의 동종 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 AroG 또는 이의 임의의 동종 효소를 과발현하는 수단, 및 TyrA 또는 이의 동종 효소를 과발현하는 수단을 포함하는 피드백 저항성 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, AroG를 과발현하는 수단은 숙주 세포의 염색체에 통합되는 또는 플라스미드 상의, 숙주 세포로 도입된 하나 이상의 aroG 유전자 카피이다. 일부 실시양태에서, TyrA를 과발현하는 수단은 숙주 세포의 염색체에 통합되는 또는 플라스미드 상의, 숙주 세포로 도입된 하나 이상의 tyrA 유전자 카피이다. 일부 실시양태에서, aroG 및/또는 tyrA 유전자는 강한 구성적 프로모터로부터 전사된다. 일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 L-티로신 합성을 위한 하기 효소 또는 이의 상응한 동종 효소 중 하나 이상 또는 이들 모두를 포함한다: 포스포에놀피루베이트 신타아제(PpsA), 트랜스케톨라아제 A(TktA), DAHP 신타아제(AroG), DHQ 신타아제(AroB), DHQ 데히드라타아제(AroD), 퀴네이트/시키메이트 데히드로게나아제(YdiB), 시키메이트 데히드로게나아제(AroE), 시키메이트 키나아제 I/II(AroK/L), EPSP 신타아제(AroA), 코리스메이트 신타아제(AroC), 코리스메이트 무타아제/프레페네이트 데히드로게나아제(TyrA) 및 티로신 아미노트랜스퍼라아제(TyrB). 일부 실시양태에서, 제1 숙주 세포는 제1 숙주 세포가 M9Y 규정 배지(1% 글루코스) 중에서 성장하거나 배양된 경우 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 또는 2.6 mM 또는 그 이상의 L-티로신을 생산할 수 있도록 티로신을 과생산하도록 조작시킨다.
일부 실시양태에서, 제2 숙주 세포는 L-DOPA 데카르복실라아제(DDC), 티라민 옥시다아제(TYO), 및 알콜 데히드로게나아제(ADH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DDC, TYO 및 ADH 중 하나 이상은 제2 숙주 세포에 대해 이종성이다.
본 발명은 HTy를 생산하는 방법으로서, (a) 제1 숙주 세포를 제공하는 단계, (b) 제1 숙주 세포를 배양하여 제1 배양물을 생산하는 단계, (c) 제2 숙주 세포를 제공하는 단계, (d) 경우에 따라, 제2 숙주 세포를 배양하여 제2 배양물을 생산하는 단계, (e) 제1 및 제2 배양물을 조합 또는 혼합하여 공배양물을 함유하는 본 발명의 조성물을 생산하는 단계, 및 (f) 조성물에서 제1 및 제2 숙주 세포를 배양하여 HTy를 생산하는 단계, 및 (g) 경우에 따라, 공배양물로부터 HTy를 추출 또는 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 앞서 보고된 역가가 유의적으로 개선된 HTy를 생산하는 생산 방법을 제공한다(Satoh et al. Metabolic Engineering 14 (2012) 603-610). 일부 실시양태에서, 합성 HTy 경로의 효율성을 개선하는 네가지 대사성 및 공정 조작 접근법이 존재한다(도 1).
HTy 경로는 티로신 히드록실화 및 L-DOPA의 HTy로의 하류 전환을 위한 5개의 이종성 효소(즉, 서로에게 이종성임)를 포함한다(도 2).
본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 포함하는 산업 적용예를 위한 생물반응기 디자인을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 유전적으로 변형된 숙주 세포를 제공한다.
하기 양태 및 나머지는 첨부 도면과 함께 읽을 경우 당업자라면 예시 실시양태의 하기 설명을 쉽게 알 것이다.
도 1. 히드록시티로졸 생산자 조작 요약.
도 2. 히드록시티로졸 생산 경로. TH: 마우스 유래 합성 티로신 히드록실라아제. DDC: 돼지 유래 합성 L-DOPA 데카르복실라아제. MAO: 미크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래 클로닝 모노아민 옥시다아제.
도 3. JW1380(feaB 넉아웃), pBbE1k-TH-DHPR-PCD(탑 부분), pBbS2c-(보조인자 유전자). 배지 M9Y(1 mM L-티로신, 아스코르브산), 37 mL 플라스크 배양, OD 0.5 유도. pTrc 아래 탑 부분(IPTG): 500 μM. pTet 아래 보조인자 유전자(aTc): 40 nM. 티로신 및 아스코르브산은 유도시 보충되었음. 상청액은 6, 18, 32 또는 39, 53시간 유도 후에 LC-MS로 분석됨. 오차 막대는 삼중 생물학적 복제물로부터의 표준 편차를 나타냄.
도 4. 탑: JW1380, pBbE1k-TH-reg, pBbS1a(빈 벡터). 배지 M9Y(1 mM L-티로신), 5 mL 튜브 배양, OD 0.4 유도. pTrc 아래 탑 부분(IPTG): 500 μM. 티로신 또는 하류 화학물질은 유도시 보충됨. 상청액은 25, 42, 76시간 유도 후에 LC-MS로 분석됨. 오차 막대는 삼중 생물학적 복제물로부터의 표준 편차를 나타냄.
도 5a. 티로신으로부터의 공배양물 도식 버전 1.
도 5b. 1 mM 티로신으로부터의 공배양물의 산물 프로파일. 공배양물: 탑-folE: JW1390, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a(빈 벡터). 버텀: JW1380, pBbE2k-TYO, pBbA1a-DDC-RFP. 버텀 세포는 4시간 유도 후에 수집되고, 탑 균주와 현탁되고, 40 h 동안 추가 배양됨(총 65 h). 단일 균주: 탑-folE+DDC-TYO: JW1380, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a-DDC-TYO. 상청액은 40시간 유도 후에 LC-MS로 분석됨.
도 6a. 글루코스로부터의 공배양물 도식 버전 2.
도 6b. 5 g/L 글루코스로부터의 공배양물의 산물 프로파일. 탑: DK176, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a(빈 벡터). 버텀: JW1380, pBbE2k-TYO, pBbA1a-DDC-RFP. 배지 M9Y(5 g/L 글루코스), 10 mL 플라스크 배양, OD 0.4 유도.
도 7a. HTy 생산을 위한 공배양물 도식(티로신 유래).
도 7b. 산물 프로파일(단일 균주 배양물 vs 공배양물). 탑+버텀(단일 균주): JW1380, pBbE1k-TH-reg, pBbS1a-DDC-TYO. 탑-folE+버텀(단일 균주): JW1380, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a-DDC-TYO. 탑: JW1380, pBbE1k-TH-reg, pBbS1a(빈 벡터). 탑: JW1380, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a(빈 벡터). 버텀 A: JW1380, pBbE2k-TYO, pBbA1a-DDC-RFP. 버텀 B: JW1380, pBbS1a-DDC-TYO, pBbE1k(빈 벡터). 배지 M9Y(1 mM L-티로신), 5 mL 튜브 배양, OD 0.4 유도. pTrc 아래 탑 부분(IPTG): 500 μM. 티로신은 유도시 보충됨. 상청액은 73시간 유도 후에 LC-MS로 분석됨. 오차 막대는 삼중 생물학적 복제물로부터의 표준 편차를 나타냄.
도 8a. 공배양물 도식(글루코스 유래).
도 8b. 글루코스로부터의 공배양물에서의 HTy 생산. 탑: DK176, pBbE1k-TH-reg-folE, pBbS1a(빈 벡터). 버텀 A: JW1380, pBbE2k-TYO, pBbA1a-DDC-RFP. 배지 M9Y(5 g/L 글루코스). 오차 막대는 삼중 생물학적 복제물로부터의 표준 편차를 나타냄.
도 8c. 에틸 아세테이트에 의한 추출로 단순화된 산물 프로파일. 각 시점에 상청액은 에틸 아세테이트 추출로 정제됨.
도 9. 산업 공정의 개략도.
본 발명의 상세한 설명
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 달리 제시되지 않는 한, 본 발명은 특정 서열, 발현 벡터, 효소, 숙주 미생물 또는 과정으로 제한되지 않으며 이에 따라 다양할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 목적이며 제한을 의도로 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에 달리 명확하게 제시하지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "발현 벡터"에 대한 언급은 단일 발현 벡터와 더불어 동일(예, 동일 오페론) 또는 상이한 복수의 발현 벡터를 포함하고; "세포"에 대한 언급은 단일 세포와 더불어 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 규정되는 다수의 용어가 참조된다:
본원에 사용된 용어 "임의의" 또는 "경우에 따라"는 후술된 특징부 또는 구조가 존재하거나 존재하지 않을 수 있거나, 또는 후술된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있고, 설명은 특정 특징부 또는 구조가 존재하는 경우 및 그 특징부 또는 구조가 부재하는 경우, 또는 사건 또는 상황이 일어나거나 그렇지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "숙주 세포" 및 "숙주 미생물"은 본원에서 상호혼용되며, 발현 벡터의 삽입을 통해 형질전환될 수 있는 생물학적 생세포, 예컨대 미생물을 나타낸다. 따라서, 본원에 기술된 숙주 유기체 또는 세포는 원핵 유기체(예, 유박테리아계의 유기체) 또는 진핵 세포일 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 원핵 세포는 막 결합 핵이 없지만, 진핵 세포는 막 결합 핵을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "이종 DNA"는 핵산의 폴리머를 나타내고, 하기 중 적어도 하나에 해당한다: (a) 핵산 서열이 제시된 숙주 미생물에 대해 외래인 것(즉, 상기 미생물에서 천연 발생하지 않는 것); (b) 서열이 제시된 숙주 미생물에서 천연 발생할 수 있지만, 비정상적인 (예, 기대한 것보다 더 많은) 양; 또는 (c) 핵산 서열이 천연적으로 서로 동일한 관계로 발생하지 않는 둘 이상의 서열을 포함함. 예를 들면, (c) 경우와 관련하여, 재조합 생산된 이종 핵산 서열은 새로운 기능적 핵산을 만들도록 배열된 비관련 유전자로부터 둘 이상의 서열을 갖는다. 구체적으로는, 본 발명은 발현 벡터의 숙주 미생물 내로의 도입을 기술하고, 여기서 발현 벡터는 숙주 미생물에서 정상적으로 발생하지 않는 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 숙주 미생물의 게놈과 관련하여, 이후 효소를 코딩하는 핵산 서열은 이종성이다.
용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 숙주 미생물을 형질도입시키거나, 형질전환시키거나, 또는 감염시켜, 세포가 세포에 고유한 것 이외의, 또는 세포에 고유하지 않은 방식으로 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 유도하는 화합물 및/또는 조성물을 나타낸다. "발현 벡터"는 숙주 미생물에 의해 발현시키고자 하는 핵산 서열(통상, RNA 또는 DNA)을 함유한다. 경우에 따라, 발현 벡터는 또한 핵산의 숙주 미생물 내로의 진입 달성을 돕는 물질, 예컨대 바이러스, 리포솜, 단백질 코팅 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하기로 고려된 발현 벡터는 핵산 서열이 임의의 바람직하거나 요구되는 작동 요소와 함께 삽입될 수 있는 것을 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 숙주 미생물 내로 전달되고 내부에서 복제될 수 있는 것이어야 한다. 바람직한 발현 벡터는 플라스미드, 특히 잘 입증되었고 핵산 서열의 전사에 바람직하거나 필요한 작동 요소를 함유하는 제한 부위를 갖는 것이다. 이러한 플라스미드와, 다른 발현 벡터는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "형질도입하다"는 숙주 미생물 또는 세포 내로의 핵산 서열의 전달을 나타낸다. 핵산 서열이 세포에 의해 안정하게 복제된 경우에만 숙주 미생물 또는 세포가 "형질전환"된다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, "형질전환"은 세포 게놈 내 핵산 서열의 통합, 즉 염색체 통합에 의해 , 또는 염색체외 통합에 의해 일어날 수 있다. 대조적으로, 발현 벡터, 예컨대 바이러스는, 숙주 미생물을 형질도입시키고, 복제시키고, (임의의 상보성 바이러스 또는 벡터의 이득 없이) 원래의 형질도입 발현 벡터와 동일한 유형의 자손 발현 벡터, 예컨대 바이러스를 다른 미생물로 전파시키는 경우에, "감염성"이며, 여기서 자손 발현 벡터는 동일한 재현 능력을 보유한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 서열", "핵산 서열" 및 이의 변이체는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 비뉴클레오티드 골격을 함유한 다른 폴리머에 대해 포괄적이어야 하며, 단 폴리머는 DNA 및 RNA에서 발견되는 것처럼 염기쌍 및 염기 중첩을 허용하는 배열의 핵염기를 함유한다. 따라서, 이러한 용어는 공지된 유형의 핵산 서열 변형, 예컨대 천연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상을 유사체로 대체; 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 미하전된 연결(예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카르바메이트 등), 음으로 하전된 연결(예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 및 양으로 하전된 연결(예, 아미노알킬포스포라미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르)에 의한 것 등; 펜던트 모이어티를 함유한 것, 예컨대 단백질(뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등을 포함) 등; 인터칼레이터(예, 아크리딘, 소랄렌 등)를 갖는 것; 및 킬레이터(예, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유한 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 기호는 IUPAC-IUB 생화학 명칭위원회에 의해 권장되는 것이다(Biochem. 9:4022, 1970).
용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예, 프로모터)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 나타내고, 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응한 핵산의 전사를 지정한다.
일부 실시양태에서, 방법은 외인성으로 제공된 티로신, 또는 적당한 탄소 공급원으로 유전적으로 변형된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 방법이 유전적으로 변형된 숙주 세포를 적당한 탄소 공급원으로 배양하는 단계를 포함하는 경우, 유전적으로 변형된 숙주 세포는 숙주 세포 내 하나 이상의 핵산 상에 위치하는 고유의 생합성 경로 또는 이종 생합성 경로를 사용하여 티로신을 합성할 수 있고, 여기서 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 벡터 상에 있거나 또는 숙주 세포 염색체 내로 안정하게 통합된다. 적당한 탄소 공급원은 숙주 세포가 섭취 및 대사가 가능한 것이다. 이러한 탄소 공급원은 제한없이 당류, 예컨대 단당류, 예를 들어 글루코스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 방향족 아미노산의 산화를 촉진할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 구성체를 유전적으로 변형된 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 (b) 효소가 숙주 세포에서 발현되기에 적당한 조건 하에서 유전적으로 변형된 숙주 세포를 배양하고, 그 배양은 원하는 산물을 생산하는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 유도하는 것인 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 효소는 L-DOPA, 도파민, 3,4-디히드록시페닐아세트알데히드, 3,4-디히드록시페닐에탄올(히드록시티로졸), 레티쿨린, 테바인, 및/또는 모르핀으로의 티로신의 산화를 촉진할 수 있으며, 숙주 세포의 배양은 L-DOPA, 도파민, 3,4-디히드록시페닐아세트알데히드, 3,4-디히드록시페닐에탄올(히드록시티로졸), 레티쿨린, 테바인, 및/또는 모르핀을 생산하는 숙주 세포를 유도한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 티로신 생합성 경로의 고유의 효소, 또는 숙주 세포 내로 도입된 이종 티로신 생합성 경로에 의해 티로신을 내생적으로 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 티로신 생합성 경로는 하기 효소 또는 이의 임의의 상응한 동종 효소 중 하나 이상을 포함한다: PpsA, TktA, AroG, AroB, AroD, YdiB, AroE, AroK/L, AroA, AroC, TyrA 및 TyrB. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 AroB 및/또는 TyrA, 또는 이의 임의의 상응한 동종 효소를 과생산한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 TH, DDC, MAO, 및/또는 알콜 데히드로게나아제, 또는 이의 동종 효소를 포함하거나 발현할 수 있고, 효소 중 하나 이상은 비변형된 숙주 세포에 비해 과생산되거나 또는 효소 중 하나 이상은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 티로신 생합성 경로의 고유의 효소, 또는 숙주 세포 내로 도입된 이종 티로신 생합성 경로에 의해 티로신을 내생적으로 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이종 TH(예, 마우스 TH), 이종 DDC(예, 돼지 DDC), 및/또는 이종 MAO(예, 엠. 루테우스 MAO), 또는 이의 동종 효소를 포함하거나 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 천연적으로 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제를 3,4-디히드록시페닐 아세테이트(3,4-DHPA) 내로 촉진할 수 있는 효소, 예컨대 효소 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 효소의 발현을 감소시킨다. 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 경우, 효소는 feaB 유전자에 의해 코딩된 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제이다. 감소된 발현은 발현을 감소시키거나 효소의 효소 활성을 감소시키는 돌연변이의 결과일 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는 절두된 또는 결실된 유전자, 예컨대 넉아웃 돌연변이이다.
숙주 세포가 MH4를 합성하게 하는 하나의 수단은 숙주 세포가 효소 GTP 시클로히드롤라아제 I(folE), folX, P-ase, 및 folM, 또는 이의 동종 효소를 포함하도록 하는 것이다.
티로신 히드록실라아제는 티로신 및 트립토판을 각각 L-DOPA 및 5-히드록시-트립토판으로 촉매작용시키는 데 테트라히드로비오프테린(BH4) 또는 MH4를 사용하는 효소이다. 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD) 및 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR)는 BH4 재생 반응을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포가 티로신 히드록실라아제(TH)를 포함하는 경우, 숙주 세포는 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD) 또는 이의 동종 효소, 및 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR) 또는 이의 동종 효소를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포가 BH4를 천연 합성하지 않는 경우, 숙주 세포는 GTP 시클로히드롤라아제 I(folE), 6-피루보일-테트라히드로프테린 신타아제(PTPS), 및 세피아프테린 리덕타아제(SR), 또는 이의 하나 이상의 동종 효소를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 생산된 하나 이상의 산화 산물을 회수하는 단계를 추가로 포함하고, 회수 단계는 배양 단계에 병행 또는 후속된다.
효소, 및 이의 코딩 핵산
동종 효소 본 명세서 또는 인용 문헌에 기술된 효소 중 임의의 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 펩티드 서열을 갖는 효소이다. 동종 효소는 효소에 보존되어 있는 것으로 인식되는 아미노산 잔기를 보유한다. 동종 효소는 상이한 아미노산으로 치환되거나 발견되는 비보존된 아미노산 잔기, 또는 동종 효소의 효소 활성에 영향을 미치지 않거나 무의미한 효과를 갖는 삽입 또는 결실된 아미노산(들)을 가질 수 있다. 동종 효소는 본 명세서 또는 인용 문헌에 기술된 효소 중 임의의 하나의 효소 활성과 동일하거나 실질적으로 동일한 효소 활성을 갖는다. 동종 효소는 천연적으로 발견되거나 이의 조작된 돌연변이체일 수 있다.
적당한 티로신 히드록실라아제 또는 티로신 3-모노옥시게나아제는 하기 아미노산 서열을 갖는 마우스 티로신 히드록실라아제(NP_033403) 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00001
적당한 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD)는 하기 아미노산 서열을 갖는 인간 PCD(NP_000272) 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00002
적당한 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR)는 하기 아미노산 서열을 갖는 인간 DHPR(P09417) 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00003
적당한 L-DOPA 데카르복실라아제(DDC)는 하기 뉴클레오티드(서열번호 4) 및 아미노산(서열번호 5) 서열을 갖는 돼지 DDC 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00004
Figure pct00005
적당한 모노아민 옥시다아제(MAO)는 하기 아미노산 서열을 갖는 미크로코쿠스 루테우스 MAO(ACS30544.1) 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00006
적당한 AroG는 하기 아미노산 서열을 갖는 이. 콜라이 AroG 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00007
적당한 TyrA는 하기 아미노산 서열을 갖는 이. 콜라이 TyrA 또는 이의 동종 효소이다:
Figure pct00008
본 발명의 핵산 구성체는 대상자 효소 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 대상자 효소의 핵산은 적당한 조건 하에서 배양된 숙주 세포에서 대상자 효소가 발현되도록 프로모터 및 경우에 따라 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 프로모터 및 제어 서열은 각 숙주 세포 종에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 핵산 구성체를 포함한다. 핵산 구성체 및 발현 벡터를 디자인하고 제작하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
대상자 효소를 코딩하는 핵산 서열은 직접 화학 합성 또는 클로닝 등을 포함한 당업자에게 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 제조된다. 직접 화학 합성의 경우, 핵산의 폴리머의 형성은 통상 3'-차단 및 5'-차단 뉴클레오티드 모노머의, 성장하는 뉴클레오티드 쇄의 말단 5'-히드록실 기에 대한 순차 첨가를 수반하고, 각 첨가는 통상 인 유도체, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포라미다이트 등인 첨가된 모노머의 3'-위치 상에 성장하는 쇄의 말단 5'-히드록실 기의 친핵성 공격에 의해 영향을 받는다. 이러한 방법론은 당업자에게 공지되어 있고 관련 텍스트 및 문헌에 기술되어 있다(예, Matteuci et al. (1980) Tet. Lett. 521:719; 미국 특허 번호 4,500,707; 5,436,327; 및 5,700,637). 또한, 기술된 서열은, 적절한 제한 효소를 사용하여 DNA를 분할하는 단계, 겔 전기영동을 사용하여 단편을 분리하는 단계, 및 이후 당업자에게 공지된 기법, 예컨대 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR; 예, 미국 특허 번호 4,683,195)의 이용을 통해 겔로부터 원하는 핵산 서열을 회수하는 단계에 의해 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다.
원하는 대상자 효소를 코딩하는 각 핵산 서열은 발현 벡터 내에 통합될 수 있다. 개별 핵산 서열의 통합은, 예를 들어 발현 벡터, 예컨대 플라스미드의 특정 부위를 절단하는 제한 효소(예, BamHI, EcoRI, HhaI, Xhol, XmaI 등)의 사용을 포함하는 기존 방법을 통해 달성될 수 있다. 제한 효소는 절단된 발현 벡터의 말단에 서열 상보성을 갖는 말단을 갖거나 말단을 갖도록 합성되는 핵산 서열로 어닐링될 수 있는 단일 가닥 말단을 생산한다. 어닐링은 DNA 리가아제 등의 적절한 효소를 사용하여 수행된다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 발현 벡터와 원하는 핵산 서열은 둘다 종종 동일 제한 효소로 절단되어, 발현 벡터의 말단과 핵산 서열의 말단이 서로 상보성이 있는 것을 보장한다. 또한, DNA 링커는 핵산 서열의 발현 벡터로의 연결을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.
일련의 개별 핵산 서열은 또한 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 조합될 수도 있다(예, 미국 특허 번호 4,683,195).
예를 들면, 각각의 원하는 핵산 서열은 별도의 PCR에서 초기에 생성될 수 있다. 이후, 특정 프라이머는 PCR 산물의 말단이 상보성 서열을 함유하도록 디자인된다. PCR 산물이 혼합되고, 변성되고, 재어닐링되는 경우, 3' 말단에 대응 서열을 갖는 가닥은 중첩되고 서로 프라이머로서 작용할 수 있다. DNA 폴리머라아제에 의한 이러한 중첩의 연장은 원래의 서열이 함께 "접합된" 분자를 생산한다. 이러한 방식으로, 일련의 개별 핵산 서열은 함께 "접합되고", 이어서 동시에 숙주 미생물로 형질도입될 수 있다. 따라서, 각각의 복수의 핵산 서열의 발현이 실시된다.
개별 핵산 서열 또는 "접합된" 핵산 서열은 이후 발현 벡터로 통합된다. 본 발명은 핵산 서열이 발현 벡터로 통합되는 과정과 관련하여 비제한적이다. 당업자라면 핵산 서열의 발현 벡터로 통합시키는 데 필요한 단계에 익숙하다. 통상의 발현 벡터는, 리보솜 결합 부위, 예컨대 3-9개의 뉴클레오티드 길이이고, 이. 콜라이에서 개시 코돈의 상류에서 3-11개의 뉴클레오티드에 위치한 뉴클레오티드 서열과 함께 하나 이상의 조절 영역이 선행되는 원하는 핵산 서열을 함유한다. 문헌[Shine et al. (1975) Nature 254:34 and Steitz, in Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, N.Y] 참조.
조절 영역은, 예를 들어 프로모터 및 오퍼레이터를 함유하는 영역을 포함한다. 프로모터는 원하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어, RNA 폴리머라아제 효소를 통해 핵산 서열의 전사를 개시한다. 오퍼레이터는 억제 단백질이 결합할 수 있는 단백질 결합 도메인을 함유하는 프로모터에 인접한 핵산 서열이다. 억제 단백질의 부재 하에, 전사는 프로모터를 통해 개시된다. 존재하는 경우, 오퍼레이터의 단백질 결합 도메인에 특이적인 억제 단백질은 오퍼레이터에 결합되어, 전사를 개시한다. 이러한 방식으로, 전사의 제어가 달성되고, 사용되는 특정 조절 영역 및 상응한 억제 단백질의 존재 또는 부재를 기반으로 달성된다. 예시로 락토즈 프로모터(LacI 억제 단백질은 락토즈와 접촉시 배좌가 변화되어, LacI 억제 단백질이 오퍼레이터에 대한 결합을 방지함)를 포함한다. 또다른 예시는 tac 프로모터이다. (문헌[deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25.] 참조) 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 상기 및 다른 발현 벡터는 본 발명에 사용될 수 있고, 본 발명은 이와 관련하여 비제한적이다.
임의의 적당한 발현 벡터가 원하는 서열을 통합시키는 데 사용될 수 있지만, 용이하게 이용가능한 발현 벡터는 제한없이 플라스미드, 예컨대 pSC101, pBR322, pBBR1MCS-3, pUR, pEX, pMR100, pCR4, pBAD24, pUC19; 박테리오파지, 예컨대 M13 파지 및 λ 파지를 포함한다. 물론, 이러한 발현 벡터는 특정 숙주 세포에만 적당할 수 있다. 하지만, 당업자라면 임의의 특정 발현 벡터가 임의의 제시된 숙주 세포에 적합한지 여부는 일상 실험을 통해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 숙주 세포 내에 도입될 수 있고, 이후 벡터에 함유된 서열의 생존력 및 발현을 모니터링한다. 또한, 발현 벡터 및 임의의 특정 숙주 세포에 대한 적합성을 기술하는 관련 텍스트 및 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입 또는 전달되어야 한다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 전달하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 이. 콜라이를 발현 벡터로 형질전환시키는 한 방법은 염화칼슘 처리를 수반하고, 여기서 발현 벡터는 칼슘 침전물을 통해 도입된다. 다른 염, 예컨대 인산칼슘은 또한 유사한 절차 후에 사용될 수도 있다. 또한, 전기천공법(즉, 세포의 핵산 서열에 대한 투과성을 증가시키기 위한 전류 인가)은 숙주 미생물을 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 핵산 서열분석기의 현미주입은 숙주 미생물을 형질감염시키는 능력을 제공한다. 지질 복합체, 리포솜 및 덴드리머 등의 다른 수단도 또한 사용될 수 있다. 당업자라면 상기 또는 다른 방법을 사용하여 원하는 서열로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다.
형질감염된 숙주 세포를 동정하기 위해, 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들면, 잠재적으로 형질감염된 숙주 세포의 배양물을, 적당한 희석액을 사용하여, 개별 세포 내로 분리시킨 후, 개별적으로 성잘시키고 원하는 핵산 서열의 발현을 테스트할 수 있다. 또한, 플라스미드가 사용되는 경우, 종종 사용되는 실시는 발현 벡터 내 의도적으로 함유된 유전자, 예컨대 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항미생물 저항성을 기반으로 세포의 선택을 수반한다.
숙주 세포는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질전환된다. (중간체 첨가 없이) 단일 발현 벡터만이 사용되는 경우, 벡터에는 필요한 모든 핵산 서열이 함유된다.
일단 숙주 세포가 발현 벡터로 형질전환되면, 숙주 세포를 성장시킬 수 있다. 미생물 숙주의 경우, 이 과정은 적당한 배지에서 세포를 배양하는 것을 수반한다. 중간체가 도입되지 않는 경우, 배양 배지가 과량의 탄소 공급원, 예컨대 당류(예, 글루코스)를 함유하는 것이 중요하다. 이러한 방식으로, 방향족 아미노산의 세포 생산이 보장된다. 첨가되는 경우, 중간체는 배양 배지에서 과량으로 존재한다.
숙주 세포가 성장 및/또는 증식함에 따라, 산화 산물(들)을 생산하는 데 필요한 효소의 발현이 영향을 받는다. 일단 발현되면, 효소는 경우에 따라 방향족 아미노산 생산, BH4 생산, 및 산화 산물 생산의 단계를 수행하는 데 필요한 단계를 촉매화한다. 중간체가 도입된 경우, 발현된 효소는 중간체를 각 산화 산물로 전환시키는 데 필요한 단계를 촉매화한다. 숙주 세포로부터 산화 산물을 회수하는 임의의 수단이 사용될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포를 수확하고 저장성 조건으로 처리하여 세포를 용해시킬 수 있다. 이후 용해물을 원심분리하고 상청액을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 기체 크로마토그래피(GC)로 처리할 수 있다. 일단 산화 산물이 회수되면, 필요에 따라 산화 산물 상에 변형을 수행할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 숙주 세포는 이종 핵산이 숙주 세포 내로 도입되어 유전적으로 변형된 것이므로, 유전적으로 변형된 숙주 세포는 천연적으로 발생되지 않는다. 적당한 숙주 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 효소를 코딩하는 핵산 구성체를 발현할 수 있는 것이다. 효소(들)를 코딩하는 유전자(들)는 숙주 세포에 이종성일 수 있거나 또는 유전자는 숙주 세포에 고유할 수 있지만 숙주 세포에서 유전자의 더 많은 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 영역 및 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
효소는 숙주 세포에 대해 고유하거나 이종성일 수 있다. 효소가 숙주 세포에 고유한 경우, 숙주 세포는 유전적으로 변형되어 효소의 발현을 조절한다. 이러한 변형은 숙주 세포에서 효소를 코딩하는 염색체 유전자의 변형을 수반할 수 있거나 또는 효소의 유전자를 코딩하는 핵산 구성체는 숙주 세포 내로 도입된다. 변형의 효과 중 하나는 효소의 발현이 숙주 세포에서 조절되는 것이며, 예를 들면 비변형된 숙주 세포에서의 효소의 발현에 비해 숙주 세포에서의 효소의 발현이 증가된다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 천연적으로 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제를 3,4-디히드록시페닐 아세테이트(3,4-DHPA)로 할 수 있는 효소, 예컨대 효소 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 숙주 세포는 효소의 발현을 감소시킨다. 숙주 세포가 이. 콜라이인 경우, 효소는 feaB 유전자에 의해 코딩되는 페닐아세트알데히드 데히드로게나아제이다. 감소된 발현은 발현을 감소시키거나 효소의 효소 활성을 감소시키는 돌연변이의 결과일 수 있다. 이러한 돌연변이의 예시는 절두 또는 결실된 유전자, 예컨대 넉아웃 돌연변이이다.
임의의 원핵 또는 진핵 숙주 세포는 핵산 서열로 형질전환된 후 살아남을 수 있는 한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 숙주 미생물은 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 그람 음성 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 프로테오박테리아 문의 것이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 감마프로테오박테리아 강의 것이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 엔테로박테리아레스 목의 것이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 엔테로박테리아세애 과의 것이다. 박테리아 숙주 세포의 예시는, 제한없이, 에스케리치아, 엔테로박터, 아조토박터, 에르위니아, 바실루스, 슈도모나스, 클레브시엘리아, 프로테우스, 살모넬라, 세라티아, 시겔라, 리조비아, 비트레오실라, 및 파라코쿠스 분류학적 부류로 할당되는 종을 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 필요한 핵산 서열의 형질도입, 단백질(즉, 효소)의 후속 발현, 또는 메발로네이트 경로와 연관된 단계를 수행하는 데 필요한 최종 중간체에 의해 악영향을 받지 않는다. 예를 들면, 숙주 세포 자신의 대사 과정과 메발로네이트 경로와 연관된 과정 사이에는 최소한의 "혼선"(즉, 간섭)이 일어나는 것이 바람직하다. 적당한 진핵 세포는 제한없이 진균, 곤충 또는 포유류 세포를 포함한다. 적당한 진균 세포는 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모 세포이다.
본 발명은 그 바람직한 특정 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 상기 설명은 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 한 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명의 범위 내 다른 양태, 장점 및 변형은 본 발명이 속한 업계의 당업자에게 자명하다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 그 전문이 본원에 참고 인용된다.
본 발명이 기술되었지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
에스케리치아 콜라이에서의 히드록시티로졸 생산의 조작
히드록시티로졸(HTy)은 기능성 식품, 식이 보충제, 화장품 및 동물 사료 등의 업계에서 잠재적 적용예를 갖는 가장 강력한 산화방지제 중 하나이다. 합성 경로로 HTy를 생산할 수 있는 조작된 이. 콜라이는 종래 보고된 5가지 이종 유전자로 이루어진다. 본원에는 합성 HTy 경로의 효능을 개선시키기 위한 3가지 대사성 조작 노력이 기술된다.
우선, 티로신 히드록실화를 위한 보조인자 생합성 경로가 조작된다. 다음으로, 하류 화학물질에 의한 티로신 히드록실화의 억제가 확인되며 이를 극복하도록 디자인된 공배양물 전략이 적용된다. 이러한 조작에 의해, 티로신 유래 산물 수율은 약 3배 개선된다.
마지막으로, 숙주 균주는 티로신을 과생산하도록 조작된다. 티로신의 임의의 외부 보충 없이 글루코스로부터의 L-DOPA의 생산이 확인되고, 생성된 L-DOPA는 종래 결과와 25배 개선된 공배양물 전략에 의해 추가로 HTy로 전환된다.
미생물 HTy 생산 과정은 산업화에 대한 잠재성을 갖도록 조작된다. 현재, HTy는 화학적 또는 효소 가수분해 후 농축된 올리브 추출물로부터 생산된다. 안정적이고 지속가능한 생산에 대한 수요가 증가하고 있으며, 본 발명자들은 미생물 발효가 유망한 해결책일 수 있다고 여기고 있다.
도 3에는 티로신 히드록실화를 위해 조작된 보조인자 생합성 경로가 도시된다. 도 3에는 FolE 도입이 티로신으로부터의 L-DOPA 생산을 2배 증가시키는 것이 도시된다. 하류 화합물에 의한 티로신 히드록실화의 억제는 확인된다(도 4). 도 4에는 TH가 히드록시티로졸 및 도파민에 의해 억제되는 것이 도시된다. 공배양물 전략을 적용함으로써, 하류 화합물에 의한 티로신 히드록실화의 억제가 극복되고, 티로신으로부터의 산물 수율은 약 3배 이상 개선된다(도 5). 경로 효소의 유전자 발현은 대사체 및 프로테옴 데이타를 사용하여 최적화된다. 숙주 균주는 티로신을 과생산하도록 조작된다. 이러한 변형에 의해, 글루코스로부터의 산물은 공배양물 전략을 사용하여 약 10배 이상 개선된다(도 6). HTy 생산은 도 7a 및 7b에 도시된 공배양물 전략에 의해 3배 이상 증가된다. 도 8a 내지 8c에는 고순도 HTy가 글루코스로부터 얻어질 수 있는 것이 도시된다.
이러한 연구는 미생물 HTy 생산의 잠재적 산업 적용예를 입증하고 방향족 아미노산의 히드록실화를 포함하는 광범위한 범위의 화학물질의 생산을 위한 우수한 재생가능한 미생물 플랫폼을 제공한다. 하기 표 1에서는 종래 보고된 히드록시티로졸 수율(Satoh et al. Metabolic Engineering 14 (2012) 603-610)과 본원에 보고된 히드록시티로졸 수율을 비교한다.
Figure pct00009
실시예 2
에스케리치아 콜라이 L-티로신 과생산자의 조작
균주를 생산하는 일부 히드록시티로졸의 경우, L-티로신 과생산자가 요구된다. 티로신 생산자를 위한 모듈 시스템이 이용가능하지만(Juminaga et al., 2012), 이 시스템은 이미 2개의 플라스미드를 이용하므로, 다른 모듈과 조합되기가 어렵다. 티로신 생합성을 위해 완전한 경로를 통합하는 대신, L-티로신 과생산자는 이. 콜라이 MG1655의 pykF 좌위(DE3)에서 피드백 저항성 돌연변이체 tyrA 및 aroG를 통합시킴으로써 구성된다. AroG는 시키메이트 경로의 입구에 위치하며 tyrA는 티로신 합성을 위한 시키메이트 경로의 가장 마지막 반응에 위치한다. 이러한 두 유전자는 티로신 합성의 첫번째 및 두번째 제한 반응인 것으로 공지되어 있으므로, 이러한 두 유전자를 강화시키는 것은 티로신 과생산 균주를 만들기에 우수한 전략이다. DK176으로 명명된 균주는 aroG 및 tyrA 유전자를 모 균주 내로 도입시킴으로써 구성된다. DK176 균주가 M9Y 배지(1% 글루코스)에서 배양되는 경우, 2.68 mM 수율의 L-티로신을 실현하며, 이는 L-티로신 생산에 있어 유의적인 개선이다.
본 발명은 이의 특정 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 당업자라면 본 발명의 진정한 취지 및 범위로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변경을 가할 수 있고 균등물로 대체될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 특정 상황, 물질, 물질 조성, 과정, 공정 단계(들)를 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 부합시키기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 그러한 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (24)

  1. (a) L-DOPA를 생산할 수 있는 제1 숙주 세포; 및 (b) L-DOPA를 히드록시티로졸(HTy)로 전환시킬 수 있는 제2 숙주 세포를 포함하는 조성물로서, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포 중 임의의 하나 또는 둘다는 유전적으로 변형된 숙주 세포인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제1 숙주 세포이고, 제2 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제2 숙주 세포인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포는 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR), 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD), 및 티로신 히드록실라아제(TH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, DHPR, PCD 및 TH 중 하나 이상은 제1 숙주 세포에 대해 이종성인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 제1 숙주 세포는 비조작 세포에 비해 티로신을 과생산하도록 조작되고, 제1 숙주 세포는 티로신 히드록실라아제(TH) 또는 이의 동종 효소를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 제1 숙주 세포는 AroG 또는 이의 동종 효소, 및/또는 TyrA 또는 이의 동종 효소를 과발현하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 제1 숙주 세포는 L-티로신의 합성을 위한 하기 효소 또는 이의 상응한 동종 효소 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함하는 것인 조성물: 포스포에놀피루베이트 신타아제(PpsA), 트랜스케톨라아제 A(TktA), DAHP 신타아제(AroG), DHQ 신타아제(AroB), DHQ 데히드라타아제(AroD), 퀴네이트/시키메이트 데히드로게나아제(YdiB), 시키메이트 데히드로게나아제(AroE), 시키메이트 키나아제 I/II(AroK/L), EPSP 신타아제(AroA), 코리스메이트 신타아제(AroC), 코리스메이트 무타아제/프레페네이트 데히드로게나아제(TyrA) 및 티로신 아미노트랜스퍼라아제(TyrB).
  8. 제7항에 있어서, PpsA, TktA, AroG, AroB, AroD, YdiB, AroE, AroK/L, AroA, AroC, TyrA 및 TyrB 중 하나 이상은 제1 숙주 세포에 대해 이종성인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 제1 숙주 세포는, 제1 숙주 세포를 M9Y 규정 배지(1% 글루코스)에서 성장시키거나 배양하는 경우, 2.0 mM 이상의 L-티로신을 생산할 수 있는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 제1 숙주 세포는, 제1 숙주 세포를 M9Y 규정 배지(1% 글루코스)에서 성장시키거나 배양하는 경우 2.6 mM 이상의 L-티로신을 생산할 수 있는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 제2 숙주 세포는 L-DOPA 데카르복실라아제(DDC), 티라민 옥시다아제(TYO), 및 알콜 데히드로게나아제(ADH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함하는 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서, DDC, TYO 및 ADH 중 하나 이상은 제2 숙주 세포에 대해 이종성인 조성물.
  13. 히드록시티로졸(HTy)을 생산하는 방법으로서,
    (a) L-DOPA를 생산할 수 있는 제1 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제1 숙주 세포를 배양하여 제1 배양물을 생산하는 단계;
    (c) L-DOPA를 히드록시티로졸(HTy)로 전환시킬 수 있는 제2 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (d) 제2 숙주 세포를 배양하여 제2 배양물을 생산하는 단계;
    (e) 제1 및 제2 배양물을 조합 또는 혼합하여 공배양물을 생산하는 단계;
    (f) 그 조성물에서 제1 및 제2 숙주 세포를 배양하여 HTy를 생산하는 단계; 및
    (g) 경우에 따라, 공배양물로부터 HTy를 추출 또는 분리하는 단계
    를 포함하고, 제1 숙주 세포 및 제2 숙주 세포 중 임의의 하나 또는 둘다는 유전적으로 변형된 숙주 세포인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제1 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제1 숙주 세포이고, 제2 숙주 세포는 유전적으로 변형된 제2 숙주 세포인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 제1 숙주 세포는 디히드로프테리딘 리덕타아제(DHPR), 프테린-4-알파-카르비놀아민 데히드라타아제(PCD), 및 티로신 히드록실라아제(TH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, DHPR, PCD 및 TH 중 하나 이상은 제1 숙주 세포에 대해 이종성인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 제1 숙주 세포는 비조작 세포에 비해 티로신을 과생산하도록 조작되고, 제1 숙주 세포는 티로신 히드록실라아제(TH) 또는 이의 동종 효소를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제1 숙주 세포는 AroG 또는 이의 동종 효소, 및/또는 TyrA 또는 이의 동종 효소를 과발현하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 숙주 세포는 L-티로신의 합성을 위한 하기 효소 또는 이의 상응한 동종 효소 중 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함하는 것인 방법: 포스포에놀피루베이트 신타아제(PpsA), 트랜스케톨라아제 A(TktA), DAHP 신타아제(AroG), DHQ 신타아제(AroB), DHQ 데히드라타아제(AroD), 퀴네이트/시키메이트 데히드로게나아제(YdiB), 시키메이트 데히드로게나아제(AroE), 시키메이트 키나아제 I/II(AroK/L), EPSP 신타아제(AroA), 코리스메이트 신타아제(AroC), 코리스메이트 무타아제/프레페네이트 데히드로게나아제(TyrA) 및 티로신 아미노트랜스퍼라아제(TyrB).
  20. 제19항에 있어서, PpsA, TktA, AroG, AroB, AroD, YdiB, AroE, AroK/L, AroA, AroC, TyrA 및 TyrB 중 하나 이상은 제1 숙주 세포에 대해 이종성인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제1 숙주 세포는, 제1 숙주 세포를 M9Y 규정 배지(1% 글루코스)에서 성장시키거나 배양하는 경우, 2.0 mM 이상의 L-티로신을 생산할 수 있는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 숙주 세포는, 제1 숙주 세포를 M9Y 규정 배지(1% 글루코스)에서 성장시키거나 배양하는 경우, 2.6 mM 이상의 L-티로신을 생산할 수 있는 것인 방법.
  23. 제13항에 있어서, 제2 숙주 세포는 L-DOPA 데카르복실라아제(DDC), 티라민 옥시다아제(TYO), 및 알콜 데히드로게나아제(ADH), 또는 이의 임의의 동종 효소를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, DDC, TYO 및 ADH 중 하나 이상은 제2 숙주 세포에 대해 이종성인 방법.
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