CN104178541A - 一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2′-脱氧腺苷，具有工艺简单、转化率高、生产成本低、反应条件温和的优点，且副产物少，绿色无污染，产物易分离纯化。本发明中腺嘌呤转化率达到72.5％以上。另外，通过采用结晶及重结晶的方法分离纯化2′-脱氧腺苷，使2′-脱氧腺苷的纯度达到99％以上。

Description

一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法。

背景技术

2′-脱氧腺苷(2-deoxyadenosine)是天然的脱氧核苷，是脱氧核糖核酸(DNA)的有机组成部分，也是基因药物和基因工程研究的重要原材料，具有很好的生理活性。2′-脱氧腺苷本身有一定药用价值，可抑制由糖诱导的胰岛素释放，并且能够降低特异性磷酸二脂酶抑制剂或腺苷环化酶激活剂促进胰岛素分泌的作用。虽未有报道其可直接用于抗病毒，但是可作为一种重要的原料，经过化学结构改造得到的2′-脱氧腺苷类似物是很多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病核苷类药物的良好中间体。

由于对核苷类物质的需求量也日益增加，从技术上分析，全世界的需求量在十几吨左右。目前，多数2′-脱氧腺苷产品来自于DNA降解，但是这种传统生产脱氧核苷类物质的方法会越来越局限于有限的天然资源，并且分离提取纯品困难。化学合成法合成2′-脱氧腺苷又存在多种问题，采用核糖或者脱氧核糖为原料则成本太高，步骤大都复杂，转化率低，有的会产生2′-脱氧腺苷的α、β-异构体，不好分离，收率低，且需要对特定基团进行保护和去保护，不需要保护的就必须要有催化剂，而催化剂往往具有一定的毒性且价格昂贵，如汞盐，另外，化学合成产生的一些副产物不易分解，严重污染环境，难以实现大规模工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2′-脱氧腺苷。

本发明的另一个目的是，通过一定的结晶与重结晶的方法对2′-脱氧腺苷进行纯化，使转化所得到的2′-脱氧腺苷的纯度得到大幅度提高。

本发明的技术方案为：

一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其中，

将具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌接种产酶培养基进行发酵培养，将发酵培养得到的大肠埃希氏菌菌体作为催化反应的酶源与脱氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及缓冲液按照一定的比例混合组成反应混合物，并于温度50-55℃下进行转化反应1-2h，得到含有所述2′-脱氧腺苷的生物转化液；

此外，还包括以下步骤：

步骤一、碱基去除，将所得生物转化液离心，得到去除大肠埃希氏菌菌体的上清液，调节所得上清液的pH值为6.5-7.0后冷却静置15-18h，去除所析出固体物质得到去除碱基的生物转化液；

步骤二、结晶，调节所述去除碱基的生物转化液的pH值至10-11后冷却静置6-8h，分离所析出的固体物质得2′-脱氧腺苷粗品；

步骤三、重结晶，将所得2′-脱氧腺苷粗品在55-60℃下溶于一定量的20-30％乙醇溶液中制备为2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，将所制的2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液于3-4℃静置6-8h，再次分离所析出的固体物质既得纯化后的所述2′-脱氧腺苷。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述反应混合物中的缓冲液为浓度为45-50mmol/L，pH值为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，构成所述反应混合物的各组分的配比为：脱氧胸腺嘧啶核苷3-5mmol，腺嘌呤3-5mmol，大肠埃希氏菌菌体4-10g及磷酸盐缓冲液100mL。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述大肠埃希氏菌的发酵培养方法为：

步骤一、种子培养，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种接种于液体种子培养基中，于35-37℃摇床上培养24-48h，得到种子培养液；

步骤二、发酵培养，将种子培养液按照产酶培养基体积的5-8％的接种量接种于所述产酶培养基进行发酵培养，发酵培养温度为35-37℃，发酵培养时间8-10h，得到含有大肠埃希氏菌菌体的发酵培养液。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述产酶培养基包含以下重量份的组分：所述产酶培养基包含以下重量份的组分：牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；所述产酶培养基的pH值为7.0-7.5。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述种子培养基包含以下重量份的组分：酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；所述种子培养基的pH值为7.0-7.5。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述大肠埃希氏菌菌体的制备方法为：将所述发酵培养液在3-4℃条件下5000-10000rpm离心5-10min，收集沉淀得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得大肠埃希氏菌湿菌体用pH值6.5-7.0，浓度为18-20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤2-3次后，再次离心既得所述大肠埃希氏菌菌体。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，步骤一中所述去除所析出的固体物质及步骤二和步骤三中所述分离所析出的固体物质的方法均采用抽滤的方法，所述冷却静置的温度均为3-4℃。

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，离心所得大肠埃希氏菌菌体于-20℃左右冷冻保存备用

优选的是，所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述大肠埃希氏菌为保藏编号是CGMCC No.8089的大肠埃希氏菌TH-1。

本发明具有以下有益效果：通过直接采用具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌体作为酶源，将其与作为转化反应底物的脱氧胸腺嘧啶核苷及腺嘌呤混合进行转化反应合成2′-脱氧腺苷，具有工艺简单、转化率高、生产成本低、反应条件温和的优点，且副产物少，一方面绿色无污染，另一方面使产物易分离纯化。本发明中腺嘌呤转化率达到72.5％以上，比化学合成法的转化率提高20％以上。

另外，通过采用结晶及重结晶的方法分离纯化2′-脱氧腺苷的生物转化液，能够快速有效地去除产物中的副产物，使2′-脱氧腺苷的纯度达到99％以上，2′-脱氧腺苷的总收率达65.5％以上，比一般化学合成法的2′-脱氧腺苷纯度及收率提高10％以上，适合2′-脱氧腺苷的大规模工业化生产。

附图说明

图1为所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。

如图1所示，一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其中，

将具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌接种产酶培养基进行发酵培养，将发酵培养得到的大肠埃希氏菌菌体作为催化反应的酶源与脱氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及缓冲液按照一定的比例混合组成反应混合物，并于温度50-55℃下进行转化反应1-2h，得到含有所述2′-脱氧腺苷的生物转化液；

此外，还包括以下步骤：

步骤一、碱基去除，所得含有所述2′-脱氧腺苷的生物转化液主要成分包括核糖基供体2′-脱氧胸苷、碱基供体腺嘌呤、副产物胸腺嘧啶和主产物2′-脱氧腺苷，需要通过碱基去除、结晶和重结晶的方法对所述2′-脱氧腺苷进行纯化。

通过将所得生物转化液离心，生物转化液中的菌体得到沉淀，取上清液既得到去除大肠埃希氏菌菌体的上清液，通过滴加适量盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节所得上清液的pH值为6.5-7.0后冷却至3-4℃并静置15-18h，杂质碱基以固体形式从所得上清液中析出，通过抽滤去除所析出固体物质得到去除碱基的生物转化液；

步骤二、结晶，所述生物转化液一般为中性，滴加适量氢氧化钠溶液，在碱性范围内调节所述去除碱基的生物转化液的pH值至10-11后冷却至3-4℃并静置6-8h，2′-脱氧腺苷从所述去除碱基的生物转化液中结晶并析出，通过抽滤分离所析出的固体物质得2′-脱氧腺苷粗品；

步骤三、重结晶，将所得2′-脱氧腺苷粗品在55-60℃下溶于一定量的20-30％乙醇溶液中，溶解过程中不断搅拌，直至2′-脱氧腺苷粗品不再溶解为止既制备为2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，将所制的2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液于3-4℃静置6-8h，通过抽滤再次分离所析出的固体物质既得纯化后的所述2′-脱氧腺苷。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述反应混合物中的缓冲液为浓度为45-50mmol/L，pH值为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，构成所述反应混合物的各组分的配比为：脱氧胸腺嘧啶核苷3-5mmol，腺嘌呤3-5mmol，大肠埃希氏菌菌体4-10g，磷酸盐缓冲液100mL。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述大肠埃希氏菌的发酵培养方法为：

步骤一、种子培养，挑取一环经活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种接种于装有液体种子培养基的500ml三角瓶中，于35-37℃摇床上培养24-48h，得到种子培养液；

步骤二、发酵培养，使用20L自动发酵罐装12L产酶培养基，将种子培养液按照产酶培养基体积的5-8％的接种量接种于所述产酶培养基进行发酵培养，发酵培养温度为35-37℃，发酵培养时间8-10h，得到含有大肠埃希氏菌菌体的发酵培养液。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述产酶培养基包含以下重量份的组分：牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；所述产酶培养基的pH值为7.0-7.5，121℃灭菌20min。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述种子培养基包含以下重量份的组分：酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；121℃灭菌20min，所述种子培养基的pH值为7.0-7.5。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所述大肠埃希氏菌菌体的制备方法为：将所述发酵培养液在3-4℃条件下5000-10000rpm离心5-10min，收集沉淀得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得大肠埃希氏菌湿菌体用pH值6.5-7.0，浓度为18-20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤2-3次后，再次离心既得所述大肠埃希氏菌菌体，所述大肠埃希氏菌菌体可于-20℃左右冷冻保存备用。

所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法中，所采用大肠埃希氏菌为保藏编号是CGMCC No.8089的大肠埃希氏菌TH-1，拉丁名为Escherichia coli，该菌株具有高核苷磷酸化酶活性，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年8月30日。

实施例1

1)种子培养

取一环经活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种，接种于500ml三角瓶中，于37℃下摇床上培养28h，种子培养基组成为：酵母膏5.2g，蛋白胨11.5g，NaCl5.5g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.0。

2)发酵培养及菌体制备

使用20L自动发酵罐装12L产酶培养基，按照产酶培养基体积的6％的接种量接种大肠埃希氏菌种子培养液，在37℃下培养8h，然后在4℃条件下6000rpm离心8min，得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得湿菌体用pH值7.0，浓度为20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤2次，离心得到所需的大肠埃希氏菌菌体，于-20℃冷冻保存备用。产酶培养基组成为：牛肉膏12g，酵母膏11g，蛋白胨6.8g，NaCl7.3g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.5。

3)转化

将0.35mmol脱氧胸腺嘧啶核苷，0.35mmol腺嘌呤，大肠埃希氏菌菌体5g，10mL浓度为50mmol/L，pH值为7.0磷酸盐缓冲液混合作为反应混合物，在55℃的恒温水浴槽中反应，反应时间为1h，得到生物转化液。

4)碱基去除

将所得生物转化液室温下4000离心10min，除去生物转化液中菌体，得到上清液，调节所得上清液pH值为7.0，冷却至4℃并静置15h，杂质碱基以固体形式析出，抽滤分离析出的杂质碱基，得到去除碱基的生物转化液。

5)结晶

在碱性范围内调节去除碱基的生物转化液的pH值至10.5，冷却至4℃并静置6h，所述2′-脱氧腺苷结晶并析出，抽滤分离析出的固体物质既得2′-脱氧腺苷粗品。

6)重结晶

以20％乙醇溶液为溶剂，在60℃温度下将所得2′-脱氧腺苷粗品进行溶解，溶解过程中不断搅拌，直至2′-脱氧腺苷粗品不再溶解既制成2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，冷却至4℃静置8h，2′-脱氧腺苷重结晶，得到纯度为99.23％的2′-脱氧腺苷纯品。

实施例2

1)种子培养

取一环经活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种，接种于500ml三角瓶中，于37℃下摇床上培养36h，种子培养基组成为：酵母膏6g，蛋白胨12.5g，NaCl7.5g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.2。

2)发酵培养及菌体制备

使用20L自动发酵罐装12L产酶培养基，按照产酶培养基体积的6％的接种量接种大肠埃希氏菌种子培养液，在37℃下培养9h，然后在4℃条件下5000rpm离心10min，得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得湿菌体用pH值7.0，浓度为20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤3次，离心得到所需的大肠埃希氏菌菌体，于-20℃冷冻保存备用。产酶培养基组成为：牛肉膏10g，酵母膏12g，蛋白胨8g，NaCl6.8g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.5。

3)转化

将0.3mmol脱氧胸腺嘧啶核苷，0.4mmol腺嘌呤，大肠埃希氏菌菌体6g，10mL浓度为50mmol/L，pH值为7.0磷酸盐缓冲液混合作为反应混合物，在55℃的恒温水浴槽中反应，反应时间为1.5h，得到生物转化液。

4)碱基去除

将所得生物转化液室温下5000离心7min，除去生物转化液中菌体，得到上清液，调节所得上清液pH值为7.0，冷却至4℃并静置18h，杂质碱基以固体形式析出，抽滤分离析出的杂质碱基，得到去除碱基的生物转化液。

5)结晶

在碱性范围内调节去除碱基的生物转化液的pH值至10.5，冷却至4℃并静置8h，所述2′-脱氧腺苷结晶并析出，抽滤分离析出的固体物质既得2′-脱氧腺苷粗品。

6)重结晶

以25％乙醇溶液为溶剂，在60℃温度下将所得2′-脱氧腺苷粗品进行溶解，溶解过程中不断搅拌，直至2′-脱氧腺苷粗品不再溶解既制成2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，冷却至4℃静置，2′-脱氧腺苷重结晶，得到纯度为99.18％的2′-脱氧腺苷纯品。

实施例3

1)种子培养

取一环经活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种，接种于500ml三角瓶中，于37℃下摇床上培养40h，种子培养基组成为：酵母膏8.2g，蛋白胨14.1g，NaCl7.3g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.3。

2)发酵培养及菌体制备

使用20L自动发酵罐装12L产酶培养基，按照产酶培养基体积的7％的接种量接种大肠埃希氏菌种子培养液，在37℃下培养10h，然后在4℃条件下8000rpm离心7min，得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得湿菌体用pH值7.0，浓度为20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤2次，离心得到所需的大肠埃希氏菌菌体，于-20℃冷冻保存备用。产酶培养基组成为：牛肉膏12.6g，酵母膏13.8g，蛋白胨7.5g，NaCl8.5g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.5。

3)转化

将0.4mmol脱氧胸腺嘧啶核苷，0.4mmol腺嘌呤，大肠埃希氏菌菌体7g，10mL浓度为50mmol/L，pH值为7.0磷酸盐缓冲液混合作为反应混合物，在55℃的恒温水浴槽中反应，反应时间为1.5h，得到生物转化液。

4)碱基去除

将所得生物转化液室温下6000离心8min，除去生物转化液中菌体，得到上清液，调节所得上清液pH值为7.0，冷却至4℃并静置16h，杂质碱基以固体形式析出，抽滤分离析出的杂质碱基，得到去除碱基的生物转化液。

5)结晶

在碱性范围内调节去除碱基的生物转化液的pH值至10.5，冷却至4℃并静置8h，所述2′-脱氧腺苷结晶并析出，抽滤分离析出的固体物质既得2′-脱氧腺苷粗品。

6)重结晶

以30％乙醇溶液为溶剂，在60℃温度下将所得2′-脱氧腺苷粗品进行溶解，溶解过程中不断搅拌，直至2′-脱氧腺苷粗品不再溶解既制成2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，冷却至4℃静置，2′-脱氧腺苷重结晶，得到纯度为99.52％的2′-脱氧腺苷纯品。

实施例4

1)种子培养

取一环经活化的具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种，接种于500ml三角瓶中，于37℃下摇床上培养48h，种子培养基组成为：酵母膏7.9g，蛋白胨12.5g，NaCl8.3g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.5。

2)发酵培养及菌体制备

使用20 L自动发酵罐装12L产酶培养基，按照产酶培养基体积的8％的接种量接种大肠埃希氏菌种子培养液，在37℃下培养10h，然后在4℃条件下10000rpm离心5min，得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得湿菌体用pH值7.0，浓度为20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤3次，离心得到所需的大肠埃希氏菌菌体，于-20℃冷冻保存备用。产酶培养基组成为：牛肉膏15g，酵母膏13g，蛋白胨10g，NaCl10g及蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，pH值7.5。

3)转化

将0.5mmol脱氧胸腺嘧啶核苷，0.5mmol腺嘌呤，大肠埃希氏菌菌体6g，10mL浓度为50mmol/L，pH值为7.0磷酸盐缓冲液混合作为反应混合物，在55℃的恒温水浴槽中反应，反应时间为2h，得到生物转化液。

4)碱基去除

将所得生物转化液室温下6000离心8min，除去生物转化液中菌体，得到上清液，调节所得上清液pH值为7.0，冷却至4℃并静置17h，杂质碱基以固体形式析出，抽滤分离析出的杂质碱基，得到去除碱基的生物转化液。

5)结晶

在碱性范围内调节去除碱基的生物转化液的pH值至10.5，冷却至4℃并静置6h，所述2′-脱氧腺苷结晶并析出，抽滤分离析出的固体物质既得2′-脱氧腺苷粗品。

6)重结晶

以30％乙醇溶液为溶剂，在60℃温度下将所得2′-脱氧腺苷粗品进行溶解，溶解过程中不断搅拌，直至2′-脱氧腺苷粗品不再溶解既制成2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，冷却至4℃静置，2′-脱氧腺苷重结晶，得到纯度为99.36％的2′-脱氧腺苷纯品。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于， 

将具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌接种产酶培养基进行发酵培养，将发酵培养得到的大肠埃希氏菌菌体作为催化反应的酶源与脱氧胸腺嘧啶核苷、腺嘌呤及缓冲液按照一定的比例混合组成反应混合物，并于温度50-55℃下进行转化反应1-2h，得到含有所述2′-脱氧腺苷的生物转化液； 

此外，还包括以下步骤： 

步骤一、碱基去除，将所得生物转化液离心，得到去除大肠埃希氏菌菌体的上清液，调节所得上清液的pH值为6.5-7.0后冷却静置15-18h，去除所析出固体物质得到去除碱基的生物转化液； 

步骤二、结晶，调节所述去除碱基的生物转化液的pH值至10-11后冷却静置6-8h，分离所析出的固体物质得2′-脱氧腺苷粗品； 

步骤三、重结晶，将所得2′-脱氧腺苷粗品在55-60℃下溶于一定量的20-30％乙醇溶液中制备为2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液，将所制的2′-脱氧腺苷的乙醇饱和溶液于3-4℃静置6-8h，再次分离所析出的固体物质既得纯化后的所述2′-脱氧腺苷。 

2.如权利要求1所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述反应混合物中的缓冲液为浓度为45-50mmol/L，pH值为6.5-7.0的磷酸盐缓冲液。 

3.如权利要求2所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，构成所述反应混合物的各组分的配比为：脱氧胸腺嘧啶核苷3-5mmol，腺嘌呤3-5mmol，大肠埃希氏菌菌体4-10g及磷酸盐缓冲液100mL。 

4.如权利要求1所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌的发酵培养方法为： 

步骤一、种子培养，挑取具有高核苷磷酸化酶活性的大肠埃希氏菌菌种接种于液体种子培养基中，于35-37℃摇床上培养24-48h，得到种子培养液； 

步骤二、发酵培养，将种子培养液按照产酶培养基体积的5-8％的接种量接种于所述产酶培养基进行发酵培养，发酵培养温度为35-37℃，发酵培养时 间8-10h，得到含有大肠埃希氏菌菌体的发酵培养液。 

5.如权利要求4所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述产酶培养基包含以下重量份的组分：牛肉膏10-15，酵母膏10-15，蛋白胨5-10，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；所述产酶培养基的pH值为7.0-7.5。 

6.如权利要求4所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述种子培养基包含以下重量份的组分：酵母膏5-10，蛋白胨10-15，NaCl5-10及蒸馏水900-1000；所述种子培养基的pH值为7.0-7.5。 

7.如权利要求4所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌菌体的制备方法为：将所述发酵培养液在3-4℃条件下5000-10000rpm离心5-10min，收集沉淀得到大肠埃希氏菌湿菌体，将所得大肠埃希氏菌湿菌体用pH值6.5-7.0，浓度为18-20mmol/L的磷酸钾缓冲液洗涤2-3次后，再次离心既得所述大肠埃希氏菌菌体。 

8.如权利要求1所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，步骤一中所述去除所析出的固体物质及步骤二和步骤三中所述分离所析出的固体物质的方法均采用抽滤的方法；所述冷却静置的温度均为3-4℃。 

9.如权利要求7所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，离心所得大肠埃希氏菌菌体于-20℃左右冷冻保存备用。 

10.如权利要求1所述的利用大肠埃希氏菌转化生产2′-脱氧腺苷的方法，其特征在于，所述大肠埃希氏菌为保藏编号是CGMCC No.8089的大肠埃希氏菌TH-1。