CN104017795B - 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法 - Google Patents

一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104017795B
CN104017795B CN201410227098.4A CN201410227098A CN104017795B CN 104017795 B CN104017795 B CN 104017795B CN 201410227098 A CN201410227098 A CN 201410227098A CN 104017795 B CN104017795 B CN 104017795B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dri
deoxidation
bacterial strain
recombinant bacterial
phosphoric acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410227098.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104017795A (zh
Inventor
孙媛霞
李季涛
杨建刚
朱玥明
门燕
马延和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201410227098.4A priority Critical patent/CN104017795B/zh
Publication of CN104017795A publication Critical patent/CN104017795A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104017795B publication Critical patent/CN104017795B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02004—Deoxyribose-phosphate aldolase (4.1.2.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧-D-核糖等2-脱氧稀少醛糖的方法，公开了两种2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体的蛋白序列，及构建的含有2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体编码基因的大肠埃希氏菌（<i>Escherichia？coli</i>）重组菌株L1。实验证明，该重组菌株能以静息细胞催化乙醛和多种醛基反应生成2-脱氧醛糖，具有很强的底物耐受性。例如能以乙醛和D-甘油醛为底物合成2-脱氧-D-核糖，以乙醛和L-甘油醛为底物合成2-脱氧-L-木糖，以乙醛和D-赤藓糖为底物合成2-脱氧-D-阿卓糖。因此，本发明的大肠埃希氏菌重组菌株L1可应用于脱氧稀少醛糖的生产领域，所得到的脱氧醛糖在食品和医药行业具有广泛的应用前景。

Description

一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体及其在脱氧糖生物合成中的应用。即利用定点突变的方法获得2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体，并利用携带2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体的工程菌高效生物合成2-脱氧-D-核糖等脱氧稀少醛糖。
背景技术
C-C键的不对称合成被认为是有机合成领域最具挑战性的课题之一，在体内C-C键的不对称合成主要通过连接酶来完成，醛缩酶是连接酶的一种，其催化的羟醛缩合反应是C-C键不对称合成的有效工具之一(BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403)。目前，已经报道的醛缩酶包括四种：磷酸二羟丙酮/二羟丙酮依赖的醛缩酶、乙醛依赖型的醛缩酶、丙酮酸依赖的醛缩酶、甘氨酸依赖的醛缩酶(BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403)。目前已报道乙醛依赖型的醛缩酶仅一种，即2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶(2-deoxyribose-5-phosphatealdolase，DERA)。该醛缩酶催化供体乙醛和受体3-磷酸甘油醛合成2-脱氧-D-核糖-5-磷酸。研究报道，该酶可以催化氯乙醛和乙醛合成(3R,5S)-6-氯-2,4,6-脱氧赤藓糖-六吡喃糖苷，其中(3R,5S)-6-氯-2,4,6-脱氧赤藓糖-六吡喃糖苷是他汀类药物的重要合成前体。该醛缩酶还可以以其他多羟基醛为受体合成相对应的C-2脱氧醛糖。
尽管2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶在生物催化合成中具有广泛的应用，但是该酶存在催化活性低，乙醛耐受性低等缺点。针对这些问题，很多研究采用定向进化的方法对2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶进行突变，得到多种较好的突变体。研究发现将来源于E.coli的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶的238位氨基酸，由Ser突变成Asp后，该酶催化2-脱氧-D-核糖裂解为乙醛和D-甘油醛的能力提高2.5倍(DeSantisG,LiuJ,ClarkDP,etal.Structure-basedmutagenesisapproachestowardexpandingthesubstratespecificityofD-2-deoxyribose-5-phosphatealdolase[J].Bioorganic&medicinalchemistry,2003,11(1):43-52)。为了提高2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶对氯乙醛的活性，研究发现将来源于E.coli的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶的200位氨基酸，由Phe突变为Ile时，2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶对氯乙醛的活性提高了近14倍(JenneweinS,SchürmannM,WolbergM,etal.Directedevolutionofanindustrialbiocatalyst:2-deoxy-D-ribose5-phosphatealdolase[J].Biotechnologyjournal,2006,1(5):537-548)。该研究同时发现，在将200位氨基酸，由Phe突变为Ile的基础上缺失一个258位氨基酸Ser或者将258和259位氨基酸突变为Thr，并同时在C末端加一串氨基酸KTQLSCTKW，得到的两个突变体虽然对氯乙醛的催化活性没有提高很多，但是对乙醛的耐受性方面显出了较大优势(JenneweinS,SchürmannM,WolbergM,etal.Directedevolutionofanindustrialbiocatalyst:2-deoxy-D-ribose5-phosphatealdolase[J].Biotechnologyjournal,2006,1(5):537-548)。MartinSchiiermann(公开号US20090209001A1)对此进行了公开说明，并详述了突变体的获得过程。
2-脱氧-D-核糖是一种稀少脱氧单糖，同时也是核苷类药物的重要前体，在制药领域特别是抗病毒药物的合成中具有广泛应用，目前需求量日益加大。目前2-脱氧-D-核糖的合成主要通过化学合成法来合成，J.C.Sowden提出的以葡萄糖为原料合成2-脱氧-D-核糖的途径，该路线原料价格低廉，但是用量大，产率低(SowdenJC.AConvenientMethodofPreparing2-Deoxy-D-ribose1[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1954,76(13):3541-3542)。相对而言，生物法合成具有生产条件温和、成本低廉、产品纯度高、环境污染小等优点。目前已有相关研究报道可以通过2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶催化乙醛和D-甘油醛合成2-脱氧-D-核糖，该催化反应效率低，且乙醛耐受性较低。因此，通过定点突变的思路对2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶进行突变，得到具有高催化活性及高乙醛耐受性的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体成为本发明的一个研究思路。为了进一步提高2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶对底物的耐受性，本发明采用静息细胞催化的方式来合成2-脱氧-D-核糖，其乙醛和甘油醛耐受性显著提高。
发明目的
本发明目的一：提供脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶突变体LK-1，其蛋白序列为SEQIDNO:1。具体是将第200位氨基酸密码子由原来的TTT突变为ATC，氨基酸由Phe突变为Ile；第238位氨基酸密码子由原来的TCC突变为GAC，氨基酸由Ser突变为Asp；最后将第259位的TAC三个碱基缺失，即缺失一个氨基酸Tyr。本发明还包括编码序列为SEQIDNO:1的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体的基因核苷酸，其序列为SEQIDNO:2。
本发明目的二：提供2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2，其蛋白序列为SEQIDNO:3。具体是第200位氨基酸密码子由原来的TTT突变为ATC，氨基酸由Phe突变为Ile；将第238位氨基酸密码子由原来的TCC突变为GAC，氨基酸由Ser突变为Asp；将第258位氨基酸密码子由原来的AGC突变为ACC，氨基酸由Ser突变为Thr；将第259位氨基酸密码子由原来的TAC突变为ACC,氨基酸由Tyr突变为Thr；最后在第259位氨基酸密码子后面添加一段密码子序列：AAAACCCAGCTGTCCTGCACCAAATGG，该密码子序列翻译所得氨基酸序列为：Lys-Thr-Gln-Leu-Ser-Cys-Thr-Lys-Trp。本发明也包括编码序列为SEQIDNO:4的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体的基因核苷酸。
本发明目的三：提供一株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)重组菌株L1，该菌株已于2014年04月08日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),保藏编号为CGMCCNo.9023。其特征在于，该重组菌株中含有携带2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1基因的质粒pELK-1。
本发明目的四：提供一种2-脱氧-D-核糖等脱氧糖的生物合成方法。
为了实现该目的，本发明以大肠埃希氏菌重组菌株L1为生物催化剂，利用重组菌的静息细胞催化乙醛和多种多羟基醛为底物高效合成2-脱氧-D-核糖等多种脱氧稀少糖。具体是以重组菌株L1的静息细胞催化乙醛和D-甘油醛合成2-脱氧-D-核糖，催化乙醛和L-甘油醛合成2-脱氧-L-木糖，催化乙醛和D-赤藓糖合成2-脱氧-D-阿卓糖。
本发明提到2-脱氧D-核糖的生物合成方法，包括以下步骤：
(1)2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1的诱导及表达。具体的，从预先活化好的大肠埃希氏菌重组菌株L1平板上，挑取单菌落接种至4mLLB培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养过夜。按照1％的接种量，将种子液接种于100mL培养基中，在37℃、200rmp条件下，培养2-3h。当菌体浓度OD600达到0.6-0.8时，添加终浓度为1mmol的IPTG，同时降低培养温度至20℃，摇床转速降低至120rmp，诱导时间为20h。
(2)大肠埃希氏菌重组菌株L1静息细胞催化D-甘油醛和乙醛合成2-脱氧-D-核糖。首先将经步骤2诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株L1菌液(100mL)，4℃、6000rmp离心10min收集菌体，并用三乙醇胺缓冲液(50mmolpH7.0)洗涤菌液三次，最终用三乙醇胺缓冲液浓缩菌液至10mL；其次，加入终浓度为2mol/L的乙醛和2mol/L的D-甘油醛进行反应。反应条件为：温度30℃，pH7.0，转速120rpm，菌体浓度(OD600)为20。
本发明与现有2-脱氧D-核糖生产方法相比，具有以下优点：
(1)成本低廉，以市场中廉价的D-甘油醛和乙醛为原料；
(2)2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶催化的缩醛反应构型专一，没有副产物产生，静息细胞可以重复利用，后期分离工艺简单；
(3)该静息细胞生产工艺对乙醛和D-甘油醛均具有较好的催化活性和底物耐受性。
(4)所生产的脱氧糖在生物医药和食品添加剂等领域具有广阔的应用前景和竞争力。
附图说明
图1A为携带2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1基因的载体pELK-1的物理图谱。
图1B为携带2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2基因的载体pELK-2的物理图谱。
图2为以2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶为催化剂，催化乙醛和D-甘油醛，乙醛和L-甘油醛及乙醛和D-赤藓糖分别合成2-脱氧-D-核糖，2-脱氧-L-木糖和2-脱氧-D-阿卓糖的化学反应结构式。
图3为大肠埃希氏菌重组菌株L1以乙醛和D-甘油醛为底物合成2-脱氧-D-核糖的高效液相色谱分析结果，以sigama的D-甘油醛和乙醛为标品。
图4为大肠埃希氏菌重组菌株L1以乙醛和L-甘油醛为底物合成2-脱氧-L-木糖的高效液相色谱分析结果，以sigama的L-甘油醛和乙醛为标品。
图5为大肠埃希氏菌重组菌株L1以乙醛和D-赤藓糖为底物合成2-脱氧-D-阿卓糖的高效液相色谱分析结果，以sigama的D-赤藓糖和乙醛为标品。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、构建2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1
1、根据Genbank中肺炎克雷伯氏菌MGH78578的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶基因(Genbank号：5341458，780bp，SEQIDNO:5)，设计引物1、引物2、引物3和引物4，引物1中含有NdeI酶切位点；在引物2、和引物3中将第200位氨基酸密码子由原来的TTT变成了ATC；引物4带有HindIII酶切位点，而且将第238位氨基酸密码子由原来的TCC变成了GAC，并将第258位的AGC三个碱基缺失。
引物序列如下：
引物1：5’-GGGTTTCATATGCATCATCACCATCACCATACTGATTTATCTGCAAGCAGCCTG-3’
引物2：5’-AAAACCGTGGGCATCAAACCGGCGGGCGGCGTGCGTACTG-3’
引物3：5’-AACCGTGGGCATCAAACCGGCGGGCGGCGTG-3’
引物4：5’-ACTCAAGCTTTTAGCTGCTGGCGCTCTTACCGTC-3’
2、以肺炎克雷伯氏菌MGH78578基因组为模板，用引物1和引物2、引物3和引物4分别扩增，分别得到片段(1)(637bp，SEQIDNO:6)和片段(2)(200bp，SEQIDNO:7)；片段(1)和片段(2)有20bp同源区域，(即片段(1)自5’端第1-10、14-23位碱基；片段(2)自3’端第1-10、14-23位碱基)，可用于片段(1)和(2)的融合。
3、以上片段(1)和(2)为模板，用引物1和引物4扩增得到2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1基因deoC-1(777bp，SEQIDNO:2)。
4、用限制性内切酶NdeI和HindIII同时对deoC-1和pET21a酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接得到含有deoC-1的载体质粒，命名为pELK-1。其物理图谱如图1A所示。
5、将携带有2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1基因的载体pELK-1转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，得到菌株大肠埃希氏菌重组菌株L1。
该大肠埃希氏菌重组菌株L1，该菌株已于2014年04月11日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),保藏编号为CGMCCNo.9023。
实施例2、构建2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2
1、根据Genbank中肺炎克雷伯氏菌MGH78578的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶基因(Genbank号：5341458，780bp，SEQIDNO:5)，设计引物5，引物5带有HindIII酶切位点，将第258位氨基酸密码子由原来的AGC变成了ACC；将第259位氨基酸密码子由原来的TAC变成了ACC；并在第259位氨基酸密码子后面添加一段密码子序列：AAAACCCAGCTGTCCTGCACCAAATGG。
引物序列如下：
引物5：5’-ACTCAAGCTTTTACCATTTGGTGCAGGACAGCTGGGTTTTGGTGGTGCTGGCGCTCTTACCGTCGC-3’
2、以肺炎克雷伯氏菌MGH78578基因组为模板，用引物1和引物2、引物3和引物5分别扩增，分别得到片段(1)和片段(3)(片段(1)637bp，SEQIDNO:6；片段(3)230bp，SEQIDNO:8)；片段(3)和片段(4)有20bp同源区域，(即片段(1)自5’端第1-10、14-23位碱基；片段(3)自3’端第1-10、14-23位碱基)，可用于片段(1)和片段(3)的融合。
3、以上片段(1)和(3)为模板，用引物1和引物5扩增得到2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2的基因deoC-2(807bp，SEQIDNO:4)。
4、用限制性内切酶NdeI和HindIII同时对deoC-2和pET21a酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接得到含有deoC-2的载体质粒，命名为pELK-2。其物理图谱如图1B所示。
实施例3、2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1和LK-2纯酶比较
1、携带有pELK-1或者pELK-2重组质粒的大肠埃希氏菌重组菌株的培养及诱导
选用LB培养基(蛋白胨(10g/L),酵母抽提物(5g/L)，氯化钠(10g/L)，培养基中添加氨苄抗生物(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对大肠埃希氏菌重组菌株L1进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mmol，降低摇床转速为120rmp，诱导约20h。
2、大肠埃希氏菌重组菌株的收集和浓缩
将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)洗涤菌液两次，最终用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)浓缩菌液至10mL。
3、超声破壁和Ni柱纯化
将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)洗涤菌液两次，最终用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)浓缩菌液至2mL。超声破碎，4℃、14000rpm离心30min，得破碎上清。首先，用三倍于Ni柱体积的Bindingbuffer(三乙醇胺50mM，咪唑10mM,pH7.0)清洗一次；其次，加入破碎上清；然后用Bindingbuffer清洗杂蛋白；最后，用600ulElutionbuffer(三乙醇胺50mM，咪唑300mM,pH7.0)清洗得到突变体酶LK-1和LK-2。
3、LK-1和LK-2参与的2-脱氧-D-核糖合成反应
取2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶DERA的突变体LK-110ul，加入含有乙醛和D-甘油醛(1：1)混合底物(50mM)的1.5mlEP管中，用TEABuffer(50mMpH7.0)补至1ml，进行反应，反应条件为：温度30℃，pH7.0，转速150rpm，反应30min。100℃沸水浴5min，终止反应。
然后将样品在4℃，14000rmp条件下离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：HitachiGL-C611，流动相：EDTA-Ca2+(0.1mM)，流速：0.4mL/min，柱温：70℃，检测器：示差折光检测器,上样量为20μl。
结果显示，LK-1的酶活较大肠埃希氏菌野生型2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶酶活提高2.5倍，LK-2提高2.4倍。二者活性相似，选取表现较好的LK-1转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中，得到大肠埃希氏菌重组菌株L1，并将其应用到脱氧糖的静息细胞合成中，具体实施如下：
实施例4、大肠埃希氏菌重组菌株L1在脱氧糖生物合成中的应用
一、大肠埃希氏菌重组菌株L1在2-脱氧-D-核糖生物合成中的应用
1、大肠埃希氏菌重组菌株L1的培养及诱导
选用LB培养基(蛋白胨(10g/L),酵母抽提物(5g/L)，氯化钠(10g/L)，培养基中添加氨苄抗生物(100mg/L)，在37℃、200rmp条件下对大肠埃希氏菌重组菌株L1进行培养，当OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG，终浓度为1mmol，降低摇床转速为120rmp，诱导约20h。
2、大肠埃希氏菌重组菌株L1的收集和浓缩
将诱导得到的大肠埃希氏菌重组菌株L1菌液(100mL)，4℃、8000rmp离心15min收集菌体，用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)洗涤菌液两次，最终用三乙醇胺缓冲液(50mmol，pH7.0)浓缩菌液至10mL。
3、低底物浓度条件下2-脱氧-D-核糖的生产
取10mL大肠埃希氏菌重组菌株L1的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为50mmol/L的乙醛和50mmol/L的D-甘油醛进行静息细胞催化反应，反应条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为20。
4、高底物浓度条件下2-脱氧-D-核糖的生产
取10mL大肠埃希氏菌重组菌株L1的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为2mol/L的乙醛和2mol/L的D-甘油醛进行静息细胞催化反应，反应条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为20。
反应结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。以Sigma公司生产的2-脱氧-D-核糖纯品为标准品。
结果如图3表示(图(a)表示D-甘油醛和乙醛的混合标品；图(b)表示反应液)所示，经过6小时反应，D-甘油醛转化率为74.72％，表明大肠埃希氏菌重组菌株L1可以以D-甘油醛和乙醛为底物合成2-脱氧-D-核糖。
二、大肠埃希氏菌重组菌株L1在2-脱氧-L-木糖生物合成中的应用
1、大肠埃希氏菌重组菌株L1的培养及诱导
与步骤一相同。
2、大肠埃希氏菌重组菌株L1的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、2-脱氧-L-木糖的生产
取10mL大肠埃希氏菌重组菌株L1的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为50mmol/L的乙醛和50mmol/L的L-甘油醛进行静息细胞催化反应，反应条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为20。
反应结束后，对样品进行14000rmp离心20min处理，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：HitachiGL-C611，流动相：EDTA-Ca2+(0.1mmol)，流速：0.4mL/min，柱温：70℃，检测器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D甘油醛，乙醛和2-D-脱氧-D-核糖纯品为标准品，上样量为20μl。
结果如图4表示(图(a)表示乙醛标品；图(b)表示L-甘油醛标品；图(c)表示反应液)所示，经过6小时反应，L-甘油醛转化率为88.52％，表明大肠埃希氏菌重组菌株L1可以以L-甘油醛和乙醛为底物合成2-脱氧-D-木糖。
三、大肠埃希氏菌重组菌株L1在2-脱氧-D-阿卓糖生物合成中的应用
1、大肠埃希氏菌重组菌株L1的培养及诱导
与步骤一相同。
2、大肠埃希氏菌重组菌株L1的收集和浓缩
与步骤一相同。
3、2-脱氧-D-阿卓糖的生产
取10mL大肠埃希氏菌重组菌株L1的浓缩菌液，放置于50mL的锥形瓶中，加入终浓度为50mmol/L的乙醛和50mmol/L的D-赤藓糖进行静息细胞催化反应，反应条件为：温度30℃，pH7.0，菌体浓度(OD600)为20。
反应结束后，对样品进行高效液相色谱分析，分析条件与步骤一相同。
结果如图5表示(图(a)表示D-赤藓糖和乙醛的混合标品；图(b)表示反应液)所示，经过6小时反应，D-赤藓糖转化率为59.01％，表明大肠埃希氏菌重组菌株L1可以以D-赤藓糖和乙醛为底物合成2-脱氧-D-阿卓糖。
由于2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶受到底物本身的抑制作用，所以，有2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶参与的反应很难实现工业化生产。实验表明，使用本发明的大肠埃希氏菌重组菌株L1静息细胞催化可以大幅度提高2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶的底物耐受性，为2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶参与的生物合成反应实现工业化生产提供了可能。
2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶不仅能够利用乙醛为供体，还能以氟代丙酮、丙酮等为供体，以各种醛为受体合成相应的脱氧醛糖、脱氧酮糖及其衍生物。使用本发明的大肠埃希氏菌重组菌株L1同样有潜力实现有2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶参与的各种脱氧糖及其衍生物的高效合成。因此，本发明的大肠埃希氏菌重组菌株L1可应用于静息细胞转化合成各种有2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶参与的各种稀少脱氧醛糖、脱氧酮糖及其衍生物的合成领域中，具有广阔的应用前景和竞争力。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法
<130>2014
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>258
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
MetThrAspLeuSerAlaSerSerLeuArgAlaLeuLysLeuMetAsp
151015
LeuThrThrLeuAsnAspAspAspThrAsnGluLysValIleAlaLeu
202530
CysHisGlnAlaLysThrProValGlyAsnThrAlaAlaValCysIle
354045
TyrProArgPheIleProIleAlaArgLysThrLeuLysGluGlnGly
505560
ThrProAspValArgIleAlaThrValThrAsnPheProHisGlyAsn
65707580
AspAspIleGluIleAlaLeuAlaGluThrArgAlaAlaIleAlaTyr
859095
GlyAlaAspGluValAspValValPheProTyrArgAlaLeuIleAla
100105110
GlyAsnGluGlnValGlyPheAspLeuValLysAlaCysLysGluAla
115120125
CysAlaAlaAlaAsnValLeuLeuLysValIleIleGluThrGlyGlu
130135140
LeuLysGluGluAlaLeuIleArgLysAlaSerGluIleSerIleLys
145150155160
AlaGlyAlaAspPheIleLysThrSerThrGlyLysValProValAsn
165170175
AlaThrProGluSerAlaArgIleMetMetGluValIleArgAspMet
180185190
GlyValSerLysThrValGlyIleLysProAlaGlyGlyValArgThr
195200205
AlaGluAspAlaGlnGlnPheLeuAlaIleAlaAspGluLeuPheGly
210215220
SerAspTrpAlaAspSerArgHisTyrArgPheGlyAlaAspSerLeu
225230235240
LeuAlaSerLeuLeuLysAlaLeuGlyHisGlyAspGlyLysSerAla
245250255
SerSer
<210>2
<211>777
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgactgatttatctgcaagcagcctgcgcgcgttgaaactgatggacctgaccaccctg60
aacgatgacgacactaatgaaaaagtcatcgccctgtgccatcaggcgaaaacgccagtg120
ggcaacactgccgctgtctgcatctatccgcgctttatcccgattgcccgcaaaacgctg180
aaagagcagggtaccccggacgtgcgcattgcaaccgtcactaacttcccgcacggtaac240
gacgatatcgagatcgcgctggcggaaacccgcgcggcgattgcctacggcgcagacgaa300
gtggacgtggtattcccgtaccgtgcgctgattgcgggcaacgagcaggtgggctttgac360
ctggtgaaagcctgtaaagaggcgtgtgccgcggcaaacgtgctgctgaaagtgatcatc420
gaaactggcgaactgaaagaagaagcgctgattcgtaaagcgtccgaaatctccatcaaa480
gccggtgctgatttcattaaaacctcaaccggtaaagtgccggtgaacgcgaccccggaa540
agcgcgcgcatcatgatggaagtgatccgtgatatgggcgtgtccaaaaccgtgggcatc600
aaaccggcgggcggcgtgcgtactgcggaagacgcgcagcagttcctggcgattgccgac660
gagctgttcggctccgactgggccgattcccgtcactaccgcttcggcgcggacagcctg720
ctggcaagcctgctgaaagcgctgggtcacggcgacggtaagagcgccagcagctaa777
<210>3
<211>268
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
MetThrAspLeuSerAlaSerSerLeuArgAlaLeuLysLeuMetAsp
151015
LeuThrThrLeuAsnAspAspAspThrAsnGluLysValIleAlaLeu
202530
CysHisGlnAlaLysThrProValGlyAsnThrAlaAlaValCysIle
354045
TyrProArgPheIleProIleAlaArgLysThrLeuLysGluGlnGly
505560
ThrProAspValArgIleAlaThrValThrAsnPheProHisGlyAsn
65707580
AspAspIleGluIleAlaLeuAlaGluThrArgAlaAlaIleAlaTyr
859095
GlyAlaAspGluValAspValValPheProTyrArgAlaLeuIleAla
100105110
GlyAsnGluGlnValGlyPheAspLeuValLysAlaCysLysGluAla
115120125
CysAlaAlaAlaAsnValLeuLeuLysValIleIleGluThrGlyGlu
130135140
LeuLysGluGluAlaLeuIleArgLysAlaSerGluIleSerIleLys
145150155160
AlaGlyAlaAspPheIleLysThrSerThrGlyLysValProValAsn
165170175
AlaThrProGluSerAlaArgIleMetMetGluValIleArgAspMet
180185190
GlyValSerLysThrValGlyIleLysProAlaGlyGlyValArgThr
195200205
AlaGluAspAlaGlnGlnPheLeuAlaIleAlaAspGluLeuPheGly
210215220
SerAspTrpAlaAspSerArgHisTyrArgPheGlyAlaAspSerLeu
225230235240
LeuAlaSerLeuLeuLysAlaLeuGlyHisGlyAspGlyLysSerAla
245250255
SerThrThrLysThrGlnLeuSerCysThrLysTrp
260265
<210>4
<211>807
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atgactgatttatctgcaagcagcctgcgcgcgttgaaactgatggacctgaccaccctg60
aacgatgacgacactaatgaaaaagtcatcgccctgtgccatcaggcgaaaacgccagtg120
ggcaacactgccgctgtctgcatctatccgcgctttatcccgattgcccgcaaaacgctg180
aaagagcagggtaccccggacgtgcgcattgcaaccgtcactaacttcccgcacggtaac240
gacgatatcgagatcgcgctggcggaaacccgcgcggcgattgcctacggcgcagacgaa300
gtggacgtggtattcccgtaccgtgcgctgattgcgggcaacgagcaggtgggctttgac360
ctggtgaaagcctgtaaagaggcgtgtgccgcggcaaacgtgctgctgaaagtgatcatc420
gaaactggcgaactgaaagaagaagcgctgattcgtaaagcgtccgaaatctccatcaaa480
gccggtgctgatttcattaaaacctcaaccggtaaagtgccggtgaacgcgaccccggaa540
agcgcgcgcatcatgatggaagtgatccgtgatatgggcgtgtccaaaaccgtgggcatc600
aaaccggcgggcggcgtgcgtactgcggaagacgcgcagcagttcctggcgattgccgac660
gagctgttcggctccgactgggccgattcccgtcactaccgcttcggcgcggacagcctg720
ctggcaagcctgctgaaagcgctgggtcacggcgacggtaagagcgccagcaccaccaaa780
acccagctgtcctgcaccaaatggtaa807
<210>5
<211>780
<212>DNA
<213>肺炎克雷伯氏菌MGH78578deoC
<400>5
atgactgatttaaaagcaagcagcctgcgcgcgttaaaactgatggacctgaccactctg60
aatgacgacgacaccaatgagaaagtcattgccctgtgtcatcaggcgaaaacgccggtg120
ggtaacaccgcggcggtctgcatctacccgcgcttcatcccgatcgcccgtaaaacgctg180
aatgagcaggggacgccggatattcgcatcgccacggtcaccaacttcccgcacgggaat240
gacgatatcgacattgcgctggcggaaacccgcgcggcgatcgcttacggcgctgacgaa300
gtggacgtggtcttcccgtaccgcgcgctgatcgccggcaacgagcaggtcggtttcgag360
ctggtgaaagcctgtaaggaagcctgtgcggcggctaacgtgctgctgaaagtgatcatc420
gaaaccggtgagctgaaagaagaagcgctgatccgtaaagcgtctgaaatctctatcaaa480
gccggggccgatttcatcaaaacctcgaccggtaaagtgccggtaaatgccacgccggaa540
agcgcgcgcatcatgatggaagtgatccgcgatatgggcgttgagaaaaccgttggcttc600
aaaccggcgggcggcgtgcgcagcgcggaagacgcgcagcagttcctggcgatcgctgat660
gaactgttcggcgccgactgggccgattctcgtcactatcgttttggcgcatccagcctg720
ctggctagcctgttgaaagccctgggtcacggcgacggcaagagcgccagcagctactaa780
<210>6
<211>637
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gggtttcatatgcatcatcaccatcaccatactgatttatctgcaagcagcctgcgcgcg60
ttgaaactgatggacctgaccaccctgaacgatgacgacactaatgaaaaagtcatcgcc120
ctgtgccatcaggcgaaaacgccagtgggcaacactgccgctgtctgcatctatccgcgc180
tttatcccgattgcccgcaaaacgctgaaagagcagggtaccccggacgtgcgcattgca240
accgtcactaacttcccgcacggtaacgacgatatcgagatcgcgctggcggaaacccgc300
gcggcgattgcctacggcgcagacgaagtggacgtggtattcccgtaccgtgcgctgatt360
gcgggcaacgagcaggtgggctttgacctggtgaaagcctgtaaagaggcgtgtgccgcg420
gcaaacgtgctgctgaaagtgatcatcgaaactggcgaactgaaagaagaagcgctgatt480
cgtaaagcgtccgaaatctccatcaaagccggtgctgatttcattaaaacctcaaccggt540
aaagtgccggtgaacgcgaccccggaaagcgcgcgcatcatgatggaagtgatccgtgat600
atgggcgtgtccaaaaccgtgggcatcaaaccggcgg637
<210>7
<211>200
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
aaccgtgggcatcaaaccggcgggcggcgtgcgtactgcggaagacgcgcagcagttcct60
ggcgattgccgacgagctgttcggctccgactgggccgattcccgtcactaccgcttcgg120
cgcgtccagcctgctggcaagcctgctgaaagcgctgggtcacggcgacggtaagagcgc180
cagcagctaaaagcttgagt200
<210>8
<211>230
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aaccgtgggcatcaaaccggcgggcggcgtgcgtactgcggaagacgcgcagcagttcct60
ggcgattgccgacgagctgttcggctccgactgggccgattcccgtcactaccgcttcgg120
cgcgtccagcctgctggcaagcctgctgaaagcgctgggtcacggcgacggtaagagcgc180
cagcaccaccaaaacccagctgtcctgcaccaaatggtaaaagcttgagt230

Claims (8)

1.一种2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1，其蛋白序列为SEQIDNO:1。
2.一种核苷酸序列，其序列为SEQIDNO:2，其特征在于，该核苷酸用于编码权利要求1所述的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-1。
3.一种2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2，其蛋白序列为SEQIDNO:3。
4.一种核苷酸序列，其序列为SEQIDNO:4，其特征在于，该核苷酸用于编码权利要求3所述的2-脱氧-D-核糖5-磷酸醛缩酶突变体LK-2。
5.大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）重组菌株L1，保藏编号为CGMCCNo.9023。
6.权利要求5所述大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023在合成2-脱氧-D-核糖中的应用，其特征在于，大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023静息细胞反应催化乙醛和D-甘油醛生成2-脱氧-D-核糖。
7.权利要求5所述大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023在合成2-脱氧-L-木糖中的应用，其特征在于，大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023静息细胞反应催化乙醛和L-甘油醛生成2-脱氧-L-木糖。
8.权利要求5所述大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023在合成2-脱氧-D-阿卓糖中的应用，其特征在于，大肠埃希氏菌重组菌株L1CGMCCNo.9023静息细胞反应催化乙醛和D-赤藓糖生成2-脱氧-D-阿卓糖。
CN201410227098.4A 2014-05-27 2014-05-27 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法 Active CN104017795B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410227098.4A CN104017795B (zh) 2014-05-27 2014-05-27 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410227098.4A CN104017795B (zh) 2014-05-27 2014-05-27 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104017795A CN104017795A (zh) 2014-09-03
CN104017795B true CN104017795B (zh) 2016-05-25

Family

ID=51434796

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410227098.4A Active CN104017795B (zh) 2014-05-27 2014-05-27 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104017795B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105063000B (zh) * 2015-08-28 2018-07-13 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 大肠杆菌2-脱氧-d-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其制备方法
CN113699195B (zh) * 2020-05-22 2024-04-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生物合成木糖的方法
CN112852890A (zh) * 2020-08-27 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 多羟基二酮以及羟基呋喃酮类化合物的生物合成方法
CN114807249B (zh) * 2022-03-25 2023-12-15 北京化工大学 催化co2合成2c或4c化合物的多酶级联途径

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1965084A (zh) * 2004-06-04 2007-05-16 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的2－脱氧－d－核糖－5－磷酸醛缩酶及其用于生产2,4,6－三脱氧己糖或其6－卤代或6－氰基取代的衍生物的用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1965084A (zh) * 2004-06-04 2007-05-16 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的2－脱氧－d－核糖－5－磷酸醛缩酶及其用于生产2,4,6－三脱氧己糖或其6－卤代或6－氰基取代的衍生物的用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Directed evolution of an industrial biocatalyst:2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase;Stefan Jennewein 等;《Biotechnology Journal》;20061231;第1卷(第5期);537-548 *
Structure-Based Mutagenesis Approaches Toward Expanding the Substrate Specificity of D-2-Deoxyribose-5-phosphate Aldolase;Grace DeSantis 等;《Bioorganic & Medicinal Chemistry》;20031231;第11卷(第1期);43-52 *
野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析;谭旖宁 等;《广西农业生物科学》;20081231;第27卷(第4期);349-353 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104017795A (zh) 2014-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10968424B2 (en) Bacillus subtilis strain, culture method and use thereof
CN104017795B (zh) 一种利用醛缩酶生物合成2-脱氧稀少醛糖的方法
CN103497911B (zh) 一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产
CN110373397A (zh) 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
CN106636020A (zh) 短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用
CN103911400B (zh) 一种采用全细胞转化生产α-酮戊二酸的方法
CN110387379B (zh) 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用
KR100882418B1 (ko) 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신 제조방법
CN113151198B (zh) 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN103898177B (zh) 制备高手性纯(r)-3-哌啶醇及其衍生物的方法
CN106520715B (zh) 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用
CN105734092B (zh) 一种酶法制备d-塔格糖的方法
CN103397006A (zh) 来源于产酸克雷伯氏菌的核糖醇脱氢酶（rdh）及其编码基因与应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN103952358A (zh) 一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用
CN103555646B (zh) 一种共表达l-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN105505904A (zh) 腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用
CN111041018A (zh) 支链酮糖的生物合成方法
CN105200076A (zh) 一株重组表达γ-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌、固定化及应用
CN103103234A (zh) 利用固定化酶合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的方法
CN109694892B (zh) 制备红景天苷的方法和试剂盒
CN110857444B (zh) 一种鲨肌醇的制备方法
CN103820506B (zh) 一种基因重组菌发酵生产辅酶q10的方法
CN102146123A (zh) 氧化葡糖杆菌吡咯喹啉醌合成蛋白系统及其编码的基因簇
CN105154487B (zh) 氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant