CN112980868A - 一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法 - Google Patents

一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法 Download PDF

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Abstract

一种提高酿酒酵母2‑苯乙醇产量的方法，属于生物技术领域。本申请一方面提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，另一方面提供了利用该CRISPR/Cas9基因编辑系统提高酿酒酵母2‑苯乙醇产量的方法。本申请能够对产2‑PE的酿酒酵母乙酰基转移酶（ATF1基因）催化的分支途径进行敲除，抑制2‑PE进一步转化为苯乙酰乙酯，提高了2‑PE产量，又降低了副产物进而提高后续分离2‑PE的纯度，降低了生产成本。

Description

一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法。
背景技术
2-苯乙醇（2-PE）是一种具有玫瑰花香味的芳香剂醇，存在很多植物以及玫瑰花的植物精油中，其它含有天然2-苯乙醇的产品是一些涉及发酵的食品，像酒类和奶酪等。2-PE由于其含有独特的香味而倍受到人们的追捧，得到了广泛的应用，例如作为食品、药品、烟草、日化用品、化妆品等的添加剂。2-PE还可以用作生产其衍生物的底物，如另一种有价值的风味化合物苯乙酸乙酯。
目前在工业上生产2-PE的方法以天然法和化学合成法为主。其中化学合成法不仅底物有毒，且产物中总会含有难以去除的副产品，因此很难受到广泛的应用，食品行业尤为突出，致使人们更加倾向于使用天然的香精化合物。天然法生产2-PE分为从植物或天然基质中直接提取法以及微生物转化法，前者由于原料供应不足以及提取步骤繁琐且效率低，无法满足工业生产，因此天然2-PE的生产主要聚焦在了微生物转化上。
在目前已知可以产生2-PE的微生物中，主要包括酵母、真菌、大肠杆菌等。酿酒酵母作为一种国际公认的安全模式微生物，并且由于其容量、坚韧性、生物安全性高且利于操作，因此作为2-PE生产研究最广泛的菌种。
基因工程是目前研究代谢途径的主要工具之一，其中CRISPR/CAS9基因编辑技术近些年来快速发展，与传统的基因工程技术相比，具有编辑效率高，周期短，操作简单以及能够同时对多个基因进行编辑等优点，已经应用于微生物代谢工程改造，在酿酒酵母中受到广泛的应用。
酿酒酵母中产2-PE的代谢途径包括两条，一是由葡萄糖开始的莽草酸从头合成途径，二是由L-苯丙氨酸（L-Phe）经过生物转化生成2-PE的艾氏途径，前者产量很低，主要以艾氏途径作为主。在艾氏途径中， L-苯丙氨酸在转氨酶的作用下转化为苯丙酮酸，再由苯丙酮酸脱羧酶催化脱去了一个羧基形成苯乙醛，苯乙醛在乙醇脱氢酶的作用下产生2-PE。
2-PE的合成的艾氏途径中存在两条分支途径，一是苯乙醛可以在乙醛脱氢酶的作用下氧化为苯乙酸，二是产物2-PE可以在乙酰基转移酶的作用下进一步转化为2-苯乙酰乙酯。因此，利用代谢工程原理和基因工程技术，切断分支途径是减少物质和能量分流，提高目标产物2-PE的菌株改造策略。乙醛脱氢酶产生的分支途径的切断已经有研究报道，Kim等人通过在酿酒酵母W303敲除ALD3、ALD2，以83mg/L L-Phe作为底物，最终2-PE产量较出发菌株提高了约35%[ Kim, B., B.R. Cho, and J.S. Hahn, Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for the production of 2-phenylethanol via Ehrlichpathway. Biotechnol Bioeng, 2014. 111(1): p. 115-24.]。
但是，乙酰基转移酶催化的分支途径尚未有相关报道。2-PE的合成后可以在乙酰基转移酶的作用下进一步转化为2-苯乙酰乙酯，降低了2-PE产量，同时增加了副产物。因此，如果抑制苯乙酰乙酯的产生既可以提高2-PE积累又降低了副产物，一举两得。酿酒酵母乙酰基转移酶主要由ATF1基因编码，本申请就是利用基因编辑技术对产2-PE的产生菌酿酒酵母的ATF1基因进行敲除，从而达到上述目的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请的目的在于设计提供一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法的技术方案。本申请首先构建了酿酒酵母高效的基因编辑系统，并对2-PE代谢途径中的乙酰基转移酶主要由ATF1进行敲除，通过该方法可以提高菌株的2-PE产量。
本申请具体通过以下技术方案实现：
所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于该系统包括CAS9质粒、gRNA质粒和供体DNA，所述CAS9质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统在敲除酿酒酵母ATF1基因中的应用。
进一步，利用所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除酿酒酵母ATF1基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将CRISPR/Cas9基因编辑系统中的Cas9质粒转化到酿酒酵母菌株中；
2）以步骤1）得到的菌株作为受体，将gRNA质粒和供体DNA一起转化导入；
3）在含有潮霉素和G418的双抗平板上挑选获得候选阳性转化子，即得到敲除ATF1基因的酿酒酵母。
进一步，所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统在提高酿酒酵母2-苯乙醇产量中的应用。
进一步，所述的一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除酿酒酵母的ATF1基因；
2）利用该敲除ATF1基因的酿酒酵母进行发酵。
进一步，所述的一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法，其特征在于该CRISPR/Cas9基因编辑系统包括CAS9质粒、gRNA质粒和供体DNA，所述CAS9质粒的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述gRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本申请能够对产2-PE的酿酒酵母乙酰基转移酶（ATF1基因）催化的分支途径进行敲除，抑制2-PE进一步转化为苯乙酰乙酯，提高了2-PE产量，又降低了副产物进而提高后续分离2-PE的纯度，降低了生产成本。
附图说明
图1为CAS9质粒图谱；
图2为gRNA质粒图谱；
图3为ATF1基因敲除转化子PCR鉴定，图3中：M，DNA标准分子量Marker；WT，野生型菌株；1，2，菌株PK2-C的ATF1基因敲除菌株；3，菌株LQ-2020-1的ATF1基因敲除菌株。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
本申请涉及的酿酒酵母菌株及培养基为：
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）PK2-C菌株(常规实验室酿酒酵母菌株)、安琪酵母酿酒酵母菌株（市购），由浙江工业大学微生物研究所保存。
酵母菌株在完全培养基YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，若制固体培养基，加入2%琼脂粉）上30℃恒温培养。
实施例1：CRISPR/Cas9基因编辑系统构建
本申请的CRISPR/Cas9基因编辑系统系统包括CAS9质粒、gRNA质粒和供体（Donor）DNA。
1）CAS9质粒
质粒特征：KanR；f1 ori with PTEF1，PT3，PAmpR；AmpR；PT3-CAS9-TCYC1。
该质粒图谱见图1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2）gRNA质粒
质粒特征：
HygR；2μ ori with PTEF1,PT3,PAmpR；AmpR；PSNR52-sgRNA-TSUP4；
该质粒图谱见附图2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
构建gRNA时，选择目标基因ATF1相关的PAM位点是通过由http://yeastriction.tnw.tudelft.nl 网站提供的在线软件预测获得。本申请中用于ATF1基因敲除编辑用的gRNA序列为：CAAATATTCTATATGCGATT。
将该序列通过反向PCR的方式构建质粒ATF1-gRNA，以空gRNA质粒作为模板，通过引物对ATF1 g1-F/ATF1 g1-R进行扩增。
ATF1 g1-F：
5-CAAATATTCTATATGCGATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAG-3（如SEQ IDNO.7所示）；
ATF1 g1-R：5-AATCGCATATAGAATATTTGGATCATTTATCTTTCACTGCGGAG-3（如SEQ IDNO.8所示）；
PCR反应结束后，反应液利用DpnⅠ酶处理消除模板，然后经DNA纯化后转化到大肠杆菌Dh5α中，繁殖后提取得到的质粒经测序确认正确后用于下一步转化。
3）供体（Donor）DNA
供体DNA来源于目标基因ATF1（GenBank Accession number NC_001147.6），由其上下游的序列经过PCR扩增获得，获得的片段中去除了目标基因编码区，因而成为无蛋白质编码功能的序列片段，即供体DNA，经过转化进入酵母细胞后，通过基因编辑将原目标基因ATF1替换，从而使酵母丧失ATF1基因功能。
ATF1基因上下游及编码区序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中ATF1基因上游序列的核苷酸序列如如SEQ ID NO.5所示，ATF1基因下游序列的核苷酸序列如如SEQID NO.6所示。
供体DNA片段的PCR扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别扩增上下游片段，然后将两个片段通过重叠延伸PCR连接成一个片段，即供体DNA。
上游片段扩增的引物对为ATF1 L500-F/ ATF1 L-R，下游片段扩增的引物对为ATF1 R-F / ATF1 R500 –R。各引物序列如下：
ATF1 L500-F：5-CTGACACCCGGATAATTAAGAAGTG-3（如SEQ ID NO.9所示）；
ATF1 L-R：5-ATATCAGTCAAGCATCATGTGAGATGAGAGCTGATAAATTGATGGTATTT-3（如SEQID NO.10所示）；
ATF1 R-F：5-AAATACCATCAATTTATCAGCTCTCATCTCACATGATGCTTGACTGATAT-3（如SEQID NO.11所示）；
ATF1 R500–R：5-GCATTTGTTTGTAGCTTTGCATTG-3（如SEQ ID NO.12所示）。
通过PCR扩增后获得的供体DNA序列为去除了中间编码区的上下游序列重组片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。扩增获得的供体DNA用于酿酒酵母转化。
4）CRISPR/CAS9系统建立及操作
将Cas9质粒先转化到酿酒酵母菌株中，再以该菌株为受体，然后将ATF1基因的gRNA质粒和供体DNA一起转化导入，在含有潮霉素和G418的双抗平板上挑选获得候选阳性转化子。
5）酵母转化
酵母转化方法采取醋酸锂介导的转化方法。
6）分子鉴定
候选阳性转化子通过传代后，通过菌落PCR的方式来确定ATF1基因的缺失。
引物对：ATF1 L500-F：5-CTGACACCCGGATAATTAAGAAGTG-3（如SEQ ID NO.13所示）；
ATF1 R500–R：5-GCATTTGTTTGTAGCTTTGCATTG-3（如SEQ ID NO.14所示）。
实施例2：ATF1基因敲除菌株的2-PE产量研究
将过夜培养的ATF1基因敲除菌株的种子培养液调整到107个/mL，取5mL接种到发酵培养基中，装液量为50mL/250mL,并在30℃、200rpm的培养条件下连续发酵36h。
发酵培养基：5g/L L-苯丙氨酸、30g/l葡萄糖、0.5g/l硫酸镁、5g/l磷酸二氢钾、1.5g/L酵母提取物。
发酵结束后，发酵液离心除去菌体，上清液中进行2-PE测定。
实施例3：2-PE测定方法
采用气相色谱，通过内标法进行测定。
样品预处理：发酵液离心取上清液200uL，加入200uL内标溶液（甲基异丁基甲醇1g/L水溶液），加入500uL乙酸乙酯，震荡混匀，离心5000 rpm, 1 min，取上层有机相，进样量1 uL。
标准曲线制作：配制标准浓度的苯乙醇水溶液0.5、1.0、5.0、10.0 g/L。同上处理。
气相色谱: 岛津GC2014；FID检测器；柱Rtx-1(30m*0.25mm*0.25um, Restek)；载气：氮气；进样口：240℃；分流；分流比：49.0；柱流量：1.45 mL/min；吹扫流量：3 mL/min；检测器：250℃；柱箱：80℃维持1min,20℃/min升温至200℃。
实施例4：提高菌株PK2-C 2-苯乙醇产量的方法
按照上述基因编辑方法，对菌株PK2-C的ATF1基因进行敲除，获得了敲除菌株。ATF1的敲除菌株PCR鉴定结果见图3，扩增出了编辑后预期长度DNA片段。图3泳道1、2。图3说明：WT泳道为野生型中完整的ATF1基因，长度为2655 bp；1,2,3泳道为ATF1基因敲除后扩增的无功能编码区片段，长度为1077bp。
敲除菌株在YPD平板上活化培养后，转接到发酵培养基进行发酵转化，对2-PE产量进行研究。发酵液经过上述方法处理后测定2-PE产量，结果：出发菌株PK2-C的2-PE产量为0.21 g/L，ATF1基因敲除后的菌株2-PE产量为0.45 g/L，产量显著提高。
实施例4：提高安琪酵母酿酒酵母菌株 2-苯乙醇产量的方法
按照上述基因编辑方法，对安琪酵母酿酒酵母菌株的ATF1基因进行敲除，获得了敲除菌株。ATF1的敲除菌株PCR鉴定结果见图3，扩增出了编辑后预期长度DNA片段。图3泳道3。图3说明：WT泳道为野生型中完整的ATF1基因，长度为2655 bp；1,2,3泳道为ATF1基因敲除后扩增的无功能编码区片段，长度为1077bp。
敲除菌株在YPD平板上活化培养后，转接到发酵培养基进行发酵转化，对2-PE产量进行研究。发酵液经过上述方法处理后测定2-PE产量，结果:出发菌株安琪酵母酿酒酵母菌株的2-PE产量为1.63g/L，ATF1基因敲除后的菌株2-PE产量为1.85 g/L，产量提高了13.49%，产量显著提高。
序列表
<110> 浙江工业大学绍兴研究院
<120> 一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9440
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 1
tttaatttct ttttttactt tctattttta atttatatat ttatattaaa aaatttaaat 60
tataattatt tttatagcac gtgatgaaaa ggacccaggt ggcacttttc ggggaaatgt 120
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 180
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tgacttgcgg ttgatctatc tcgcgctggc gcatatgatc aaatttcggg gacacttcct 3240
catcgagggg gacctgaacc cagacaacag cgatgtcgac aaactcttta tccaactggt 3300
tcagacttac aatcagcttt tcgaagagaa cccgatcaac gcatccggag ttgacgccaa 3360
agcaatcctg agcgctaggc tgtccaaatc ccggcggctc gaaaacctca tcgcacagct 3420
ccctggggag aagaagaacg gcctgtttgg taatcttatc gccctgtcac tcgggctgac 3480
ccccaacttt aaatctaact tcgacctggc cgaagatgcc aagcttcaac tgagcaaaga 3540
cacctacgat gatgatctcg acaatctgct ggcccagatc ggcgaccagt acgcagacct 3600
ttttttggcg gcaaagaacc tgtcagacgc cattctgctg agtgatattc tgcgagtgaa 3660
cacggagatc accaaagctc cgctgagcgc tagtatgatc aagcgctatg atgagcacca 3720
ccaagacttg actttgctga aggcccttgt cagacagcaa ctgcctgaga agtacaagga 3780
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ggaggaattt tacaaattta ttaagcccat cttggaaaaa atggacggca ccgaggagct 3900
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catcccccac cagattcacc tgggcgaact gcacgctatc ctcaggcggc aagaggattt 4020
ctaccccttt ttgaaagata acagggaaaa gattgagaaa atcctcacat ttcggatacc 4080
ctactatgta ggccccctcg cccggggaaa ttccagattc gcgtggatga ctcgcaaatc 4140
agaagagacc atcactccct ggaacttcga ggaagtcgtg gataaggggg cctctgccca 4200
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ggacctcctc ttcaagacga accggaaagt taccgtgaaa cagctcaaag aagactattt 4440
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atccctggga acgtatcacg atctcctgaa aatcattaaa gacaaggact tcctggacaa 4560
tgaggagaac gaggacattc ttgaggacat tgtcctcacc cttacgttgt ttgaagatag 4620
ggagatgatt gaagaacgct tgaaaactta cgctcatctc ttcgacgaca aagtcatgaa 4680
acagctcaag aggcgccgat atacaggatg ggggcggctg tcaagaaaac tgatcaatgg 4740
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tagcccagct atcaaaaagg gaatactgca gaccgttaag gtcgtggatg aactcgtcaa 4980
agtaatggga aggcataagc ccgagaatat cgttatcgag atggcccgag agaaccaaac 5040
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catcaatcgg ctctccgact acgacgtgga tcatatcgtg ccccagtctt ttctcaaaga 5280
tgattctatt gataataaag tgttgacaag atccgataaa aatagaggga agagtgataa 5340
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cgaagataat gagcagaagc agctgttcgt ggaacaacac aaacactacc ttgatgagat 6540
catcgagcaa ataagcgaat tctccaaaag agtgatcctc gccgacgcta acctcgataa 6600
ggtgctttct gcttacaata agcacaggga taagcccatc agggagcagg cagaaaacat 6660
tatccacttg tttactctga ccaacttggg cgcgcctgca gccttcaagt acttcgacac 6720
caccatagac agaaagcggt acacctctac aaaggaggtc ctggacgcca cactgattca 6780
tcagtcaatt acggggctct atgaaacaag aatcgacctc tctcagctcg gtggagacag 6840
cagggctgac cccaagaaga agaggaaggt gtgatctctt ctcgagtcat gtaattagtt 6900
atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt 6960
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ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt 7080
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gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 7260
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tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 7440
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 7500
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 7560
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 7620
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 7680
cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 7740
agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcct 7800
gtctagagat ctgtttagct tgcctcgtcc ccgccgggtc acccggccag cgacatggag 7860
gcccagaata ccctccttga cagtcttgac gtgcgcagct caggggcatg atgtgactgt 7920
cgcccgtaca tttagcccat acatccccat gtataatcat ttgcatccat acattttgat 7980
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aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 8700
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 8760
attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 8820
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tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 8940
atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 9000
tctaatcagt actgacaata aaaagattct tgttttcaag aacttgtcat ttgtatagtt 9060
tttttatatt gtagttgttc tattttaatc aaatgttagc gtgatttata ttttttttcg 9120
cctcgacatc atctgcccag atgcgaagtt aagtgcgcag aaagtaatat catgcgtcaa 9180
tcgtatgtga atgctggtcg ctatactgct gtcgattcga tactaacgcc gccatccagt 9240
gtcgaaaacg agctctatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 9300
gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg 9360
catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac 9420
cgtcatcacc gaaacgcgcg 9440
<210> 2
<211> 6221
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 2
tttcaaaaaa ccaaaaacgc accggactgt aacgagctac taaaatattg cgaataccgc 60
ttccacaaac attgctcaaa agtatctctt tgctatatat ctctgtgcta tatccctata 120
taacctaccc atccaccttt cgctccttga acttgcatct aaactcgacc tctacatttt 180
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atagaagaaa ccgttcataa ttttctgacc aatgaagaat catcaacgct atcactttct 360
gttcacaaag tatgcgcaat ccacatcggt atagaatata atcggggatg cctttatctt 420
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gaaacttgat gttttctttc gagtatatac aaggtgatta catgtacgtt tgaagtacaa 3240
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ctgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 3480
gtggcaccga gtcggtggtg ctttttttgt tttttatgtc ttcgagtcat gtaattagtt 3540
atgtcacgct tacgttcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt 3600
agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg 3660
ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt 3720
atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcggccgg 3780
tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc actggccgtc gttttacaac 3840
gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 3900
tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 3960
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tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 4080
tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 4140
tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 4200
gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 4260
agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 4320
cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 4380
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gcagggaaac gctcccctca cagacgcgtt gaattgtccc cacgccgcgc ccctgtagag 4680
aaatataaaa ggttaggatt tgccactgag gttcttcttt catatacttc cttttaaaat 4740
cttgctagga tacagttctc acatcacatc cgaacataaa caaccatggg taaaaagcct 4800
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ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt 4920
ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat 4980
cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggaattcagc 5040
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gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac 5220
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gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg 5340
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ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat 5460
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gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc 5700
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ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga ataatctcga 5820
gtcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 5880
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 5940
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 6000
tacgcatgta acattatact gttgaaaagc tgtggtatgg tgcactctca gtacaatctg 6060
ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg 6120
acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg 6180
catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 6221
<210> 3
<211> 1077
<212> DNA
<213> 供体(Donor)
<400> 3
ctgacacccg gataattaag aagtggtaag cttatgttag agtacttgta cttgacaagt 60
aaaatcagaa ttgggaatta tcaattgaga tcacgtgcaa accgaagaaa tgcaaagaag 120
taaggttagg gtttatggac ccaggcagca gaaaattgta gcttcatttg ttggcacagg 180
actattccac ccttagaatt gactttttgg acattgagct aaggttcaat gcactcgatg 240
gtcttctcac ttccgaatat atagatctag cgtgtgagga ctactcattg gcttgcgatt 300
tacggttttt atattttttg ccgcacatca ttttttggcc tggtattgtc atcgcgttga 360
gcggactctg aatataatcc tattgttttt tatggatctc tggaagcgtc tttttgaagc 420
caacccaaca aaaattcgag acaagaaaat aaaaaacggc acttcatcag tatcacaaat 480
accatcaatt tatcagctct catctcacat gatgcttgac tgatattatt cgacaatatg 540
attatgtcgt gtaaataacc cactttcatg ttgtcactcc ctcggctttg gttggttaaa 600
gggacttatc ggtttctttt tttagagttg atttaagatc agatcgaagt aaataacgtg 660
cagaacattg catatgatag ataacaacct atagtatata tttcaaaatc gcgacaaatc 720
tgaaatatta attgatttga ttagctgcag agatcttctc gatgtaagga gctatttaaa 780
tagaaagggt cagaatcgtc gtcctgtggg agctggtata tactaaattg atgaacaact 840
aaaatagcac tctcattgtc attttgggtg tgagacctta agcaaggaga gatattttta 900
atggatgtat tagcgcagcc gttgcttacg gtattccttg gcatattgtc cctgaaaaaa 960
aaccgttgta cactcggata cgcatttttc ggacttctcc cacccaagaa acgcaacttt 1020
tgaagggcgc ctacaccact agaccaacaa ggccaatgca aagctacaaa caaatgc 1077
<210> 4
<211> 2655
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 4
ctgacacccg gataattaag aagtggtaag cttatgttag agtacttgta cttgacaagt 60
aaaatcagaa ttgggaatta tcaattgaga tcacgtgcaa accgaagaaa tgcaaagaag 120
taaggttagg gtttatggac ccaggcagca gaaaattgta gcttcatttg ttggcacagg 180
actattccac ccttagaatt gactttttgg acattgagct aaggttcaat gcactcgatg 240
gtcttctcac ttccgaatat atagatctag cgtgtgagga ctactcattg gcttgcgatt 300
tacggttttt atattttttg ccgcacatca ttttttggcc tggtattgtc atcgcgttga 360
gcggactctg aatataatcc tattgttttt tatggatctc tggaagcgtc tttttgaagc 420
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accatcaatt tatcagctct catgaatgaa atcgatgaga aaaatcaggc ccccgtgcaa 540
caagaatgcc tgaaagagat gattcagaat gggcatgctc ggcgtatggg atctgttgaa 600
gatctgtatg ttgctctcaa cagacaaaac ttatatcgaa acttctgcac atatggagaa 660
ttgagtgatt actgtactag ggatcagctc acattagctt tgagggaaat ctgcctgaaa 720
aatccaactc ttttacatat tgttctacca acaagatggc caaatcatga aaattattat 780
cgcagttccg aatactattc acggccacat ccagtgcatg attatatttc agtattacaa 840
gaattgaaac tgagtggtgt ggttctcaat gaacaacctg agtacagtgc agtaatgaag 900
caaatattag aagaattcaa aaatagtaag ggttcctata ctgcaaaaat ttttaaactt 960
actaccactt tgactattcc ttactttgga ccaacaggac cgagttggcg gctaatttgt 1020
cttccagaag agcacacaga aaagtggaaa aaatttatct ttgtatctaa tcattgcatg 1080
tctgatggtc ggtcttcgat ccactttttt catgatttaa gagacgaatt aaataatatt 1140
aaaactccac caaaaaaatt agattacatt ttcaagtacg aggaggatta ccaattattg 1200
aggaaacttc cagaaccgat cgaaaaggtg atagacttta gaccaccgta cttgtttatt 1260
ccgaagtcac ttctttcggg tttcatctac aatcatttga gattttcttc aaaaggtgtc 1320
tgtatgagaa tggatgatgt ggaaaaaacc gatgatgttg tcaccgagat catcaatatt 1380
tcaccaacag aatttcaagc gattaaagca aatattaaat caaatatcca aggtaagtgt 1440
actatcactc cgtttttaca tgtttgttgg tttgtatctc ttcataaatg gggtaaattt 1500
ttcaaaccat tgaacttcga atggcttacg gatattttta tccccgcaga ttgccgctca 1560
caactaccag atgatgatga aatgagacag atgtacagat atggcgctaa cgttggattt 1620
attgacttca ccccctggat aagcgaattt gacatgaatg ataacaaaga aaatttttgg 1680
ccacttattg agcactacca tgaagtaatt tcggaagctt taagaaataa aaagcatctc 1740
catggcttag ggttcaatat acaaggcttc gttcaaaaat atgtgaacat tgacaaggta 1800
atgtgcgatc gtgccatcgg gaaaagacgc ggaggtacat tgttaagcaa tgtaggtctg 1860
tttaatcagt tagaggagcc cgatgccaaa tattctatat gcgatttggc atttggccaa 1920
tttcaaggat cctggcacca agcattttcc ttgggtgttt gttcgactaa tgtaaagggg 1980
atgaatattg ttgttgcttc aacaaagaat gttgttggta gtcaagaatc tctcgaagag 2040
ctttgctcca tttacaaagc tctcctttta ggcccttaga tctcacatga tgcttgactg 2100
atattattcg acaatatgat tatgtcgtgt aaataaccca ctttcatgtt gtcactccct 2160
cggctttggt tggttaaagg gacttatcgg tttctttttt tagagttgat ttaagatcag 2220
atcgaagtaa ataacgtgca gaacattgca tatgatagat aacaacctat agtatatatt 2280
tcaaaatcgc gacaaatctg aaatattaat tgatttgatt agctgcagag atcttctcga 2340
tgtaaggagc tatttaaata gaaagggtca gaatcgtcgt cctgtgggag ctggtatata 2400
ctaaattgat gaacaactaa aatagcactc tcattgtcat tttgggtgtg agaccttaag 2460
caaggagaga tatttttaat ggatgtatta gcgcagccgt tgcttacggt attccttggc 2520
atattgtccc tgaaaaaaaa ccgttgtaca ctcggatacg catttttcgg acttctccca 2580
cccaagaaac gcaacttttg aagggcgcct acaccactag accaacaagg ccaatgcaaa 2640
gctacaaaca aatgc 2655
<210> 5
<211> 501
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 5
ctgacacccg gataattaag aagtggtaag cttatgttag agtacttgta cttgacaagt 60
aaaatcagaa ttgggaatta tcaattgaga tcacgtgcaa accgaagaaa tgcaaagaag 120
taaggttagg gtttatggac ccaggcagca gaaaattgta gcttcatttg ttggcacagg 180
actattccac ccttagaatt gactttttgg acattgagct aaggttcaat gcactcgatg 240
gtcttctcac ttccgaatat atagatctag cgtgtgagga ctactcattg gcttgcgatt 300
tacggttttt atattttttg ccgcacatca ttttttggcc tggtattgtc atcgcgttga 360
gcggactctg aatataatcc tattgttttt tatggatctc tggaagcgtc tttttgaagc 420
caacccaaca aaaattcgag acaagaaaat aaaaaacggc acttcatcag tatcacaaat 480
accatcaatt tatcagctct c 501
<210> 6
<211> 576
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 6
atctcacatg atgcttgact gatattattc gacaatatga ttatgtcgtg taaataaccc 60
actttcatgt tgtcactccc tcggctttgg ttggttaaag ggacttatcg gtttcttttt 120
ttagagttga tttaagatca gatcgaagta aataacgtgc agaacattgc atatgataga 180
taacaaccta tagtatatat ttcaaaatcg cgacaaatct gaaatattaa ttgatttgat 240
tagctgcaga gatcttctcg atgtaaggag ctatttaaat agaaagggtc agaatcgtcg 300
tcctgtggga gctggtatat actaaattga tgaacaacta aaatagcact ctcattgtca 360
ttttgggtgt gagaccttaa gcaaggagag atatttttaa tggatgtatt agcgcagccg 420
ttgcttacgg tattccttgg catattgtcc ctgaaaaaaa accgttgtac actcggatac 480
gcatttttcg gacttctccc acccaagaaa cgcaactttt gaagggcgcc tacaccacta 540
gaccaacaag gccaatgcaa agctacaaac aaatgc 576
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 7
caaatattct atatgcgatt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aag 53
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 8
aatcgcatat agaatatttg gatcatttat ctttcactgc ggag 44
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 9
ctgacacccg gataattaag aagtg 25
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 10
atatcagtca agcatcatgt gagatgagag ctgataaatt gatggtattt 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 11
aaataccatc aatttatcag ctctcatctc acatgatgct tgactgatat 50
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 12
gcatttgttt gtagctttgc attg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 13
ctgacacccg gataattaag aagtg 25
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物( primer )
<400> 14
gcatttgttt gtagctttgc attg 24

Claims (6)

1.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于该系统包括CAS9质粒、gRNA质粒和供体DNA，所述CAS9质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA质粒的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统在敲除酿酒酵母ATF1基因中的应用。
3.利用权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除酿酒酵母ATF1基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将CRISPR/Cas9基因编辑系统中的Cas9质粒转化到酿酒酵母菌株中；
2）以步骤1）得到的菌株作为受体，将gRNA质粒和供体DNA一起转化导入；
3）在含有潮霉素和G418的双抗平板上挑选获得候选阳性转化子，即得到敲除ATF1基因的酿酒酵母。
4.如权利要求1所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑系统在提高酿酒酵母2-苯乙醇产量中的应用。
5.一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除酿酒酵母的ATF1基因；
2）利用该敲除ATF1基因的酿酒酵母进行发酵。
6.如权利要求5所述的一种提高酿酒酵母2-苯乙醇产量的方法，其特征在于该CRISPR/Cas9基因编辑系统包括CAS9质粒、gRNA质粒和供体DNA，所述CAS9质粒的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述gRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105385615A (zh) * 2015-12-28 2016-03-09 天津科技大学 一株高产酯低产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建与应用
CN110760453A (zh) * 2019-10-23 2020-02-07 波顿（上海）生物技术有限公司 一种高产乙酸苯乙酯的基因工程酵母菌株及其构建方法和生产乙酸苯乙酯的方法

Patent Citations (2)

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Non-Patent Citations (1)

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Title
李瑞花: "利用CRISPR/Cas9技术构建Drosha、XRCC6、RNase L基因编辑细胞系", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》, 15 September 2016 (2016-09-15) *

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