CN112011473A - 一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种低产2‑苯乙醇的基因工程菌，所述基因工程菌是由酿酒酵母将ARO80基因全部缺失得到。ARO80基因编码的转录因子Aro80p，在存在芳香族氨基酸时，激活芳香族氨基酸分解代谢基因的转录，促进氨基酸氨基转移酶Ⅰ和芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅱ的合成。ARO80基因的缺失，阻碍ARO9和ARO10基因表达的激活，从而调控艾氏途径中2‑苯乙醇的合成，获得低产2‑苯乙醇的酿酒酵母菌株。本发明所述基因工程菌应用于液态发酵法生产白酒中。

Description

一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种低产2-苯乙醇的酿酒酵母基因工程菌及其应用。

背景技术

白酒中的风味物质主要有高级醇类、酯类、醛类等。其中，高级醇是形成白酒风味和口感的重要的化学物质之一。适宜的高级醇含量具有使白酒口感和香气丰满，酒体柔和协调的作用，但过量的高级醇是白酒异杂味的主要来源，也是导致白酒饮后上头的重要原因。作为高级醇中重要的成分之一，2-苯乙醇对白酒风格有较大的影响，适量的2-苯乙醇可以给白酒酒体带来玫瑰香味，过量的2-苯乙醇则会给酒体带来酯类的酸味。因而，在白酒酿造过程中，应尽量控制2-苯乙醇的形成。当前国内大部分白酒生产厂家采用的是液态法酿制白酒，液态法酿造白酒具有出酒率高，机械化程度较高，利于自动化等优点。但是采用此工艺酿造的白酒，由于工艺上的缺陷，不可避免地存在高级醇含量较高的问题，在口味上不能很好的表现出其应有的特色。此外，分子量越大的高级醇的毒性则越强，研究证明了高级醇对人体的肝脏有毒害作用。人体在长时间饮用高级醇含量高的酒精饮料后，肾病发生率会显著增大，出现慢性中毒。因此，如何将酒中各种高级醇的含量控制在合适的范围内，是酿酒行业一直关注的课题。作为高级醇中重要的风味物质之一，控制液态法白酒中高级醇的含量，首先要解决的就是2-苯乙醇含量过高的问题。液态法白酒中的2-苯乙醇含量一般为固态法白酒的三倍以上，除了给白酒带来异杂味儿以外，作为多碳醇，饮后不易代谢，副作用明显，这是阻遏液态法白酒发展的主要原因之一。工业上为了降低液态法白酒中2-苯乙醇含量通常会通过改变发酵工艺来调整发酵培养基成分，例如调整培养基中碳氮源比例，但是此方法往往导致酿酒酵母生成的多种风味物质发生较大改变，从而导致酒体风格的差异。此外，工业上还会通过增大酵母接种量，减少发酵过程中酵母的增殖倍数，从而减少增殖过程中高级醇的形成。但是过高的酵母接种量会使酵母过早的进入衰亡期，发酵提前终止，这将导致白酒发酵不充分，严重影响白酒风味物质的形成和品质。

酿酒酵母中合成2-苯乙醇的途径可分为两个部分：莽草酸途径和艾氏途径。酿酒酵母通过莽草酸途径合成2-苯乙醇的代谢途径长、支路多，并存在多种抑制作用，因此通过莽草酸途径合成2-苯乙醇的产量很低。在艾氏途径中，L-苯丙氨酸经芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ或酶Ⅱ催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶催化下脱羧生成苯乙醛，苯乙醛在醇脱氢酶催化下脱氢生成2-苯乙醇。在2-苯乙醇合成的艾氏途径中，参与2-苯乙醇合成的两个重要的同工酶，即芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ和芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅱ，分别由ARO8和ARO9基因编码。ARO80基因编码的转录因子Aro80p属于Zn2Cys6蛋白家族的一员。它对芳香族氨基酸产生应答而激活ARO9和ARO10的表达。已有很多相关的报道针对这两条途径对2-苯乙醇的代谢进行调控，Rossouw等人(Rossouw,D.,Naes,T.,&Bauer,F.F.(2008).Linking gene regulation and the exo-metabolome:a comparativetranscriptomics approach to identify genes that impact on the production ofvolatile aroma compounds in yeast.BMC genomics,9,530.

https://doi.org/10.1186/1471-2164-9-530)发现在葡萄酒酵母VIN13中过量表达BAT1基因能显著提高异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇的产量。Aoki和Uchida(Aoki,T.,&Uchida,K..(2014).Amino acids-uptake deficient mutants of zygosaccharomycesrouxii with altered production of higher alcohols.Agricultural&BiologicalChemistry,55(11),2893-2894.https://doi.org/10.1080/00021369.1991.10857905)用亚硝基胍对野生菌株进行诱变，筛选得到一株氨基酸吸收突变株，该菌株吸收苯丙氨酸的能力大大降低，2-苯乙醇的生成量分别下降了91％。诱变育种虽然方法简单易操作，但是诱变方向很难掌握，盲目性大，需要处理大量试验菌株，也很难将不同的目的性状集中在同一株菌株上，并且菌株易发生回复突变。而且通过此方法调控高级醇代谢，选育得到的突变株多为氨基酸营养缺陷型，需在富含相应氨基酸的培养条件下生长。诸多缺点使诱变在育种的实际应用中受到不少限制。近些年来，随着酿酒酵母代谢途径的深入研究和分子生物技术的飞速发展，采用基因工程手段对酿酒酵母进行定向改造，选育出具有适宜高级醇生成量的优良菌株重点研究方向。

发明内容

本发明的目的是解决酿酒酵母菌株在液态法白酒生产中产生2-苯乙醇含量较高的问题，通过调控酿酒酵母生成2-苯乙醇的艾氏途径，构建低产2-苯乙醇的酿酒酵母菌株。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌是由酿酒酵母将ARO80基因全部缺失得到。

ARO80基因编码的转录因子Aro80p，在存在芳香族氨基酸时，激活芳香族氨基酸分解代谢基因的转录，促进氨基酸氨基转移酶Ⅰ和芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅱ的合成。ARO80基因的缺失，阻碍ARO9和ARO10基因表达的激活，从而调控艾氏途径中2-苯乙醇的合成，获得低产2-苯乙醇的酿酒酵母菌株。

优选地，所述ARO80基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述ARO80基因在NCBI中可查询的Gene ID为：852031。

优选地，所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15的单倍体菌株α5。

在本发明的一种具体实施方式中，所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，通过同源重组的方法敲除其ARO80基因得到。

在本发明的一种具体实施方式中，所述基因工程菌可以通过如下步骤得到：

(1)以酿酒酵母的基因组为模板，PCR扩增得到ARO80基因的上、下游序列的DNA分子片段；

(2)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)所述上、下游序列的DNA分子片段以及筛选标记基因转化至所述酿酒酵母中，通过同源重组得到敲除了ARO80基因的重组菌株；

(3)采用Cre-loxP重组系统敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因；

(4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失，获得酿酒酵母重组菌。

优选地，所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。

本发明另一目的是提供上述基因工程菌在液态发酵法生产白酒中的应用。

在本发明的一种具体实施方式中，所述液态发酵法生产白酒是以本发明所述基因工程菌作为生产菌株，以高粱为原料，制备高粱水解液作为发酵培养基，接种所述基因工程菌，静置发酵。

有益效果：

本发明提供的低产2-苯乙醇酿酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，抑制芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ和芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅱ的表达，调控酵母代谢中2-苯乙醇的艾氏合成途径，达到了降低2-苯乙醇的效果，为酿造风味良好，口感独特的液态法白酒奠定了理论基础。

本发明基因工程菌2-苯乙醇生成量显著降低。在经过液态法发酵后，原始菌株α5的2-苯乙醇生成量是131.06mg/L，本发明得到的缺失ARO80基因的重组菌株α5-ΔARO80-k-p的2-苯乙醇生成量为64.59mg/L，相比较亲本菌株降低了50.72％。

本发明基因工程菌发酵性能及生长性能良好，未出现生长发酵受抑制或其他负面情况。特别地，本发明提供的缺失ARO80基因的酿酒酵母菌株实现了在降低2-苯乙醇含量的同时提升了酯类物质的含量，有效降低了醇酯比，显著改善了液态法白酒的风味。

附图说明

图1：实施例中重组菌株α5-ΔARO80-k-p的构建流程图。

图2：实施例中ARO80A、ARO80B、loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。

图3：实施例中重组菌株α5-ΔARO80的验证电泳图。

图4：实施例中重组菌株α5-ΔARO80-k(敲除KanMX抗性基因)的验证电泳图。

图5：实施例中重组菌株α5-ΔARO80-k-p(丢弃pSH-Zeocin质粒)的验证电泳图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，酿酒酵母α5仅为其中一种较佳的实施方式，其来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15(保藏编号为No.CICC32315)的单倍体菌株。

实施例1：缺失ARO80基因的酿酒酵母菌株的构建

以酿酒酵母α5(Li,W.,Wang,J.H.,Zhang,C.Y.,Ma,H.X.,&Xiao,D.G.(2017).Regulation of Saccharomyces cerevisiae genetic engineering on the productionof acetate esters and higher alcohols during Chinese Baijiufermentation.Journal of industrial microbiology&biotechnology,44(6),949–960.https://doi.org/10.1007/s10295-017-1907-2)为宿主菌，通过同源重组的方法构建缺失ARO80基因的重组基因工程菌株。

具体的构建步骤详述如下：

(1)以出发菌株酿酒酵母α5的基因组为模板，以ARO80A-F和ARO80A-R为引物，利用PCR扩增得到ARO80基因的上游DNA分子片段ARO80A(1779bp)；以酿酒酵母α5基因组为模板，以ARO80B-F和ARO80B-R为引物利用PCR扩增得到ARO80基因的下游DNA分子片段ARO80B(1758bp)。

(2)以质粒pUG6为模板，以ARO80K-F和ARO80K-R为引物利用PCR扩增得到含有KanMX标记基因的PCR产物片段loxP-KanMX-loxP(1663bp)。KanMX标记基因也可以从其他含有其基因序列的质粒上获取或者直接合成其DNA分子片段。

附图2是ARO80A、ARO80B、loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以酿酒酵母α5基因组为模板，ARO80A-F和ARO80A-R为引物对PCR扩增的结果(1779bp单一条带)；2泳道是以酿酒酵母α5基因组为模板，ARO80B-F和ARO80B-R为引物对PCR扩增的结果(1758bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，ARO80K-F和ARO80K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。

(3)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)和(2)获得的PCR产物片段ARO80A、ARO80B中间连入loxP-KanMX-loxP转化到所述出发菌株中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的酵母菌落，提取纯化后的酵母菌株的DNA作为模板，分别以ARO80-M1-U/ARO80-M1-D和ARO80-M2-U/ARO80-M2-D为引物，利用PCR进行转化子的定点验证，分别得到长度为2071bp和2372bp的正确条带。即为正确的阳性转化子，记为重组菌株α5-ΔARO80。

附图3是重组菌株α5-ΔARO80的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株α5-ΔARO80的基因组为模板，ARO80-M1-U与ARO80-M1-D为引物对PCR扩增得到的片段(2071bp单一片段)；2泳道是以重组菌株α5-ΔARO80的基因组为模板，ARO80-M2-U与ARO80-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(2372bp单一片段)；3泳道是以α5的基因组为模板，ARO80-M1-U与ARO80-M1-D为引物对PCR扩增得到的结果；4泳道是以α5基因组为模板，ARO80-M2-U与ARO80-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果。

(4)利用Cre-loxP重组系统，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤(3)的重组菌株中，分别以重组菌株α5-ΔARO80的基因组和转化子的基因组为模板，以K-F与K-R为引物利用PCR扩增，以重组菌株α5-ΔARO80为模板进行PCR扩增得到的片段1613bp，而在以转化子的基因组为模板的PCR扩增中，无条带，证明得到剔除KanMX抗性标记的转化子，记为重组菌株α5-ΔARO80-k。

附图4是重组菌株α5-ΔARO80-k的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNAmarker；1泳道是以重组菌株α5-ΔARO80的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2泳道是以α5-ΔARO80-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果。

(5)将步骤(4)所得重组菌株α5-ΔARO80-k进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，以Zn-F与Zn-R为引物进行PCR扩增，此外，提取pSH-Zeocin质粒为模板并以Zn-F与Zn-R为引物进行PCR扩增，PCR结果出现1172bp的条带，而以传代后菌株的基因组为模板，无条带。证明获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，记为α5-ΔARO80-k-p。

附图5是重组菌株α5-ΔARO80-k-p的验证电泳图。其中，M泳道是DL5000 DNAmarker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以α5-ΔARO80-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。

本实施例中所用PCR引物的核苷酸序列如表1所示。

表1 PCR引物序列表

实施例2：重组菌株α5-ΔARO80-k-p液态法白酒发酵实验

(1)发酵工艺路线：

高粱颗粒→粉碎→液化、糖化→加入酸性蛋白酶→冷却→过滤→高粱汁糖度调整→分装→灭菌→接种、发酵→蒸馏；

(2)主要的工艺条件如下：

粉碎条件：粉碎度以没有整粒的高粱为宜，粉碎程度不易过细，以免造成过滤压力过大；

液化、糖化条件：粉碎后的高粱以料水比1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，90℃保持60min，进行液化。调节水浴锅温度至60℃，保持30min，进行糖化。液化和糖化过程中每隔5min充分搅拌一次；糖化完成后，调节水浴锅温度至40℃，加入酸性蛋白酶搅拌均匀，并保持16h，使蛋白酶充分发挥作用。

过滤条件：使用双层纱布过滤高粱水解液，调节高粱水解液糖度为18度。

灭菌条件：将上述高粱水解液分装至三角瓶中并于115℃灭菌20min。冷却至室温，即为发酵培养基。

(3)发酵实验：

将在相同实验条件下活化好的酿酒酵母出发菌株α5和重组菌株α5-ΔARO80-k-p种子液分别接种到(2)中制备好的发酵培养基中(接种量为5×10⁶CFU/mL)，在30℃的培养箱中静置进行液态法白酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵96h时，出发菌株α5和重组菌株α5-ΔARO80-k-p发酵液的失重不再减小，认为发酵结束，停止培养；测定发酵液的失重、酒精度、残糖以及主要香气成分含量。以失重、酒精度、残糖表征其综合性能，结果见表2。主要香气成分含量结果见表3。

(4)GC分析测定高级醇和酯含量：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分析，色谱条件为：毛细管色谱柱LZP-930，50m×320μm×1.0μm，载气为纯度为99.99％的氮气，分流比1:10。进样口温度200℃，检测器温度200℃，进样量1μL。采用程序升温，50℃保持8min，5℃/min升温，升温至150℃，保持15min。为保持数据的准确性，每个样品进样两次，取平均值。在同一色谱条件下，用已知的高级醇类和酯类标准品色谱峰的保留时间与样品中高级醇类物质色谱峰的保留时间对照进行分析。

表2高粱原料液态法白酒发酵的发酵性能

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值，*p<0.05,**p<0.01。

表2表明：液态法白酒发酵实验时，本发明所获得的酿酒酵母重组菌株与出发菌株相比，发酵性能没有明显变化。这说明本发明中敲除ARO80基因，没有对酿酒酵母α5的发酵性能产生影响。

表3高粱原料液态法发酵白酒的主要香气成分含量(mg/L)

表3表明：就各个高级醇的生成量来看，原始菌株α5的2-苯乙醇生成量是131.06mg/L，本发明重组菌株α5-ΔARO80-k-p的2-苯乙醇生成量为64.59mg/L，相比较亲本菌株降低了50.72％。这说明本发明得到的缺失ARO80基因的重组菌株可以在很大程度上降低液态法白酒中2-苯乙醇的含量，为优化白酒口感，提供了理论基础。

此外经测定，酿酒酵母α5所产乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别为14.00mg/L以及15.56mg/L，总量为29.56mg/L。本发明中缺失ARO80基因的重组菌株α5-ΔARO80-k-p的乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别为15.71mg/L以及18.60mg/L，总量为34.31mg/L，较出发菌株α5提高了16.07％。需要说明的是液态法白酒的醇酯比过高会对白酒的口感产生不好的影响。在白酒酿造中，适当降低高级醇的生成量以提高醇酯比，可显著提升白酒的口感。此基础上，如能继续保持或者提高酯类物质含量则会更进一步地提高白酒的口感。本发明中缺失ARO80基因的重组菌株实现了在降低高级醇的同时还提升了酯类物质的含量，显著提高了液态法白酒的风味。

另外，本发明中，缺失ARO80基因的重组菌株α5-ΔARO80-k-p具有一定的应用价值。在液态法白酒实际生产中，考虑将重组菌株与出发菌株或其他高产2-苯乙醇、高产酯的酿酒酵母菌株/非酿酒酵母菌株按照一定比例进行混菌发酵，可以达到调控白酒中2-苯乙醇含量，并改善白酒香气成分的目的。例如祝霞(祝霞,王媛,刘琦,赵丹丹,韩舜愈,杨学山.混菌发酵对贵人香低醇甜白葡萄酒的香气影响[J].食品与发酵工业,2019,45(04):95-102.)利用以贵人香酿酒葡萄为原料，选用非酿酒酵母和酿酒酵母混菌发酵低醇葡萄酒，赋予酒样强烈花香、果香的同时也增强了酒体香气复杂性和层次感，明显提升了贵人香低醇白葡萄酒的香气品质。赵芳琴(赵芳琴,王诗,赵丹丹,宋茹茹,杨学山,韩舜愈,祝霞.混菌发酵接种比例对美乐低醇葡萄酒香气品质的影响[J].甘肃农业大学学报,2020,55(01):186-195+203.)报道称，将M.pulcherrima 346与S.cerevisia ES488以1∶1的接种比例进行混菌发酵，可有效提升美乐低醇葡萄酒的香气品质。孟金明(孟金明.液态发酵生产大麦酒工艺研究[D].天津科技大学,2016.)在液态发酵生产大麦酒的工艺中，采用酿酒酵母和汉逊酵母顺序接种的混菌发酵方式，所得酒样酯醇比达到1:1，酒的品质有明显提高。因此，本发明中获得的低产2-苯乙醇的基因工程菌对于更为有效调控高级醇含量和风味方面都具有很强的实用性，为白酒产业提供了一株潜力极强的生产菌。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种低产2-苯乙醇的基因工程菌及其应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2853

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atgtctgcta agaaaaggcc ttcgggaaac gcagcatttg aacttccaaa acggagaaga 60

acctaccaag cttgcatcag ctgcagatca aggaaggtga aatgtgatct tggtccggtt 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tatcaagtta gtcgtgggac agctgaagct tcgtacgctg cagg 44

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtgcggtt gtcttggtgc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatcagatcc actagtggcc tatgcaccaa gacaaccgca cta 43

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaaagaaa gcccagaa 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cattatcttc ggctcaaa 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caagactgtc aaggaggg 18

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcagaccgat accagg 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccgtaacaa gggaaa 16

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccacacacc atagcttca 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

Claims (9)

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是由酿酒酵母将ARO80基因全部缺失得到。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ARO80基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母是酿酒酵母AY15的单倍体菌株α5。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，通过同源重组的方法敲除其ARO80基因得到。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过如下步骤构建得到：

(1)以酿酒酵母的基因组为模板，PCR扩增得到ARO80基因的上、下游序列的DNA分子片段；

(2)通过醋酸锂化学转化法，将步骤(1)所述上、下游序列的DNA分子片段以及筛选标记基因转化至所述酿酒酵母中，通过同源重组得到敲除了ARO80基因的重组菌株；

(3)采用Cre-loxP重组系统敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因；

(4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失，获得酿酒酵母重组菌。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。

7.权利要求1-6任一项所述基因工程菌在液态发酵法生产白酒中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述液态发酵法生产白酒是以所述基因工程菌作为生产菌株，以高粱为原料，制备高粱水解液作为发酵培养基，接种所述基因工程菌，静置发酵。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌的接种量为5×10⁶CFU/mL，30℃静置发酵。

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