CN109536420B

CN109536420B - 一株枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109536420B
Application number: CN201811640262.9A
Authority: CN
Inventors: 胡萍
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou Huishui County Fengyuan Trading Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109536420A

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌命名为JP‑2，于2017年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017846；该枯草芽孢杆菌从酱香型窖内酒醅中分离得到，本发明枯草芽孢杆菌具有良好发酵能力和产蛋白酶、淀粉酶的能力，并且产酱香能力优良，芽孢杆菌代谢产生的蛋白酶和淀粉酶可将食品原料中的蛋白质水解成多种氨基酸、淀粉水解为糖类，能在短时间内分解富含蛋白质和碳水化合物的食品原料，使其具有特有的酱香风味，增强食品的营养价值并产生浓郁风味。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，特别是一株具有良好发酵能力和产蛋白酶和淀粉酶的能力的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

芽孢杆菌的菌体呈杆状，形态为长直或接近直，大小为0.3～2.2×1.2～7.0微米。多数运动，鞭毛典型侧生。菌体可形成耐热内生孢子，在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。菌体暴露在空气中并不妨碍孢子的形成，革兰氏染色为阳性呈蓝色。有机化能营养，可利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或者呼吸和发酵二者兼有的代谢。在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数的种可以产生氢氧化物酶，严格好氧或兼性厌氧。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一个种，呈杆状，很少成链，染色均匀，鞭毛侧生。内生孢子的大小为0.8×1.5～1.8微米，游离孢子的表面着色较弱，萌发时芽孢壳赤道裂，营养细胞露出后，孢子壳消解缓慢。菌落形态为圆形或不规则形，菌落直径2～4mm，边缘粗糙。菌落表面粗糙褶皱，白色不透明。

枯草芽孢杆菌除了能形成C₄化合物、挥发性有机酸、吡嗪、酚类和芳香族等挥发性化合物外，还能增强食品的香味浓度。

因此，发掘出株产酱香枯草芽孢杆菌并应用于制备富含高蛋白或高碳水化合物的食品发酵中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种枯草芽孢杆菌及其应用，本发明枯草芽孢杆菌从酱香型窖内酒醅中分离得到，具有良好发酵能力和产蛋白酶、淀粉酶的能力，并且产酱香能力优良，芽孢杆菌代谢产生蛋白酶和淀粉酶可将原料中的蛋白质水解成多种氨基酸，淀粉水解成糖类，能在短时间内分解富含蛋白质和碳水化合物的食物原料，形成酱香风味物质或其前体物质，增强食品的营养价值并产生浓郁风味。

本发明的技术方案：一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌命名为JP-2，于2017年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017846。

一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品，所述制品的活性成分包括前述的枯草芽孢杆菌。

一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品，所述制品的活性成分是前述的枯草芽孢杆菌。

前述的富含蛋白质和碳水化合物的制品，所述制品还包括用于制备富含蛋白质和碳水化合物制品的常规成分和/或用于培养所述的枯草芽孢杆菌的培养基成分。

一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品的制备方法，采用前述的枯草芽孢杆菌作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

一种制备富含蛋白质和/或碳水化合物食品的方法，在制备过程中添加和/或使用前述的制品。

一种具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

一种具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

前述的具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明从酱香酒醅中分离出一株枯草芽孢杆菌，具有优良的产酱香能力，且具有产蛋白酶、淀粉酶能力，芽孢杆菌代谢产生蛋白酶和淀粉酶可将原料中的蛋白质水解成多种氨基酸，淀粉水解成糖类，能在短时间内分解富含蛋白质和碳水化合物的食物原料，形成酱香风味物质或其前体物质，增强食品的营养价值并产生浓郁风味。

2、该枯草芽孢杆菌经过本发明的培养基优优化后具有更强的产蛋白酶、淀粉酶的能力，并且能产生更好风味。

3、本发明的芽孢杆菌耐高温，为应用中的运输和保存提供便利。

附图说明

图1是JP-2镜检图；

图2是JP2-系统发育树图；

图3是4株芽孢杆菌发酵大豆的评分图；

图4是发酵后的大豆图；

图5是酪氨酸标准曲线图；

图6是葡萄糖标准曲线图；

图7是发酵时间对JP-2菌株产蛋白酶活力的影响；

图8是发酵时间对JP-2菌株产淀粉酶活力的影响；

图9是温度对JP-2菌株产蛋白酶活力的影响；

图10是温度对JP-2菌株产淀粉酶活力的影响；

图11是接种量对JP-2菌株产蛋白酶活力的影响；

图12是接种量对JP-2菌株产淀粉酶活力的影响。

具体实施方式

实施例1：

本发明枯草芽孢杆菌(命名为JP-2)是从酱香型酒醅中分离获得到的，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017846；镜检图如图1。

1、枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017846的鉴定

(1)菌体形态

将分离的枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2017846在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养48h后菌落为圆形，白色不透明，光学显微镜下观察到杆状细胞(图1)，大多数运动，鞭毛周生，细胞为0.6～0.8×3～5μm，革兰氏染色均匀，并可见细胞中被染成蓝紫色芽孢。

(2)细菌的16S rRNA分子学鉴定

提取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNA Kit试剂盒说明书进行，提取得到DNA后PCR扩增测序(16s rDNA序列测定由上海生工生物工程有限公司进行序列测定)，得到结果如图2，鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，命名为JP-2。

实施例2：

本发明提供一株枯草芽孢杆菌微生物菌剂应用于富含高蛋白和/或高碳水化合物的食品中，也可根据实际的生产条件及产品进行相应的调整；枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备步骤如下：

1)种子液的制备：将保藏于-80℃的枯草芽孢杆菌放置于4℃的环境中，待其解冻后于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线于37℃培养24小时，从培养基上挑取一环菌苔接种至装有牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，在37℃下，160r/min摇床振荡培养18h，然后将培养液于温度为4℃的离心机中在转速为4000r/min离心3min，弃去上清液取沉淀用生理盐水洗涤1次，离心收集菌体，加入生理盐水调整浓度为10⁸CFU/mL得到种子液；

2)接种培养：接9％的种子液于发酵培养基上于37℃下发酵72h，待培养基中孢子含量≥1000亿/克时停止发酵，将其磨成粉末得到微生物菌剂。

步骤2)中所述的发酵培养基的制备方法如下：将高粱、小麦、麸皮按1:1:1的质量比混匀，加入三者总重量60％的水，浸润20h，放入蒸笼铺平，蒸30min至高粱、小麦、麸皮变色熟透后冷却至室温打散，121℃灭菌15min得到发酵培养基。

且所述的高粱与小麦是将干燥高粱、干燥小麦破碎为高粱沙、高粱粉以及小麦沙和小麦粉且添加沙与粉的比例都为1：1。

实施例3：

1枯草芽孢杆菌产酱香性能测定

1.1材料与设备

1.1.1菌种

实验菌株为4株芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌(JP-2)、蜡样芽孢杆菌(CP-3)、2株纳豆芽孢杆菌(ND-1、ND-2)，其中枯草芽孢杆菌从贵州某酱香酒厂的窖内酒醅中分离得到，蜡样芽孢杆菌从酱香成品酒曲分离得到，2株纳豆芽孢杆菌从日本纳豆中分离得到。

1.1.2实验试剂

生理盐水，0.85g氯化钠，蒸馏水100mL；0.1mol/L盐酸；0.1mol/L氢氧化钠；平板计数琼脂(PCA)：上海博微生物科技有限公司。

牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。

大豆培养基：大豆原产地为贵州大方。大豆：水量的体积比为1:4，浸泡过夜14h，称40g的大豆装入250ml的三角瓶中，纱布封口，121℃灭菌20min。

1.1.3实验仪器与设备

电子分析天平：上海青海仪器有限公司；LS-B75L-I立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；XW-80涡旋混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；HPX-9082MBE数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TGL20M台式高速冷冻离心机：长沙麦佳森仪器设备有限公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市试验设备厂；HPX-9082MBE数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

1.2实验方法

1.2.1种子液制备

将活化的菌株挑取几环菌苔接种至装有牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中。37℃，160r/min摇床振荡培养18h。菌液4000r/min离心3min，沉淀再用生理盐水洗涤1次，离心收集菌体，用生理盐水配制一定的浓度，使其菌落数达到10⁸CFU/mL。

1.2.2枯草芽孢杆菌产酱香的初步评定

1.2.2.1接种

在无菌超净台上，向装有灭菌冷却30℃左右的大豆培养基中接入3％的种子液，混匀，封口，置于37℃恒温培养箱培养48h。同时以三株芽孢杆菌(菌株号分别为ND-1、ND-2、CP-3))发酵大豆作为对照，以未接种的大豆发酵培养基为空白。

1.2.2.2感官评定

邀请12名食品专业研究生和老师组成评定小组，对发酵的大豆进行感官评分，每隔半小时重复评分两次(取平均值)。评分时，评分人员之间不得交谈，独立进行评分，避免相互影响。以酱香得分和总分的平均值高低进行产酱香菌株的筛选。评分标准见表1：

表1芽孢杆菌产酱香的评分标准

感官评价结果：大豆的评分包括酱香、色泽(由于大豆表面布满菌体，而与三角瓶接触的底部菌体较少，故褐变的判断通过观看瓶底底部)和粘稠度或拉丝，褐变与美拉德反应有关，粘稠度或拉丝与芽孢杆菌的有关分泌的酶有关(拉丝物质是谷氨酸多肽与果聚糖混合物)。由图3可以看出，从总分上来看，JP-2>ND-1>CP-3>ND-2>K，从酱香的评分上，JP-2>ND-1>CP-3>ND-2>K，JP-2菌株发酵大豆的总分和酱香得分均最高，最低的是空白K。通过对4株芽孢杆菌的产酱香评定，JP-2菌株产酱香评分最高，具有产酱香的特性。各菌株发酵的大豆见图4。

通过接种发酵大豆，对其产酱香进行了感官评定，枯草芽孢杆菌JP-2具有产酱香特性。且芽孢杆菌JP-2的酱香评分最高，产酱香较好、酱香浓郁。

2枯草芽孢杆菌产酶性能测定

2.1材料与设备

2.1.1实验试剂

3,5-二硝基水杨酸(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；酒石酸钾钠：成都金山化学试剂有限公司；无水碳酸钠：天津市永大化学试剂有限公司；福林酚试剂、L-酪氨酸：北京Solarbio公司；酪蛋白：Biosharp公司；三氯乙酸(TCA)：天津富宇精细化工有限公司；磷酸氢二钾：天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钾：上海广诺化学科技有限公司；可溶性淀粉、葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、亚硫酸钠：成都金山化学试剂有限公司；盐酸：重庆川东化(集团)有限公司。如无特殊说明，均为分析纯。

麸皮培养基：麸皮99g，葡萄糖1g，加水70ml，搅拌均匀后，121℃灭菌15min。

高粱培养基：将干燥高粱破碎为高粱沙、高粱粉各半，加入60％的水，浸润18h，蒸煮、冷却、打散，称取40g于250mL的三角瓶中，121℃灭菌15min备用。

小麦培养基：将干燥小麦麦粒破碎为麦沙、麦粉各半，后续操作同高粱培养基。

高粱小麦固态培养基：称取粉、沙各半的小麦、高粱，质量比1:1混匀，后续操作同高粱培养基。

高粱小麦麸皮培养基：称取粉、沙各半的小麦、高粱，在加入麸皮，三者质量比为1:1:1混匀，后续操作同高粱培养基。

2.1.2实验仪器与设备

电子分析天平：上海青海仪器有限公司；LS-B75L-I立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；XW-80涡旋混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；超净工作台：苏州市金净净化设备科技有限公司；HPX-9082MBE数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TGL20M台式高速冷冻离心机：长沙麦佳森仪器设备有限公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；HPX-9082MBE数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；L5S紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司。

2.2实验方法

2.2.1种子液制备

同1.2.1。

2.2.2产酱香培养基的选择

试验前期对芽孢杆菌JP-2在固、液态培养基中发酵做了对比，发现固态发酵产酱香比较浓郁，而液态发酵中杂味较多，且酱香较淡，故采用固态发酵。

2.2.2.1接种培养

将JP-2的种子液按3％的接种量分别接种至麸皮培养基、小麦培养基、高粱培养基、高粱小麦培养基、高粱小麦麸皮培养基中。45℃恒温培养箱培养4d。

2.2.2.2感官评定

邀请7名具有食品专业且在酱香型酒厂参加两星期实习的同学和一名老师组成评定小组，以很弱、弱、一般、强、很强五个等级对酱香味进行评定，每隔半小时重复评分两次(结果取平均值)。评分标准如表2所示。

表2酱香味强弱的评分标准(10分)

2.2.3产酶发酵条件的单因素实验设计

2.2.3.1发酵时间

2.2.3.1.1接种培养

在2.2.2筛选到的培养基基础上，向装有10g已灭菌的培养基中接入3％的种子液，每个瓶子分别编上0h、12h、24h、48h、72h、96h，做两个平行，置于45℃培养箱中培养，到相应的时间取出对应编号的三角瓶。

2.2.3.1.2粗酶液的制备

向发酵醅中加入100mL的蒸馏水，置于40℃水浴锅浸提1h，每隔15min搅拌一次，1h后转入离心管中，6000r/min离心3min，取上清液作为粗酶液。

2.2.3.1.3蛋白酶活力测定

(1)绘制标准曲线

称取干燥无水的酪氨酸0.1000g，用0.1mol/L的盐酸溶液溶解，定容到100mL，得到1mg/mL的酪氨酸溶液。

吸取1mg/mL的酪氨酸溶液10mL，用蒸馏水定容到100mL,得到100μg/mL的酪氨酸溶液，再配制成0、10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL的酪氨酸溶液。

分别取上述酪氨酸溶液各1mL(做3个平行)，各加0.4mol/碳酸钠溶液5mL、福林试剂(2倍蒸馏水稀释)1mL。混合，置于40℃水浴显色20min，在680nm处测定吸光度(1cm比色皿，以不含酪氨酸的反应液为空白对照)，绘制标准曲线(3个平行取平均值)。

(2)酶活测定——福林酚法

吸取酶浸出液1mL，注入10mL离心管中，在40℃±2℃水浴中预热5min，准确加入20g/L酪蛋白溶液1mL，计时，准确保温10min，立刻加入2mL 0.4mol/L三氯乙酸溶液，以沉淀多余的蛋白质，终止酶解反应。15min后离心分离(或用干滤纸过滤)。吸取上层清液1mL，注入试管中，加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL福林酚试剂，摇匀，在40℃±2℃水浴中加热显色20min。

空白试验：与试样测定同时进行，离心管中先后注入酶浸出液1mL，三氯乙酸2mL、20g/L酪蛋白。15min后离心分离或过滤，以下的操作均与试样测定相同。

以空白液为对照，在680nm波长下，1cm比色皿测定试样的吸光度。

定义：1g发酵醅，在40℃，一定pH条件下，1min水解酪蛋白生成1mg酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位(U/g)。

蛋白酶活力＝K*A*4*100*1/10*1/m

式中K——吸光度为1时相当的酪氨酸微克数(吸光数)；

A——试样吸光度；

m——干曲质量；

100——酶浸出液总体积，mL；

4——酶反应液总体积，mL；

10——反应时间，min；

2.2.3.1.4淀粉酶活力测定

(1)葡萄糖标准曲线

称取烘至恒重的葡萄糖0.1000g，配置成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/ml的标准液，采用3，5-二硝基水杨酸显色法，在540nm处测定吸光值，葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)酶活测定——3,5-二硝基水杨酸法

粗酶液0.2mL与质量分数为1％的淀粉溶液1mL于40℃水浴5min后，沸水浴5min终止反应，加入1ml 3,5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴5min后迅速冷却，10ml定容，于波长540nm处测定其吸光度值，以煮沸1％的淀粉溶液为空白。

酶活力单位定义：在40℃，1g发酵醅1min催化底物生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位(U/g)。

2.2.3.2发酵温度

2.2.3.2.1接种培养

在发酵时间确定的基础上，向培养基中将接入3％的种子液，分别置于32℃、37℃、42℃、47℃、52℃的恒温培养箱中培养。

2.2.3.2.2粗酶液的制备

方法同2.2.3.1.2。

2.2.3.2.3蛋白酶活力测定

方法同2.2.3.1.3。

2.2.3.2.4淀粉酶活力测定

方法同2.2.3.1.4。

2.2.3.3接种量

2.2.3.3.1接种培养

在发酵温度确定的基础上，将种子液按1％、3％、5％、7％、9％分别接入培养基中，置于培养箱中培养。

2.2.3.3.2粗酶液的制备

方法同2.2.3.1.2。

2.2.3.3.3蛋白酶活力测定

方法同2.2.3.1.3。

2.2.3.3.4淀粉酶活力测定

方法同2.2.3.1.4。

2.2.4产酶发酵条件的正交实验设计

根据枯草芽孢杆菌发酵条件的单因素实验结果，选择发酵时间、发酵温度、接种量3个影响因素，每个因素取3个水平，如表3到表4所示。按照正交表L9(34)设计方案并进行实验。

表3 JP-2菌株产蛋白酶的正交试验因素及水平

表4 JP-2菌株产淀粉酶的正交试验因素及水平

2.3试验结果

2.3.1枯草芽孢杆菌产酱香培养基的确定

表5 JP-2菌株发酵产酱香味强弱的评分结果

由表5可以看出，JP-2菌株以高粱小麦麸皮培养基发酵产酱香的评分最高，产酱香的评分属于强级。以麸皮为培养基的评分最低，基本上只有麸皮的味道。

2.3.2酪氨酸标准曲线

如图5所示，酪氨酸浓度在0～80μg/mL范围内时，对应的吸光值与酪氨酸浓度成良好的线性关系，回归方程为y＝0.013x+0.0006，R2＝0.9972。将y＝1带入回归方程，计算出K值。

2.3.3葡萄糖标准曲线

如图6所示，葡萄糖含量在0～1.2mg范围内时，对应的吸光值与葡萄糖含量成良好的线性关系，回归方程为y＝1.1952x-0.0283，R2＝0.9986。将芽孢杆菌产淀粉酶的吸光度带入回归方程即可计算出相应的葡萄糖含量。

2.3.4发酵时间对枯草芽孢杆菌产酶的影响

由图7可以看出，在0h时，培养基中的蛋白酶活力基本为零，在0～72h内，枯草芽孢杆菌JP-2产蛋白酶的活力均呈上升趋势，在72h蛋白酶活力菌均达到最大，JP-2菌株的蛋白酶活力为71.14±5.853U/g，在72～96h时，蛋白酶活力下降，故芽孢杆菌JP-2产蛋白酶活力的最佳发酵时间为72h。

由图8可以看出，芽孢杆菌JP-2在0～24h产淀粉酶活力呈上升趋势，在24h产淀粉酶活力达到最大，为21.28±0.871U/g，在24～49h呈小幅度减下。故芽孢杆菌JP-2产淀粉酶活力的最佳发酵时间为24h。

2.3.5发酵温度对枯草芽孢杆菌产酶的影响

由图9可以看出，芽孢杆菌JP-2在32～37℃范围内产蛋白酶活力呈上升趋势，在37℃蛋白酶活力最大，为117.16±4.435U/g，在52℃时酶活力基本为零。故芽孢杆菌JP-2产蛋白酶活力的最佳发酵温度为37℃。

由图10可以看出，芽孢杆菌JP-2在32～42℃范围内产淀粉酶活力呈上升趋势，在42℃淀粉酶活力最大，为26.42±0.383U/g。故芽孢杆菌JP-2产淀粉酶活力的最佳发酵温度为42℃。

2.3.6接种量对枯草芽孢杆菌产酶的影响

由图11可以看出，芽孢杆菌JP-2接种量为1～7％时，蛋白酶活力呈上升趋势，接种量为7％时蛋白酶活力最大，为139.81±10.565U/g，接种量为7～9％时，蛋白酶活力呈下降趋势。故芽孢杆菌JP-2产蛋白酶活力的最佳接种量为7％。

由图12可以看出，芽孢杆菌JP-2接种量为1～7％时，淀粉酶活力呈上升趋势，接种量为7％时淀粉酶活力最大，为40.95±1.552U/g，接种量为7～9％时，淀粉酶活力呈下降趋势。故芽孢杆菌JP-2产淀粉酶活力的最佳接种量为7％。

2.3.7枯草芽孢杆菌产酶条件的优化

表6 JP-2菌株产蛋白酶条件的正交实验结果

表7 JP-2菌株产蛋白酶条件的正交实验方差分析

注：*代表方差分析差异显著(p<0.05)

由表6、表7可知，极差分析表明影响芽孢杆菌JP-2产蛋白酶的因素显著程度依次为：B发酵温度>C接种量>A发酵时间，发酵温度对芽孢杆菌JP-2产蛋白酶的影响显著(p<0.05)。最佳产酶条件组合A2B2C3，即发酵时间为72h、发酵温度为37℃、接种量为9％，验证实验测得在此条件下蛋白酶活力为228.68±13.476U/g，较优化前提高了41.86％。

表8 JP-2菌株产淀粉酶条件的正交实验结果

表9 JP-2菌株产淀粉酶条件的正交实验方差分析

注：*代表方差分析差异显著(p<0.05)

由表8、表9可知，极差分析表明影响芽孢杆菌JP-2产淀粉酶的因素显著程度依次为：B发酵温度>A发酵时间>C接种量，发酵温度对芽孢杆菌JP-2产淀粉酶的影响显著(p<0.05)。最佳产酶条件组合A2B3C1，即发酵时间为24h、发酵温度为47℃、接种量为5％，验证实验测得在此条件下淀粉酶活力为39.69±1.711U/g，较优化前提高了44.61％。

通过以上实验例证明枯草芽孢杆菌JP2具有良好发酵能力和产蛋白酶、淀粉酶的能力，并且产酱香能力良好；且通过本发明的发酵培养基及发酵条件优化培养后蛋白酶活力和淀粉酶活力均得到优化，蛋白酶活力为228.68±13.476U/g，较优化前提高了41.86％；淀粉酶活力为39.69±1.711U/g，较优化前提高了44.61％。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一株枯草芽孢杆菌及其应用

<130> 2018

<141> 2018-12-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1526

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

ttgtgttacc ctttgttacg actttcaact ccattcatct gttcccacct tcgacggctg 60

ctccataaaa ggtactcacg gacttcgggt gttaacaaac tctccgtggg tgtgacgggc 120

ggtgtgtaca aggcccggga aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg atttactagc 180

gattcccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagaa acagatttgt 240

gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc ccttttgttt ctgtccattg tagcacgtgt 300

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 360

caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 420

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 480

gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 540

ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 600

cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 660

ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 720

ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 780

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acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 900

ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc 960

caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 1020

ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt 1080

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gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1320

caccttttat gtctgaacca tgcggttcag acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc 1380

ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1440

atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg 1500

ttcgtcctga gccaggatca aactct 1526

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌JP-2，于2017年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017846。

2.一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

3.一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

4.如权利要求2或3所述的富含蛋白质和/或碳水化合物的制品，其特征在于：所述制品还包括用于制备富含蛋白质和碳水化合物制品的常规成分和/或用于培养所述的枯草芽孢杆菌的培养基成分。

5.一种富含蛋白质和/或碳水化合物的制品的制备方法，其特征在于：采用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。

6.一种制备富含蛋白质和/或碳水化合物食品的方法，其特征在于：在制备过程中添加和/或使用权利要求2-4中任一项所述的制品。

7.一种具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

8.一种具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。

9.如权利要求7或8所述的具有产蛋白酶和/或淀粉酶能力的微生物菌剂，其特征在于：还包括用于制备菌剂的常规成分。