CN102199559A - 一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途，菌体宽0.5μm，菌体长2.6μm；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；有鞭毛。菌落形态：纯白色、形状不规则、菌落中心呈同心环状隆起、不透明、表面干燥、菌体微粘稠、易挑取。本发明的枯草芽孢杆菌菌种发酵生产的豆豉色泽与自然发酵相似，且不产气、产酶能力较强、发酵风味较好的适宜工业纯种发酵生产豆豉。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种枯草芽孢杆菌菌种，同时还涉及该枯草芽孢杆菌菌种在实现细菌型豆豉纯种发酵方面的应用。

背景技术

细菌型豆豉目前主要采用传统的自然发酵进行生产，没有实现纯种发酵，导致由湿豉调配生产的水豆豉常出现杂菌污染，产气、顶盖和二次污染现象严重，易产生毒素，且食盐含量过高，这些因素都严重威胁人体的健康。

而日本纳豆和印度尼西亚天培的生产由于采用纯种发酵技术，产销产量都很大，早已经步入工业化生产。自然发酵的细菌型豆豉中的主要菌种有芽孢杆菌、微球菌、乳酸菌和酵母菌。前发酵时，芽孢杆菌数量占优势，分泌酶种类最多，产酶量也最多；后发酵时，由于加入食盐，耐盐性的微球菌、乳酸菌和酵母菌才开始生长。目前，芽孢杆菌主要应用于工业酶制剂的生产。纯种发酵豆豉则存在发酵风味、色泽和质地差等难题，很难应用于食品工业生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种发酵生产豆豉色泽与自然发酵相似，且不产气、产酶能力较强、发酵风味较好的适宜工业纯种发酵生产豆豉的枯草芽孢杆菌菌种。

本发明的另一目的在于提供该枯草芽孢杆菌菌种在在豆豉发酵生产中的用途。

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2，为不产气菌株，其产蛋白酶能力(3.60h/c)较高。个体形态特征：菌体宽0.5μm，菌体长2.6μm；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；有鞭毛。菌落形态：纯白色、形状不规则、菌落中心呈同心环状隆起、不透明、表面干燥、菌体微粘稠、易挑取。菌体大小均比《伯杰氏鉴定手册》中芽孢杆菌0.7-0.8×2-3(μm×μm)的描述偏小，芽孢中生。菌株安全、无毒。

该菌种已于2010年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国 北京 中国科学院微生物研究所)，保藏号：CGMCC NO：4256，名称为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2。

(一)一种豆豉芽孢杆菌菌种(Bacillus subtilis BJ3-2)的分离步骤：

1.初筛

将贵州毕节、遵义等主要地区的细菌型豆豉样品采用稀释划线法分离获得单菌株，纯化后经革兰氏染色的疑似芽孢杆菌菌株，接种高压灭菌并冷却后的大豆，依照发酵后豆豉的色泽、粘丝、豉香、酱香、氨味、之地进行综合评测并打分，筛选出发酵品质较突出的菌株。

2.复筛

复筛采用粗测产蛋白酶能力和发酵风味感官评测相结合的方法。将初筛得到的菌株分别接种于酪蛋白琼脂平板，依据分解酪蛋白后产生的透明圈直径(h)与菌落直径(c)的比值，同时参考其发酵大豆风味的风味品质，筛选得到BJ3-2菌株。

(二)菌种的培养：

完全培养基：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.0。固体培养基加琼脂20g，121℃灭菌20min。

(三)保种和传代：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加水至1000mL。用5N NaOH调pH 7.0-7.2。

LB培养基：酵母抽提物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水至1000mL，5N NaOH调pH7.0-7.2。

以上为液体培养基。固体培养基需按2％添加琼脂，121℃灭菌20min，冷却至45-50℃时倒入培养皿中即可。

保存方法有三种：

(1)每月一次，从已生长的固体或液体培养基按一接种环量接种到新的平板上或斜面试管中，32℃，30h。置于4℃保存。

(2)用15×180mm的试管，盛琼脂培养基5mL，做成斜面，接种菌种，32℃，培养30h，倒入约10ml灭菌石蜡油覆盖其上，置于4℃保存。3个月转种一次。

(3)冻存法。接种LB液体培养基，32℃，200rpm，24h后添加20％的无菌甘油，混匀后无菌倒入冻存管中，置于-80℃保存。一年转种一次。

(四)菌种的生态特征：

BJ3-2菌株1％接种牛肉膏蛋白胨液体培养基，32℃，200rpm培养，0-4h为延滞期；5-10h为对数生长期；10-14h为生长稳定期；14-20h为衰亡期。菌落形态特征：革兰氏阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；有鞭毛。菌落形态为纯白色、形状不规则、菌落中心呈同心环状隆起、不透明、表面干燥、菌体微粘稠、易挑取。菌体大小均比《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版中芽孢杆菌0.7-0.8×2-3(μm×μm)的描述偏小，芽孢中生。

(五)菌种的培养特性

(1)培养温度4℃-50℃，最适生长温度在32℃-42℃。

(2)培养pH6-8，最佳pH为7.0-7.2。

按照常见《细菌系统鉴定手册》(东秀珠，1999)和《伯杰氏细菌鉴定手册》提供的鉴定依据，同时对其16SrDNA的进行克隆和分析，长度为932bp，与枯草芽孢杆菌比较，序列同源性高达99％。综合同源性比对结果确定该菌株属芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌。由于该菌种是从贵州毕节地区(BJ)豆豉样品分离获得，特依据筛选数量命名为：豆豉芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：从风味优良的细菌型豆豉样品中，对发酵起主要作用菌种进行分离、筛选，获得发酵风味突出、酶系较为完整的芽孢杆菌菌株，并通过发酵产气试验，筛选前发酵不产气的菌株，同时对后发酵条件进行优化，可实现细菌型豆豉的纯种发酵。产品理化及卫生指标均达到豆豉标准DB52/524-2007，豆豉感官品质与自然发酵豆豉相似，且品质较好，香味突出，拉丝较长，稳定性好，无“发臭”、“产气”等现象出现。以此为原料生产出的水豆豉产品品质显著优于自然发酵法，产品预盖率低。豆豉中的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、脂肪酶活力、豆豉溶纤酶活力较高，豆豉色泽与风味较好，可以作为用于工业纯种发酵生产候选菌株。

具体实施方式

(1)豆豉芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2菌株分离与筛选

1)菌种分离和纯化

取2g贵州毕节、遵义等主要地区的市售的细菌型豆豉样品于18g无菌水的三角瓶中，并加入0.1％吐温80，180rpm培养30min，然后梯度稀释为10-2-10-9，每个稀释梯度做3个重复。静置10min后取液1mL，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培养24h。革兰氏染色和芽孢染色，将G+芽孢杆菌单菌落纯化3代后保种于牛肉膏蛋白胨斜面试管，每个样品保留4-5菌株，并记录菌株的平板形态，归类。

2)初筛

接种菌株于牛肉膏蛋白胨液体试管，30℃培养12h，按黄豆(g)∶种子菌液(mL)＝125∶1的比例接种到发酵培养基，37℃培养72h，以纳豆芽孢杆菌(CICC：1023)纯种发酵豆豉和自然发酵豆豉为对照，感官评价发酵豆豉的色泽和风味，从中筛选出与对照菌株发酵风味相似或有特点的菌株，每个地区筛选出1-3株发酵品质较好的菌株。

3)复筛

菌株产蛋白酶能力的测定：将菌株点接于酪蛋白琼脂平板，37℃培养24h，分别测量菌落透明圈直径(h)和菌落直径(c)，各测3次，计算平均值，h/c值大小表示菌体产蛋白酶能力的高低。

色泽和风味的评测：黄豆200g，1％接种菌株发酵。感官评定筛选菌株发酵豆豉的外观、风味和质地等，评分标准见下表。以分值高低表示发酵豆豉品质的优劣。

表1感官评价标准

                                                                    

项目    评分标准

                                                                    

色泽    黄褐色(8-10分)、深黄褐色或淡黄褐色(5-7分)、黑褐色(0-4分)

粘丝    很粘(8-10分)、中等(5-7分)、不粘(0-4分)

豉香    浓郁(16-20分)、中等(11-15分)、豉味淡或有异味(0-10分)

氨味    轻(16-20分)、中等(11-15分)、重(0-10分)

酱香    浓郁(16-20分)、中等(11-15分)、轻(0-10分)

质地    适中(15-20分)、太硬或太软(10-14分)

                                                                    

4)发酵产气试验

将1mL牛肉膏蛋白胨液体培养的菌液接种于发酵产气培养基，37℃培养72h，观察试管中的倒置杜氏发酵管中有无气泡，出现气泡者为阳性。

(2)菌株鉴定

1)个体形态特征

将菌体进行革兰氏染色，用显微镜观察个体形态，并用目镜测微尺测量菌体大小。

2)菌落形态

将分离菌株点种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养24h，形成菌落。观察菌落的大小、质地、形状、颜色。

3)生理生化鉴定

通过糖发酵、丙酸盐、柠檬酸盐、卵磷脂酶等试验，进行生理生化鉴定，参照《伯杰氏鉴定手册》(第八版)和常见细菌系统鉴定手册(东秀珠等，1999)鉴定到种属。

4)分子鉴定

PCR扩增16S rDNA序列

溶菌酶裂解法提取芽孢杆菌基因组，紫外定量检测后采用特异性引物(P1：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG/P2：GCCCCCGTCA ATTCCTTTGAG)扩增细菌16S rDNA序列。94℃，5min×1cycle→94℃，1min→50℃，40Sec→72℃，40sec×5cycle→94℃，1min→54℃，40Sec→72℃，40sec×25cycle→72℃，8min→4℃，∞。

16S rDNA克隆与测序

胶回收16S rDNA 0.5-1μg，克隆至pMD18-T，阳性克隆送大连宝生物公司测序。

序列登录号

Genbank：FJ235079.2

(3)菌株产酶活力的测定

枯草芽孢杆菌株接种预处理的大豆，72h内每隔6h分别取样检测蛋白酶、脂肪酶、溶纤酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶的活力，筛选产酶活力最高的菌株。

1)蛋白酶活力测定

酪氨酸标准曲线的绘制

配制50ug/mL酪氨酸标准溶液，取六支试管标号0，1，2，3，4，5。分别加入0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL的标准酪氨酸溶液。各管用蒸馏水补足到1mL再分别加0.55mol/L的碳酸钠溶液5mL最后各管依次加入酚试剂0.5mL摇匀置于30℃恒温显色15min，紫外分光光度计在680nm测定吸光值。以酪氨酸含量为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制标准曲线。

活力的测定

吸取0.5％酪蛋白溶液2mL置于试管中在30℃水浴5min后，加入预热的1mL酶液(30℃，5min)立即记时；10min后取出并立即加入10％的三氯乙酸溶液3mL，放置15min后用干滤纸过滤，对照组先加3mL三氯乙酸溶液然后再加入0.5％的酪蛋白2mL，30℃保温10min后取出放置15min，过滤；取三支试管编号，分别加入1mL样品滤液，对照滤液和水各1mL，然后加入0.55mol/L的Na₂CO₃溶液5mL，再加入0.5mL福林酚试剂，30℃显色15min，680nm下比色。测定OD值依照标准曲线计算蛋白酶活力。

2)脂肪酶活力测定

采用橄榄油乳化液水解滴定法。取两个100mL三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中，加入底物(25％聚乙烯醇橄榄油乳化液)4.0mL和磷酸缓冲液5.0mL，再于A瓶中加入95％乙醇15.0mL，于40℃水浴中预热5min，然后再两瓶中各加入待测定酶液1.0mL，立即混匀计时，在40℃水浴中准确反应15min，在B瓶中立即补加95％乙醇15.0mL终止反应，取出。于空白和样品溶液中各加入酚酞指示剂2滴，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为其终点，记录消耗0.05mol/L氢氧化钠的体积。

计算公式：X＝(B-A)×c/0.05×50×1/15×n＝200/3×(B-A)×c×n

式中：X：样品的酶活力，μ/g

B：滴定样品时消耗氢氧化钠标准品溶液的体积，mL

A：滴定空白时消耗氢氧化钠标准品溶液的体积，mL

C：氢氧化钠标准品溶液浓度，mol/L

0.05：氢氧化钠标准品溶液浓度换算系数

50：0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmoL

1/15：反应时间，以1min计

n：稀释倍数

3)淀粉酶活力测定

麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，编号，分别加入麦芽糖标准溶液(1mg/mL)0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0，然后加蒸馏水使各管达到2.0mL。各加入3，5-二硝基水杨酸(DNS)2.0mL，摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

活力的测定

取试管4支，每试管中加酶提取液1.0mL，在70℃水浴加热15min。取出迅速冷却，在试管中加入1.0mL pH 5.6的柠檬酸缓冲液。对照管中先加入4.0mL NaOH，终止酶的活性。将对照管和测定管置40℃恒温水浴中保温15min，加入40℃预热的淀粉溶液2.0mL，混匀，立即放入40℃水浴中准确保温15min后去除，加入4.0mL 0.4mol/L NaOH，终止酶活性。

取酶作用后的溶液和对照管中的各2.0mL，放入25mL试管中加入3.0mL DNS混匀，按标准曲线查出麦芽糖含量，计算α-淀粉酶活力。

计算公式：α-淀粉酶活力(mg/g)＝(A-A’)×样品稀释体积/[样品重(g)×C]

式中：

A：α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖含量；

A’：α-淀粉酶对照管中的麦芽糖含量；

C：比色时样品液毫升数。

4)溶纤酶活力测定

纤维蛋白平板的配制

移取10mL 2％琼脂溶液于平板中，冷却凝固后形成第一层。将12.5mL纤维蛋白原溶液与20mL 1.0％的无菌琼脂糖溶液(0.2g琼脂糖溶解于20mL巴比妥钠-HCl缓冲液)中，50℃充分混合，迅速加入250μl 20IU/mL牛凝血酶，混匀后向每个琼脂平板移取15mL，形成双层纤维蛋白平板。

酶液的提取

豆豉样品(g)与无菌生理盐水(mL)按1∶2比例混合，取50mL，于4℃冰箱中浸提24h，浸提液经离心机4,000rpm，离心30min，取上清备用。

点样

用口径3mm的微量打孔器在纤维蛋白平板上打孔，每个孔内点酶液10μL，静止10min，于37℃培养18h，测定并计算溶菌圈面积(两个垂直直径的乘积)，以尿激酶活力单位为横坐标，溶菌圈面积为纵坐标，由尿激酶标准曲线查得溶纤酶活力(U)。

5)谷氨酰胺酶活力测定

采用GENMED SCIENTIFICS IN.U.S.A细菌谷氨酰胺酶活性光谱法定量检测试剂盒(货号：GMS50374.4)。

(4)菌株发酵性能

菌株生产最适pH、温度、预处理原料、接种量、装载量、相对湿度、发酵时间均以豆豉氨基酸态氮含量进行判定，通过正交试验确定优化的发酵工艺参数。

(5)菌株生产使用说明

菌种制备：斜面菌种接种LB液体培养基，200rpm，30℃培养12-14h。

发酵容器：竹筐(10-20kg)采用蒸汽杀菌处理15min。

生产工艺：泡豆水温30-35℃，泡豆水pH8.0，豆量(g)∶水量(mL)为1∶4，泡豆4-10h，大豆蒸煮4-8h，冷却至40℃±3。

发酵条件：接种量1％，发酵温度36-38℃，相对湿度65-90％，发酵时间70-72h。

发酵室：≥30m2，控温为盘管加热方式。

201110023795.4一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途序列表

SEQUENCE LISTING

<110>贵州大学

拥军，吴

<120>一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途

<130>NCBI/FJ235079.2

<140>201110023795.4

<141>2011-01-21

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<220>

<221>rRNA

<222>(1)..(21)

<300>

<308>P1

<309>2008-10-28

<313>(1)..(21)

<400>1

gagagtttga tcctggctca g    21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<220>

<221>rRNA

<222>(1)..(21)

<300>

<308>P2

<309>2008-10-28

<313>(1)..(21)

<400>2

gcccccgtca attcctttga g    21

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2，其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCC NO：4256。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BJ3-2在豆豉发酵生产中的用途。