CN101638639A - 一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法，属于生物工程技术领域。本发明采用竹黄菌株在液态发酵条件下生产SOD，主要为胞外酶。在发酵过程中通过添加H2O2、表面活性剂或烷烃可以提高SOD产量，同时光照也可以提高SOD产量。SOD产量最高可达800U/mL，在发酵过程中同时菌体会生成苝醌色素，产量可达1.1g/L，其中竹红菌甲素占90％，竹红菌乙素占5％。竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等苝醌色素，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能同时生产苝醌色素；本发明具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶(SOD)的方法，属于生物工程技术领域。本发明涉及利用竹黄菌株Shiraia sp.SUPER-H168保藏号为CCTCCM 207104，通过液态发酵获得SOD。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够清除超氧阴离子自由基的酶，在生物体抗氧化系统中占有重要地位，广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。SOD能够提高人体对自由基损伤的抵抗力，以及对自由基诱发因子的抵抗力，具有明显的抗衰老，增强对超负荷的适应力，具有抗炎、抗肿瘤等作用，尤其是对风湿性关节炎、老年黑斑具有显著防治效果，目前已经广泛应用于医疗、食品、日用品及保健等方面。SOD主要从动物血液(如猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法[P].申请号，02147888.0，2002-12-19；徐文中，阎家麒.超氧化物歧化酶大规模生产新工艺[P].申请号，01144922.5，2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动物血液来源困难，而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前报道，已经可以通过微生物发酵法生产SOD，但主要为胞内酶(刁治民，姚银霞，张文静.酵母菌SOD发酵条件的研究[J].青海师范大学学报(自然科学版)，2002，4：48-51；杨明琰，郭爱莲，沈俭，等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研究[J].食品科学，2005，26(10)：147-150)，提取工艺较为繁琐。
竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等苝醌色素，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能同时生产苝醌色素，开发前景广阔。
目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。
发明内容
本发明的目的针对当前问题，利用竹黄菌株Shiraia sp.SUPER-H168保藏号为CCTCC M 207104通过液态发酵获得SOD。本发明采用液态发酵生产SOD，通过物理方法或者化学方法刺激菌丝体产SOD，使SOD产量得到提高。
本发明的技术方案：一种竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，以竹黄菌株Shiraia sp.SUPER-H168为出发菌株，该菌株保藏号为CCTCC M 207104，已在中国专利ZL 200710132510.4公开，液态发酵培养基组成为：碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，K2HPO4 2-4g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.4g/L，NaCl 1-3g/L，马铃薯汁0-200g/L；在光照发酵罐内装入发酵罐体积60％-70％的培养基，灭菌冷却后接入竹黄菌，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；
在发酵过程中通过添加表面活性剂、烷烃化合物、H2O2或进行光照，以提高超氧化物歧化酶SOD的产量，最终发酵液中SOD活力达10-800U/mL；
经检测胞内也有少量SOD，达0.1-5U/mL；
在发酵过程中同时菌体会生成苝醌色素，产量达0.3-1.1g/L，其中竹红菌甲素占90％-93％，竹红菌乙素占2％-6％。
所述的产SOD碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖或乳清。
所述的产SOD氮源为(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。
所述的通过添加H2O2，以采用氧化胁迫的方法提高SOD产量：发酵开始后的0-40小时，往发酵液中添加H2O2使发酵液中H2O2浓度达0.1-40μmol/L，随后的发酵不再补加H2O2。
所述的通过光照方法提高SOD产量：光照强度为1000-15000Lux，光照从发酵开始后的5-40小时开始，持续时间为80-115小时。
所述的添加表面活性剂以提高SOD的产量，所添加表面活性剂选用：Tween20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Triton X-100、TritonX-114、TritonX-116、Triton X-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7、AEO-9、一乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表面活性剂的质量浓度达0.1％-2％(w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。
所述的添加烷烃以提高SOD的产量，所添加烷烃选用：庚烷、辛烷、癸烷、十二烷、十四烷或十六烷，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷烃的质量浓度达1％-10％(w/w)，随后的发酵不再补加烷烃。
SOD酶活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光照下的还原作用。SOD活力测定方法和SOD活力定义详见：Chin-Wen Lin，Jeng-Huh Yang andLieh-Chi Su(1997)The extraction and properties of superoxide dismutase fromporcine blood Chin-Wen Lin，Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，46(3)：303-312.
苝醌色素的产量采用液相色谱法测定，详见：Xiao-Hui Lianga，Yu-Jie Cai，Xiang-Ru Liao，Kang Wu，Lei Wang，Da-Bing Zhang and Qiang Meng(2009).Isolation and identification of a new hypocrellin A-producing strain Shiraia spSUPER-H168.Microbiological Research 164(1)：9-17.
本发明有如下特征：
(1)用于SOD发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖或乳清。氮源可以是(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。马铃薯汁既可以补充碳源也可以补充氮源，马铃薯汁200g/L是指称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤得到滤液，所有滤液加入到培养基中，培养基终体积为1000mL。
(2)竹黄菌发酵SOD可采用光照机械搅拌和光照气升式发酵罐。对于机械搅拌发酵罐，搅拌转速为70-150r/min，通风量1∶0.1-1∶0.5v/v/m。对于气升式发酵罐，通风量为1∶0.3-1∶1.5v/v/m。通风量数值与单位说明：1∶0.5v/v/m指1个体积的发酵液每分钟通0.5体积的无菌空气。所述发酵罐内的光源为荧光灯。发酵罐体积为5-500L，结合本领域的基本常识可根据生产情况调整发酵罐大小。
(3)竹黄菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的过程，伴随着如下所示的三种母核为基本结构的苝醌色素的生成，其中主要是竹红菌甲素。同时该菌可产生以此三种母核结构进行基团修饰的多种苝醌类化合物。可在2，3，6，7，11，12，17，18，26，28，29，30，32，36，37，45，46，53，55，56，58，62，63，71，72位置修饰上各种化学基团，如CH3、OCH3、COCH3、CH(OH)CH3、CHO、OH、H等，这些化学基团之间还可以进一步形成更为复杂的结构。随着发酵条件的不同，各苝醌色素的产量和比例会有所不同。
伴随SOD产生的苝醌色素母核
(4)竹黄菌生产超氧化物歧化酶(SOD)的过程，伴随着苝醌色素的生成。苝醌色素可在发酵过程中产生活性中间体(超氧阴离子自由基、羟基自由基、单线态氧)，对生物体具有一定杀伤能力。这就意味着竹黄在发酵过程中受到氧胁迫作用，菌株会以生成SOD的机制来清除氧自由基等以抵抗氧胁迫。为了提高SOD的产量，本发明通过添加H2O2，以采用氧化胁迫的方法提高SOD产量。发酵开始后的0-40小时，往发酵液中添加H2O2使发酵液中H2O2浓度达0.1-40μmol/L，随后的发酵不再补加H2O2。
(5)为了提高SOD的产量，本发明在发酵过程中增加光照，以使苝醌色素在光照条件下产生更多的氧自由基，从而使竹黄菌产生更多的SOD用来清除氧自由基。光照强度可为1000-15000Lux。光照从发酵开始后的5-40小时开始，持续时间为80-115小时。
(6)为了提高SOD的产量，本发明通过添加表面活性剂，以改善竹黄细胞膜的通透性。发酵过程中添加的表面活性剂主要有：Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Triton X-100、TritonX-114、TritonX-116、Triton X-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7、AEO-9、一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺。添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表面活性剂的质量浓度达0.1％-2％(w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。结果表明所有表面活性剂对于SOD的产量均有促进作用，其中Tween 60添加量为0.8％的效果最好。
(7)为了提高SOD的产量，本发明通过添加烷烃类化合物，以使发酵过程中产生的苝醌色素更易于由胞内进入发酵液体系统，从而能更好地刺激菌体生产SOD。添加的烷烃主要有：庚烷、辛烷、癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等。添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷烃的质量浓度达1％-10％(w/w)，随后的发酵不再补加烷烃。结果表明所有烷烃对于SOD的产量均有促进作用，其中十四烷效果最好，添加量在2％-3％(W/W)时效果较好。
本发明的有益效果：竹黄是一种药用真菌，其发酵主要产物为竹红菌素等苝醌色素，具有很高药用价值和保健功效。竹黄发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能同时生产苝醌色素，开发前景广阔。
具体实施方式
实施例1
培养基组成为：马铃薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，NH4NO3 10g/L，玉米浆粉12g/L，pH自然，接种量为10％，发酵温度为30℃，300L气升式发酵罐，装液量70％，通风量为1∶1.5v/v/m，发酵时间为3天。当发酵进行24h后，发酵液中加入H2O2 1μmol/L、Tween 60 0.8％和十四烷2.5％，并连续给予10000Lux的光照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为800U/mL，胞内为5U/mL。苝醌色素产量为1.14g/L，其中竹红菌甲素占90％，竹红菌乙素占5％。
实施例2
培养基组成为：果糖20g/L，牛肉膏20g/L，玉米浆粉30g/L，pH自然。接种量为5％，发酵养温度为24℃，300L气升式发酵罐，装液量70％，通风量为1∶0.3v/v/m，发酵时间为5天。不添加表面活性剂、烷烃、H2O2。不进行光照。在该条件下，发酵液中SOD活力为10U/mL，胞内为1U/mL。苝醌色素产量为0.31g/L，其中竹红菌甲素占91％，竹红菌乙素占4％。
实施例3
培养基组成为：马铃薯汁200g/L，乳糖20g/L，NH4NO310g/L，蛋白胨10g/L，pH自然。接种量为10％，培养温度为30℃，500L机械搅拌发酵罐，装液量60％，通风量为1∶0.5v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵时间为4天。当发酵开始后，发酵液中立即加入Triton X-100 1.5％。在该条件下，发酵液中SOD活力为321U/mL，胞内为3U/mL。苝醌色素产量为0.53g/L，其中竹红菌甲素占93％，竹红菌乙素占3％。
实施例4
培养基组成为，蔗糖20g/L，NH4NO3 10g/L，蛋白胨10g/L，pH自然。接种量为10％，培养温度为30℃，5 L机械搅拌发酵罐，装液量65％，通风量为1∶0.1v/v/m，搅拌转速为70r/min，发酵周期为5天。当发酵开始后40小时，加入癸烷3％。在该条件下，发酵液中SOD活力为15U/mL，胞内为0.1U/mL。苝醌色素产量为0.62g/L，其中竹红菌甲素占90％，竹红菌乙素占2％。
实施例5
培养基组成为：马铃薯汁200g/L，麦芽糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，黄豆饼粉10g/L，pH自然。接种量为10％，培养温度为28℃，500L机械搅拌发酵罐，装液量70％，通风量为1∶0.4v/v/m，搅拌转速为150r/min，发酵周期为5天。发酵起始阶段加TX-6 1％，当发酵开始后10小时，连续给予15000Lux的光照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为200U/mL，胞内为4U/mL。苝醌色素产量为0.81g/L，其中竹红菌甲素占92％，竹红菌乙素占2％。
实施例6
培养基组成为，半乳糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，尿素10g/L，pH自然。接种量为8％，培养温度为30℃，60L机械搅拌发酵罐，装液量60％，通风量为1∶0.3v/v/m，搅拌转速为120r/min，发酵时间为5天。当发酵开始后，发酵液中立即加入三乙醇胺1％。发酵开始后10小时，连续给予1500Lux的光照至发酵结束。在该条件下，发酵液中SOD活力为620U/mL，胞内为2U/mL。苝醌色素产量为0.77g/L，其中竹红菌甲素占93％，竹红菌乙素占3％。
实施例7
培养基组成为，木糖20g/L，酵母膏10g/L，尿素10g/L，pH自然。接种量为10％，菌龄2天，培养温度为30℃，60L气升发酵罐，装液量65％，通风量为1∶1.2v/v/m，发酵时间为5天。当发酵开始后24小时，发酵液中加入AEO-71％和癸烷3％。在该条件下，发酵液中SOD活力为700U/mL，胞内为4U/mL。苝醌色素产量为0.73g/L，其中竹红菌甲素占90％，竹红菌乙素占6％。
Claims (7)
1.一种利用竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于以竹黄菌株Shiraia sp.SUPER-H168为出发菌株，液态发酵培养基组成为：碳源5-50g/L，氮源5-50g/L，K2HPO4 2-4g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.4g/L，NaCl 1-3g/L，马铃薯汁0-200g/L；在光照发酵罐内装入发酵罐体积60％-70％的培养基，灭菌冷却后接入竹黄菌，接种量为5％-10％，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为24-32℃，发酵周期为2-5天；
在发酵过程中通过添加表面活性剂、烷烃化合物、H2O2或进行光照，以提高超氧化物歧化酶SOD的产量，最终发酵液中SOD活力达10-800U/mL；
经检测胞内也有少量SOD，达0.1-5U/mL；
在发酵过程中同时菌体会生成苝醌色素，产量达0.3-1.1g/L，其中竹红菌甲素占90％-93％，竹红菌乙素占2％-6％。
2、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖或乳清。
3、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的氮源为(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆粉或豆饼粉。
4、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的通过添加H2O2，以采用氧化胁迫的方法提高SOD产量：发酵开始后的0-40小时，往发酵液中添加H2O2使发酵液中H2O2浓度达0.1-40μmol/L，随后的发酵不再补加H2O2。
5、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的通过光照方法提高SOD产量：光照强度为1000-15000Lux，光照从发酵开始后的5-40小时开始，持续时间为80-115小时。
6、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的添加表面活性剂以提高SOD的产量，所添加表面活性剂选用：Tween20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Triton X-100、TritonX-114、TritonX-116、Triton X-405、TX-4、TX-6、TX-9、TX-10、AEO-3、AEO-7、AEO-9、一乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中表面活性剂的质量浓度达0.1％-2％(w/w)，随后的发酵不再补加表面活性剂。
7、根据权利要求1所述的竹黄菌发酵生产超氧化物歧化酶的方法，其特征在于所述的添加烷烃以提高SOD的产量，所添加烷烃选用：庚烷、辛烷、癸烷、十二烷、十四烷或十六烷，添加时间为发酵开始后的0-40小时，使发酵液中烷烃的质量浓度达1％-10％(w/w)，随后的发酵不再补加烷烃。
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Owner name: JIANGSU ZHUHONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: JIANGNAN UNIVERSITY Effective date: 20111208 |
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| COR | Change of bibliographic data |
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Effective date of registration: 20111208 Address after: 223900 Zijinshan Road, north of Sihong Economic Development Zone, Jiangsu, Suqian, Zhujianglu Road Patentee after: Jiangsu bamboo Biotechnology Co., Ltd. Address before: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Institute of biological engineering Patentee before: Jiangnan University |
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