CN112899323B - 一种添加预处理桦木屑促进桦褐孔菌产降血糖活性多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进桦褐孔菌液体深层发酵产降血糖活性多糖的培养基。该培养基由液体培养基和碱结合臭氧预处理桦木屑组成；所述液体培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为体积分数10％‑80％的桦树浸提汁水溶液；所述溶质如下：葡萄糖、胰蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄，pH自然。采用上述培养基对桦褐孔菌进行发酵培养。结果表明，经本专利技术获得的桦褐孔菌菌丝体多糖产量显著提高，与添加水洗桦木屑的基础培养基相比增长了52.92‑79.51％，同时，α‑葡糖苷酶的抑制率增长了64.43‑150.21％，本发明提升了桦褐孔菌多糖的降血糖活性，为桦木屑的综合利用提供了新途径。

Description

一种添加预处理桦木屑促进桦褐孔菌产降血糖活性多糖的 方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，包含桦褐孔菌液体深层发酵技术，桦木屑组合预处理技术，具体涉及一种通过组合桦树浸提汁和碱结合臭氧预处理桦木屑，进而促进桦褐孔菌液体深层发酵分解利用桦木屑产降血糖活性多糖。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，属于担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科木腐真菌，同时也是一种珍贵的白腐真菌，主要生长繁殖在白桦树、榆树等树皮腋下。16-17世纪以来，在乌克兰、白俄罗斯、波兰和大多数波罗的海国家，民间医学早有用桦褐孔菌来治疗糖尿病、肠道癌和心血管疾病的记录。桦褐孔菌多糖是桦褐孔菌主要化学成分之一，已经作为一种很有前途的功能性食品或糖尿病治疗候选药物引起广泛的探究，具有广泛的应用前景。桦褐孔菌多糖通过抑制肠道α-葡萄糖苷酶的作用，减少食物中碳水化合物的吸收，从而降低餐后血糖，达到治疗糖尿病的作用。

桦褐孔菌主要生长繁殖在白桦树等树皮腋下，造成木材白腐，桦褐孔菌腐朽初期木质部的细胞壁被初步降解，强度下降，木材质地、颜色、韧性皆发生改变，腐朽中期心材部分大部分被腐朽，布满白色菌丝，木质素被降解，腐朽完成后木材的整个宏观机构已经被破坏，质地发生改变，颜色变为深褐色，木材呈现粉末状，并产生出子实体或菌核。

木质纤维素经过预处理后可以提高纤维素酶、漆酶和木聚糖酶的水解率，因此如果采取木质纤维素进行预处理，将有可能帮助桦褐孔菌菌丝体提高促进降血糖活性物质的生产效率。碱预处理可将木质素和半纤维素分解成可溶性片段，从而使被紧密包裹的纤维素暴露出来，臭氧能够有效降解木屑中的木质素和少量半纤维素，提高白腐真菌对木质纤维素的利用率。本研究前期发现碱结合臭氧预处理可以较好地提高木质纤维素的酶解效率，但不同的处理强度使得木质素的脱除量不同，本专利通过研究建立促进桦褐孔菌菌丝生产降血糖活性多糖的桦木屑预处理方法，为大规模采用液体深层培养方法生产桦褐孔菌降血糖提供技术参考。

桦树是我国重要的经济树种，然而，目前桦木屑利用率较低，因此，开发一种以桦木屑为原料，通过生物技术，提高其利用率的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是利用“桦树浸提汁和碱结合臭氧预处理桦木屑”的组合，提供一种促进桦褐孔菌液体深层发酵产降血糖活性多糖的方法及其专用培养基。该方法具有促进多糖合成，提高多糖降血糖活性等优点。

本发明所提供的桦褐孔菌液体发酵培养基由液体培养基和碱结合臭氧预处理桦木屑组成；

所述液体培养基由溶剂和溶质组成；

所述溶剂为体积分数10％-80％的桦树浸提汁水溶液；

所述溶质及其浓度如下：葡萄糖1.0-4.0g/100mL，胰蛋白胨0.2-0.6g/100mL，KH₂PO₄ 0.05-0.15g/100mL，MgSO₄ 0.05-0.15g/100mL，pH自然。

所述碱结合臭氧预处理桦木屑的用量与所述液体培养基的用量配比为1％-5％(g/100mL)；所述碱结合臭氧预处理桦木屑的质量以绝干重计。

所述桦树浸提汁是按照包括下述步骤的方法制备得到的：对桦木进行粉碎，过40-60目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将所述桦木屑加水进行提取，提取结束后抽滤，分别收集滤液和滤渣，所述滤液即为桦树浸提汁；

上述方法中，所述桦木屑与水的料液比为1:20-1:40(g/ml)，所述提取的条件为：常温(15-25℃)水提8-12h。

所述碱结合臭氧预处理桦木屑是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)对桦木进行粉碎，过40-60目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将所述桦木屑在一定温度条件下用碱进行处理一定时间，得到碱处理后的桦木屑；

2)将所述碱处理后的桦木屑与pH 9-11的碱液混合后，用臭氧进行处理，得到碱结合臭氧预处理桦木屑。

上述方法步骤1)中，所述碱具体可为质量分数为1-5％的氢氧化钠水溶液；所述温度条件为50-90℃；所述处理时间为0.5-3h；所述桦木屑和氢氧化钠水溶液的固液比为1:10-20(g/ml)，所述桦木屑质量按木屑绝干重计。

上述方法步骤2)中，所述pH 9-11的碱液具体可为pH 9-11氢氧化钠水溶液；所述碱处理后的桦木屑与pH 9-11氢氧化钠水溶液的固液比为1:10-20(g/ml)；所述碱处理后的桦木屑质量按木屑绝干重计。

所述臭氧的通气量为50-100mg/L，处理时间为15-60min。

本发明还提供了提高桦褐孔菌液体深层发酵产物中降血糖活性多糖含量的方法。

该方法包括下述步骤：将桦褐孔菌液体种子接种至上述桦褐孔菌液体发酵培养基，进行发酵培养。

上述方法中，所述桦褐孔菌液体种子接种量为所述桦褐孔菌液体发酵培养基中液体培养基体积分数的8％-10％。

所述桦褐孔菌液体种子于28℃，150r/min的恒温摇床中培养5-7d。

培养好的液态种子形态为白色绒毛状，呈圆状向外延伸，为典型的白腐真菌类，菌丝体以球状形态存在，球体透明光滑，呈乳白色色或者浅黄色，直径约为1-2mm(见附图2)。

所述发酵培养的条件为：28℃，150r/min，振荡培养13-15d。

所述方法还包括发酵结束后进一步处理的步骤，包括：收集发酵醪，抽滤获得发酵液，再将所述发酵液浓缩、醇沉、烘干，得到发酵粗多糖。

所述浓缩具体可在40-65℃的条件下按1:10的体积比例浓缩发酵液。

所述醇沉可选择无水乙醇，所述无水乙醇与浓缩液的体积比可为4:1。

按照上述方法制备得到的发酵粗多糖也属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述发酵粗多糖在制备降血糖产品中和/或在制备抑制α-葡糖苷酶产品中的应用。

以及以该发酵粗多糖为活性成分制备的降血糖产品或抑制α-葡糖苷酶的产品也属于本发明的保护范围。

所述产品可为药物或保健品。

本发明通过组合桦树浸提汁和碱结合臭氧预处理桦木屑，一是能显著提高桦褐孔菌的胞外多糖含量，经过碱结合臭氧处理桦木屑，优化培养基配方等步骤得到较高的胞外多糖含量；为桦褐孔菌的发酵特性、发酵产物的化学成分分析以及桦褐孔菌降血糖系列产品的深层次开发利用研究奠定一定的理论基础；为桦褐孔菌液体深层发酵和相关产品的生产开发提供科学合理的工艺；为桦褐孔菌的规范工业化发酵生产和工艺质量监管提供理论支持和技术指导，二是通过试验证明经过本发明提取的得到的桦褐孔菌多糖具有显著的降血糖功效，该方法提升了桦褐孔菌多糖的产量和降血糖活性，为桦木屑的综合利用提供了新途径。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线。

图2为桦褐孔菌液体种子的图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明所采用的桦褐孔菌菌种购于中国林业微生物保藏管理中心，菌株编号：cfcc83280。

实施例1

(1)对桦木进行粉碎，过40目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将桦木屑和去离子水料液比为1:40(g/ml)，常温水提12h，抽滤去掉桦木屑渣，即得到桦树浸提汁，桦树渣备用。

(2)使用碱性水溶液为质量体积浓度2％的氢氧化钠水溶液，将粉碎过筛后的桦木屑和碱性水溶液按照固液比为1:15(g/ml)进行碱预处理，碱预处理的条件如下：60℃处理2h，桦木屑质量按木屑绝干重计。

(3)使用臭氧处理步骤(2)所得到的桦木屑，于pH 9氢氧化钠水溶液中添加碱处理结束后固液分离得到的桦木屑(固液比为l：15(g/ml))，臭氧通气量和时间如下:78mg/L处理30min，通气结束后，固液分离，收集处理后的桦木屑，桦木屑质量按滤渣绝干重计。

(4)桦褐孔菌液体种子培养：采用液体菌种培养(％)：葡萄糖2，胰蛋白胨0.4，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄ 0.1，pH自然。将桦褐孔菌PDA斜面菌种接入100mL培养基/250mL，28℃，150r/min振荡培养7d，获得液体种子。培养好的液态种子形态为白色绒毛状，呈圆状向外延伸，菌丝体以球状形态存在，球体透明光滑，呈乳白色色或者浅黄色，直径约为1-2mm。

(5)桦褐孔菌液体发酵活性多糖：发酵培养基与种子培养基成分相同，区别在于用体积分数40％的桦树浸提汁代替水进行培养基配制，向其中接入体积分数10％的液体种子，质量体积分数为1％处理后得到的桦木屑(以绝干重计)，装液量100mL/250mL，然后于28℃，150r/min，振荡培养13d。收集发酵醪，抽滤获得发酵液，在60℃的条件下按1:10的体积比例浓缩发酵液至5mL，添加4倍体积的无水乙醇醇沉、过夜、烘干后即得到发酵粗多糖。

实施例2

(1)对桦木进行粉碎，过40目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将桦木屑和去离子水料液比为1:40(g/ml)，常温水提12h，抽滤去掉桦木屑渣，即得到桦树浸提汁，桦树渣备用。

(2)使用质量体积浓度为1％的氢氧化钠水溶液进行碱处理，桦木屑和碱性水溶液的固液比为1:15(g/ml)，碱预处理的条件如下：70℃处理1h，桦木屑质量按木屑绝干重计。

(3)使用臭氧处理步骤(2)所得到的桦木屑，于pH 9的氢氧化钠水溶液中添加碱处理结束后固液分离得到的桦木屑(固液比为l：15(g/ml))，臭氧通气量和时间如下:78mg/L处理30min，通气结束后，固液分离，收集处理后的桦木屑，桦木屑质量按滤渣绝干重计。

(4)桦褐孔菌液体种子培养：采用液体菌种培养，种子培养基为(％)：葡萄糖2，胰蛋白胨0.4，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄ 0.1，pH自然。将桦褐孔菌PDA斜面菌种接入100mL培养基/250mL，28℃，150r/min振荡培养7d，获得液体种子。

(5)桦褐孔菌液体发酵活性多糖：发酵培养基与种子培养基成分基本相同，区别在于用体积分数60％的桦树浸提汁代替水进行培养基配制，向其中接入体积分数10％的液体种子，质量体积分数为1％处理后得到的桦木屑(以绝干重计)，装液量100mL/250mL，然后于28℃，150r/min，振荡培养13d。收集发酵醪，抽滤获得发酵液，在60℃的条件下按1:10的体积比例浓缩发酵液至5mL，添加4倍体积的无水乙醇醇沉、过夜、烘干后即得到发酵粗多糖。

实施例3

(1)对桦木进行粉碎，过40目筛，取筛下部分，桦木屑和去离子水料液比为1:40(g/ml)，常温水提12h，抽滤去掉桦木屑渣，即得到桦树浸提汁，桦树渣备用。

(2)使用质量体积浓度为3％的氢氧化钠水溶液进行碱处理，桦木屑和碱性水溶液的固液比为1:15(g/ml)，碱预处理的条件如下：50℃处理3h，桦木屑质量按木屑绝干重计。

(3)使用臭氧处理步骤(2)所得到的桦木屑，于pH 9的氢氧化钠水溶液中添加碱处理结束后固液分离得到的桦木屑(固液比为l：15(g/ml))，臭氧通气量和时间如下:78mg/L处理30min，通气结束后，固液分离，收集处理后的桦木屑，桦木屑质量按滤渣绝干重计，。

(4)桦褐孔菌液体种子培养：采用液体菌种培养，种子培养基(％)：葡萄糖2，胰蛋白胨0.4，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄ 0.1，pH自然。将桦褐孔菌PDA斜面菌种接入100mL/250mL，28℃，150r/min振荡培养7d，获得液体种子。

(5)桦褐孔菌液体发酵活性多糖：发酵培养基与种子培养基成分基本相同，区别在于用体积分数80％的桦树浸提汁代替水进行培养基配制，在其中接入体积分数10％的液体种子，质量体积分数为1％处理后得到的桦木屑(以绝干重计)，装液量100mL/250mL，然后于28℃，150r/min，振荡培养13d。收集发酵醪，抽滤获得发酵液，在60℃的条件下按1:10的比例浓缩发酵液至5mL，添加4倍体积的无水乙醇醇沉、过夜、烘干后即得到发酵粗多糖。

上述实施例的相关检测试验及结果如下所示：

1.α-葡糖苷酶的抑制率的测定采用如下方法：

用0.1mol/L的磷酸钾缓冲液(PBS)稀释上述实施例中的发酵粗多糖得到不同浓度粗多糖溶液，按表1加入各反应试剂。首先，加入不同浓度多糖样品溶液，在37℃下保持5min，然后向反应体系中加入α-葡萄糖苷酶，在37℃下反应30min，随后加入底物pNPG(对硝基苯基-Β-D-吡喃半乳糖苷)引发反应，继续在37℃下反应30min。最后，向反应体系中加入Na₂CO₃终止反应，在405nm处测量吸光度。对照组用PBS代替样品，通过以下公式计算α-葡糖苷酶的抑制率：

表1α-葡萄糖苷酶活性抑制率反应体系

2.多糖含量的测定采用苯酚硫酸法

(1)标准曲线的绘制：精确称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100.0mg，置于100mL容量瓶中，加适量水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg/mL的葡萄糖标准贮藏液。吸取1.0mg/mL的葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分别置于刻度试管中，各加蒸馏水，使其体积至10mL，摇匀。再分别量取2mL置于干燥具塞试管中，再加6％苯酚液(称取3g的苯酚，加入47mL的蒸馏水溶解，现配现用)1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，混匀，沸水浴2min，冷却至室温；另以蒸馏水2.0mL，同上操作，作为空白对照，于486nm处测定吸光度(Abs)，三次重复取平均值后，以标准品葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度Abs为纵坐标绘制标准曲线，见图1。由图可知标准曲线线性回归方程为y＝5.3118x+0.0141，R²＝0.999，式中y为吸光值，x为葡萄糖质量(mg/mL)。

(2)样品溶液总糖的测定：准确吸取2.0mL样品溶液，置于25mL具塞试管中，加入1.0mL质量分数为6％的苯酚溶液后，沿试管壁缓慢加入5.0mL浓硫酸溶液，摇匀，沸水浴加热2min后，冷却后以试剂空白为参比，紫外分光光度计测定486nm波长处吸光值，从标准曲线上查得相应含量，计算粗多糖含量。

(3)实施例1中不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响结果如下：

表2不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响

(4)实施例2中不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响结果如下：

表3不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响

(5)实施例3中不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响结果如下：

表4不同处理方式对桦褐孔菌发酵多糖产量及活性影响

注：上述表2-4中，水洗桦木屑组是指采用常规的发酵培养基+水洗桦木屑(步骤1)中常温水提，抽滤后剩余的桦木屑渣)对桦褐孔菌进行液体发酵；

组合处理组是指将常规的发酵培养基中的水替换成桦树浸提汁同时添加碱结合臭氧处理后的桦木屑对桦褐孔菌进行液体发酵。

Claims (3)

1.一种桦褐孔菌液体发酵培养基，由液体培养基和碱结合臭氧预处理桦木屑组成；

所述液体培养基由溶剂和溶质组成；

所述溶剂为体积分数10％-80％的桦树浸提汁水溶液；

所述溶质及其浓度如下：葡萄糖1.0-4.0g/100mL，胰蛋白胨0.2-0.6g/100mL，KH₂PO₄0.05-0.15g/100mL，MgSO₄ 0.05-0.15g/100mL，pH自然；

所述碱结合臭氧预处理桦木屑的用量与所述液体培养基的用量配比为1％-5％(g/100mL)；所述碱结合臭氧预处理桦木屑的质量以绝干重计；

所述桦树浸提汁是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

对桦木进行粉碎，过40-60目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将所述桦木屑加水进行提取，提取结束后抽滤，收集滤液，即为桦树浸提汁；

所述碱结合臭氧预处理桦木屑是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)对桦木进行粉碎，过40-60目筛，取筛下部分得到所需桦木屑；将所述桦木屑在60℃下用碱处理2h，得到碱处理后的桦木屑；

所述碱为质量分数为2％的氢氧化钠水溶液；

所述桦木屑和氢氧化钠水溶液的固液比为1:10-20(g/ml)，所述桦木屑质量按木屑绝干重计；

2)将所述碱处理后的桦木屑与pH 9-11的碱液混合后，用臭氧进行处理，得到碱结合臭氧预处理桦木屑；

所述碱结合臭氧预处理桦木屑制备方法的步骤2)中，所述pH 9-11的碱液为pH9-11氢氧化钠水溶液；所述碱处理后的桦木屑与pH 9-11氢氧化钠水溶液的固液比为1:10-20(g/ml)；所述碱处理后的桦木屑质量按木屑绝干重计；

所述臭氧的通气量为50-100mg/L，处理时间为15-60min。

2.根据权利要求1所述的桦褐孔菌液体发酵培养基，其特征在于：

所述桦树浸提汁的制备方法中，所述桦木屑与水的料液比为1:20-1:40(g/ml)，所述提取的条件为：常温水提8-12h。

3.一种提高桦褐孔菌液体发酵产物中降血糖活性多糖含量的方法，包括下述步骤：将桦褐孔菌液体种子接种至权利要求1或2所述的桦褐孔菌液体发酵培养基，进行发酵培养；

所述桦褐孔菌液体种子接种量为所述桦褐孔菌液体发酵培养基中液体培养基体积分数的8％-10％；

所述桦褐孔菌液体种子在28℃，150r/min，恒温的摇床中培养5-7d；

所述发酵培养的条件为：28℃，150r/min，振荡培养13-15d；

发酵结束收集发酵醪，抽滤获得发酵液，再将所述发酵液浓缩、醇沉、烘干，得到发酵粗多糖。

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