CN107118969A - 一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法,这种培养方法主要是通过在现有盐藻的培养基中选择性地增加特定钙、镁、铁、锌和硒无机矿物质元素的离子浓度,可以提高盐藻细胞内特定生物矿物质元素的含量和调节不同矿物质元素的组成,同时通过把无机矿物营养转化为生物矿物质,提高盐藻矿物质元素的生物利用度。既可以开发具有目前普通盐藻功能和保健效果的产品,同时又可以开发全新的富含特定矿物质营养和高生物利用度的新一代盐藻产品,满足市场精细化的要求。

Description

一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法
本申请得到天津市药用植物细胞规模培养企业重点实验室的资助。
技术领域
本发明涉及到藻类的培养方法,特别是涉及到一种选择性提高盐藻细胞内矿物质元素营养及其生物利用度的培养方法。
背景技术
盐藻是一种极具经济价值的单细胞真核藻类,主要分布在海洋、盐湖等盐水水体中,是目前发现最耐盐的真核光合生物。盐藻富含人体健康所需的多种天然类胡萝卜素、维生素、膳食纤维、氨基酸和多种矿物质元素,具有提高免疫力、抗氧化、延缓衰老等生物活性。目前,包括美国、以色列、澳大利亚等在内的许多国家相继开展了盐藻健康产品的开发,并已进入商业化生产,目前中国也在积极开展盐藻相关健康产业的研究。
盐藻富含多种生物矿物质元素,可以作为功能和保健食品一般补充剂,例如德国布鲁拜尔SUNNY、美国爱司盟盐藻复合片等产品均含有盐藻作为补充剂。但是随着市场对于产品的精细化尤其是对特定矿物营养的要求,利用自然条件大规模养殖或野生散养的盐藻受自然和人工养殖条件的局限,已不能满足市场对于特定盐藻矿物质营养及其含量的需求。市场需要新一代的养殖技术,能够选择性地实现富含不同矿物营养的盐藻,使盐藻更能满足精细化市场需求。
发明内容
在盐藻培养过程中,通过选择性地提高盐藻培养基中特定无机矿物质元素的离子浓度,从而利用盐藻的生物吸收和利用将无机矿物质元素转化为生物矿物质营养,选择性的提高盐藻中特定矿物质元素的含量,并且可以根据市场和产品开发的需求调节不同矿物质元素的比例和提高特定矿物质元素的含量,同时通过生物转化提高盐藻中生物矿物质元素的生物利用度。
为实现上述目的,本发明公开了如下的技术内容:
一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)培养基配制:采用的是改良后的f/2培养基,其中每升培养基含有20.785mg NaCl、3.477mg Na2SO4、0.587mg KCl、0.17mg NaHCO3、0.0845mg KBr、0.0225mg H3BO3、0.0027mgNaF、9.395mg MgCl2▪6H2O、1.316mg CaCl2▪2H2O、0.0214mg SrCl2▪6H2O、75mg NaNO3、5.0mgNaH2PO4▪H20、4.36mg Na2EDTA、3.16mg FeCl3▪6H2O、0.01mg CuSO4▪5H2O、0.023mg ZnSO4▪7H2O、0.012mg CoCl2▪6H2O、0.018mg MnCl2▪4H2O、0.07mg Na2MoO4▪2H2O、0.012mg Na2SeO3、0.0001mg 维生素B1、0.0005mg 维生素B12和0.0005mg 生物素;
(2)盐藻接种与培养:培养液中盐藻的初始密度为1×104~1×105 细胞/m,在盐藻培养的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度,培养温度为25±1℃,光照强度为3500lux,光暗比为12h / 12h的震荡培养箱中进行盐藻培养,培养周期为15天,在培养15天结束后,进行盐藻细胞收集,40℃真空干燥;
(3)收获富含特定有机矿物质的盐藻:采用原子吸收分析法测定盐藻细胞中生物矿物质元素的含量;所述的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度指的是:加入不同体积的2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/LZnSO4▪7H2O溶液和24mg/L Na2SeO3溶液,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度提高10-100倍,优选20-50倍。
本发明所述的盐藻培养指的是:根据需要选择性地增加矿物质离子的浓度,这些矿物质离子包括钙、镁、铁、锌和硒,但并局限这五种,也可以是铜、锰、钴等,优选钙、镁、铁、锌、硒。
本发明所述的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度包括:培养基配制阶段和盐藻的培养期间。例如盐藻培养的第2天、第10天、第14天。
本发明公开的提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
(1)本发明在现有盐藻的培养基中选择性地增加特定无机矿物质元素的离子浓度,可以提高盐藻细胞内特定生物矿物质元素的含量和调节不同矿物质元素的组成,同时通过把无机矿物营养转化为生物矿物质,提高盐藻矿物质元素的生物利用度。
(2)通过提高盐藻培养基中钙镁等矿物质元素的离子浓度,进而提高盐藻细胞中的钙镁等矿物质元素的含量,从而提高盐藻矿物质元素的生物利用度,既可以开发具有目前普通盐藻功能和保健效果的产品,同时又可以开发全新的富含特定矿物质营养和高生物利用度的新一代盐藻产品,满足市场精细化的要求。
附图说明
图1 为盐藻的生长曲线;
图2为大鼠对盐藻中钙元素的生物利用度;
图3为大鼠对盐藻中镁元素的生物利用度。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售;
其中所述的改良后的f/2培养基:指的是:每升培养基含有20.785mg NaCl、3.477mgNa2SO4、0.587mg KCl、0.17mg NaHCO3、0.0845mg KBr、0.0225mg H3BO3、0.0027mg NaF、9.395mg MgCl2▪6H2O、1.316mg CaCl2▪2H2O、0.0214mg SrCl2▪6H2O、75mg NaNO3、5.0mgNaH2PO4▪H20、4.36mg Na2EDTA、3.16mg FeCl3▪6H2O、0.01mg CuSO4▪5H2O、0.023mg ZnSO4▪7H2O、0.012mg CoCl2▪6H2O、0.018mg MnCl2▪4H2O、0.07mg Na2MoO4▪2H2O、0.012mg Na2SeO3、0.0001mg 维生素B1、0.0005mg 维生素B12和0.0005mg 生物素。
实施例1
一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法:
(1)培养基配制:采用的是改良后的f/2培养基,其中每升培养基含有20.785mg NaCl、3.477mg Na2SO4、0.587mg KCl、0.17mg NaHCO3、0.0845mg KBr、0.0225mg H3BO3、0.0027mgNaF、9.395mg MgCl2▪6H2O、1.316mg CaCl2▪2H2O、0.0214mg SrCl2▪6H2O、75mg NaNO3、5.0mgNaH2PO4▪H20、4.36mg Na2EDTA、3.16mg FeCl3▪6H2O、0.01mg CuSO4▪5H2O、0.023mg ZnSO4▪7H2O、0.012mg CoCl2▪6H2O、0.018mg MnCl2▪4H2O、0.07mg Na2MoO4▪2H2O、0.012mg Na2SeO3、0.0001mg 维生素B1、0.0005mg 维生素B12和0.0005mg 生物素;
(2)盐藻接种与培养:培养液中盐藻的初始密度为1×104~1×105 细胞/mL,在盐藻培养第1-14天的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度,培养温度为25±1℃,光照强度为3500 lux,光暗比为12h / 12h的震荡培养箱中进行盐藻培养,培养周期为15天,在培养15天结束后,进行盐藻细胞收集,40℃真空干燥;
(3)收获富含特定有机矿物质的盐藻:采用原子吸收分析法测定盐藻细胞中生物矿物质元素的含量;所述的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度指的是:每次增加2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/L ZnSO4▪7H2O溶液和24mg/L Na2SeO3溶液各10mL,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度提高20倍。
实施例2
(1)采用改良后的f/2培养基进行盐藻培养,培养温度为25±1℃,光照强度为3500lux,光暗比为12h / 12h,生长周期为15天,在第10天开始进入对数生长阶段,盐藻生长曲线见附图1。
在盐藻培养15天结束后,进行盐藻收集,40℃真空干燥,采用原子吸收分析法测定盐藻细胞中生物矿物质钙、镁、铁、锌、硒5种生物矿元素的含量,结果如表1:
表1 盐藻中各矿物质含量
(2)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养基本培养基,在盐藻基本培养基中增加CaCl2▪2H2O和MgCl2▪6H2O的含量,使盐藻基本培养基中的钙和镁的离子浓度分别为7.066mg/L和22.215mg/L,同时以基本培养基培养盐藻作为对照,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁培养基培养的盐藻(HBD)两种盐藻细胞中的矿物质钙元素和镁元素的含量,结果如表2:
表2 盐藻细胞内钙镁含量测定
结果表明,在培养基中增加钙镁离子浓度,可以提高盐藻细胞内矿物质钙和镁的含量,在富含钙镁浓度的培养基中,盐藻细胞内矿物质钙元素含量提高了5.20倍,矿物质镁元素含量提高了3.83倍。
(3)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养的基本培养基,在盐藻基本培养基中增加CaCl2▪2H2O、MgCl2▪6H2O、FeCl3▪6H2O、ZnSO4▪7H2O和Na2SeO3的含量,使盐藻培养基中钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度分别为7.066mg/L、22.215mg/L、13.084 mg/L、0.110 mg/L和0.052mg/L,同时以基本培养基培养盐藻作为对照,之后进行相同浓度的盐藻细胞接种,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁铁锌硒培养基培养的盐藻(HHBD-1)两种盐藻细胞中的矿物质钙元素和镁元素的含量,结果如表3:
表3 盐藻细胞内钙镁铁锌硒含量测定
结果表明,在培养基中增加钙镁铁锌硒离子浓度,可以提高盐藻细胞内矿物质钙镁铁锌硒的含量,在富含钙镁铁锌硒离子浓度提高20倍的培养基中,盐藻细胞内矿物质钙元素含量提高了5.20倍,矿物质镁元素含量提高了3.83倍,矿物质铁元素含量提高了6.55倍,矿物质硒元素含量提高了5.32倍,硒元素含量提高了3.73倍。
(4)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养基本培养基对盐藻进行培养,在盐藻细胞生长第二天加入2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/L ZnSO4▪7H2O溶液和24mg/L Na2SeO3溶液各10mL,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度均提高了20倍,同时以不增加钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度的基本培养基培养盐藻作为对照,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁铁锌硒培养基培养的盐藻(HHBD-2)两种盐藻细胞中的矿物质钙、镁、铁、锌、硒的含量,结果如表4:
表4盐藻细胞内钙镁铁锌硒含量测定
结果表明,在盐藻培养第二天增加培养基中钙镁铁锌硒离子浓度,可以提高盐藻细胞内相应矿物质钙镁铁锌硒的含量。
(5)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养基本培养基对盐藻进行培养,在盐藻细胞生长第10天加入2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/L ZnSO4▪7H2O溶液和24mg/L Na2SeO3溶液各10mL,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度均提高了20倍,同时以不增加钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度的基本培养基培养盐藻作为对照,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁铁锌硒培养基培养的盐藻(HHBD-3)两种盐藻细胞中的矿物质钙、镁、铁、锌、硒的含量,结果如表5:
表5盐藻细胞内钙镁铁锌硒含量测定
结果表明,在盐藻培养第10天增加培养基中钙镁铁锌硒离子浓度,可以提高盐藻细胞内相应矿物质钙镁铁锌硒的含量。
(6)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养基本培养基对盐藻进行培养,在盐藻细胞收获的前一天加入2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/L ZnSO4▪7H2O溶液和24mg/ Na2SeO3溶液各10mL,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度均提高了20倍,同时以不增加钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度的基本培养基培养盐藻作为对照,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁铁锌硒培养基培养的盐藻(HHBD-4)两种盐藻细胞中的矿物质钙、镁、铁、锌、硒的含量,结果如表6:
表6盐藻细胞中钙镁铁锌硒含量测定
结果表明,在盐藻细胞收获前一天增加培养基中钙镁铁锌硒离子浓度,仍然可以提高盐藻细胞内相应矿物质钙镁铁锌硒的含量。
(7)通过上述(3)、(4)、(5)和(6)的实验表明:在盐藻接种前培养基中增加矿物质的离子浓度和盐藻培养过程中的不同生长阶段增加矿物质的离子浓度均能提高盐藻细胞中相应矿物质元素的含量。
(8)以f/2改良培养基中,配制不同钙离子浓度的盐藻培养基对盐藻进行培养,其中钙离子浓度分别为0.353、3.53、7.06、14.12、28.24和35.3mg/L,在盐藻培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,测定干燥盐藻中钙元素的含量,结果如表7:
表7 盐藻细胞中钙含量测定
结果表明,随着培养基中钙离子浓度的增加,盐藻细胞中钙元素含量也相应的增加。
(9)以f/2改良培养基中,配制不同镁离子浓度的盐藻培养基对盐藻进行培养,其中-镁离子浓度分别为1.111、11.11、22.22、33.33、44.44和55.55mg/L,在盐藻培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,测定干燥盐藻中镁元素的含量,结果如表8:
表8 盐藻细胞中镁含量测定
结果表明,随着培养基中镁离子浓度的增加,盐藻细胞中镁元素含量也相应的增加。
(10)以基本培养基和富含钙镁培养基培养后的盐藻进行体内钙镁元素生物利用度考察:实验对象:雄性SD大鼠,20只,180-200g,大鼠进行3天适应性喂养后,随机分为两组,基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁培养基培养的盐藻(HBD)实验组;大鼠禁食12h,不禁水,之后灌胃给予BD和HBD的水溶混悬液,剂量为10 g/kg(盐藻质量/大鼠体重,w/w),分别再给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、4、8、12和24 h后眼眶静脉丛取血,静置30min,4000 rpm离心,取血清,原子吸收法测定血清中钙镁的浓度。血药浓度数据用DAS1.0软件进行拟合,计算药代动力学参数,结果如表9:
表9 两种不同盐藻的药学动力学参数
结果表明,在培养基中增加钙镁离子的浓度,可以提高盐藻中钙镁元素的体内生物利用度。
实施例3
对比试验:
(1)以改良后的f/2培养基作为盐藻培养基本培养基,在盐藻基本培养基中加入CaCl2和MgCl2,使盐藻基本培养基中的Ca2+和Mg2+的浓度增加20倍,同时以不加CaCl2和MgCl2的基本培养基培养盐藻作为对照,在培养15天后进行盐藻收集,40℃真空干燥,分别测定基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁培养基培养的盐藻(HBD)两种盐藻细胞中的矿物质钙元素和镁元素的含量,结果如表2:
表2 盐藻细胞内钙镁含量测定
结果表明,在培养基中增加钙镁离子浓度,可以提高盐藻细胞内矿物质钙和镁的含量,在富含钙镁浓度的培养基中,盐藻细胞内矿物质钙元素含量提高了5.2倍,矿物质镁元素含量提高了3.62倍。
(2)以基本培养基和富含钙镁培养基培养后的盐藻进行体内钙镁元素生物利用度考察:实验对象:雄性SD大鼠,20只,180-200g,大鼠进行3天适应性喂养后,随机分为两组,基本培养基培养的盐藻(BD)和富含钙镁培养基培养的盐藻(HBD)实验组;大鼠禁食12 h,不禁水,之后灌胃给予BD和HBD的水溶混悬液,剂量为10 g/kg(盐藻质量/大鼠体重,w/w),分别再给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、4、8、12和24 h后眼眶静脉丛取血,静置30 min,4000rpm离心,取血清,原子吸收法测定血清中钙镁的浓度。血药浓度数据用DAS1.0软件进行拟合,计算药代动力学参数,结果如表9:
表9 两种不同盐藻的药学动力学参数
结果表明,在培养基中增加钙镁离子的浓度,可以提高盐藻中钙镁元素的体内生物利用度。

Claims (4)

1.一种提高盐藻细胞内矿物质元素及其生物利用度的培养方法,其特征在于按如下的步骤进行:
(1)培养基配制:采用的是改良后的f/2培养基,其中每升培养基含有20.785mg NaCl、3.477mg Na2SO4、0.587mg KCl、0.17mg NaHCO3、0.0845mg KBr、0.0225mg H3BO3、0.0027mgNaF、9.395mg MgCl2▪6H2O、1.316mg CaCl2▪2H2O、0.0214mg SrCl2▪6H2O、75mg NaNO3、5.0mgNaH2PO4▪H20、4.36mg Na2EDTA、3.16mg FeCl3▪6H2O、0.01mg CuSO4▪5H2O、0.023mg ZnSO4▪7H2O、0.012mg CoCl2▪6H2O、0.018mg MnCl2▪4H2O、0.07mg Na2MoO4▪2H2O、0.012mg Na2SeO3、0.0001mg 维生素B1、0.0005mg 维生素B12和0.0005mg 生物素;
(2)盐藻接种与培养:将盐藻种子液接种到培养基中,使培养液中盐藻的初始密度为1×104~1×105 细胞/m,在盐藻培养过程中不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度,培养温度为25±1℃,光照强度为3500 lux,光暗比为12h / 12h的震荡培养箱中进行盐藻培养,培养周期为15天,在培养15天结束后,进行盐藻细胞收集,40℃真空干燥;
(3)收获富含特定有机矿物质的盐藻:采用原子吸收分析法测定盐藻细胞中生物矿物质元素的含量;所述的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度指的是:每次增加不同体积的2.608g/L CaCl2▪2H2O溶液、18.777g/L MgCl2▪6H2O溶液、6.318g/L FeCl3▪6H2O溶液、46mg/L ZnSO4▪7H2O溶液和24mg/L Na2SeO3溶液,使原来培养基中的钙、镁、铁、锌、硒的离子浓度提高10-100倍。
2.权利要求1所述的培养方法,其中所述的盐藻培养指的是:根据需要选择性地增加矿物质离子的浓度,这些矿物质离子包括钙、镁、铁、锌和硒,但并不限于这五种。
3.权利要求1所述的培养方法,其中所述的不同阶段增加培养基中矿物质的离子浓度包括:培养基配制阶段和盐藻的培养期间。
4.权利要求3所述的培养方法,其中所述的盐藻的培养期间包括盐藻培养的生长初期、对数生长期和生长末期。
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