CN103477984B - 一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基及培养方法 - Google Patents
一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基及培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，具体地，公开了一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基及培养方法。所述培养基是在MS配方中除了添加15～60g/L蔗糖、3～9g/L琼脂和0.01～0.2mg/LNAA之外，还根据不同倍性的再生芽对己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6）的敏感性的不同，特别地添加相应浓度的DA-6。所述培养基可以使再生芽的高度和重量、根的重量、直径、数量、一级根的长度、根总长、根冠比及移栽成活率都显著提升。本发明的应用将可促进紫锥菊生物技术育种相关科研工作的开展。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基及培养方法。
背景技术
紫锥菊(Echinacea purpurea L.)为菊科多年生草本植物，具有良好的免疫调节作用，其提取物是近年来在国际上受到普遍重视的一种免疫促进剂和免疫调节剂。由于其确切的功效作用，紫锥菊已经成为一种世界著名的药用植物。人们为了获得多品种的紫锥菊，通常采用组织培养技术进行再生或再生克隆。利用组织培养技术对植物进行再生或再生克隆，通常包含两个步骤。第一步是从外植体诱导产生不定芽。第二步是再生芽生长成完整植株，以备移栽。对于紫锥菊，现有技术中已有很多报道研究其外植体诱导产生不定芽；而至于如何促使这些再生芽生长良好，则很少有人研究。
本发明的发明人在成功获得单倍体和四倍体紫锥菊以后，开始比较这些单倍体、四倍体和它们的母本二倍体的离体生根后，发现基因剂量较高的芽需要更高浓度的NAA或IBA来诱导生根。尽管四倍体紫锥菊的再生芽的根诱导率高，但是其移栽成活率通常较低，原因在于传统方法复原的植株根质量差。
己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6）是一种植物生长调节剂，通常用于田间栽培，很少用于组织培养。而且还没有人尝试将其用于紫锥菊组织栽培方面。
发明内容
本发明为了克服现有技术中紫锥菊再生芽生长较差的缺陷，提供一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基。
本发明的另一个目的是提供一种促进紫锥菊再生芽生长的培养方法。
本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：
一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基，紫锥菊再生芽生长所需的培养基是在MS培养基的中除了添加15～60 g/L蔗糖、3～9 g/L琼脂和0.01～0.2 mg/L NAA之外，还特别地添加己酸二乙氨基乙醇酯（DA-6）。
所述紫锥菊再生芽为二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽。
优选地，所述二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08～0.16 mg/L。
更优选地，所述二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08或0.16 mg/L。
最优选地，所述六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08 mg/L；所述二倍体、三倍体或四倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.16 mg/L。
一种提高紫锥菊外植体再生不定芽的培养方法，根据如上所述二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽接种在适合各自生长的培养基中，在培养温度为25±4 ℃，光照强度为1000~2500 lx，光照时间为10～16 h/d的条件下培养10～60 d。
DA-6是一种植物生长调节剂，通常用于田间栽培，很少用于组培。在本发明所述的四种不同倍性水平的紫锥菊上，结果呈现出在绝大部分的情况下，DA-6显然能够促进紫锥菊再生芽的生长。在含有DA-6的培养基上复原的植株质量非常高，而且在移栽时成活率也很高。
本发明的有益效果：本发明解决了通常紫锥菊再生芽生长培养中再生芽质量低和再生芽的根质量差、移栽成活率低的突出问题，对于紫锥菊的生物技术研究特别是对于不能够产生种子但具有更高种植价值的三、四、六倍体的种苗克隆具有重要的可直接应用的价值。
说明书附图
图1.不同DA-6浓度对二倍体再生芽生长的影响；1～4分别是用0、0.08、0.16、0.32 mg/L的DA-6处理的二倍体再生芽。
图2.不同DA-6浓度对三倍体再生芽生长的影响；1～4分别是用0、0.08、0.16、0.32 mg/L的DA-6处理的三倍体再生芽。
图3.不同DA-6浓度对四倍体再生芽生长的影响；1～4分别是用0、0.08、0.16、0.32 mg/L的DA-6处理的四倍体再生芽。
图4.不同DA-6浓度对六倍体再生芽生长的影响；1～4分别是用0、0.08、0.16、0.32 mg/L的DA-6处理的六倍体再生芽。
图5.移栽炼苗器皿及炼苗过程；1：炼苗器皿为透明旋盖塑料瓶，标尺为1 cm；2：闭盖炼苗；3：开盖炼苗。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
植物材料：本发明所述二倍体紫锥菊由种子获得；四倍体紫锥菊的获得方法可参考Nilanthi D, Chen X L, Zhao F C, et al. Induction of tetraploids from petiole explants through colchicine treatments in Echinacea purpurea L[J]. BioMed Research International, 2009, 2009.。三倍体紫锥菊是将二倍体和四倍体杂交获得。六倍体是将三倍体外植体用秋水仙素处理加倍后诱导不定芽获得（将三倍体外植体用秋水仙素处理加倍后诱导不定芽获得六倍体紫锥菊的方法可参考本领域常规技术）。这些植株的倍性均通过根尖染色体计数技术进行了鉴定。
实施例1：
S1.再生芽的准备：首先获得紫锥菊叶柄外植体，叶柄外植体来自组织培养条件下的紫锥菊二倍体无菌苗（外植体的制备可参考本领域常规技术方法），然后将叶柄外植体接种在再生培养基上（再生培养基为含有30 g/L 蔗糖、0.3 mg/L BA、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基）。当再生芽长到连叶高约2 cm时，将芽从外植体组织上切下来，就可以作为本发明所用的材料——再生芽。
S2.再生芽的培养：把步骤S1中所述从二倍体紫锥菊叶柄外植体上得到的芽切割出来，接种到添加了不同浓度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的生长培养基上（生长培养基为含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/LNAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基），检查再生芽生长的情况。
检查结果见表1和图1。从表1和图1可知，DA-6能高效强化再生芽的生长。在所有浓度中，DA-6 0.08 mg/L提升植株高度和重量、根重、根数和一级根长度、总根长度似乎是最有效的。而如果要根直径达到最大，根冠比达到最高，则要较高浓度的DA-6（0.16 mg/L）。所有的生长参数都在表1列出，达到了显著水平（P<0.05）。
表1 不同浓度DA-6对二倍体再生芽生长的影响
注：表中同一列的数据后面不同的数字表示邓肯测试差异显著（P<0.05）。
实施例2
S1.再生芽的准备：首先获得紫锥菊叶柄外植体，叶柄外植体来自组织培养条件下的紫锥菊三倍体无菌苗（外植体的制备可参考本领域常规技术方法），然后将叶柄外植体接种在再生培养基上（再生培养基为含有30 g/L 蔗糖、0.3 mg/L BA 、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基）。当再生芽长到连叶高约2 cm时，将芽从外植体组织上切下来，就可以作为本发明所用的材料——再生芽。
S2.再生芽的培养：把步骤S1中所述从三倍体紫锥菊叶柄外植体上得到的芽切割出来，接种到添加了不同浓度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的生长培养基上（生长培养基为含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/LNAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基），检查再生芽生长的情况。检查结果见表2和图2。根据表2和图2，显然DA-6能够有效增强三倍体芽的生长情况。在所有测试的浓度里，DA-6 0.08 mg/L看起来是最适合用于增加根冠比的。而DA-6 0.16 mg/L 则更适于增加株高、株重、根重、根粗与根总长。实验中最高浓度DA-6（0.32 mg/L）看起来也能够显著增加根直径。此外，在培养基里添加DA-6缩短了一级根的长度，而且浓度越高，一级根长度就越短。
表2 不同浓度DA-6对三倍体芽生长的影响
注：表中同一列的数据后面不同的数字表示邓肯测试差异显著（P<0.05）。
实施例3
S1.再生芽的准备：首先获得紫锥菊叶柄外植体，叶柄外植体来自组织培养条件下的紫锥菊四倍体无菌苗（外植体的制备可参考本领域常规技术方法），然后将叶柄外植体接种在再生培养基上（再生培养基为含有30 g/L 蔗糖、0.3 mg/L BA 、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基）。当再生芽长到连叶高约2 cm时，将芽从外植体组织上切下来，就可以作为本发明所用的材料——再生芽。
S2.再生芽的培养：把步骤S1中所述从四倍体紫锥菊叶柄外植体上得到的芽切割出来，接种到添加了不同浓度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的生长培养基上（生长培养基为含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/LNAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基），检查再生芽生长的情况。
检查结果见表3和图3。根据表3和图3，显然DA-6能够有效促进四倍体芽的生长。在所有测试的浓度中，DA-6 0.08 mg/L是提升一级根和根冠比最佳的浓度。较高浓度的DA-6（0.16 mg/L）最适合用于提升株高、株重、根重、根数及总根长。最高浓度的DA-6（0.32 mg/L）抑制一级根长。
表3 不同浓度DA-6对四倍体芽生长的影响
注：表中同一列的数据后面不同的数字表示邓肯测试差异显著（P<0.05）。
实施例4
S1.再生芽的准备：首先获得紫锥菊叶柄外植体，叶柄外植体来自组织培养条件下的紫锥菊六倍体无菌苗（外植体的制备可参考本领域常规技术方法），然后将叶柄外植体接种在再生培养基上（再生培养基为含有30 g/L 蔗糖、0.3 mg/L BA 、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基）。当再生芽长到连叶高约2 cm时，将芽从外植体组织上切下来，就可以作为本发明所用的材料——再生芽。
S2.再生芽的培养：把步骤S1中所述从六倍体紫锥菊叶柄外植体上得到的芽切割出来，接种到添加了不同浓度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的生长培养基上（生长培养基为含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基），检查再生芽生长的情况。
检查结果见表4和图4。根据表4及图4，添加0.08 mg/L DA-6能够显著提升根重、一级根长和根冠比。在DA-6浓度为0.08~0.16 mg/L时会增加根粗。在本实验的各浓度里，添加DA-6没有显著提升株高、株重、根总数和根总长。
表4 不同浓度DA-6对六倍体芽生长的影响
注：表中同一列的数据后面不同的数字表示邓肯测试差异显著（P<0.05）。
实施例5
S1.再生芽的准备：首先获得紫锥菊叶柄外植体，叶柄外植体来自组织培养条件下的紫锥菊二倍体、三倍体、四倍体、六倍体无菌苗（外植体的制备可参考本领域常规技术方法），然后将叶柄外植体接种在再生培养基上（再生培养基为含有30 g/L 蔗糖、0.3 mg/L BA、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基）。当再生芽长到连叶高约2 cm时，将芽从外植体组织上切下来，就可以作为本发明所用的材料——再生芽。
S2.再生芽的培养：把步骤S1中所述从紫锥菊叶柄外植体上得到的芽切割出来，接种到添加了不同浓度DA-6（0、0.08、0.16、0.32 mg/L）的生长培养基上（生长培养基为含有30 g/L蔗糖、0.01 mg/L NAA，以4.5 g/L 琼脂固化，在1.4 kg cm-2下灭菌20 min的MS培养基），进行培养，获得可移栽的幼苗。
S3.把步骤S2中所述二倍体、三倍体、四倍体、六倍体的幼苗进行炼苗移栽：将培养瓶拧松瓶盖，移至自然光下。3 d后，小心地将植株从培养基中轻轻取出，把根上的培养基洗净，栽种到含有湿润无菌园艺土的有盖透明塑料瓶中，在自然光照、凉爽的环境中闭盖炼苗。3 d后打开塑料瓶盖，在自然光照、通风、凉爽、湿润的环境下开盖炼苗。10天后检查幼苗存活状况。
检查结果见表5和图5。根据表5，显然添加0.16 mg/L DA-6能显著提升幼苗成活率，在此浓度下生长的二倍体、三倍体及四倍体能达到100 %成活率。最高浓度0.32 mg/L下会降低幼苗成活率。
表5不同浓度DA-6对生根35 d后炼苗成活率的影响
注：表中同一列的数据后面不同的数字表示邓肯测试差异显著（P<0.05）。
需说明的是，除以上实施例外，本发明还可以有其他实施方式和变形，以上例举的仅是本发明的具体实施例子。凡本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
讨论：有报道指多倍体植株产生次生代谢物的能力更强。因此，育种上为了培育具有高栽培价值的新品种，特别是新的药用植物，制造多倍体是其中一个策略。虽然多倍体有许多优点，但是也有缺点，低育性是其中一个最常见的问题。如前文所述，除了三倍体紫锥菊，四倍体和六倍体紫锥菊也被创造了出来。三倍体和六倍体的紫锥菊高度不育，因此，有效的离体繁殖培育方法成为研究工作进展关键，否则无法进一步展开生物技术育种研究。
对一个芽来说，要使之长成一个完整植株，关键在于诱导出不定根并使这些不定根生长良好。诱导生根、促进生根最传统的做法是把生长素、NAA、IAA或IBA添加到培养基中，然后接种那些需要生根的芽。虽然也有一些其他的方法可以刺激根的产生，但并没有太高的应用价值。而且，利用传统的生根方法芽的生根效果很差，移栽后的存活率低。而本发明通过在再生芽的生长培养基中加入适量浓度的DA-6可以使再生芽的高度和重量、根的重量、直径、数量、一级根的长度、根总长、根冠比及移栽成活率都显著提升。
Claims (2)
1.一种促进紫锥菊再生芽生长的培养基，其特征在于，该紫锥菊再生芽生长培养基为MS+15～60 g/L蔗糖+3～9 g/L琼脂+0.01～0.2 mg/L NAA+己酸二乙氨基乙醇酯，即DA-6；
所述紫锥菊再生芽为二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽；
所述二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08～0.16 mg/L。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，所述二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08或0.16 mg/L。
3. 根据权利要求2所述培养基，其特征在于，所述六倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.08 mg/L；所述二倍体、三倍体或四倍体紫锥菊来源的再生芽生长所需的培养基中添加的DA-6的量为0.16 mg/L。
4. 一种促进紫锥菊再生芽生长的培养方法，其特征在于，二倍体、三倍体、四倍体或六倍体紫锥菊来源的再生芽接种在权利要求1-3任一项所述的培养基中，在培养温度为25±4 ℃，光照强度为1000～2500 lx，光照时间为10～16 h/d的条件下培养10～60 d。
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