CN104365475B - 一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于作物生物技术和遗传育种技术领域，具体公开了一种高效获得六倍体紫锥菊的筛选方法，即将染色体加倍处理后的三倍体紫锥菊的根外植体诱导不定芽再生，不定芽长至连叶高2 cm后诱导生根，选择从不定芽诱导开始后第150～210天长出2cm根的不定芽进行倍性鉴定，高成功率的获得由三倍体成功加倍成六倍体的紫锥菊，由本发明所述方法筛选获得的六倍体的成功率高达53.33%，为多倍体紫锥菊筛选提供了可靠的技术手段，为多倍体紫锥菊的育种提供了重要的技术支撑，应用前景广阔，具有很好的实际应用价值，能够产生较好的经济效益和社会效益。

Description

一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法
技术领域
本发明涉及作物生物技术和遗传育种领域，更具体地，涉及一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法。
背景技术
紫锥菊(Echinacea purpurea)为菊科多年生草本植物，是原产于美洲的一种野生花卉，因其具有良好的免疫调剂作用已广泛应用于营养补充剂和保健食品。由于紫锥菊的有效成分主要存在于根部，为提高根部产量，进一步改善品质，提高有效成分含量，增强其抗病性，围绕其展开的倍性育种研究发展迅猛，现有技术中已有利用紫锥菊叶柄外植体成功培育出四倍体、八倍体的研究，但其诱导成功率较低；现有技术中对成功加倍的多倍体紫锥菊筛选效率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中获得成功加倍的六倍体紫锥菊的筛选效率低的缺陷，提高一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法，即将染色体加倍处理后的三倍体紫锥菊的根外植体诱导不定芽再生，不定芽长至连叶高2cm后诱导生根，选择从不定芽诱导开始后第150～210天长出2cm根的不定芽进行倍性鉴定，高成功率的获得由三倍体成功加倍成六倍体的紫锥菊。
秋水仙素是一种生物碱，它能够抑制有丝分裂，秋水仙素处理后的细胞，其染色体虽然纵裂，但细胞并不分裂，不能形成两个细胞，因此可以使细胞染色体加倍，秋水仙素经常被用来作为植物多倍体诱导的物质，但因植物种类不同，针对不同的植物，其用秋水仙素处理的条件显著不同，需要研究者进行多次实验和分析。
申请人已在前期的研究中实现了利用秋水仙素诱导紫锥菊叶柄外植体获得四倍体和八倍体，但其不仅成功诱导率较低，而且筛选效率也低，本发明首先是将紫锥菊的根作为外植体进行加倍，获得了成功率高的六倍体。
经秋水仙素处理的根外植体在转接到含BA的MS培养基上诱导不定芽产生后，记录该转接日期a；当再生芽长至连叶高2cm时转接到生根培养基上诱导不定根产生，当不定根长至2cm时记录该日期b。从诱导不定芽再生到根尖染色体检查的时间跨度即培养时间，记为b-a天。
本发明研究结果显示生长时间与六倍体获得率有显著关系，秋水仙素处理后进行不定芽诱导的时候，越早达到生根高度、长出2cm不定根的芽株，越有可能是没有加倍的三倍体，越晚长成的芽，其为六倍体的几率越高，在第150～210d才获得2cm根的不定芽，其为六倍体的几率很高。
优选地，所述根外植体诱导不定芽再生的培养基为含BA的MS培养基；更优选地，所述BA的浓度为0.5mg/L。
申请人在研究中还发现，只要是同时生根，且选取的各条根本身状态相互接近，不论是接近根尖部分的根段作为外植体，还是远离根尖部分的根段作为外植体，还是根的中段作为外植体，经秋水仙素加倍处理以后，在含有0.5mg/L BA的MS培养基上诱导再生不定芽的效果差异不显著。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法，即将染色体加倍处理后的三倍体紫锥菊的根外植体诱导不定芽再生，不定芽长至连叶高2cm后诱导生根，选择从不定芽诱导开始后第150～210天长出2cm根的不定芽进行倍性鉴定，高成功率的获得由三倍体成功加倍成六倍体的紫锥菊，由本发明所述方法筛选获得的六倍体的成功率高达53.33％，为多倍体紫锥菊筛选提供了可靠的技术手段，为多倍体紫锥菊的育种提供了重要的技术支撑，应用前景广阔，具有很好的实际应用价值，能够产生较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进一步具体描述。本发明的设计思想或同类物质的简单替代属于本发明的保护范围。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。
本发明所采用染色体加倍的方法参考Nilanthi(2009)，基本流程为：取材→预培养→不同类型外植体(叶、叶柄、根)进行加倍处理→MS培养基中添加BA进行诱导不定芽再生→培养不同天数(～210天)→诱导不定根→倍性鉴定，倍性鉴定方法为根尖染色体压片后镜检(卡宝品红染色)。
本发明所述含有秋水仙素的培养基为秋水仙素120mg/L、BA 0.4mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L的MS培养基。
数据格式与处理：数据的分析采用美国IBM公司的SPSS(Statistical Product and ServiceSolutions)19.0软件进行，实验处理各项平均数后列出的误差项为各平均数的标准误差。各处理的平均数间差异显著性分析：使用邓肯式多重范围比较(Duncan’s New Multiple RangeTest)进行三组或以上数据的差异显著性分析；用T检验进行两组数据的差异显著性分析。
实施例1秋水仙素对不同类型外植体存活状态的影响
本发明所用的紫锥菊的二倍体种子购自美国马萨诸塞州诺顿的Plantation Products园艺公司；四倍体通过申请人已有的方法对二倍体紫锥菊进行秋水仙素处理使其染色体加倍获得(Nilanthi,2009)；三倍体通过将二倍体和四倍体进行杂交并栽培种子获得。
对获得的三倍体紫锥菊分别取叶片、叶柄和根外植体使用120mg/L秋水仙素处理18d后，转移到含有BA0.4mg/L，NAA0.01mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L的MS再生培养基上培养，22d后统计外植体存活率。从表1可知，不同类型三倍体外植体对于120mg/L秋水仙素处理后的培养反应差异显著，其中叶柄和根外植体均100％存活，但叶片外植体只有77.0％存活，其余的叶片外植体黄化死亡。
表1不同类型外植体经秋水仙素处理后存活状态
*本表为120mgL秋水仙素处理18天后，再在再生培养基上培养22天后的结果。
*表中每一列的数值后面的不同的字母表示在邓肯测试中差异显著(P＜0.05)。
实施例2根外植体选取位置对秋水仙素处理后诱导不定芽的影响
同一三倍体株系，生根30天后，选取状态接近的根，截取不同位置(近根尖段、中段、远离根尖段)，预处理后，即在含有秋水仙素120mg/L、BA 0.4mg/L、NAA 0.01mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L的MS培养基上，在23～27℃、冷白光光照密度600～1300lx、光照周期12h/d条件下培养25天，然后在含有0.5mg/L BA的MS培养基上诱导再生不定芽，研究其不定芽诱导率。根据表2可知，只要是同时生根，且选取的各条根本身状态相互接近，不论是接近根尖部分的根段作为外植体，还是远离根尖部分的根段作为外植体，经秋水仙素加倍处理以后，在含有0.5mg/L BA的MS培养基上诱导再生不定芽的效果差异不显著，平均每个外植体能够诱导出0.14～0.4个再生芽。
表2秋水仙素处理对不同选取位置的根外植体再生不定芽诱导率的影响
根段 外植体数量 芽总数 单位外植体芽数
根尖 21 3 0.1429±0.07825a*
根中段 20 8 0.4000±0.11239a
远离根尖 20 6 0.3000±0.10513a
*表中每一列的数值后面的相同的字母表示在邓肯测试中差异不显著(P＜0.05)。
实施例3从诱导不定芽再生到根尖染色体检查的时间跨度与其六倍体获得率的关系经120mg/L秋水仙素处理18d后的根外植体在转接到含0.5mg/L BA的MS培养基上诱导不定芽发生后，记录该转接日期a；当再生芽长至连叶高2cm时转接到生根培养基(含有NAA0.01mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L的MS培养基)上，在23～27℃、冷白光光照密度600～1300lx、光照周期12h/d条件下培养，诱导不定根产生，当不定根长至2cm时记录该日期b。从诱导不定芽再生到根尖染色体检查的时间跨度即生长时间，记为b-a天。
从表3可知，结果显示生长时间与六倍体获得率有显著关系，秋水仙素处理后进行不定芽诱导的时候，越早达到生根高度、长出2cm不定根的芽株，越有可能是没有加倍的三倍体，越晚长成的芽，其为六倍体的几率越高，在第150～210d才获得2cm根的不定芽，其为六倍体的几率高达53.33％。这不仅说明多倍体生根速度较慢，而且还暗示多倍体整体植株生长也较慢。
由此可以得出，在利用秋水仙素处理三倍体加倍获得六倍体的试验中，可以通过延长生长时间来筛选成功加倍的六倍体，这不仅可以提高六倍体的成功获得率，而且可以缩短操作者的实验成本，为六倍体的筛选提供理论指导。
表3生长时间与其六倍体获得率的关系
生根培养天数 植株总数 三倍体数 六倍体数 六倍体比例
0～49d 21 21 0 0b*
50～149d 35 28 7 0.2000±0.6860b
150～210d 15 7 8 0.5333±0.1333a
*表中每一列的数值后面的不同的字母表示在邓肯测试中差异显著(P＜0.05)。

Claims (3)

1.一种获得六倍体紫锥菊的筛选方法，其特征在于，将染色体加倍处理后的三倍体紫锥菊的根外植体诱导不定芽再生，不定芽长至连叶高2 cm后诱导生根，选择从不定芽诱导开始后第150～210天长出2cm根的不定芽进行倍性鉴定，获得由三倍体成功加倍成六倍体的紫锥菊，所述的根外植体取材于近根尖段、中段或远离根尖段；所述染色体加倍处理后的三倍体紫锥菊的根外植体是在含有秋水仙素120 mg/L、 BA 0.4 mg/L、NAA 0.01 mg/L、蔗糖 30 g/L、琼脂4.5 g/L 的MS培养基上，在23～27℃、冷白光光照密度600～1300 lx、光照周期12 h/d 条件下培养25天获得。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述根外植体诱导不定芽再生的培养基为含BA的MS培养基。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述BA的浓度为0.5 mg/L。
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