CN103194524A - 快速鉴定抗青枯病花生种质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物种质鉴定技术，本发明的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，包括如下步骤：（1）培养花生青枯菌，制备108个/ml或109个/ml浓度的菌悬液；（2）从播后55-65天的健康花生植株第2对侧枝顶端切取长有叶片的茎枝，置于上述菌悬液中培养；（3）培养3天后，从受测茎枝的枯萎程度来判断该株花生是否抗青枯病，在浓度为108个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为抗青枯病花生种质；在浓度为109个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为高抗青枯病花生种质。本发明弥补了现行的花生青枯病抗性鉴定方法周期长、操作繁琐、难以鉴定分离世代材料抗性，不影响其它农艺性状选择而与遗传育种实践脱节的不足。
Description
技术领域
本发明涉及植物种质鉴定技术，具体涉及一种获得抗青枯病花生种质的方法。
背景技术
花生是世界五种最重要的油料作物之一，也是许多发展中国家植物油和蛋白质的重要来源。我国是世界上最大的花生生产、消费和出口国。由Ralstoniasolanacearum引起的细菌性萎蔫病(青枯病)是花生生产中重要的病害之一，常导致大面积减产甚至绝产。作为土传病害，花生青枯病很难用化学方法防治，较长周期的轮作有一定效果，但其受耕地面积限制。生物防治也是一种重要的方法，并取得一定效果，如2004年7月28日公开的中国专利申请，其公开号为CN1515666A，公开了一种用于防治青枯病假单胞菌的筛选方法，但由于花生青枯病在花生各个时期(苗期、初花期、盛花期等)均有发生，造成生物防治费用较高，于是培育和种植抗病品种是防治这一病害较为经济有效的途径。
花生种质青枯病抗性可于田间和室内鉴定。田间自然鉴定法需地力均匀、地势平坦、病害压力一致的自然病地，只能在花生生长季节进行，周期较长，收获时统计植株存活率，难以确定个体（单粒种子或单个植株）的抗病性。人工接种鉴定法，可将种子浸泡于菌液中而后播种于田间，其它步骤与田间自然鉴定法相同；或在水培花生生长至3-4叶龄时，采用伤根浸根法对花生进行青枯菌接种处理,10-15天后调查植株发病情况；亦可在花盆内栽培的植株上进行剪叶接种：在花生6叶期，从上向下第二、三叶顶端两片小叶1/4处剪切叶片，每蘸1次菌液剪2片叶。剪叶植株置于26℃培养箱中，湿度保持为75％，4d后记录发病情况。其中后两种方法可用于确定单个植株的抗性。但仍然存在占用较大空间、难以与遗传育种实践结合的问题。因此，迫切需要一种受时间，空间限制较少，能够在实验室中快速鉴定获得抗青枯菌花生种质的方法。
发明内容
本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其在田间植株生长过程中进行，能够在实验室内操作的快速鉴定抗青枯病花生种质的技术。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：其包括如下步骤：
（1）培养花生青枯菌，制备108个/ml或109个/ml浓度的菌悬液；
（2）从播后55-65天的健康花生植株第2对侧枝顶端切取长有叶片的茎枝，置于上述菌悬液中培养；
（3）培养3天后，从受测茎枝的枯萎程度来判断该株花生是否抗青枯病，在浓度为108个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为抗青枯病花生种质；在浓度为109个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为高抗青枯病花生种质。
本发明的内容是在花生生长时期，从花生植株上第2对侧枝顶端取部分茎枝，置于浓度为108个/ml或109个/ml的花生青枯菌菌悬液中共培养，经过一段时间培养后，从茎枝叶片的变化来判断其青枯病抗性。
步骤（1）中的青枯菌在NA固体培养基上划线培养。NA固体培养基组分为每升培养基中含葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母粉0.5g、琼脂20g，pH值为7.0-7.2。此培养基为已公开的青枯菌基本培养基。
步骤（1）中的青枯菌培养方式为：挑取单菌落悬浮后，均匀涂布在NA固体培养基上，待菌苔长满培养基表面后，用双蒸水将其冲洗下来，用血球计数板计算其浓度，将菌液浓度调整到108个/ml或109个/ml。
步骤（2）中切取时刀片与茎枝成垂直方向切下，使截面积最小化，减少对被切取枝条的损害，可使被截处组织均匀的与菌液接触，提高实验准确性。
步骤（2）中的培养步骤置于光照培养箱中，28℃按光周期和暗周期各12小时交替培养。此条件模仿田间花生在青枯病发病时期的自然生长环境，且此温度为青枯菌的最适生长温度，有利于在菌液—茎枝共培养条件下准确测得待测花生是否具有青枯病抗性。
本发明技术弥补了现行的花生青枯病抗性鉴定方法周期长、操作繁琐、难以鉴定分离世代材料抗性同时不影响其它农艺性状选择而与遗传育种实践脱节的不足。
具体实施方式
本发明快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，包括如下步骤：
（1）将保存的青枯菌在NA培养基上划线培养，挑取单菌落悬浮后，涂布NA培养基，待菌苔长满培养基表面后，用双蒸水将其冲洗下来。用血球计数板计算其浓度，将菌液浓度调整到108个/ml或109个/ml。
（2）于上午10时之前，切取播种后60天左右健康花生植株第2对侧枝的顶芽，切取时刀片与茎成垂直方向，迅速切下，立即置于上述菌悬液中，置28℃光照培养箱中，按光周期和暗周期各12小时培养。
（3）培养3天后，观察茎枝枯萎情况，在浓度为108个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为抗青枯病花生种质（包括高抗和中抗）；在浓度为109个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为高抗青枯病花生种质。
我们用本发明的方法鉴定了山东省花生研究所生物技术实验室保存的40份花生样品，该批样品之前已通过田间实验得知其抗青枯病特性。将这40份样品播种，待其长出第2对侧枝时切取健壮茎枝，按本发明的方法置于制备好的菌悬液中共培养，实验结束后统计，所有40份花生样品的青枯病抗性鉴定结果与田间实验得出的结果完全一致。抗病种质与易感种质的枯萎程度呈现显著差别。
Claims (6)
1.一种快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）培养花生青枯菌，制备108个/ml或109个/ml浓度的菌悬液；
（2）从播后55-65天的健康花生植株第2对侧枝顶端切取长有叶片的茎枝，置于上述菌悬液中培养；
（3）培养3天后，从受测茎枝的枯萎程度来判断该株花生是否抗青枯病，在浓度为108个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为抗青枯病花生种质；在浓度为109个/ml的菌液中，没有出现显著枯萎症状的即为高抗青枯病花生种质。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，步骤（1）中的青枯菌在NA固体培养基上划线培养。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，NA固体培养基组分为每升培养基中含葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母粉0.5g、琼脂20g，pH值为7.0-7.2。
4.根据权利要求2所述的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，步骤（1）中的青枯菌培养方式为：挑取单菌落悬浮后，均匀涂布在NA固体培养基上，待菌苔长满培养基表面后，用双蒸水将其冲洗下来，用血球计数板计算其浓度，将菌液浓度调整到108个/ml或109个/ml。
5.根据权利要求1所述的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，步骤（2）中切取时刀片与茎枝成垂直方向切下。
6.根据权利要求1或5所述的快速鉴定抗青枯病花生种质的方法，其特征在于，步骤（2）中的培养步骤置于光照培养箱中，28℃按光周期和暗周期各12小时交替培养。
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