CN113088536A - 一种提高白桦扦插生根率的转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高白桦扦插生根率的转基因方法，属于林木育种技术领域。本发明提供一种白桦BpmiR156基因在白桦扦插繁殖育种中的应用，所述白桦BpmiR156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过导入BpmiR156基因过表达白桦，在不需要激素处理的情况下，生根率能达到85％以上；本发明将该方法应用于白桦扦插繁殖育种中，可显著地提高白桦扦插繁殖生根率，有效地解决了白桦扦插生根难的瓶颈，为白桦良种推广提供技术支持。

Description

一种提高白桦扦插生根率的转基因方法

技术领域

本发明涉及林木育种领域，涉及一种提高白桦扦插生根率的转基因方法。

背景技术

目前，英国、新西兰、加拿大和巴西等发达国家在发展工业用材林时都把杂种优势的利用放到优先考虑的地位。八十年代后，随着无性繁殖技术的发展，英、美、新西兰、加拿大等国进行了一些生根困难树种的扦插繁殖研究，尤其是在阔叶树杂种的应用在提高木材产量、实现造林品种化方面取得了举世瞩目的成就。在“有性制种、无性利用”方面创造了一批高产优质的范例。

白桦(Betula platyphylla Suk.)属桦木科桦木属，是一种分布较广的阔叶落叶树种，也是东北地区的先锋树种之一。白桦具有更新好、适应性强、资源丰富等特点，适合种植在庭园、公园草坪、池畔、湖滨或列植于道旁，是我国胶合板生产中最适宜和最重要的材料。白桦的良种选育始于“八五”期间，在种源选择、杂交育种方面取得了显著成效，但良种在推广利用上受到了限制，主要原因是缺乏经济有效的无性繁殖方法。白桦无性繁殖技术体系尚未建立，组织培养体系已建立，体细胞胚发生技术体系尚在探索阶段，但对于这两个途径的技术及条件要求高，不利于基层单位推广应用。而适合于基层单位的扦插繁殖技术，因为白桦扦插生根难的问题一直很难突破。扦插繁殖实施条件简便，操作容易，繁殖成本较低，但不同的种源及无性系间生根能力差异很大。很多科研团队也开展了白桦扦插繁殖技术研究，例如：宋晓东等通过对扦插时间、化学药剂、扦插基质(种类、深度等)进行的试验研究，认为扦插繁殖白桦时宜采用嫩枝适时扦插，用IBA(吲哚丁酸)处理插条，辅以割伤、遮荫等措施，用珍珠岩+泥炭作基质，扦插繁殖生根率达到45％-50％。该方法需要激素处理，并且所达到的生根率远远不能满足大规模的种植原料的供应，因此，扦插生根难的问题仍未从根本上得到解决，制约了白桦良种化推广进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高白桦扦插生根率的转基因方法，通过导入BpmiR156基因过表达白桦，在不需要激素处理的情况下，生根率能达到85％以上，可显著地提高白桦扦插繁殖生根率，有效地解决了白桦扦插生根难的瓶颈，为白桦良种推广提供技术支持。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种白桦BpmiR156基因在白桦扦插繁殖育种中的应用，所述白桦BpmiR156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的是，应用于提高白桦扦插繁殖生根率。

本发明还提供一种提高白桦扦插繁殖生根率的方法，包括以下步骤：

步骤1：获取权利要求1中所述的白桦BpmiR156基因的核苷酸序列；

步骤2：利用步骤1所得的核苷酸序列构建重组质粒，并将所述重组质粒导入宿主菌，构建侵染植物用的工程菌；

步骤3：用所得工程菌侵染白桦合子胚进行遗传转化，得到提高白桦扦插繁殖生根率的转基因白桦。

优选的是，所述宿主菌为根瘤农杆菌。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过根据白桦基因组及转录组数据设计基因特异引物，克隆BpmiR156基因，并利用GATEWAY克隆方法进行载体的连接，得到重组质粒；再用重组质粒电击转化根瘤农杆菌，以获取侵染植物用的工程菌，将所得工程菌通过农杆菌介导的白桦合子胚转化法进行白桦的遗传转化，即可得到转基因白桦。本发明提供的方法得到的转基因白桦，生根率能达到85％以上，可显著地提高白桦扦插繁殖生根率，有效地解决了白桦扦插生根难的瓶颈，为白桦良种推广提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中BpmiR156基因扩增产物电泳检测图；M.Marker DL2000；1.对照；2-13.miR156；

图2为实施例1中BpmiR156植物过表达载体的PCR检测结果；M.Marker DL2000；1.对照；2.PCR鉴定为阳性的单菌落；

图3为实施例1中重组质粒pGWB2-BpmiR156转化EHA105农杆菌的结果；M.MarkerDL2000；1-6.大肠杆菌转化子；7.对照；

图4为白桦合子胚遗传转化过程；A.不含抗生素的分化培养基共培养侵染后的白桦合子胚；B.含有潮霉素的选择培养基培养白桦合子胚；C.愈伤组织；D.愈伤组织在分化培养基上培养；E.愈伤组织形成不定芽；F.不定芽分化成丛生苗；G.丛生苗二次分化；H.超表达转化子；

图5为转BpmiR156过表达白桦株系的PCR检测结果；M.Marker DL2000；1.pGWB2-miR156；2.WT；3-10.转化子；

图6为OE156株系和WT株系中IAA和GA₃含量变化；A.IAA的含量变化；B.GA₃含量变化；

图7为OE156株系和WT株系生根率比对结果；

图8为OE156-2及OE156-4株系不定根数目、长度和鲜重比对结果；A.不定根数目变化；B.不定根长度变化；C.不定根鲜重变化；

图9为OE156-2及OE156-4株系1-5级不定根分布情况；A.OE156-2株系1-5级不定根分布情况；B.OE156-4株系1-5级不定根分布情况；

图10为OE156株系不定根发生过程中的解剖学观察；A.白桦一年生萌条横切面；B.维管射线细胞加宽；C.维管射线细胞加宽处形成薄壁细胞团；D.根原基发端细胞；E.早期根原基；F.根原基内部分层；G.分化根原基伸出周皮；H.根部维管束与茎中维管束相连；

图11为OE156株系不定根发生过程中的激素变化；

图12为OE156株系不定根发生过程中的NO含量变化；

图13为OE156株系不定根发生过程中的H₂O₂含量变化；

图14为OE156株系不定根发生过程中可溶性糖及可溶性蛋白质的含量变化；

图15为OE156株系不定根发生过程中CAT及POD的含量变化。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1转BpmiR156过表达白桦株系的构建

1、BpmiR156基因克隆

根据白桦基因组及转录组数据(https://genomevolution.org/CoGe/GenomeInfo.pl？gid＝35080)设计基因特异引物miR156-F：5'-CACCGTTTCCACATCTGGGAATAAGC-3'和miR156-R：5'-TCAGCAGCTGTTGAAGTTGAAGG-3'。

以白桦cDNA为模板，扩增包含BpmiR156成熟序列的251bp的片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR条带，以获取目的片段。

PCR反应体系：2μL 10×KOD Buffer、2μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.2μL MgSO₄、0.3μLKOD Plus Neo、0.6μL miR156-F(10μmol/L)、0.6μL miR156-R(10μmol/L)、2μL模板和11.3μL水。

PCR扩增反应程序：94℃预变性2min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸15s，35个循环后继续在72℃延伸7min。

结果如图1所示，利用上述引物扩增出清晰的亮条带，大约为251bp，和预期的结果相一致，说明成功克隆BpmiR156基因片段。

2、BpmiR156植物过表达载体的构建以及遗传转化

使用GATEWAY克隆方法进行载体的连接，将纯化后的PCR产物通过TOPO反应连接到入门载体(pENTRTM/D-TOPO Cloning Kit,invitrogen)上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购于宝生物工程(大连)有限公司)，挑取单克隆进行PCR检测(结果如图2所示)，将阳性克隆进行测序。

提取上述TOPO反应后经检测的阳性单克隆的质粒，进行LR反应，将TOPO重组质粒连接至pGWB2载体上。将重组质粒pGWB2-BpmiR156通过电击转化法导入到EHA105农杆菌感受态细胞中，在固体LB(含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)培养基上进行筛选，获得带有重组质粒并具有卡那霉素抗性和利福平抗性的根瘤农杆菌，作为侵染植物用的工程菌(结果如图3所示)。

通过农杆菌介导的白桦合子胚转化法进行白桦的遗传转化。

3、转BpmiR156过表达白桦株系的获得

在不含抗生素的分化培养基(WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA₃)上共培养经侵染后的白桦合子胚，每天脱菌2～3次，2-3d后使用加有50mg/L的潮霉素的选择培养基上(WPM+0.8mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.5mg/L GA₃)，在25℃、光照16h/黑暗8h条件下倒置培养，期间不定期脱菌，约15-20d后可见白桦合子胚切口处长有绿色的愈伤；待愈伤长到适宜大小，用刀片切下，置于分化培养基上，数日后浅黄色愈伤逐渐变为绿色愈伤组织，慢慢形成不定芽；再经过20-30d左右，不定芽逐渐分化长大形成丛生苗，丛生苗二次分化，最终获得8个超表达转化子，分别命名为OE156-1-OE156-8。上述白桦合子胚遗传转化过程详见图4。

4、转BpmiR156白桦的PCR检测

通过改良的CTAB法提取转基因白桦总DNA，以提取的转基因及非转基因对照白桦株系的DNA为模板，以pGWB2-miR156为阳性对照，非转基因白桦(WT)为阴性对照，分别以基因序列设计上游引物(miR156-F：5'-CACCGTTTCCACATCTGGGAATAAGC-3')，以载体序列设计下游引物(pGWB2-R：5'-ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3')进行PCR扩增反应体系及程序同1，产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

结果如图5所示，转基因株系扩增出目标条带，与阳性对照一致，而非转基因白桦(WT)没有扩增出条带，说明miR156已成功整合到白桦基因组中。

实施例2转BpmiR156白桦不同生理指标的测定

一、实验材料

1、转BpmiR156白桦扦插生根及解剖鉴定

取转miR156过表达白桦株系及非转基因对照白桦当年生嫩枝剪成含有2个芽点的插穗，在由多菌灵(50％)处理的基质(黑土：草炭土：蛭石＝2：2：1)中扦插，附上保鲜膜，放置在植物培养室中培养，培养条件为：室温25℃，16h光照/8h黑暗。扦插30d统计转miR156过表达白桦株系及对照白桦扦插生根率。并在扦插后0d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d分别切取插穗基部5mm长茎段用于石蜡切片的制备

二、实验方法及结果

1、OE156株系内源激素分布

选取主茎及侧枝，以及扦插培养过程中所取的8个时间点的插条形态学下端1cm处的茎段，采用液质联用的方式分别测定激素含量。

如图6所示结果显示，OE156株系的主茎与侧枝中的IAA及GA3含量要明显低于WT株系，且OE156株系中这两种激素的分布情况也与WT株系相反，证明这种激素的分布情况变化影响了主茎及侧枝的生长。

2、不定根发生情况统计

取2年生转基因及非转基因对照株系的当年生嫩枝，截取带2个芽点的茎段将其扦插到基质中(黑土：草炭土：蛭石＝2：2：1)，附上保鲜膜，放置在植物培养室中培养，培养条件为：室温25℃，16h光照/8h黑暗，培养24d后统计其生根情况。

2.1生根率

如图7所示，WT株系部分茎段在伤口处形成愈伤组织，但茎段生根率为0％，而OE156株系的生根率则达到了86.74％。

2.2不定根数目、长度及鲜重

如图8所示，OE156-2及OE156-4株系每根茎段的不定根数目为3.6和4.3条，不定根的平均长度为2.94cm及3.08cm，每根插条上不定根的鲜重为73.27mg及82.85mg，相较于WT株系不仅在生根率方面有显著提升，且产生了不定根的插条在后续的培养过程中也保持了较高(>90％)的成活率。

2.3一级不定根上的二级不定根数量分布情况

如图9所示，OE156-2株系中1-5级的不定根所占百分比分别为11％、7％、18％、21％、43％，OE156-4株系中1-5级的不定根所占百分比为8％、8％、21％、25％、38％。

3.不定根发生过程中的解剖学观察

取扦插不同时间插条1cm处的茎段，FAA固定后，采用石蜡切片法进行制片，观察转基因白桦不定根发生过程。

如图10所示，白桦茎段在正常情况下无潜伏的根原基；受到外界刺激时形成层的细胞，维管射线细胞加宽处形成薄壁细胞团；细胞团分化为不定根原基的发端细胞并形成不定根原基；不定根原基内部分层，伸出周皮并与茎段维管束相连，最终形成不定根。WT株系在切口处形成愈伤，而OE156株系在形成层处形成不定根，但OE156株系及WT株系在不定根原基形成前的插条变化相似。

4.不定根发生过程中的激素变化

选取OE156株系主茎及侧枝，以及扦插培养21d中每3d为一个取材间隔所取的8个时间点的插条形态学下端1cm处的茎段，分别采用液质联用的方式测定IAA、Zeatin、SA、JA、ABA五种激素含量。

如图11所示，在插穗离体后IAA含量降低，而后缓慢增长，在9d时含量达到最高值，之后缓慢下降。Zeatin的含量变化则相对不稳定，最低值出现在9d，生长素与Zeatin的比值则表现为在9d时的突然升高，而其他时间则维持在7左右。ABA的含量在9d及12d时上升，而在其他时间点则保持在65ng/g左右。SA在3d及6d时表达量较低，9d时的表达量突然升高，且在后续时间点保持在较高水平。证明9d可能是不定根原基形成的时间。JA的含量则在12d时达到最低水平。

5.OE156株系不定根发生过程中的生理指标变化

选取培养0d、6d、12d、18d、24d不同时间插条的形态学下端1cm处的茎段为材料，分别测定一氧化氮、过氧化氢、可溶性糖、可溶性蛋白、CAT及POD含量，具体方法详见说明书(苏州科铭生物技术有限公司).

5.1 NO的含量变化

如图12所示，WT株系的NO含量一直保持在一个相对较高的水平且略有上升，而OE156的两个株系则表现为在上升到峰值后下降的单波峰状态。说明OE156株系已完成对外界刺激的适应并回落到一个相对稳定的状态，而WT株系则还在适应的过程中。

5.2 H₂O₂的含量变化

如图13所示，在不定根的发生过程中WT株系的过氧化氢含量存在较大的波动，而OE156的两个株系中的过氧化氢含量在不定根发生的前中期则保持在相对稳定的状态，在24d时降低到较低水平。

5.3可溶性糖及可溶性蛋白质的含量变化

如图14所示，可溶性糖及可溶性蛋白的含量变化相似，但变化幅度略有不同。在不定根发生过程中，OE156两个转基因株系在6d及18d存在两个峰值，而WT株系则仅在12d时存在一个峰值。可见，WT株系的含量变化幅度均高于OE156株系，而这三个株系的可溶性蛋白含量变化幅度高于可溶性糖的含量变化。

5.4 CAT及POD的含量变化

如图15所示，WT株系及OE156两个株系的CAT及POD含量变化相似。前期CAT含量维持在一个较低的水平，在18d-24d期间，CAT提升到一个较高的水准，从而降低过氧化氢对植株的伤害。WT株系中POD含量在12d时存在单波峰，OE156株系在6d及18d时存在两个波峰，而WT POD含量整体高于OE156两个株系。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种提高白桦扦插生根率的转基因方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtttccacat ctgggaataa gctgtcttta ttattccttt tctaattttc tgtttgtttc 60

cctgggacat agaaattgac agaagagagt gagcacacag aggccatatg gtataaagtc 120

tatactaatg cttttgcgtg ctcacttctc tttctgtcag attccagtcc cggaggagtc 180

ctgccattgt tccagatcct atcttttttc ttttttgatg aatatttttc tccttcaact 240

tcaacagctg c 251

Claims (4)

1.一种白桦BpmiR156基因在白桦扦插繁殖育种中的应用，其特征在在于，所述白桦BpmiR156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的白桦BpmiR156基因在白桦扦插繁殖育种中的应用，其特征在于，应用于提高白桦扦插繁殖生根率。

3.一种提高白桦扦插繁殖生根率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获取权利要求1中所述的白桦BpmiR156基因的核苷酸序列；

步骤2：利用步骤1所得的核苷酸序列构建重组质粒，并将所述重组质粒导入宿主菌，构建侵染植物用的工程菌；

步骤3：用所得工程菌侵染白桦合子胚进行遗传转化，得到提高白桦扦插繁殖生根率的转基因白桦。

4.如权利要求3所述的提高白桦扦插繁殖生根率的方法，其特征在于，所述宿主菌为根瘤农杆菌。

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