CN112831608A - 一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在hrm检测试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，涉及分子生物学技术领域。本发明的引物根据ENTV‑2全基因组序列及与ENTV‑2同源性较高的病毒如ENTV‑1、JSRV、ERVs等病毒的基因序列进行比对设计，对应的PCR扩增目的片段长度为108bp，该引物应用于HRM检测试剂中，可通过分析PCR产物的溶解曲线，根据特异的溶解峰和TM值，鉴定扩增产物是否为目的片段，无需特异的探针，无需测序，全程闭关操作，提高了实验的准确性，具有特异性强、重复性好、快速和成本低的优点，适用于羊鼻内肿瘤的边境检验检疫，本发明填补了国内外该领域研究的空白，具有重要的经济意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体是涉及一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用。
背景技术
山羊地方性鼻内肿瘤(Enzootic nasal tumor，ENT)是一种以患病羊的鼻甲骨筛骨上皮细胞发生恶性转化为特征的慢性、进行性、接触性传染病，临床症状主要病羊食欲减退，持续流鼻液，呼吸困难，后期发展为大量鼻漏，极度消瘦，部分出现眼部突出和颅骨变形，剖检可见鼻腔内一侧或两侧出现菜花样肿瘤；该病发病率不高，约为0.5-15％，但死亡率可达到100％，潜伏期长达数月甚至一年，给羊养殖业造成重大的损失和潜在威胁；该病尚无疫苗用于预防，且发病早期症状不易与羊常见呼吸道疾病区分，因此，急需一种敏感、特异的对发病羊和羊群进行早期诊断的方法，以便对感染羊进行淘汰，保护健康羊群。
由于目前山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)无法体外培养，未建立血清学的检测方法，因此主要依靠分子生物学检测，已建立了包括RT-PCR与限制性内切酶分析鉴定ENTV的方法，RT-PCR方法，实时荧光定量PCR检测方法与Taqman实时荧光定量PCR。检索到CN201610311800.4的中国发明专利公开了一种用于检测羊地方性鼻内肿瘤病毒基因的引物对及其应用，和CN202010013356.4的中国发明专利公开的一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒.
然而普通PCR敏感度不够高，临床应用中容易漏检，荧光定量的方法由于不饱和染料的添加，对结果有较大影响，Taqman的方法需要探针，价格较为昂贵。高分辨率熔解曲线(high resolution meltingcurve，HRM)是美国Utah大学Wittwer实验室首次提出的基于新型饱和突光染料的发明而进行分子生物学检测的技术。多应用于检测基因突变，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、闭管操作等优点，目前国内外尚无将HRM方法用于山羊地方性鼻内肿瘤中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，根据ENTV-2全基因组序列及与ENTV-2同源性较高的病毒如ENTV-1、JSRV、ERVs等病毒的基因序列进行比对设计引物，并将该引物应用于HRM检测试剂中，在q-PCR反应体系中加入饱和荧光染料，通过PCR产物扩增曲线和溶解曲线对结果进行分析，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、闭管操作等优点，目前国内外尚未有报道将HRM方法应用于检测ENTV-2。该方法能快速准确地鉴定ENTV-2，适用羊鼻内肿瘤的边境检验检疫。
为实现上述目的，本发明提供一种山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)检测的引物及其在HRM检测试剂中的应用，所述引物根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列及与山羊地方性鼻内肿瘤病毒同源性较高的病毒基因序列进行比对设计，对应的PCR扩增目的片段长度为108bp，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。序列如下：
S1-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-TCATACTGTGGATTCCCTGTC-3’和R2-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-CTAACTACATCATATAAAGCTGATAGTC-3’。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述同源性较高的病毒为绵羊肺腺瘤病病毒(ENTV-1)、内源性病毒(ERVs)、绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)中的一种及以上。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述的引物在制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒的HRM检测试剂中的应用。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述试剂用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的HRM检测中，所述HRM检测方法包括以下步骤：
(1)RNA的提取及反转录：提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的RNA，-70℃保存，经脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)处理去除残留的基因组DNA后，将RNA反转录为cDNA，-20℃保存；
(2)标准品的构建：以步骤(1)所获得的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物对ENTV-2进行PCR扩增，获得PCR产物；通过凝胶电泳实验将所述PCR产物回收纯化后克隆至pMD18-T载体上，然后转化至大肠杆菌DH5a中，扩大培养、提取重组质粒，进行测序鉴定，并将序列正确的重组质粒作为阳性标准品；
(3)反应条件的优化：包括扩增体系的优化和反应条件的优化，分别通过对引物浓度、退火温度来进行筛选；
(4)HRM曲线的绘制：包括标准曲线的绘制和溶解曲线的绘制，将所述步骤(2)构建的阳性标准品质粒用ddH2O稀释后作为模板，进行PCR扩增，以模板浓度为X轴，Cq值为Y轴，绘制标准曲线；所述溶解曲线参数按仪器默认参数设置；
(5)HRM反应：以待测样品的核酸为模板，利用权利要求1所述引物以及步骤(3)所述反应条件进行PCR扩增，获得扩增曲线和溶解曲线。
(6)检测结果分析：对步骤(5)中扩增曲线和溶解曲线进行阴阳性分析，判断待测样品中是否含有山羊地方性鼻内肿瘤病毒。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(2)中PCR扩增体系如下：
所述引物终浓度为0.5μmol/L。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(2)中反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30S，55℃退火15s，72℃延伸15s，循环数为35，最后72℃延伸10min。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(2)中PCR产物长度为108bp，为特异性目的片段。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(3)中扩增体系如下：
所述引物终浓度为10μmol/L，所述syto9终浓度为2.5μmol/L；
所述反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(4)中标准品按10倍倍比稀释。
对于上文所述技术方案中，进一步的，所述步骤(5)中以步骤(2)所构建的标准品为阳性对照，以ddH2O作为阴性对照。
本发明的有益效果：
本发明通过比对ENTV-2和ENTV-1、JSRV、ERVs等病毒的全基因组序列，根据比对结果寻找ENTV-2保守的特异性片段，设计1对引物，将该引物应用于HRM检测试剂中，并建立了HRM检测方法，该方法通过分析PCR产物的溶解曲线，根据特异的溶解峰和TM值，鉴定扩增产物是否目的片段，该方法无需特异的探针，无需测序，全程闭关操作，提高了试验的准确性。
本通过本发明的实施，解决了普通PCR检测ENTV-2灵敏度不够、准确率低的问题，在ENTV-2的快速检测中有较好的应用价值。
本发明首次将HRM检测方法应用在ENTV-2检测上，具有特异性强、重复性好、快速和成本低的优点，适用于羊鼻内肿瘤的边境检验检疫，该发明填补了国内外该领域研究的空白，具有重要的经济意义。
附图说明
图1为本发明ENTV-2HRM标准曲线；
图2为本发明ENTV-2HRM溶解曲线；
图3为本发明HRM特异性试验图，图中：1为ENTV-2，2-8为山羊皮细胞、山羊肾细胞、绵羊肺细胞、ORFV、BCV、MO、Mmc、Mccp基因组DNA；
图4为本发明HRM溶解曲线图，图中：1为ENTV-2，2-8为山羊皮细胞、山羊肾细胞、绵羊肺细胞、ORFV、BCV、MO、Mmc、Mccp基因组DNA；
图5为本发明部分样品HRM特异性试验图，图中1为阳性样品，2-15均为临床样品，16为ddH2O作为阴性对照；
图6为本发明部分样品HRM溶解曲线图，图中1为阳性样品，2-15均为临床样品，16为ddH2O作为阴性对照。
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
为了更好地阐述本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内文献或参考书籍所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》(第四版)，科学出版社；Jennifer Doudna,Prashant Mali编著.CRISRP-Cas:A laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器设备未注明生产商者，均为常规产品。
本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施案例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
试验材料：菌(毒)株及样品
山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)、羊肾细胞、山羊皮肤细胞、绵羊肺细胞、羊口疮病毒(ORFV)、牛冠状病毒BCV、绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)由本实验室分离鉴定保存，山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)由兰州兽医研究所储岳峰博士惠赠，92份羊鼻拭子样品，为2017-2020年采集自福建省各地山羊养殖场。
主要试剂和仪器：
Premix Taq Hotstart Version购自Takara Bio公司，脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)及反转录试剂盒
Reverse Transcriptase购自北京全式金生物技术有限公司，syto9购自ThermoFisher公司，病毒RNA\DNA提取试剂盒为TaKaRa的MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，pMD18-T、Nase-Free Water和DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品；荧光定量PCR仪为roche公司的LightCycler96。
实施例1：引物的设计
本发明根据NCBI上发表的ENTV-2全基因组序列及与ENTV-2同源性较高的病毒如ENTV-1、内源性病毒(ERVs)、绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)进行比对，设计1对引物，经NCBI BLAST比对验证后，由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，核苷酸序列如下：
S1-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-TCATACTGTGGATTCCCTGTC-3’和R2-enHRM1223(SEQ ID NO.1)：5’-CTAACTACATCATATAAAGCTGATAGTC-3’。
实施例2：引物在HRM检测试剂中的应用
将含有上述引物的试剂应用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒的HRM检测中，HRM检测方法包括以下步骤：
(1)RNA的提取及反转录：依照EasyPure Viral DNA/RNA Kit的说明书提取ENTV-2的RNA，-70℃保存，经脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)处理去除残留的基因组DNA后，参照
Reverse Transcriptase说明书将RNA反转录为cDNA，-20℃保存。
(2)标准品的构建：以步骤(1)中获得的cDNA为模板，利用上述引物对ENTV-2进行PCR扩增，引物S1-enHRM1223与R2-enHRM1223扩出ENTV-2的特异性目的片段，长度为108bp。
以20μL PCR扩增体系：模板1μL、上、下游引物各lμL(终浓度为0.5μmol/L)、PremixTaq 10μL、加ddH2O 7μL。反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30S，55℃退火15s、72℃延伸15s，循环数为35；最后72℃延伸10min。
通过凝胶电泳实验将PCR产物回收纯化后克隆至pMD18-T载体上，然后转化至大肠杆菌DH5a中，扩大培养、提取重组质粒，送生工生物有限公司进行测序。将序列正确的重组质粒作为阳性标准品，并用NanoDrop 2000测定标准品的初始浓度26ng/μL，换算成拷贝数约8.27×109copies/μL。
(3)HRM反应条件的优化：20μL反应体系，上下游引物S1-enHRM1223与R2-enHRM1223各1μL(终浓度为10μmol/L)，模板1μL，2×Taq酶10μL，styo9 1μL(终浓度为2.5μmol/L)补水至20μL。扩增反应条件初步设定为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环。分别用55-65℃作为PCR反应的退火温度，引物浓度(0.2pmol/L、0.4pmol/L、0.8pmol/L、1.0pmol/L、1.5pmol/L、1.75pmol/L、2.0pmol/L)对反应条件进行优化。
(4)标准曲线的绘制：将步骤(2)中构建的标准阳性质粒用ddH2O按10倍比稀释后作为模板，进行qPCR扩增，以模板浓度为X轴，Cq值为Y轴，绘制标准曲线，如图1所示，模板浓度与Cq值的线性关系良好，相关系数R2＝1.00，直线方程：y＝-3.668×log(x)+40.15；HRM溶解曲线见图2，可以看出，溶解曲线TM值为76.13±0.1℃，无引物二聚体和非特异峰出现，说明所建立的HRM方法引物特异性好。
实施例3：HRM的特异性试验
分别从山羊皮肤细胞、绵羊肺细胞与羊肾细胞中提取DNA作为内源性羊鼻内肿瘤病毒(enENTV)的阴性样本，羊口疮病毒(ORFV)、牛冠状病毒(BCV)、绵羊肺炎支原体(MO)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)以及实施例2步骤(1)中得到的羊鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)cDNA为模板，按步实施例2骤(3)优化后的反应条件进行HRM反应。
实施例4：重复性试验
对104、105、106copies/μL的标准品DNA进行批内和批间重复性试验。其中批内重复性试验每个梯度设计3个平行重复，分析批内样品的重复性；同时，对每个梯度再重复3次试验，比较这3次试验结果，分析批间样品的重复性。
为了对上述HRM检测方法作进一步的效果验证，进行如下检测：
1、特异性检测
用建立的ENTV-2HRM方法检测ENTV-2、山羊皮细胞、山羊肾细胞、绵羊肺细胞、ORFV、BCV、MO、Mmc、Mccp等病原的基因组DNA，从图4-5可以看出，只有ENTV-2呈现阳性，其他均为阴性，说明用本方法检测上述羊内源性鼻内肿瘤病毒与常见病毒均无交叉反应，特异性较好。
2、重复性检测
对8.27×104copies/μL，8.27×105copies/μL，8.27×106copies/μL的阳性标准质粒进行检测，每个浓度设3个重复，进行批内检测重复性实验，每个浓度设3个重复实验；批间实验：对同一次实验的每个浓度设3个重复，共检测3次。结果如表1可知，批内、批间重复实验的变异系数(coefficient of variation，CV)均小于1，说明试验重复性良好。
表1 HRM检测ENTV-2的重复性
3、样品的检测
为了更好的验证检测结果，分别以Taqman-qPCR方法和HRM方法对92份样品进行检测，并设立阴阳性对照，结果显示，Taqman-qPCR方法检测出17份阳性，75份阴性，检出率为18.5％；而HRM方法同样检出17份阳性，75份阴性，检出率为18.5％，两种检测方法结果一致，说明本发明建立的HRM检测方法准确率高，可应用于边境检验检疫，其中部分样品检测结果如图5和图6所示。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种引物，用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒进行HRM检测，其特征在于，所述引物根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒全基因组序列及与山羊地方性鼻内肿瘤病毒同源性较高的病毒基因序列进行比对设计，对应的PCR扩增目的片段长度为108bp，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述同源性较高的病毒为绵羊肺腺瘤病病毒、内源性病毒、绵羊肺腺瘤病毒中的一种及以上。
3.根据权利要求1或2任一项所述的引物在制备山羊地方性鼻内肿瘤病毒的HRM检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂用于山羊地方性鼻内肿瘤病毒的HRM检测中，所述HRM检测方法包括以下步骤：
(1)RNA的提取及反转录：提取山羊地方性鼻内肿瘤病毒的RNA，-70℃保存，经脱氧核糖核酸酶I处理去除残留的基因组DNA后，将RNA反转录为cDNA，-20℃保存；
(2)标准品的构建：以步骤(1)所获得的cDNA为模板，利用权利要求1所述引物对山羊地方性鼻内肿瘤病毒进行PCR扩增，获得PCR目的片段；通过凝胶电泳实验将所述PCR产物回收纯化后克隆至pMDl8-T载体上，然后转化至大肠杆菌DH5a中，扩大培养、提取重组质粒，进行测序鉴定，并将序列正确的重组质粒作为阳性标准品；
(3)反应条件的优化：包括扩增体系的优化和反应条件的优化，分别通过对引物浓度、退火温度来进行筛选；
(4)HRM曲线的绘制：包括标准曲线的绘制和溶解曲线的绘制，将所述步骤(2)构建的阳性标准品质粒用ddH2O稀释后作为模板，进行HRM-qPCR扩增，以模板浓度为X轴，Cq值为Y轴，绘制标准曲线；所述溶解曲线参数按仪器默认参数设置；
(5)HRM反应：以待测样品的核酸为模板，利用权利要求1所述引物以及步骤(3)所述反应条件进行PCR扩增，获得扩增曲线和溶解曲线。
(6)检测结果分析：对步骤(5)中扩增曲线和溶解曲线进行阴阳性分析，判断待测样品中是否含有山羊地方性鼻内肿瘤病毒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增体系如下：
所述引物终浓度为0.5μmol/L。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30S，55℃退火15s，72℃延伸15s，循环数为35，最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中扩增体系如下：
所述引物终浓度为10μmol/L，所述syto9终浓度为2.5μmol/L；
所述反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中标准品按10倍倍比稀释。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中以步骤(2)所构建的标准品为阳性对照，以ddH2O作为阴性对照。
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|---|---|---|---|---|
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| CN112301163A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-02-02 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 检测鉴别山羊痘病毒属病毒的试剂盒及使用方法 |
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