CN113088497A - 一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法 - Google Patents

一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法 Download PDF

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徐朝
李小玲
邢国珍
薛继初
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Abstract

本发明涉及一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法，设计靶向abhd16a基因在第三个外显子的sgRNA序列，并构建pHMG‑sgRNA‑sgabhd16a敲除表达载体；将含有靶向abhd16a基因的sgRNA表达载体通过脂质体转染至HEK293细胞，通过CTAB法提取细胞基因组扩增含有靶向sgRNA序列上下游片段，测序检测是否有基因编辑；通过嘌呤霉素筛选后，利用有限稀释法获得除abhd16a基因敲除细胞细胞株，通过免疫印迹法检测敲除细胞株中abhd16a基因敲除后蛋白表达水平。本发明通过CRISPR/Cas9构建HEK293‑ABHD16A‑/‑细胞系，为进一步研究ABHD16A功能和作用机制提供有效的工具。

Description

一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法。
背景技术
人abhd16a又称为人类白细胞抗原-B(Human leukocyte antigen-B，HLA-B)相关转录物5(HLA-B associated transcript 5,BAT5)，属于含有α/β-水解酶结构域(Hydrolase domain containing，ABHD)家族，位于染色体6p21.33的位置，有21个外显子。研究显示ABHD家族的蛋白显示出酯酶、蛋白酶、过氧化物酶、氧化物水解酶和脱卤酶等多种酶活性，与脂代谢、细胞信号转导及多种代谢障碍等有关。人abhd16a基因编码的蛋白质又称为HLA-B相关转录物5(HLA-B associated transcript 5，BAT5)，因与肿瘤坏死因子TNFα和TNFβ、主要热休克蛋白HSP70等基因的位置靠近，都位于MHC ClassⅢ区域内，推测人abhd16a可能参与机体免疫调节。ABHD16A近年来报道研究较少并且对其功能方面的研究比较欠缺。研究显示人abhd16a可能与神经退行性疾病、免疫调节、川崎病与冠状动脉瘤有关，但具体的分子机制有待更深一步研究。为了实现abhd16a的功能和潜在的免疫调节作用的进一步研究，本发明构建了HEK293-ABHD16A-/-细胞系。
发明内容
本发明的目的是为了实现abhd16a的功能和潜在的免疫调节作用的进一步研究，本发明提供一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法，该方法构建的HEK293-ABHD16A-/-细胞系为进一步研究abhd16a功能和作用机制提供了有效的工具，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供重要的研究思路。
本发明为实现上述技术目的，采用的技术方案是：一种稳定敲除abhd16a基因的细胞系，所述细胞系为以具有脂代谢和机体免疫相关蛋白ABHD16A缺失的人肾胚HEK293-ABHD16A-/-细胞系。
一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)、设计引物序列：按照CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计原则，设计并合成sgRNA引物；
2)、pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体的构建：将sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4DNA Ligase以及T4DNA Ligase Buffer反应，然后转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取反应得到的阳性单菌落进行PCR扩增验证，引物为SEQ ID NO.1-2，验证完成即获得pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；
3)、细胞培养与转染：取HEK293细胞培养并传染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；
4)、敲除细胞测序验证：取转染后的HEK293细胞，裂解并抽提基因组，然后按照人abhd16a基因组在敲除靶标位点上下游设计验证引物,引物为SEQ ID NO.3-4,以转染组HEK293细胞的基因组为对照组，进行PCR扩增验证，验证完成后将基因组片段回收并连接至PMD-19T，采用热激法转化DH5a感受态，采用蓝白斑筛选阳性克隆；将阳性克隆以及PCR回收产物进行测序；
5)、敲除细胞系的筛选与检测：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，筛选后的细胞进行单克隆化，再提取单克隆化的敲除细胞的基因组，然后根据步骤4)中的方法扩增靶标序列上下游进行PCR产物回收测序；采用RAPI裂解液裂解细胞，检测HEK293细胞中ABHD16A蛋白表达情况。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤2)中sgRNA物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4DNA Ligase以及T4DNA Ligase][PREWQ Buffer在4℃条件下反应8-18h。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤2)中挑取阳性单菌落PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，57℃条件下反应30s；72℃条件下反应20s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤3)中HEK293细胞培养和传染的具体方法为：将HEK293细胞置于含有质量浓度为10％FBS的高糖DMEM中，并置于条件为37℃、5％CO2培养箱中进行培养，转染前一天，将生长旺盛、生长状态良好的HEK293细胞铺板至24孔板中，在铺板后24h以内，采用脂质体POLOdeliverer 3000转染试剂进行转染，每孔转染1μg pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤4)中抽提转染后的HEK293细胞基因组的具体方法为：取转染后的HEK293细胞，先用PBS清洗两次，然后加入0.025％的胰酶消化细胞，离心收集细胞；再向收集的细胞中加入CTAB裂解液，于65℃水浴锅温浴1h，采用酚氯仿异戊醇方法抽提基因组。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤4)中PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，60℃条件下反应30s，72℃条件下反应30s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
作为本发明一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法的进一步优化：所述步骤5)中敲除细胞单克隆化的具体方法为：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次含有终浓度为2ng/μL的嘌呤霉素的新鲜培养基，直至对照组未转染的HEK293细胞全部死亡；然后将筛选后的细胞采用0.025％的胰酶消化，通过有限稀释法将细胞铺板于96孔板，进行敲除细胞的单克隆化。
有益效果
本发明将筛选后敲除abhd16a的HEK293细胞系，通过CTAB法提取基因组扩增特异性靶标序列上下游，单克隆后经PCR纯化回收后测序，结果显示在abhd16a基因组有碱基的缺失以及增加。本发明通过RAPI裂解液提取细胞总蛋白，以HEK293为对照组，Western blot检测敲除后细胞ABHD16A细胞表达，结果显示在敲除的细胞系中，未检测到ABHD16A蛋白的表达。本发明利用CRISPR/cas9技术构建了HEK293-ABHD16A-/-细胞系，为进一步开展人ABHD16A功能和作用机制的进一步研究提供了可用的实验材料，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供重要的研究思路。
附图说明
图1为本发明载体构建过程对阳性单菌落进行PCR扩增验证的2％琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为本发明载体构建过程对阳性克隆进行测序的结果峰图；
图3为本发明转染后的HEK293细胞通过CTAB法提取的基因组的2％琼脂糖凝胶电泳结果；
图4为本发明按照人abhd16a基因组在敲除靶标位点上下游设计验证引物进行PCR扩增的2％琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为本发明抽提基因组经PCR扩增验证后的基因组片段测序结果峰图；
图6为本发明筛选后敲除abhd16a的HEK293细胞系，通过CTAB法提取基因组扩增特异性靶标序列上下游，选取4个单克隆，分别经PCR纯化回收后测序的结果；
图7为本发明采用Western blot检测敲除后细胞ABHD16A蛋白表达情况。
具体实施方式
一种构建abhd16a基因敲除HEK293细胞系的方法
使用的材料和主要试剂如下：pHMG-sgRNA线性化质粒，DH5α(E.coli)，PMT19T-Vecor(TAKARA,)；嘌呤霉素(2mg/mL)人胚肾细胞HEK293细胞由本实验室保存。Taq DNA聚合酶及限制性内切酶购自大连宝生物，反转录试剂盒、RNA提取、质粒小提及DNA回收等试剂盒均购自TIANGEN公司。卡那霉素、氨苄青霉素等购自鼎国生物工程公司，HRP染色试剂盒购自索莱宝公司，POLOdeliverer 3000转染试剂购自上海赛尔有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，其它一般试剂均为市售分析纯(AR)。主要试剂：2×Taq mix；CTAB裂解液(2％CTAB，1.4M Nacl，0.02M EDTA，0.1M Tris-Hcl)；ABHD16A抗体(本实验室制备)；RAPI细胞裂解液(25mM HEPES(pH 7.6)，137mM NaCl，2mM EDTA，3mMβ-glycerophosphate，1％Triton X-100，1μg/ml aprotinin，1mM PMSF)，嘌呤霉素(2mg/mL)；蛋白分子Marker；DMEM高糖培养、胎牛血清购均自浙江天杭生物科技股份有限公司。BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天公司，PVDF膜，实验所用其他试剂菌为分析纯(AR)。
1)、abhd16a sgRNA引物序列设计
根据NCBI已经提交的数据库abhd16a(NM_021160.2)，通过在线设计网站(crispr.mit.edu/)，遵循CRISPR/Cas9的sgRNA设计原则，设计并合成Oligos，如SEQ No.5-6。见表1：
表1 abhd16a sgRNA引物序列
Figure BDA0003032126600000051
2)、pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体的构建
将公司合成的sgRNA引物溶解为终浓度100μM，进行退火反应(4μL Oligo F+4μLOligo R+8μL 5×NEB Buffer，沸水浴5min，自然降至室温)。反应结束后在PCR反应管中加入:3μL ddH2O、1μL pHMG-sgRNA线性化质粒、1μL T4DNA Ligase、2μL T4DNA LigaseBuffer；4℃反应过夜。转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性单菌落PCR扩增验证(F:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’；R:AAACGTACAAGTAGAAGAAGGCGAC)。反应条件为：95℃预变性5min，(95℃，30s；57℃，30s；72℃，20s)×32个循环，72℃延伸10min。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
通过北京华大有限公司合成的引物通过退火连接反应，对转化后的的阳性克隆子进行PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增出特异性分子量约为230bp的条带(图1：菌液PCR验证阳性克隆(M：DM2000DNA Marker；CK：control check；1：HEK293基因组PCR；2：HEK293sgABHD16A基因组PCR)。将阳性克隆送至公司测序结果如图2，结果显示成功克隆pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体。
3)、细胞培养与转染
HEK293细胞在含有10％FBS的高糖DMEM，培养于37℃、5％CO2培养箱。本研究采用脂质体POLO deliverer 3000方法转染细胞。将生长旺盛、生长状态较好的HEK293细胞转染前一天细胞铺板至24孔板中，24h以内，采用脂质体POLO deliverer 3000转染试剂，每孔转染1μgpHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体，以转染空载体为对照组。
4)、敲除细胞测序验证
取转染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体48h后HEK293细胞，用于检测基因编辑。用PBS清洗两次细胞，加入0.025％的胰酶消化细胞，1000r/min，离心收集细胞。加入0.5mLCTAB裂解液，于65℃水浴锅温浴1h，采用酚氯仿异戊醇方法抽提基因组。
按照GeneBank已经报道的人abhd16a基因组(Gene ID:7920)在敲除靶标位点上下游设计验证引物F:5’-ATTACATTGACACACTACTTTTCA-3‘，R:5’-ACTTTGGACAAACTCAAGTAACCT-3’。以转染组HEK293细胞的基因组为对照，各取10ng基因组加入10μL体系中，反应条件为：95℃预变性5min，(95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s)×32个循环，72℃延伸10min。2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将目的片段回收后取50ng回收后产物连接至PMD-19T，采用热激法转化DH5α感受态，采用蓝白斑筛选阳性克隆；将阳性克隆以及PCR回收产物100ng送至北京华大基因进行测序。
通过CTAB法提取HEK293细胞与转染敲除载体pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a的HEK293细胞的基因组如图3(M：λDNAHindⅢMaker；1：HEK293gDNA；2：HEK293转染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a后gDNA)。通过对靶标序列上下游进行扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳结果显示得到特异性扩增片段约520bp，如图4(M：DM2000DNA Marker；CK：control check；1：HEK293gDNAPCR；2：HEK293sgABHD16A gDNA PCR)。将该片段通过PCR产物纯化回收，PCR产物回收后的片段送至公司的测序，测序结果显示，在PAM序列之后有套锋的出现，说明abhd16a sgRNA具有编辑基因组(gDNA)现象，测序结果峰图如图5。
5)、敲除细胞系的筛选与检测
将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次含有终浓度为2ng/μL的嘌呤霉素的新鲜培养基，至对照组未转染的HEK293细胞全部死亡。然后将筛选后的细胞采用0.025％的胰酶消化，通过有限稀释法将细胞铺板于96孔板，进行敲除细胞的单克隆化。
将在96孔板形成的单克隆进行扩大培养后，通过CTAB法提取细胞基因组，根据4)中的方法扩增靶标序列上下游进行PCR产物回收测序。采用RAPI裂解液裂解细胞，通过western blot检测HEK293细胞中ABHD16A蛋白表达情况。
将筛选后敲除abhd16a的HEK293细胞系，通过CTAB法提取基因组扩增特异性靶标序列上下游，选取4个单克隆，分别标记1-4号，经PCR纯化回收后送公司测序(如SEQ No.7-10)，结果如图6(图中圆点表示碱基添加，方框表示碱基缺失)，结果显示在abhd16a基因组有碱基的缺失以及增加。
为了进一步验证敲除细胞系中abhd16a碱基的缺失与增加是否影响蛋白表达，通过RAPI裂解液提取细胞总蛋白，以HEK293为对照组，Western blot检测敲除后细胞ABHD16A蛋白表达(如图7)，结果显示，在敲除的细胞系中，未检测到ABHD16A蛋白的表达。
综上所述，本发明利用CRISPR/cas9技术构建了HEK293-ABHD16A-/-细胞系，为进一步开展人abhd16a功能和作用机制的进一步研究提供了可用的实验材料，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供重要的研究思路。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法
<141> 2021-04-21
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 1
aaaaaaagca ccgactcggt gccac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 2
aaacgtacaa gtagaagaag gcgac 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 3
attacattga cacactactt ttca 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> human
<400> 5
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<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> human
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<211> 39
<212> DNA
<213> human
<400> 7
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<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> human
<400> 8
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<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> human
<400> 9
cctctccctt cgccttcttc tacttgaaag gtcag 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> human
<400> 10
cctctccctt cgccttcttc tacttgaaag gtcag 35

Claims (8)

1.一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系，其特征在于：所述细胞系为以具有脂代谢和机体免疫相关蛋白ABHD16A缺失的人肾胚HEK293-ABHD16A-/-细胞系。
2.一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)、设计引物序列：按照CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计原则，设计并合成sgRNA引物；
2)、pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体的构建：将sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4 DNA Ligase以及T4 DNA Ligase Buffer反应，然后转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取反应得到的阳性单菌落进行PCR扩增验证，引物为SEQ ID NO.1-2，验证完成即获得pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；
3)、细胞培养与转染：取HEK293细胞培养并传染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；
4)、敲除细胞测序验证：取转染后的HEK293细胞，裂解并抽提基因组，然后按照人abhd16a基因组在敲除靶标位点上下游设计验证引物,引物为SEQ ID NO.3-4,以转染组HEK293细胞的基因组为对照组，进行PCR扩增验证，验证完成后将基因组片段回收并连接至PMD-19T，采用热激法转化DH5a感受态，采用蓝白斑筛选阳性克隆；将阳性克隆以及PCR回收产物进行测序；
5)、敲除细胞系的筛选与检测：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，筛选后的细胞进行单克隆化，再提取单克隆化的敲除细胞的基因组，然后根据步骤4)中的方法扩增靶标序列上下游进行PCR产物回收测序；采用RAPI裂解液裂解细胞，检测HEK293细胞中ABHD16A蛋白表达情况。
3.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4DNA Ligase以及T4DNA Ligase Buffer在4℃条件下反应8-18h。
4.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中挑取阳性单菌落PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，57℃条件下反应30s；72℃条件下反应20s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
5.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中HEK293细胞培养和传染的具体方法为：将HEK293细胞置于含有质量浓度为10％FBS的高糖DMEM中，并置于条件为37℃、5％CO2培养箱中进行培养，转染前一天，将生长旺盛、生长状态良好的HEK293细胞铺板至24孔板中，在铺板后24h以内，采用脂质体POLOdeliverer 3000转染试剂进行转染，每孔转染1μg pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体。
6.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中抽提转染后的HEK293细胞基因组的具体方法为：取转染后的HEK293细胞，先用PBS清洗两次，然后加入0.025％的胰酶消化细胞，离心收集细胞；再向收集的细胞中加入CTAB裂解液，于65℃水浴锅温浴1h，采用酚氯仿异戊醇方法抽提基因组。
7.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，60℃条件下反应30s，72℃条件下反应30s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
8.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中敲除细胞单克隆化的具体方法为：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次含有终浓度为2ng/μL的嘌呤霉素的新鲜培养基，直至对照组未转染的HEK293细胞全部死亡；然后将筛选后的细胞采用0.025％的胰酶消化，通过有限稀释法将细胞铺板于96孔板，进行敲除细胞的单克隆化。
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