JP6085746B2 - 抗トロンボポエチン抗体の検出における検出感度の向上方法、免疫性血小板減少症の検出方法及びキット - Google Patents
抗トロンボポエチン抗体の検出における検出感度の向上方法、免疫性血小板減少症の検出方法及びキット Download PDFInfo
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Description
本発明は、生体試料中の抗トロンボポエチン（ＴＰＯ）抗体の検出方法、免疫性血小板減少症の検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキット及び免疫性血小板減少症を検出するためのキットに関する。
免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）患者の骨髄では、巨核球の成熟が障害されることにより、血小板の産生能が低下していると考えられているが、その機序は不明な点が多い。近年、巨核球の成熟障害を標的としたＩＴＰの新規治療薬である、ＴＰＯ受容体作動薬が発売され、ＩＴＰにおける巨核球の成熟障害が注目されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
血小板自己抗原は血小板のみならず巨核球にも発現する。このため、抗血小板抗体は巨核球にも結合する。そして、ＩＴＰ患者由来の抗血小板抗体が、インビトロで巨核球の成熟障害を誘導することが報告されている（例えば、非特許文献２を参照。）。
また、巨核球の減少を伴うＩＴＰ患者の血漿において、ＴＰＯの受容体であるｃ−Ｍｐｌに対する自己抗体が見出されている（例えば、非特許文献３を参照。）。
ＴＰＯは主に肝細胞で産生される液性因子であり、巨核球とその前駆細胞に働き、増殖及び分化を促進する。再生不良性貧血等の造血障害による血小板減少症では、血中ＴＰＯ濃度が著増している。これに対し、ＩＴＰ患者の血中ＴＰＯ濃度は、正常であるか、軽度に増加しているのみであることが知られている（例えば、非特許文献４を参照。）。
Nurden A.T., et al., New-generation drugs that stimulate platelet production in chronic immune thrombocytopenic purpura, Lancet, 373, 1562-1569, 2009
McMillan R., et al., Suppression of in vitro megakaryocyte production by antiplatelet autoantibodies from adult patients with chronic ITP, Blood, 103, 1364-1369, 2004
Kuwana M., et al., Autoantibody to c-Mpl (thrombopoietin receptor) in systemic lupus erythematosus: relationship to thrombocytopenia with megakaryocytic hypoplasia, Arthritis Rheum. 46, 2148-2159, 2002
Mukai H.Y., et al., Serum thrombopoietin (TPO) levels in patients with amegakaryocytic thrombocytopenia are much higher than those with immune thrombocytopenic purpura, Thromb Haemost, 76, 675-678, 1996
ＩＴＰ患者の巨核球が未熟であるにもかかわらず、ＩＴＰ患者の血中ＴＰＯ濃度が著増していない原因は不明である。発明者らは、この原因について、ＩＴＰ患者の血液中には、ＴＰＯに対する自己抗体（抗ＴＰＯ抗体）が存在し、この抗ＴＰＯ抗体によりＴＰＯが破壊され、血中ＴＰＯ濃度を低下させており、血中ＴＰＯ濃度の低下によってＴＰＯ受容体からのシグナル伝達が低下することにより、巨核球の成熟障害を誘導しているのではないかという仮説を立てた。そして、通常の方法により、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出系を構築したが、十分な検出感度が得られなかった。
そこで、本発明は、検出感度が向上した、抗ＴＰＯ抗体の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、検出感度が向上した、免疫性血小板減少症の検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキット及び免疫性血小板減少症を検出するためのキットを提供することを目的とする。
本発明は以下の通りである。
（１）生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出における検出感度の向上方法であって、ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものであり、前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、検出感度の向上方法。
（２）前記検出が酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により行われる、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（３）前記ＴＰＯを固相上に固定化させる工程と、前記生体試料を固相上の前記ＴＰＯと接触させる工程と、前記固相を洗浄する工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と固相上の前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記固定化させる工程が、３０〜４０℃で行われる、（２）に記載の検出感度の向上方法。
（４）前記検出が免疫沈降法により行われる、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（５）前記抗ＴＰＯ抗体がＴＰＯに対する中和抗体であり、前記ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程が、前記生体試料及び抗ＴＰＯ抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加することにより行われ、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程が、ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートし、インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量することにより行われ、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中に抗ＴＰＯ抗体が存在することを示す、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の検出感度の向上方法により検出された抗ＴＰＯ抗体の量を指標とする、免疫性血小板減少症の検出方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の検出感度の向上方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含み、前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、キット。
（８）（６）に記載の免疫性血小板減少症の検出方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キット。
（１）生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出における検出感度の向上方法であって、ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものであり、前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、検出感度の向上方法。
（２）前記検出が酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により行われる、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（３）前記ＴＰＯを固相上に固定化させる工程と、前記生体試料を固相上の前記ＴＰＯと接触させる工程と、前記固相を洗浄する工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と固相上の前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記固定化させる工程が、３０〜４０℃で行われる、（２）に記載の検出感度の向上方法。
（４）前記検出が免疫沈降法により行われる、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（５）前記抗ＴＰＯ抗体がＴＰＯに対する中和抗体であり、前記ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程が、前記生体試料及び抗ＴＰＯ抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加することにより行われ、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程が、ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートし、インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量することにより行われ、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中に抗ＴＰＯ抗体が存在することを示す、（１）に記載の検出感度の向上方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の検出感度の向上方法により検出された抗ＴＰＯ抗体の量を指標とする、免疫性血小板減少症の検出方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の検出感度の向上方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含み、前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、キット。
（８）（６）に記載の免疫性血小板減少症の検出方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キット。
本発明により、検出感度が向上した、抗ＴＰＯ抗体の検出方法を提供することができる。また、検出感度が向上した、免疫性血小板減少症の検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキット及び免疫性血小板減少症を検出するためのキットを提供することができる。
〔生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出方法〕
１実施形態において、本発明は、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出方法であって、ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものである、検出方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出方法であって、ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程と、前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものである、検出方法を提供する。
［ＥＬＩＳＡ法による検出方法］
１実施形態において、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により行われてもよい。図１は、本実施形態に係る抗ＴＰＯ抗体の検出方法を説明する図である。図１に示すように、本実施形態に係る検出方法は、ＴＰＯを固相上に固定化させる工程と、生体試料を固相上のＴＰＯと接触させる工程と、固相を洗浄する工程と、抗ＴＰＯ抗体と固相上のＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含む。以下、図１を参照しながら説明する。
１実施形態において、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により行われてもよい。図１は、本実施形態に係る抗ＴＰＯ抗体の検出方法を説明する図である。図１に示すように、本実施形態に係る検出方法は、ＴＰＯを固相上に固定化させる工程と、生体試料を固相上のＴＰＯと接触させる工程と、固相を洗浄する工程と、抗ＴＰＯ抗体と固相上のＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含む。以下、図１を参照しながら説明する。
（ＴＰＯを固相上に固定化させる工程）
ＴＰＯを固相上に固定化させる工程において、固相上にＴＰＯ１０を固定化する。ＴＰＯ１０は、哺乳動物細胞発現系で発現されたものである必要があり、ヒトＴＰＯであることが好ましい。哺乳動物細胞発現系で発現されたヒトＴＰＯとしては、市販されたものを使用することができる。あるいは、ヒトＴＰＯ遺伝子が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞内で発現させ、当該哺乳動物細胞の培養物からヒトＴＰＯを精製して使用してもよい。哺乳動物細胞としては、ヒト細胞株、サル細胞株、げっ歯類細胞株等が挙げられ、より具体的には、ＨｅＬａ細胞株、Ｃｏｓ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株等が挙げられる。
ＴＰＯを固相上に固定化させる工程において、固相上にＴＰＯ１０を固定化する。ＴＰＯ１０は、哺乳動物細胞発現系で発現されたものである必要があり、ヒトＴＰＯであることが好ましい。哺乳動物細胞発現系で発現されたヒトＴＰＯとしては、市販されたものを使用することができる。あるいは、ヒトＴＰＯ遺伝子が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞内で発現させ、当該哺乳動物細胞の培養物からヒトＴＰＯを精製して使用してもよい。哺乳動物細胞としては、ヒト細胞株、サル細胞株、げっ歯類細胞株等が挙げられ、より具体的には、ＨｅＬａ細胞株、Ｃｏｓ細胞株、Ｖｅｒｏ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株等が挙げられる。
後述するように、発明者らは、本実施形態の検出方法にバキュロウイルス発現系で発現されたＴＰＯを用いた場合、十分な検出感度を得ることができないことを明らかにした。理論に拘泥するものではないが、発明者らは、上記の結果から、特に抗ＴＰＯ抗体の検出においては、哺乳動物細胞発現系と哺乳動物細胞以外の発現系とで発現されたＴＰＯにおける糖鎖修飾の違いの影響が顕著であるものと推察している。
固相としては、９６ウェルプレートが例示できる。固相の表面は、静電相互作用、疎水的な相互作用、水素結合、共有結合等により、タンパク質が固相上に固定化されやすいように修飾されていることが好ましい。例えば、固相の表面には、−ＣＨＯＨ基、＞Ｃ＝Ｏ基、−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基、又は＞ＮＨ基が導入されていることが好ましい。
ＴＰＯの固定化は、ＴＰＯを含むバッファーを固相と接触させることにより行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェル内にＴＰＯを含むバッファーを添加し、３０〜４０℃、例えば３７℃でインキュベート（静置）することにより、ＴＰＯを固定化することができる。インキュベートする時間は、例えば０．５〜２４時間であり、例えば、１〜３時間である。通常、ＥＬＩＳＡ法において、抗原を固相上に固定化する場合には４℃で終夜インキュベートすることが一般的である。これに対し、発明者らは、本実施形態の検出方法では、３０〜４０℃でＴＰＯの固定化を行うことにより、より向上した検出感度が得られることを見出した。
（生体試料を固相上のＴＰＯと接触させる工程）
生体試料としては、被検者の血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧが挙げられる。本工程においては、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と生体試料とを接触させる。本工程は、例えば、ＴＰＯが固定化されたＥＬＩＳＡプレートのウェルに生体試料を添加してインキュベートすることにより行うことができる。
生体試料としては、被検者の血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧが挙げられる。本工程においては、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と生体試料とを接触させる。本工程は、例えば、ＴＰＯが固定化されたＥＬＩＳＡプレートのウェルに生体試料を添加してインキュベートすることにより行うことができる。
（固相を洗浄する工程）
続いて、固相の表面を洗浄する。これにより、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と結合した抗ＴＰＯ抗体２０以外の物質を除去することができる。固相の洗浄は、例えば、界面活性剤を含むバッファーで固相表面を洗い流すことにより行うことができる。バッファーとしては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。また、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられる。
続いて、固相の表面を洗浄する。これにより、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と結合した抗ＴＰＯ抗体２０以外の物質を除去することができる。固相の洗浄は、例えば、界面活性剤を含むバッファーで固相表面を洗い流すことにより行うことができる。バッファーとしては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。また、界面活性剤としては、ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が挙げられる。
（抗ＴＰＯ抗体と固相上の前記ＴＰＯとの結合を検出する工程）
続いて、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と結合した抗ＴＰＯ抗体２０を検出する。生体試料がヒト由来である場合には、抗ＴＰＯ抗体２０はＩｇＧ型であると考えられるため、例えば、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体３０を反応させ、続いて、当該酵素３５の基質を反応させて発色物質４０等を生成することにより、抗ＴＰＯ抗体を検出することができる。あるいは、酵素標識ではなく蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させ、当該蛍光の強度を測定することによって抗ＴＰＯ抗体を検出してもよい。本実施形態の検出方法により、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出を定量的に行うこともできる。
続いて、固相上に固定化されたＴＰＯ１０と結合した抗ＴＰＯ抗体２０を検出する。生体試料がヒト由来である場合には、抗ＴＰＯ抗体２０はＩｇＧ型であると考えられるため、例えば、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体３０を反応させ、続いて、当該酵素３５の基質を反応させて発色物質４０等を生成することにより、抗ＴＰＯ抗体を検出することができる。あるいは、酵素標識ではなく蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させ、当該蛍光の強度を測定することによって抗ＴＰＯ抗体を検出してもよい。本実施形態の検出方法により、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出を定量的に行うこともできる。
［免疫沈降法による検出方法］
１実施形態において、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出は、免疫沈降法により行われてもよい。
１実施形態において、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出は、免疫沈降法により行われてもよい。
（ビーズへの抗ＩｇＧ抗体の結合）
本実施形態の検出方法の概要は次の通りである。まず、ほとんどの哺乳動物由来のＩｇＧ抗体と結合することが知られている、プロテインＧ、プロテインＡ等のタンパク質が表面に結合された免疫沈降用ビーズを、生体試料と接触させ、ビーズの表面に、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を含むＩｇＧ抗体を結合させる。本実施形態の検出方法に好適な生体試料としては、被検者の血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧが挙げられる。
本実施形態の検出方法の概要は次の通りである。まず、ほとんどの哺乳動物由来のＩｇＧ抗体と結合することが知られている、プロテインＧ、プロテインＡ等のタンパク質が表面に結合された免疫沈降用ビーズを、生体試料と接触させ、ビーズの表面に、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を含むＩｇＧ抗体を結合させる。本実施形態の検出方法に好適な生体試料としては、被検者の血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧが挙げられる。
（ビーズへのＴＰＯの結合）
次に、上記のビーズにＴＰＯを接触させる。ＴＰＯは、哺乳動物細胞発現系で発現されたものである必要があり、ヒトＴＰＯであることが好ましい。後述するように、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを使用することにより、格段に検出感度が向上する。ＴＰＯとしては、上述したＥＬＩＳＡ法による検出方法におけるものと同様のものを使用することができる。この工程において、ビーズの表面に抗ＴＰＯ抗体が結合していた場合には、当該抗ＴＰＯ抗体を介してＴＰＯがビーズに結合する。
次に、上記のビーズにＴＰＯを接触させる。ＴＰＯは、哺乳動物細胞発現系で発現されたものである必要があり、ヒトＴＰＯであることが好ましい。後述するように、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを使用することにより、格段に検出感度が向上する。ＴＰＯとしては、上述したＥＬＩＳＡ法による検出方法におけるものと同様のものを使用することができる。この工程において、ビーズの表面に抗ＴＰＯ抗体が結合していた場合には、当該抗ＴＰＯ抗体を介してＴＰＯがビーズに結合する。
（ビーズに結合したＴＰＯの検出）
続いて、ビーズに結合したＴＰＯを検出する。この工程は、例えばウエスタンブロット法により行うことができる。より具体的には、遠心分離により回収したビーズ（免疫沈降物）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、膜に転写し、当該膜を抗ヒトＴＰＯ抗体で染色することにより、ビーズに結合したＴＰＯを検出することができる。
続いて、ビーズに結合したＴＰＯを検出する。この工程は、例えばウエスタンブロット法により行うことができる。より具体的には、遠心分離により回収したビーズ（免疫沈降物）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、膜に転写し、当該膜を抗ヒトＴＰＯ抗体で染色することにより、ビーズに結合したＴＰＯを検出することができる。
本工程で検出されるＴＰＯの量は、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の量に比例する。このため、本実施形態の方法により、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出することができる。生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の検出は、半定量的に行うこともできる。
［ＭＡＰＫのリン酸化の検出による検出方法］
１実施形態において、本発明は、前記抗ＴＰＯ抗体がＴＰＯに対する中和抗体であり、前記ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程が、前記生体試料及び抗ＴＰＯ抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加することにより行われ、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程が、ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートし、インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量することにより行われ、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中に抗ＴＰＯ抗体が存在することを示す、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体（ＴＰＯに対する中和抗体）の検出方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、前記抗ＴＰＯ抗体がＴＰＯに対する中和抗体であり、前記ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程が、前記生体試料及び抗ＴＰＯ抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加することにより行われ、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程が、ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートし、インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量することにより行われ、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中に抗ＴＰＯ抗体が存在することを示す、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体（ＴＰＯに対する中和抗体）の検出方法を提供する。
すなわち、本実施形態の検出方法は、生体試料中のＴＰＯに対する中和抗体の検出方法であって、
前記生体試料及びＴＰＯに対する中和抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加する工程と、
ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートする工程と、
インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量する工程と、を含み、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中にＴＰＯに対する中和抗体が存在することを示し、
前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものである、検出方法を提供する。
前記生体試料及びＴＰＯに対する中和抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加する工程と、
ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートする工程と、
インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量する工程と、を含み、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中にＴＰＯに対する中和抗体が存在することを示し、
前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものである、検出方法を提供する。
ここで、抗ＴＰＯ抗体には、機能的に異なる２種類が存在すると考えられる。第１の抗ＴＰＯ抗体は、血中のＴＰＯに結合し、その結果、ＴＰＯが網内系のマクロファージ等により貪食・破壊される抗ＴＰＯ抗体である。第２の抗ＴＰＯ抗体は、ＴＰＯに対する中和抗体である。つまり、第２の抗ＴＰＯ抗体は、血中のＴＰＯと結合し、その結合部位（エピトープ）により、ＴＰＯとＴＰＯ受容体であるｃ−Ｍｐｌとの結合を阻止（ブロック）するもの、又は、ＴＰＯとＴＰＯ受容体であるｃ−Ｍｐｌとの結合は阻止しないものの、ｃ−Ｍｐｌからのシグナル伝達を減弱する抗ＴＰＯ抗体である。なお、中和抗体とは、特定タンパク質の活性を中和できる抗体を意味する。ＴＰＯに対する中和抗体とは、ＴＰＯの活性、すなわち、ＴＰＯがｃ−Ｍｐｌに結合してシグナルを伝達する活性を中和する抗体を意味する。
したがって、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法では、全ての抗ＴＰＯ抗体を検出可能であるが、本実施形態の検出方法では、ＴＰＯに対する中和抗体のみが検出される。
本実施形態の検出方法は、ＴＰＯによるシグナル伝達を利用するものである。より具体的には、ＴＰＯと生体試料とを反応させた反応物の存在下で巨核芽球細胞を培養し、当該巨核芽球細胞内のｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化のレベルを測定する。
生体試料中にＴＰＯに対する中和抗体が存在した場合には、ＴＰＯと結合するため、ＴＰＯが巨核芽球細胞表面のＴＰＯ受容体（ｃ−Ｍｐｌ）に結合できなくなる。その結果、当該巨核芽球細胞内のｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化のレベルは低下する。
一方、生体試料中にＴＰＯに対する中和抗体が存在しなかった場合には、ＴＰＯが巨核芽球細胞表面のＴＰＯ受容体（ｃ−Ｍｐｌ）に結合する。その結果、当該巨核芽球細胞内のｐ４４／４２ＭＡＰＫがリン酸化される。
したがって、本実施形態の方法により、生体試料中のＴＰＯに対する中和抗体を検出することができる。本実施形態の検出方法において好適な生体試料としては、被検者の血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧが挙げられる。本実施形態の検出方法により、生体試料中のＴＰＯに対する中和抗体の検出を定量的に行うこともできる。
〔免疫性血小板減少症の検出方法〕
１実施形態において、本発明は、上述したいずれかの検出方法により検出された抗ＴＰＯ抗体の量を指標とする、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）の検出方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述したいずれかの検出方法により検出された抗ＴＰＯ抗体の量を指標とする、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）の検出方法を提供する。
後述するように、少なくとも一部のＩＴＰ患者の血液中には、ＴＰＯに対する自己抗体（抗ＴＰＯ抗体）が存在しており、この抗ＴＰＯ抗体によりＴＰＯが破壊され、血中ＴＰＯ濃度が低下しており、血中ＴＰＯ濃度の低下によってＴＰＯ受容体からのシグナル伝達が低下することにより、巨核球の成熟障害が誘導されていると考えられる。
したがって、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の量に基づいて、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）を検出することができる。すなわち、本実施形態の検出方法により、免疫性血小板減少症の患者由来の生体試料を検出することができる。つまり、生体試料が、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）の患者由来であるか否かを判定することができる。
〔生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキット〕
１実施形態において、本発明は、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キットを提供する。
本実施形態のキットは、上述した、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体のＥＬＩＳＡ法による検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の免疫沈降法による検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の、ＭＡＰＫのリン酸化の検出による検出方法に好適に用いることができる。
本実施形態のキットにより、高感度に生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出又は定量することができる。
〔免疫性血小板減少症を検出するためのキット〕
１実施形態において、本発明は、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）を検出するためのキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キットを提供する。
１実施形態において、本発明は、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）を検出するためのキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キットを提供する。
本実施形態のキットは、上述した、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、ＭＡＰＫのリン酸化の検出による検出方法等による、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の定量に好適に用いることができる。そして、定量された被検者の生体試料中の抗ＴＰＯ抗体の量に基づいて、被検者が、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）であるか否かを精度よく診断することができる。
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１：ＥＬＩＳＡ法による抗ＴＰＯ抗体の検出］
（抗原の固相化）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト社、型番「ＭＳ−８５９６Ｆ」）に、リコンビナントヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ社）を加え固相化した。ｒｈＴＰＯとしては、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ最終濃度を５００ｎｇ／ｍＬに調整して、１ウェルに５０μＬずつ分注した。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間インキュベート（静置）して、ｒｈＴＰＯを固相化した。なお、上記の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、固相の表面に、−ＣＨＯＨ基及び＞Ｃ＝Ｏ基が導入されたものであった。
（抗原の固相化）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト社、型番「ＭＳ−８５９６Ｆ」）に、リコンビナントヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ社）を加え固相化した。ｒｈＴＰＯとしては、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ最終濃度を５００ｎｇ／ｍＬに調整して、１ウェルに５０μＬずつ分注した。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間インキュベート（静置）して、ｒｈＴＰＯを固相化した。なお、上記の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、固相の表面に、−ＣＨＯＨ基及び＞Ｃ＝Ｏ基が導入されたものであった。
（洗浄）
２時間後、０．０５％ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μＬ／ウェルずつ添加して捨てる操作により、ｒｈＴＰＯを固相化したＥＬＩＳＡプレートを２回洗浄した。
２時間後、０．０５％ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μＬ／ウェルずつ添加して捨てる操作により、ｒｈＴＰＯを固相化したＥＬＩＳＡプレートを２回洗浄した。
（ブロッキング反応）
１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間静置してブロッキング反応を行った。
１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間静置してブロッキング反応を行った。
（一次反応）
生体試料（サンプル）として、１００倍希釈した、健常人の血漿又はＩＴＰ患者の血漿を１００μＬずつウェルに入れて、室温で９０分間静置した。血漿の希釈には０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを使用した。また、検量線用検体として、抗ＴＰＯ抗体高力価プール血漿を希釈して用いた。希釈系列は、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００、４０００倍希釈の７系列とした。
生体試料（サンプル）として、１００倍希釈した、健常人の血漿又はＩＴＰ患者の血漿を１００μＬずつウェルに入れて、室温で９０分間静置した。血漿の希釈には０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを使用した。また、検量線用検体として、抗ＴＰＯ抗体高力価プール血漿を希釈して用いた。希釈系列は、６２．５、１２５、２５０、５００、１０００、２０００、４０００倍希釈の７系列とした。
（洗浄）
サンプルの血漿を９０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄した。
サンプルの血漿を９０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄した。
（二次反応）
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）をＰＢＳ−Ｔで２５００倍希釈したものを使用し、室温で１時間反応させた。
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）をＰＢＳ−Ｔで２５００倍希釈したものを使用し、室温で１時間反応させた。
（洗浄）
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄し、更にＰＢＳ １５０μＬで１回洗浄した。
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄し、更にＰＢＳ １５０μＬで１回洗浄した。
（発色反応）
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液（Ｓｉｇｍａ社）を各ウェルに加え、３０分から４０分遮光して発色させた。１Ｎ硫酸で反応を止め、プレートリーダー（バイオ・ラッド社、商品名「ｉＭａｒｋ」）を用いて波長４５０ｎｍ（参照波長５４０ｎｍ）の吸光を測定した。抗ＴＰＯ抗体高力価の血漿検体の希釈系列から検量線を４係数Ｌｏｇｉｓｔｉｃ解析により作成し、ユニット換算することで測定間の数値的な比較を可能にした。
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液（Ｓｉｇｍａ社）を各ウェルに加え、３０分から４０分遮光して発色させた。１Ｎ硫酸で反応を止め、プレートリーダー（バイオ・ラッド社、商品名「ｉＭａｒｋ」）を用いて波長４５０ｎｍ（参照波長５４０ｎｍ）の吸光を測定した。抗ＴＰＯ抗体高力価の血漿検体の希釈系列から検量線を４係数Ｌｏｇｉｓｔｉｃ解析により作成し、ユニット換算することで測定間の数値的な比較を可能にした。
図２（ａ）及び（ｂ）は、ＥＬＩＳＡ法による解析結果を示すグラフである。図２（ａ）は、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合の結果であり、図２（ｂ）は、マウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合の結果である。
バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、ＩＴＰ患者１０１例（ｎ＝１０１）中７例（６．９％）の血漿から抗ＴＰＯ抗体が検出された。カットオフ値は健常人（ｎ＝７２）の血漿サンプルを用いた場合の測定値の平均値＋３ＳＤ（８．５８ユニット、図２（ａ）のグラフ中点線で示す。）に設定した。
一方、マウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、ＩＴＰ患者１０１例（ｎ＝１０１）中２４例（２３．８％）の血漿から抗ＴＰＯ抗体が検出された。カットオフ値は健常人（ｎ＝７２）の血漿サンプルを用いた場合の測定値の平均値＋３．５ＳＤ（３．８ユニット、図２（ｂ）のグラフ中点線で示す。）に設定した。
ＴＰＯとして、哺乳動物細胞発現系で発現されたものを使用することにより、抗ＴＰＯ抗体の検出感度が格段に向上することが示された。また、ＩＴＰ患者の血漿では、抗ＴＰＯ抗体量が増加していることが判明した。
［実験例２：ＥＬＩＳＡ法における抗原の固相化条件の検討］
（抗原の固相化）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト社、型番ＭＳ−８５９６Ｆ）に、リコンビナントヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ社）を加え、４℃で終夜又は３７℃で２時間インキュベートすることにより固相化した。ｒｈＴＰＯとしては、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ最終濃度を５００ｎｇ／ｍＬに調整して、１ウェルに５０μＬずつ分注した。
（抗原の固相化）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、住友ベークライト社、型番ＭＳ−８５９６Ｆ）に、リコンビナントヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）（Ｒ＆Ｄ社）を加え、４℃で終夜又は３７℃で２時間インキュベートすることにより固相化した。ｒｈＴＰＯとしては、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを用いた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でそれぞれ最終濃度を５００ｎｇ／ｍＬに調整して、１ウェルに５０μＬずつ分注した。
（洗浄）
２時間後、０．０５％ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μＬ／ウェルずつ添加して捨てる操作により、ｒｈＴＰＯを固相化したＥＬＩＳＡプレートを２回洗浄した。
２時間後、０．０５％ポリオキシエチレンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）含有のＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１５０μＬ／ウェルずつ添加して捨てる操作により、ｒｈＴＰＯを固相化したＥＬＩＳＡプレートを２回洗浄した。
（ブロッキング反応）
１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間静置してブロッキング反応を行った。
１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で１時間静置してブロッキング反応を行った。
（一次反応）
生体試料（サンプル）として、１００倍希釈した、ＩＴＰ患者（ｎ＝２０）の血漿を１００μＬずつウェルに入れて、室温で９０分間静置した。血漿の希釈には０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを使用した。
生体試料（サンプル）として、１００倍希釈した、ＩＴＰ患者（ｎ＝２０）の血漿を１００μＬずつウェルに入れて、室温で９０分間静置した。血漿の希釈には０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを使用した。
（洗浄）
サンプルの血漿を９０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄した。
サンプルの血漿を９０分間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄した。
（二次反応）
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）をＰＢＳ−Ｔで２５００倍希釈したものを使用し、室温で１時間反応させた。
二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）をＰＢＳ−Ｔで２５００倍希釈したものを使用し、室温で１時間反応させた。
（洗浄）
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄し、更にＰＢＳ １５０μＬで１回洗浄した。
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔ １５０μＬで６回洗浄し、更にＰＢＳ １５０μＬで１回洗浄した。
（発色反応）
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液（Ｓｉｇｍａ社）を各ウェルに加え、３０分から４０分遮光して発色させた。１Ｎ硫酸で反応を止め、プレートリーダー（バイオ・ラッド社、商品名「ｉＭａｒｋ」）を用いて波長４５０ｎｍ（参照波長５４０ｎｍ）の吸光を測定した。
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色液（Ｓｉｇｍａ社）を各ウェルに加え、３０分から４０分遮光して発色させた。１Ｎ硫酸で反応を止め、プレートリーダー（バイオ・ラッド社、商品名「ｉＭａｒｋ」）を用いて波長４５０ｎｍ（参照波長５４０ｎｍ）の吸光を測定した。
図３（ａ）及び（ｂ）は、ＥＬＩＳＡ法による解析結果を示すグラフである。図３（ａ）は、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合の結果であり、図３（ｂ）は、マウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合の結果である。
４℃で終夜インキュベートすることにより、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、波長４５０ｎｍの吸光度の平均値±標準誤差は、−０．００５±０．００１であった。一方、３７℃で２時間インキュベートすることにより、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、波長４５０ｎｍの吸光度の平均値±標準誤差は、０．００４±０．００１であった。４℃でｒｈＴＰＯを固相化した場合と３７℃でｒｈＴＰＯを固相化した場合のこれらの吸光度には、危険率０．１％未満で有意差が認められた（ｐ＜０．００１）。
また、４℃で終夜インキュベートすることにより、哺乳動物細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、波長４５０ｎｍの吸光度の平均値±標準誤差は、０．０１±０．００６であった。一方、３７℃で２時間インキュベートすることにより、哺乳動物細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを固相化した場合、波長４５０ｎｍの吸光度の平均値±標準誤差は、０．０１５±０．００７であった。４℃でｒｈＴＰＯを固相化した場合と３７℃でｒｈＴＰＯを固相化した場合のこれらの吸光度には、危険率１％で有意差が認められた（ｐ＝０．０１）。
以上の結果から、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯと哺乳動物細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯのいずれを固相化した場合においても、３７℃で２時間インキュベートしてｒｈＴＰＯを固相化することにより、４℃で終夜インキュベートした場合と比較して、有意差を持って吸光度の増加（検出感度の向上）が認められた。
［実験例３：抗ＴＰＯ抗体と巨核球数の関連性の検討］
ＥＬＩＳＡ法により血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されたＩＴＰ患者（陽性）、及びＥＬＩＳＡ法により血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されなかったＩＴＰ患者（陰性）について、血液中の巨核球の数を測定し、巨核球数が減少した患者数、及び巨核球数が正常又は増加した患者数を求めた。結果を下記表１に示す。
ＥＬＩＳＡ法により血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されたＩＴＰ患者（陽性）、及びＥＬＩＳＡ法により血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されなかったＩＴＰ患者（陰性）について、血液中の巨核球の数を測定し、巨核球数が減少した患者数、及び巨核球数が正常又は増加した患者数を求めた。結果を下記表１に示す。
その結果、血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されたＩＴＰ患者は、血漿中に抗ＴＰＯ抗体が検出されなかったＩＴＰ患者と比較して、巨核球が減少している頻度が高かった。この結果には、危険率４．５％で有意差が認められた（ｐ＝０．０４５）。
［実験例４：免疫沈降法による抗ＴＰＯ抗体の検出］
免疫沈降法（免疫沈降−ウエスタンブロット法）により血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体を検出した。
免疫沈降法（免疫沈降−ウエスタンブロット法）により血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体を検出した。
（ビーズとの反応）
５００μＬのＩＰＰバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ｐＨ８．０）中で、免疫沈降用ビーズ（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｓｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ」、ＧＥヘルスケア社）に、サンプルとして、健常人の血漿１０μＬ又はＩＴＰ患者の血漿１０μＬを添加して混合し、４℃で終夜又は室温で２時間反応させた。陽性対照には、抗ＴＰＯ抗体高力価の血漿サンプルを用いた。
５００μＬのＩＰＰバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ｐＨ８．０）中で、免疫沈降用ビーズ（商品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｓｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ」、ＧＥヘルスケア社）に、サンプルとして、健常人の血漿１０μＬ又はＩＴＰ患者の血漿１０μＬを添加して混合し、４℃で終夜又は室温で２時間反応させた。陽性対照には、抗ＴＰＯ抗体高力価の血漿サンプルを用いた。
（洗浄）
続いて、血漿と反応させた免疫沈降用ビーズを、５００μＬのＩＰＰバッファーで３回洗浄した。
続いて、血漿と反応させた免疫沈降用ビーズを、５００μＬのＩＰＰバッファーで３回洗浄した。
（ｒｈＴＰＯとの反応）
抗原として、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯ（いずれもＲ＆Ｄ社）を用いた。各ｒｈＴＰＯを、ＮＥＴ−２バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ｐＨ７．４）で最終濃度５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。これらのｒｈＴＰＯを、血漿と反応後の免疫沈降用ビーズに加え、室温で２時間反応させた。
抗原として、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯ又はマウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯ（いずれもＲ＆Ｄ社）を用いた。各ｒｈＴＰＯを、ＮＥＴ−２バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、ｐＨ７．４）で最終濃度５０ｎｇ／ｍＬに希釈した。これらのｒｈＴＰＯを、血漿と反応後の免疫沈降用ビーズに加え、室温で２時間反応させた。
（洗浄）
続いて、ｒｈＴＰＯと反応後の免疫沈降用ビーズを、ＮＥＴ−２バッファーで５回洗浄した。
続いて、ｒｈＴＰＯと反応後の免疫沈降用ビーズを、ＮＥＴ−２バッファーで５回洗浄した。
（ウエスタンブロット法）
ウエスタンブロット法により、免疫沈降物を解析した。具体的には、免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。続いて、一次抗体としてヤギ抗ヒトＴＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ社）を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用い、化学的に発色させて抗ＴＰＯ抗体を検出した。
ウエスタンブロット法により、免疫沈降物を解析した。具体的には、免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。続いて、一次抗体としてヤギ抗ヒトＴＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ社）を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用い、化学的に発色させて抗ＴＰＯ抗体を検出した。
図４（ａ）及び（ｂ）は、免疫沈降−ウエスタンブロット法による解析結果を示す写真である。図４（ａ）は、バキュロウイルス発現系で発現されたｒｈＴＰＯを抗原に用いた場合の結果であり、図４（ｂ）は、マウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯを抗原に用いた場合の結果である。
図４（ａ）において、レーン１及び２は陽性対照であり、レーン３及び４は健常人の血漿を用いた結果であり、レーン５及び６は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果であり、レーン７〜１３は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果である。
陽性対照では約５０ｋＤａの位置にバンドが認められた。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿を含むすべてのサンプルで、バンドが認められなかった。
図４（ｂ）において、レーン１及び２は陽性対照であり、レーン３及び４は健常人の血漿を用いた結果であり、レーン５〜７は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果であり、レーン８〜１４は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果である。
ＥＬＩＳＡ法により測定した、図４（ｂ）の各レーンのサンプルに使用した血漿中の抗ＴＰＯ抗体の濃度（ユニット）を下記表２に示す。
陽性対照及びＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿をサンプルに使用した場合には、約８０ｋＤａの位置にバンドが認められた。一方、健常人の血漿及びＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿をサンプルに使用した場合には、バンドが認められなかった。
ＴＰＯとして、バキュロウイルス発現系で発現されたものを使用した場合には、血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体を検出することができなかった。これに対し、ＴＰＯとして、哺乳動物細胞発現系で発現されたものを使用することにより、血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体の検出が可能となり、抗ＴＰＯ抗体の検出感度が格段に向上することが示された。
［実験例４：ＭＡＰＫリン酸化の検出によるＴＰＯに対する中和抗体の検出］
ヒト巨核芽球細胞株であるＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は、ｃ−Ｍｐｌが高発現し、ＴＰＯ依存性に増殖する細胞である。ＴＰＯ／ｃ−Ｍｐｌの下流には、ｐ４４／４２ＭＡＰＫシグナル伝達経路が存在する。
ヒト巨核芽球細胞株であるＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は、ｃ−Ｍｐｌが高発現し、ＴＰＯ依存性に増殖する細胞である。ＴＰＯ／ｃ−Ｍｐｌの下流には、ｐ４４／４２ＭＡＰＫシグナル伝達経路が存在する。
本実験例では、ＴＰＯを添加した血漿サンプルの存在下で、巨核芽球細胞をインキュベートし、巨核芽球細胞のＭＡＰＫリン酸化を検出することにより、血漿サンプル中のＴＰＯに対する中和抗体を検出した。つまり、血漿サンプル中のＴＰＯに対する中和抗体が、血漿サンプルに添加されたＴＰＯの作用を抑制し、ＴＰＯの受容体であるｃ−Ｍｐｌの下流のシグナルを減弱させることができるか否か、すなわち、血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体が、巨核芽球細胞の成熟障害を引き起こす機能的な抗体であるか否かについて検討した。
（血漿サンプルとｒｈＴＰＯの反応）
血漿サンプルとして、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿、健常人の血漿を使用した。また、陽性対照として、抗ＴＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ社）を使用し、陰性対照としてＰＢＳを使用した。
血漿サンプルとして、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿、健常人の血漿を使用した。また、陽性対照として、抗ＴＰＯ抗体（Ｒ＆Ｄ社）を使用し、陰性対照としてＰＢＳを使用した。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）中で、マウスミエローマ細胞発現系で発現されたｒｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社）１０ｎｇ／ｍＬと、上記の血漿サンプル各１０μＬとを反応させた。
（ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞と反応）
上記の培地にＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を１×１０５個ずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分反応させた。その後、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心して回収した。続いて回収した細胞から細胞抽出物を調製した。
上記の培地にＵＴ−７／ＴＰＯ細胞を１×１０５個ずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分反応させた。その後、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心して回収した。続いて回収した細胞から細胞抽出物を調製した。
（ウエスタンブロット法）
ウエスタンブロット法により細胞抽出物を解析し、ＭＡＰＫリン酸化を検出した。具体的には、免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。続いて、一次抗体としてリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、又は抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ抗体（いずれもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、化学的に発色させてバンドを検出した。
ウエスタンブロット法により細胞抽出物を解析し、ＭＡＰＫリン酸化を検出した。具体的には、免疫沈降物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。続いて、一次抗体としてリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体、又は抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ抗体（いずれもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、化学的に発色させてバンドを検出した。
図５は、ＭＡＰＫリン酸化の解析結果を示す写真である。図５において、レーン１は陽性対照であり、レーン２は陰性対照であり、レーン３は健常人の血漿を用いた結果であり、レーン４及び５は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果であり、レーン６〜９は、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿を用いた結果である。ＥＬＩＳＡ法により測定した、図５の各レーンのサンプルに使用した血漿中の抗ＴＰＯ抗体の濃度（ユニット）を下記表３に示す。
陽性対照では、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化が認められず、ＭＡＰＫ活性が抑制されていることが示された。陰性対照、健常人の血漿、及びＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陰性であったＩＴＰ患者の血漿をサンプルに使用した場合には、ｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化が認められ、ＭＡＰＫが活性化されていることが示された。一方、ＥＬＩＳＡ法による検出で抗ＴＰＯ抗体陽性であったＩＴＰ患者の血漿をサンプルに使用した場合には、陰性対照と比較してＭＡＰＫのリン酸化レベルが少ないか、ＭＡＰＫのリン酸化が認められなかった。
以上の結果から、ＩＴＰ患者の血漿サンプル中の抗ＴＰＯ抗体が、巨核芽球細胞の成熟障害を引き起こす機能的な抗体であることが確認された。また、ＴＰＯを添加した血漿サンプルの存在下で、巨核芽球細胞をインキュベートし、巨核芽球細胞のＭＡＰＫリン酸化を検出することにより、血漿サンプル中のＴＰＯに対する中和抗体の検出が可能であることが示された。
また、以上の結果は、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを用いて、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）の罹患が疑われる被験者から得た生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出することにより、免疫性血小板減少症を高精度に検出することができることを示す。また、抗ＴＰＯ抗体の検出に加え、巨核芽球細胞のｐ４４／４２ＭＡＰＫのリン酸化状態を測定することにより、免疫性血小板減少症を更に高精度に検出することができることを示す。
本発明により、検出感度が向上した、抗ＴＰＯ抗体の検出方法を提供することができる。また、検出感度が向上した、免疫性血小板減少症の検出方法、生体試料中の抗ＴＰＯ抗体を検出するためのキット及び免疫性血小板減少症を検出するためのキットを提供することができる。
１０…ＴＰＯ、２０…生体試料中の抗ＴＰＯ抗体、３０…酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体、３３…抗ヒトＩｇＧ抗体、３５…酵素、４０…発色物質。
Claims (8)
- 生体試料中の抗トロンボポエチン（ＴＰＯ）抗体の検出における検出感度の向上方法であって、
ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程と、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、を含み、
前記ＴＰＯが哺乳動物細胞発現系で発現されたものであり、
前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、検出感度の向上方法。 - 前記検出が酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）により行われる、請求項１に記載の検出感度の向上方法。
- 前記ＴＰＯを固相上に固定化させる工程と、
前記生体試料を固相上の前記ＴＰＯと接触させる工程と、
前記固相を洗浄する工程と、
前記抗ＴＰＯ抗体と固相上の前記ＴＰＯとの結合を検出する工程と、
を含み、前記固定化させる工程が、３０〜４０℃で行われる、請求項２に記載の検出感度の向上方法。 - 前記検出が免疫沈降法により行われる、請求項１に記載の検出感度の向上方法。
- 前記抗ＴＰＯ抗体がＴＰＯに対する中和抗体であり、
前記ＴＰＯと前記生体試料とを接触させる工程が、前記生体試料及び抗ＴＰＯ抗体を含まない陰性対照にＴＰＯを添加することにより行われ、
前記抗ＴＰＯ抗体と前記ＴＰＯとの結合を検出する工程が、ＴＰＯが添加された前記生体試料又はＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下で巨核芽球細胞をインキュベートし、インキュベート後の前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化を定量することにより行われ、
ＴＰＯが添加された前記生体試料の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルが、ＴＰＯが添加された前記陰性対照の存在下でインキュベートされた前記巨核芽球細胞におけるＭＡＰＫのリン酸化レベルと比較して少ないことが、前記生体試料中に抗ＴＰＯ抗体が存在することを示す、請求項１に記載の検出感度の向上方法。 - 請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出感度の向上方法により検出された抗ＴＰＯ抗体の量を指標とする、免疫性血小板減少症の検出方法。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出感度の向上方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含み、前記生体試料が血漿、血清又は血漿若しくは血清から精製されたＩｇＧである、キット。
- 請求項６に記載の免疫性血小板減少症の検出方法に用いられるキットであって、哺乳動物細胞発現系で発現されたＴＰＯを含む、キット。
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