JP2023502508A

JP2023502508A - 好中球エラスターゼ活性のポリペプチド阻害剤およびその使用

Info

Publication number: JP2023502508A
Application number: JP2022529923A
Authority: JP
Inventors: ローレンス，ダニエル
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2023-01-24
Also published as: WO2021102176A2; EP4061956A4; CA3158862A1; CN114867865A; AU2020388059A1; WO2021102176A3; US20220372111A1; EP4061956A2

Abstract

本発明はビトロネクチンと結合する能力が低下し、ＰＡＩ－１クリアランス受容体ＬＤＬ受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）と相互作用する能力が低下し、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の存在下で好中球エラスターゼを効率的に阻害する能力を有するプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１（ＰＡＩ－１）の変異体を含むポリペプチドを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメイン単量体または部分に任意に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。本発明はまた、異常な好中球エラスターゼ活性（実施例として、特発性肺線維症）を特徴とする疾患および状態を治療するためにポリペプチドを使用する医薬組成物および方法を特徴とする。

Description

発明の詳細な説明

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１９年１１月２１日に出願された米国仮出願第６２／９３８，８５９号の優先権および利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

〔発明の分野〕
本発明は、ビトロネクチンと結合する能力が低下し、ＰＡＩ－１クリアランス受容体ＬＤＬ受容体関連タンパク質１（LDL receptor-related protein 1：ＬＲＰ１）と相互作用する能力が低下し、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴｓ）の存在下で好中球エラスターゼ（ＮＥ）を効率的に阻害する能力を有するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（plasminogen activator inhibitor 1：ＰＡＩ－１）の変異体を含むポリペプチドを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分に任意に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。本発明はまた、異常な好中球エラスターゼ活性（例えば、特発性肺線維症）を有することを特徴とする疾患および状態を治療するためのポリペプチドを用いた医薬組成物および方法を特徴とする。

〔はじめに〕
特発性肺線維症（Idiopathic Pulmonary Fibrosis：ＩＰＦ）は進行性かつ慢性の肺疾患であり、呼吸不全および死亡をもたらす。ＩＰＦは進行性肺疾患による最も一般的な死因であり、全世界では約５００万人が罹患している。診断後の推定生存期間中央値はわずか３～５年である（Chakraborty et al., (2014) Expert Opin Investig Drugs, 23:893-910; Spagnolo et al., (2015) Pharmacology & Therapeutics 152:18-27; Tzouvelekis et al., (2015) Therapeutics and Clinical Risk Management 11:359-370; Lederer DJ and Martinez FJ. The New England journal of medicine. 2018;378:1811-1823を参照のこと）。米国では約１３０，０００人のＩＰＦ患者が存在し、毎年推定３０，０００～４０，０００人の新規症例が診断されている（Ley,B., and Collard,H.R. 2013. Epidemiology of idiopathic pulmonary fibrosis. Clin. Epidemiol. 5:483-492; Lynch,J.P., III, et al., 2016. Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Epidemiology, Clinical Features, Prognosis, and Management. Semin. Respir. Crit Care Med. 37:331-357を参照のこと）。ＩＰＦの有病率は１００，０００人当たり１４．０～４２．７症例であり、年間発症率は１００，０００人当たり６．８～１６．３症例であり、使用される診断基準の厳格さに依存する（Jones, M.G., and Richeldi, L. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2016; 37:477-484を参照のこと）。ＩＰＦの有病率は年齢とともに上昇し、ほとんどのＩＰＦ患者は診断時に年齢が６０歳であるか、さらに高齢である。この疾患は女性よりも男性においてより一般的であり（Fernandez Perez E R et al., (2010) Chest 137(1):129-137を参照のこと）、ほとんどの患者は、現在または過去の喫煙者である（Jones, MG and Richeldi, L., Semin. Respir. Care Med. 2016, 37:477-484を参照のこと）。

ＩＰＦの病因は不明のままである。しかしながら、喫煙、粉塵暴露、および感染因子などの潜在的因子がＩＰＦの発症と関連している。ＩＰＦは、上皮細胞および内皮細胞のアポトーシス、線維芽細胞の過形成、ならびに細胞外マトリックスリモデリングの結果として、肺の構造が進行的かつ不可逆的に歪むことを特徴とする（Chakraborty et al., (2014) Expert Opin Investig Drugs, 23:893-910を参照のこと）。間質性線維症が肺構造の歪みを伴って進行すると、肺のコンプライアンスが低下し、呼吸に伴う労作が増大し、呼吸困難に至る。典型的には、肺機能は時間とともに緩徐に低下するが、一部の患者は急速な低下を経験し、特に疾患の後期には入院または死亡に至る可能性がある。

ＩＰＦ治療剤の開発は進行が遅れている。ＩＰＦを治療するための最初の２つの薬剤、ピルフェニドンおよびニンテダニブは２０１４年末にようやく承認された（King et al., (2014) N Engl J Med 370:2083-92; Richeldi et al., (2014) N Engl J Med 370:2071-82; Richeldi, L, et al., Am. J. Med. Sci. 2019, 357:370-373を参照のこと）。しかしながら、これら２つの薬物は限られた効果しかなく、重大な副作用を有し、複雑な投与計画を必要とする。最近実施されたピルフェニドン、シルデナフィル、ボセンタン、エタネルセプト、およびインターフェロンガンマ－１ｂの第３期臨床試験では、主要評価項目における有効性を示すことができなかった。Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、コルチコステロイド、ならびに免疫抑制薬のシクロホスファミドおよびアザチオプリンがよく処方されるが、これらの薬物の使用が患者の転帰を改善するか、または疾患の自然経過を変化させるという証拠はほとんどない（Collard H R et al., (2004) Chest 125(6):2169-2174; Walter N et al., (2006) Proc Am Thorac Soc 3(4):377-381を参照のこと）。肺移植は生存率を改善する唯一の治療法であるが、ほとんどのＩＰＦ患者は年齢または併発状態のために移植に適格ではない。ＩＰＦ患者は通常、咳嗽および呼吸困難の対症療法、低酸素血症に対する酸素補給、禁煙、肺リハビリテーション、ならびに気道感染の予防および制御などの対症療法により管理される。

ＩＰＦを治療するための改善された方法が必要とされている。

本発明はこの必要性に対応するものである。

〔発明の概要〕
プラスミノーゲン－アクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ－１）と標的酵素との複合体がＬＤＬ受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）に強固に結合することは十分に確立されている一方で、この相互作用の分子的な詳細は十分に明らかにされていない。さらに、遊離ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用の性質に関して、文献においてかなりの議論がある。本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験において、遊離ＰＡＩ－１およびＰＡＩ－１と低分子量ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）との複合体のＬＲＰ１への結合を試験した。データから、ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体がＰＡＩ－１単独よりも約１００倍増加した親和性でＬＲＰ１に結合することを確認している。ＰＡＩ－１の化学修飾から、ＰＡＩ－１およびｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の両方のＬＲＰ１への相互作用のためのＰＡＩ－１のリシン残基が必須で必要であることを確認している。表面プラズモン共鳴測定は、ＰＡＩ－１およびｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の複数の部位がＬＲＰ１の相補的部位と相互作用する２価結合モデルを支持している。結合のイオン強度依存性は、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用のための２つの重要な荷電残基およびｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用のための３つの荷電残基の関与を示唆している。ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の３つの領域のＬＲＰ１のＬＤＬａリピートとの相互作用から生じる親和性の増強は、ＬＲＰ１に対するｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の親和性の増加についての分子的な説明を提供する。変異解析により、ＬＲＰ１の結合とＰＡＩ－１の低分子阻害剤であるＣＤＥ－０９６（特異的ＰＡＩ－１阻害剤）の結合部位との重複が明らかになり、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用におけるＫ２０７、ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用におけるＫ２０７、Ｋ８８、およびＫ８０の重要な役割も明らかにしている。

本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験から、ＰＡＩ－１およびプロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相対的な結合親和性を明らかにした。さらに、プロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合が主にＰＡＩ－１の決定基に起因するかどうかを決定するために実験を行った。さらに、遊離ＰＡＩ－１および標的プロテアーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ））との複合体におけるＰＡＩ－１のＬＲＰ１へのそれらの結合に関与する特異的アミノ酸残基を決定するために実験を行った。実際、変異解析により、ＬＲＰ１の結合とＰＡＩ－１の低分子阻害剤であるＣＤＥ－０９６の結合部位との重複が明らかになり、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用ではＫ２０７、ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用ではＫ２０７、Ｋ８８、およびＫ８０の重要な役割も明らかにしている。

ＩＰＦは、肺機能を劇的に制限し得る間質性瘢痕組織形成によって特徴付けられている。米国では約１３０，０００人のＩＰＦ患者が存在し、毎年推定３０，０００～４０，０００人の新規症例が診断されている（Ley,B., and Collard,H.R. 2013. Epidemiology of idiopathic pulmonary fibrosis. Clin. Epidemiol. 5:483-492; Lynch,J.P., III, et al., 2016. Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Epidemiology, Clinical Features, Prognosis, and Management. Semin. Respir. Crit Care Med. 37:331-357を参照のこと）。ＩＰＦの診断後の平均余命は、一般的に３～５年である（Lederer, D.J. and Martinez, F.J., NEJM 2018, 378:1811-1823を参照のこと）。肺移植以外に有効な治療処置はない。ＩＰＦの進行を止める治療法の欠如は、重大な課題を提示し、主要な満たされていない医療ニーズである。現在承認されている２つの薬剤であるピルフェニドンおよびニンテダニブは疾患の進行を遅らせることが示されているが、進行を止めることはなく、失われた肺機能を回復させることはできない。そのため、ＩＰＦ治療のための新規治療法は、疾患管理に必要である。

本発明は、ＮＥを阻害すること、特にＮＥＴｓに結合したＮＥを阻害することができる変異ＰＡ１－Ｉポリペプチドを含む組成物を提供することによって、このニーズに対処する。本明細書では、ビトロネクチンおよびＬＲＰ１と結合する能力を減少させながら、ＮＥ活性を阻害することができるＰＡＩ－１変異体が提供される。実際、本発明のための実施形態を開発する過程で行われた実験は、そのようなＰＡＩ－１変異体がそのようなビトロネクチン結合に関与するＰＡＩ－１アミノ酸残基を改変（例えば、Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋ）することによってビトロネクチンとの結合能を阻害することによって、ＮＥ活性に関連する状態（例えば、ＩＰＦ）を治療するための改善された効果を有することを実証した。

実際、本発明のための実施形態を開発する過程で行われた実験では、セルピンマッピング技術を利用し、ＮＥＴｓ環境内でＮＥを効率的に阻害可能なＮＥの阻害剤として、変異体型のＰＡ１－１（例えば、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有する）を同定した。このような変異体型のＰＡ１－Ｉは、ＮＥＴｓの主成分であるＤＮＡに結合したＮＥを不可逆的に阻害することが示された。ここで、ＦＤＡが承認したＡｒａｌａｓｔと商標付けられたヒト血漿由来のＡ１ＡＴは効果がない。特定の実施形態において、このような変異体型のＰＡＩ－１は、ヒトＩｇＧ－Ｆｃとさらに関連する。

したがって、本発明は、ビトロネクチン結合に関与するアミノ酸残基を改変（例えば、Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋ）することによって、ＮＥ活性を阻害することができる一方、ビトロネクチンとの結合能が減少し、その結果、ＬＲＰ１結合に関与するアミノ酸残基（例えば、Ｋ２０７、Ｋ８８、およびＫ８０）を改変することによって薬物動態（pharmacokinetics：ＰＫ）を改善し、その結果、ＮＥ活性に関連する状態（例えば、ＩＰＦ）を治療するための効果を改善する、ＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む（例えば、ＰＫを改善する目的のために）。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分は、ポリペプチドの安定性を増加させるか、または薬物動態を改善する。

このような部分は、アミノ酸または他の共有結合によって融合または結合され得、ポリペプチドの安定性を増加し得る。Ｆｃドメインの単量体に融合したＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドはまた、２つのＦｃドメインの単量体間の相互作用によって、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体が結合した本明細書に記載のポリペプチドは、リンカーによってポリペプチドに融合されている。いくつかの実施形態において、リンカーはアミノ酸スペーサーである。

本発明のポリペプチドはＮＥ活性を阻害するために使用され得、ＮＥＴｓに結合したＮＥ活性を阻害するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、異常なＮＥ活性を有することを特徴とする状態（例えば、ＩＰＦ）を有する対象を治療するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、対象が異常なＮＥ活性を有することを特徴とする状態（例えば、ＩＰＦ）によって苦しむことを予防するために使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドはまた、異常なＮＥ活性を伴う疾患または状態を発症するまたは有する危険性を有する対象においてＮＥ活性に作用させるために使用され得る。

いくつかの実施形態において、本発明はＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであって、当該変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、配列番号５に示されるように、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内の以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ２０７Ａ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む。この変異体は、特にＮＥＴＳ中のＮＥに対して完全な活性を有するＦｃ型において、延長された半減期を有するはずである。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであって、当該変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内の以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む（配列番号７）。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ２０７Ａ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、ＮＥを阻害することができ、特に、ＮＥＴｓに結合したＮＥを阻害することができる。

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチド）をコードする核酸分子であることを特徴とする。別の態様において、本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターであることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞であって、前記宿主細胞は、前記の２つの態様に記載の核酸分子またはベクターを含み、前記核酸分子または前記ベクターは、前記宿主細胞において発現される、宿主細胞であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチドを調製する方法、前記方法は、ａ）本明細書中に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を準備する工程、およびｂ）前記ポリペプチドの形成を可能にする条件下で、前記宿主細胞中で前記核酸分子または前記ベクターを発現させる工程を含む、方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のポリペプチド、核酸分子、またはベクター、および１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む薬学的組成物であることを特徴とする。薬学的組成物のいくつかの実施形態において、ポリペプチド、核酸分子、またはベクターは治療有効量である。

別の態様において、本発明はまた、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するＰＡＩ－１変異体をそれぞれ含む２つの同一のポリペプチド（例えば、ホモ二量体）を含むコンストラクトであって、当該変異体は、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合されているコンストラクトであることを特徴とする。コンストラクトにおいて、２つのポリペプチドの２つのＦｃドメイン単量体は相互作用して、Ｆｃドメインを形成する。

別の態様において、本発明はまた、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内の以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上の異なる組み合わせを有するＰＡＩ－１変異体をそれぞれ含む２つの異なるポリペプチド（例えば、ヘテロ二量体）を含むコンストラクトであって、２つの変異体は、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合されている、コンストラクトであることを特徴とする。コンストラクトにおいて、２つのポリペプチドの２つのＦｃドメイン単量体は相互作用して、Ｆｃドメインを形成するコンストラクトであることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、ＮＥ活性の阻害を必要とする対象におけるＮＥ活性を阻害する方法であることを特徴とする。別の態様において、本発明は、ＮＥ活性の阻害を必要とする対象におけるＮＥＴｓに結合したＮＥ活性を阻害する方法であることを特徴とする。当該方法は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を対象に投与する工程を含む。

対象におけるＮＥ活性またはＮＥＴｓ内に結合したＮＥ活性を阻害する方法のいくつかの実施形態において、前記対象は、ＩＰＦおよび／または異常なＮＥ活性を有することを特徴とする状態（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫）を有する。対象におけるＮＥ活性またはＮＥＴ内に結合したＮＥ活性を阻害する方法のいくつかの実施形態において、前記対象は、Ａ１ＡＴ活性および／または発現欠損を有する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、ＩＰＦを有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、嚢胞性線維症を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、ＣＯＰＤを有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、肺気腫を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、虚血再潅流傷害を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、エタノール誘発慢性膵炎を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、関節リウマチ（ＲＡ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する対象に投与することによって、対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載される薬学的組成物の、治療有効量を、クローン病を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、好中球病理を伴う皮膚疾患を有する対象に投与することによって、対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、Ａ１ＡＴ活性および／または発現の欠損を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、異常なＮＥ活性および／または発現を有することを特徴とする任意の状態を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、欠損したＡ１ＡＴ活性および／または発現を有する特徴とする任意の状態を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

上記の任意の態様のうちのいくつかの実施形態において、対象は、異常なＮＥ活性を有すること特徴とする状態（例えば、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、肺気腫、ＡＲＤＳ、虚血再潅流、慢性膵炎、ＲＡ、ＤＩＣ、ＵＣ、クローン病、皮膚疾患）を有するか、または発症する危険性がある。

上記の任意の態様のうちのいくつかの実施形態において、対象は、欠損したＡ１ＡＴ活性および／または発現を特徴とする状態を有するか、または発症する危険性がある。

〔図面の簡単な説明〕
図１．ＰＡＩ－１およびＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合に対するＰＡＩ－１のリシン残基の必須の役割。Ａ．ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体および遊離ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合はＳＰＲによって分析し、Ｒｅｑ値は平衡測定によって決定した。３つの独立した実験を行い、平均±ＳＥをプロットした。ＫＤ値（ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１については０．９±０．２ｎＭ、ＰＡＩ－１については７４±１３ｎＭ）を非線形回帰分析によって決定した。Ｂ．ＰＡＩ－１（レーン１）および化学修飾ＰＡＩ－１（レーン２）は、ＬＭＷｕＰＡと複合体を形成する（それぞれレーン３および４）。レーン５、ＬＭＷｕＰＡ。Ｃ．スルホ－ＮＨＳ－酢酸で化学修飾された２５０ｎＭのＰＡＩ－１および３００ｎＭのＰＡＩ－１を、ＬＲＰ１を固定化したＳＰＲチップ上に注入した。Ｄ．９ｎＭのＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体および化学修飾されたＰＡＩ－１で形成された８０ｎＭの複合体を、ＬＲＰ１が固定化されたＳＰＲチップ上に注入した。

図２．ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合は、イオン強度に依存する。Ａ．漸増濃度のＮａＣｌを含む緩衝液中の漸増濃度のＰＡＩ－１を、ＬＲＰ－１が被覆されたＳＰＲチップ上に注入し、Ｒｅｑ値を決定した。データを、各ＮａＣｌ濃度についてＲｍａｘに正規化している。上の曲線から下へのＮａＣｌの濃度：１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭ。Ｂ．ＬＲＰ１に結合するＰＡＩ－１のＤｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロット。各イオン強度（１５０、２５０、５００、７５０、および１０００ｍＭのＮａＣｌ）におけるＫＤ値を、平衡ＳＰＲ測定によって測定した。３つの独立した実験を行い、プロットした値は平均±ＳＥである。１．５±０．１の傾きを、線形回帰分析によって決定した。傾きについては、個々の実験の線形回帰分析の結果を平均することによって、類似の値が得られた。

図３．ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合は、２価結合モデルによって十分に説明される。（Ａ）ＰＡＩ－１の２つの異なる領域のＬＲＰ１の相補的部位との相互作用に関する２価結合モデルの模式図。（Ｂ）漸増濃度のＰＡＩ－１（９．４、３７．５、７５、３００ｎＭ）を、ＬＲＰ１が結合したＳＰＲチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。データを２指数関数的減衰（青線）にフィッティングした。Ｃ．漸増濃度のＰＡＩ－１（３．９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５ｎＭ）をＬＲＰ１が結合したチップ上に注入した。実験データ（黒線）の２価結合モデルへのフィッティングは、青線で示す。示されたデータは、実施された６つの独立した実験の代表の実験である。

図４．ＬＲＰ１のクラスタＩＶへのＰＡＩ－１の結合は、２価結合モデルによくフィットする。（Ａ）ＬＲＰ１のドメイン構成を示す模式図。リガンド結合リピートのクラスタ（赤丸）をＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと標識した。（Ｂ）漸増濃度のＰＡＩ－１（９．４、１５．６、３１、６２．５、１２５ｎＭ）をＬＲＰ１クラスタＩＶが結合したＳＰＲチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。データを２指数関数的減衰にフィッティングした（青線）。Ｃ．漸増濃度のＰＡＩ－１（３．９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５ｎＭ）を、ＬＲＰ１クラスタＩＶが結合したチップ上に注入した。実験データ（黒線）の２価結合モデルへの適合は、青線で示す。示されたデータは、実施された３つの独立した実験の代表である。

図５．ＣＤＥ－０９６は、ＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合を阻害する。Ａ．１ｎＭのＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、ＣＤＥ－０９６の非存在下（上の曲線）および漸増濃度のＣＤＥ－０９６（１５．６、３１．２、６２．５、１２５、２５０、５００ｎＭ）存在下で、ＬＲＰ１が結合したＳＰＲチップ上に流した。Ｂ．パネルＡからの会合相（association phase）の最初の傾き対ＣＤＥ－０９６濃度のプロット。７０±１１ｎＭのＩＣ５０を、非線形回帰分析によって決定した。データは、２つの独立した実験の代表の実験である。

図６．ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合は、イオン強度に依存する。Ａ．漸増濃度のｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、漸増濃度のＮａＣｌの存在下で、ＬＲＰ－１が被覆したＳＰＲチップ上に流し、Ｒｅｑ値を決定した。データを、各ＮａＣｌ濃度についてＲｍａｘに正規化する。上の曲線から下へのＮａＣｌ濃度：１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭ。Ｂ．ＬＲＰ１に結合するＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＤｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロット。各イオン強度（１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭのＮａＣｌ）におけるＫＤ値を、平衡ＳＰＲ測定によって測定した。３つの独立した実験を行い、平均±ＳＥをプロットした。２．４±０．４の傾きを、線形回帰分析によって決定した。個々の実験の線形回帰分析の結果を平均することによって、同一の値が得られた。

図７．ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体は、複合体動態モデルを介してＬＲＰ１に結合する。Ａ）ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合を分析するために使用されるモデル。スキームＩにおいて、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１は、２価モデルを介して結合する。より高濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１では、結合の１価モデルが生じる（スキームＩＩ）。Ｂ）漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体（３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０ｎＭ）を、ＬＲＰ１が結合したチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。Ｂ．漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１（０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）をＬＲＰ１に結合したチップ上に注入した。スキームＩおよびＩＩを含むモデルへの実験データ（黒線）のフィッティングを示す（青線）。データは、３つの独立した実験の代表である。

図８．ＬＲＰ１のクラスタＩＶに結合するＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の動態解析。Ａ）漸増濃度のｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体（０．６、１．２、２．５、５、１０、２０、および４０ｎＭ）を、ＬＲＰ１に結合したチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。Ｂ）漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１（０．６、１．２、２．５、５、１０、２０および４０ｎＭ）をＬＲＰ１結合チップ上に注入した。実験データ（黒線）のスキームＩおよびＩＩモデル（青線）へのフィッティング。データは、３つの独立した実験の代表である。

図９．ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＬＲＰ１を介した細胞への取り込みは、リシン残基の変異を含むＰＡＩ－１と複合体を形成するときに低下する。Ｉ９１ＬＰＡＩ－１または示された変異体ＰＡＩ－１分子と形成された５ｎＭの１２５Ｉ標識したＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、過剰のＲＡＰの非存在下または存在下で、３７℃で６時間、ＷＩ－３８ヒト線維芽細胞とインキュベートした。インキュベーション後、内在化した複合体の量を定量した。実験は３回行った。

図１０．野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。

図１１．野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異体：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号４）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異体：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号５）が提供される。

図１２．野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃ核酸配列（配列番号６）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃアミノ酸配列（配列番号７）が提供される。

図１３は、ＭＤＩ－１００１がＡｒａｌａｓｔよりも良好に炎症性ｎｅｔｓを標的とすることを示す。

図１４は、Ａｒａｌａｓｔ、Ａｖｅｌｅｓｔａｔ、ＭＤＩ－１００２、ＭＤＩ－１００３、およびＭＤＩ－１００４のインビトロでの比較を示す。

図１５は、ＭＤＩ－１００３がＣＦ痰中のＮＥＴｓを標的とすることを示す。

図１６は、エラスターゼ活性を阻害剤濃度の関数として示す。

図１７は、ＭＤＩ－１００２が急性肺損傷から保護することを示す。

図１８は、ＭＤＩ－１００２が肺線維症から保護することを示す。

図１９は、ＭＤＩ－１００２がブレオマイシン後の回復を改善しないことを示す。

図２０は、吸入されたＭＤＩ－１００３が急性肺損傷から保護することを示す。

図２１は、ＭＤＩ－１００３がＭＤＩ－１００１よりも良好に肺線維症から保護することを示す。

図２２は、ＭＤＩ－１００３がブレオマイシン後の回復を改善することを示す。

図２３は、ＭＤＩ－１００２およびＭＤＩ－１００４のＦｃ融合体のコンストラクトを示す。

図２４は、ＭＤＩ－１００２およびＭＤＩ－１００４のＦｃ融合体の発現を示す。

図２５は、Ｆｃ融合体がＰＫを改善することを示す。

図２６は、ＬＲＰ１結合残基の変異がＤＮＡＮＥＴｓの存在下で好中球エラスターゼの阻害に影響を及ぼし、それによって、ＮＥＴｓにおけるクリアランス受容体、ＬＲＰ１との相互作用の減少、およびエラスターゼに対する活性の保持を実証することを示す。

〔定義〕
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｃドメイン」は、２つのＦｃドメイン単量体の二量体をいう。Ｆｃドメインは、少なくともＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含むヒトＦｃドメインに対して、少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％の配列同一性）を有する。Ｆｃドメイン単量体は、第２および第３の抗体定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメイン単量体はまた、ヒンジドメインを含む。Ｆｃドメインは、抗原認識領域（例えば、可変ドメインまたは相補性決定領域（complementarity determining region：ＣＤＲ））として作用することができる免疫グロブリンの任意の一部を含まない。野生型Ｆｃドメインでは、２つのＦｃドメイン単量体が２つのＣ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の相互作用、ならびに二量体化する２つのＦｃドメイン単量体のヒンジドメインの間に形成される１つ以上のジスルフィド結合によって二量化する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、「デッドＦｃドメイン」に典型的なエフェクター機能を欠くように変異され得る。特定の実施形態において、Ｆｃドメイン中のそれぞれのＦｃドメイン単量体は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるために、Ｃ_Ｈ２抗体定常ドメイン中にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＦｃドメインがＦｃドメインの二量体化を低減または阻害する１つ以上のアミノ酸置換を含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはＩｇＤを含む任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプであり得る。さらに、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインはまた、天然に存在しないＦｃドメイン、例えば、組み換えＦｃドメインであり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「融合」または「結合（attached）」は、化学的コンジュゲーション、組み換え法、および化学結合（例えば、アミド結合）を含む手段による、２つ以上の要素、成分、またはタンパク質ドメイン（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）の組み合わせまたは結合を記述するために使用される。例えば、直列に並んだ２つの単一ペプチドを融合させて、化学的コンジュゲーション、化学結合、ペプチドリンカー、または任意の他の共有結合の手段を介して、１つの連続したタンパク質構造（例えば、ポリペプチド）を形成することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単量体がアミド結合を介して一緒に共有結合されているアミノ酸残基である、単一のポリマーを表す。ポリペプチドは、天然に存在するか、組み換えであるか、または合成的に産生されるかのいずれかの任意のアミノ酸配列を包含することが意図される。

本明細書中で使用される場合、用語「ホモ二量体」は、２つの同一の巨大分子（例えば、タンパク質または核酸）によって形成される分子コンストラクトをいう。２つの同一の単量体は、共有結合または非共有結合によってホモ二量体を形成し得る。例えば、２つのＦｃドメイン単量体が同じ配列を含む場合、Ｆｃドメインは、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体であり得る。別の例では、Ｆｃドメイン単量体に融合したＰＡＩ－１変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、ホモ二量体中にＦｃドメインを形成する２つのＦｃドメイン単量体の相互作用を介してホモ二量体を形成し得る。

本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロ二量体」は、２つの異なる巨大分子（例えば、タンパク質または核酸）によって形成される分子コンストラクトをいう。２つの単量体は、共有結合または非共有結合によってヘテロ二量体を形成し得る。例えば、Ｆｃドメイン単量体に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む本明細書に記載のポリペプチドは、２つのＦｃドメイン単量体の相互作用を介してヘテロ二量体を形成し得、それぞれは、ヘテロ二量体中にＦｃドメインを形成する、異なるＰＡＩ－１変異体に融合されている。

本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するために必要な細胞成分（例えば、オルガネラ）を含むビヒクルをいう。核酸は、典型的には当技術分野で公知の従来技術（形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなど）によって宿主細胞に導入され得る核酸ベクターに含まれる。宿主細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）、または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞））であってもよい。

本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、異常なＮＥ活性および／または欠損したＡ１ＡＴ活性を有することを特徴とする任意の状態（例えば、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、肺気腫、ＡＲＤＳ、虚血再潅流、慢性膵炎、ＲＡ、ＤＩＣ、ＵＣ、クローン病、皮膚疾患）などの疾患を有する患者を治療する際に所望の治療効果を達成するために有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクトルを含む薬学的組成物の量をいう。用語「治療有効量」はまた、このような状態を有する患者を治療する際に所望の治療効果を達成するために有効な、本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクター、または本発明のポリペプチド、核酸、もしくはベクターを含む薬学的組成物の量をいう。特に、ポリペプチド、核酸、またはベクターの治療有効量は、有害な副作用を回避する。

本明細書中で使用される場合、用語「薬学的組成物」は、活性成分ならびに活性成分の投与方法への適合を可能にするための賦形剤および希釈剤を含む、医学または薬学的製剤を指す。本発明の薬学的組成物は、ポリペプチド、核酸、またはベクターと適合している薬学的に許容可能な成分を含む。薬学的組成物は、経口投与のための錠剤もしくはカプセル形態、または静脈内もしくは皮下投与のための水性形態であり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体または賦形剤」は、薬学的組成物中の賦形剤または希釈剤をいう。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合していなければならず、患者に有害であってはならない。本発明において、薬学的に許容される担体または賦形剤は、ＰＡＩ－１変異体、ポリペプチドをコードする核酸分子、またはそのような核酸分子を含むベクターを含むポリペプチドに十分な薬学的安定性を提供しなければならない。担体または賦形剤の性質は、投与様式によって異なる。例えば、静脈内投与のためには水溶液担体が一般的に使用され、経口投与のためには固形担体が好ましい。

本明細書中で使用される場合、用語「治療および／または予防する」は、本発明の方法および組成物を用いて、疾患（例えば、異常なＮＥ活性および／または欠損したＡ１ＡＴ活性を有することを特徴とする任意の状態（例えば、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、肺気腫））を治療および／または予防することを指す。一般的に、このような疾患を治療することは、対象が疾患を発症し、および／または既にその疾患を有すると診断された後に生じる。このような疾患を予防することは、対象が疾患を発症する危険性がある場合に行われる工程または手順をいう。対象は、医師により疾患を発症する症状または危険因子があると判断された徴候または軽度の症状を示すこと、または疾患を発症する家族歴もしくは遺伝的素因を有するがまだ疾患を発症していないことがある。

本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物（例えば、好ましくはヒト）をいう。哺乳動物としては、ヒト、ならびにサル、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの家畜および牧畜が挙げられるが、これらに限定されない。

〔発明の詳細な説明〕
ＩＰＦは、肺機能を劇的に制限し得る間質性瘢痕組織形成によって特徴付けられている。米国では約１３０，０００人のＩＰＦ患者が存在し、毎年推定３０，０００～４０，０００人の新規症例が診断されている（Ley,B., and Collard,H.R. 2013. Epidemiology of idiopathic pulmonary fibrosis. Clin. Epidemiol. 5:483-492; Lynch,J.P., III, et al., 2016. Idiopathic Pulmonary Fibrosis: Epidemiology, Clinical Features, Prognosis, and Management. Semin. Respir. Crit Care Med. 37:331-357を参照のこと）。ＩＰＦの診断後の平均余命は、一般的に３～５年である（Lederer, D.J., and Martinez, F.J., NEJM 2018; 378:1811-1823を参照のこと）。肺移植以外に有効な治療処置はない。ＩＰＦの進行を止める治療法の欠如は、重大な課題を提示し、主要な満たされていない医療ニーズである。現在承認されている２つの薬剤であるピルフェニドンおよびニンテダニブは疾患の進行を遅らせることが示されているが、進行を止めることはなく、失われた肺機能を回復させることはできない。そのため、ＩＰＦ治療のための新規治療法は、疾患管理に必要である。

本発明はＮＥを阻害すること、特にＮＥＴｓに結合したＮＥを阻害することができる変異ＰＡ１－Ｉポリペプチドを含む組成物を提供することによって、このニーズに対処する。

本発明は、ＮＥを阻害すること、特にＮＥＴｓに結合したＮＥを阻害することができる変異ＰＡ１－Ｉポリペプチドを含む組成物を提供することによって、このニーズに対処する。本明細書では、ビトロネクチンおよび／またはＬＲＰ１と結合する能力を減少させながら、ＮＥ活性を阻害することができるＰＡＩ－１変異体が提供される。実際、本発明のための実施形態を開発する過程で行われた実験は、そのようなＰＡＩ－１変異体がそのようなビトロネクチン結合に関与するＰＡＩ－１アミノ酸残基を改変（例えば、Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋ）することによってビトロネクチンとの結合能を阻害することによって、ＮＥ活性に関連する状態（例えば、ＩＰＦ）を治療するための改善された効果を有することを実証した。

本発明のための実施形態を開発する過程で行われた実験では、セルピンマッピング技術を利用し、ＮＥＴｓ環境内でＮＥを効率的に阻害可能なＮＥの阻害剤として、変異体型のＰＡ１－Ｉ（例えば、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有する）を同定した。このような変異体型のＰＡ１－Ｉは、ＮＥＴｓの主成分であるＤＮＡに結合したＮＥを不可逆的に阻害することが示された。ここで、ＦＤＡが承認したＡｒａｌａｓｔと商標付けられたヒト血漿由来のＡ１ＡＴは効果がない。特定の実施形態において、このような変異体型のＰＡＩ－１は、ヒトＩｇＧ－Ｆｃとさらに関連する。

先天的な免疫応答の一環として、好中球は、末梢血中に最も多く存在する白血球であり、感染に対する防御の最前部にある。好中球は、食作用によって、ならびに酸素依存性および酸素非依存性のメカニズムによって、微生物感染を効率的に除去する。最近、ＤＮＡ、ヒストン、および抗菌ペプチドから構成されるＮＥＴｓの放出という新しい好中球抗菌メカニズムが説明された。このような変異体型のＰＡＩ－１は、ＩＰＦにおけるかなりの量の肺機能の喪失（Obayashi,Y., et al., 1997Chest 112:1338-1343; Schaaf,B., et al., 2000 Respiration 67:52-59; Takemasa,A., et al., 2012 Eur. Respir. J 40:1475-1482; Kristensen,J.H., et al., 2015 BMC. Pulm. Med. 15:53を参照のこと）および他の破壊的な肺疾患（Gregory,A.D., et al., 2015 J Leukoc. Biol. 98:143-152を参照のこと）（例えば、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））の原因であるＮＥを特異的に標的とした初めての治療法を示す。より効果的な治療および疾患の逆転の可能性のあるこの見通しは、この奇病に苦しんでいる患者にとって非常に魅力的であろう。

このような変異体型のＰＡＩ－１の臨床適応には、特発性肺線維症（ＮＥ－ＮＥＴｓは肺線維芽細胞の分化を含む線維症の病因に関与するため）、ＣＯＰＤ（Grabcanovic-Musija, F., et al., 2015 Respir. Res. 16:59を参照のこと）、ＮＥ－ＮＥＴｓが上昇し、これらの疾患が明らかになると現在の治療選択肢が制限される肺疾患を示す嚢胞性線維症、肺気腫、ＡＲＤＳ、虚血再潅流、慢性膵炎、ＲＡ、ＤＩＣ、ＵＣ、クローン病、および皮膚疾患が含まれる。

したがって、本発明は、ビトロネクチン結合に関与するアミノ酸残基を改変（例えば、Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋ）および／またはＬＲＰ１結合に関与するアミノ酸残基（例えば、Ｋ２０７、Ｋ８８、およびＫ８０）を改変することによって、ＮＥ活性を阻害することができる一方、ビトロネクチンおよびＬＲＰ１との結合能が減少し、その結果、薬物動態（ＰＫ）の改善およびＮＥ活性に関連する状態（例えば、ＩＰＦ）を治療するための効果を改善する、ＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む（例えば、ＰＫを改善する目的のために）。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分は、ポリペプチドの安定性を増加させるか、または薬物動態を改善する。Ｆｃドメイン単量体に融合されたＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドはまた、２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を通して、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。本明細書に記載のＰＡＩ－１変異体は、ＮＥ活性を阻害することができ、ＮＥがＮＥＴｓ内に結合しているＮＥ活性を阻害することができる。本発明はまた、本明細書に記載のＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドを対象に投与することによって、対象における異常なＮＥ活性および／または欠損したＡ１ＡＴ活性を含む疾患および状態を治療する方法を含む。

エラスターゼは、活性化された好中球、およびマクロファージ、および単球によって放出されるセリンプロテイナーゼである。炎症反応の間、好中球は活性化され、エラスターゼを放出し、タンパク質分解を介して組織破壊を引き起こす。肺において、エラスターゼは弾性組織を分解し、肺気腫を引き起こす。エラスターゼはまた、嚢胞性線維症（ＣＦ）ならびに成体および乳児の両方の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）における悪化因子である。エラスターゼはまた、ＴＮＦ媒介性炎症（Massague, J. et al., Annu. Rev. Biochem. 62:515-541 (1993)を参照のこと）およびＨＩＶ感染（Bristow, C. L. et al., International Immunol. 7:239-249 (1995)に関与している。

エラスターゼは、プラスミノーゲンアクチベーターよりも広いスペクトルの反応度を有し、プラスミノーゲンアクチベーターの各々は、前駆体基質に優先的に作用してそれを活性化する。

エラスターゼに対する自然防御は、α_１アンチトリプシン（α_１ＡＴ）またはα_１プロテイナーゼインヒビター（α_１ＰＩ）と呼ばれるタンパク質である。α_１ＡＴが不足している患者、とりわけ喫煙者は、肺気腫を起こしやすい。さらに、喫煙は炎症を誘発する。このようなα_１ＡＴ欠損では、酵素は存在する（ＣＲＭ^＋）が、機能的に障害がある。さらに、正常な酵素を有する個人においてさえ、喫煙は、α_１ＡＴを直接的に不活性化する。したがって、エラスターゼの改善された阻害剤は、影響を受けやすい対象における肺気腫の予防のために、またはこの疾患および他の関連疾患に繋がる病態生理学的プロセスの回復のために、非常に望ましいであろう。

主要なＰＡＩは、血中の多くのプロテイナーゼインヒビター、ならびに無関係または未知の機能を有する他のタンパク質を含むセリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）遺伝子スーパーファミリーに属する（Gettins, P. G. W., and Olson, S. T. (2016) Inhibitory serpins. New insights into their folding, polymerization, regulation and clearance. Biochem. J. 473, 2273-2293を参照のこと）。セルピンは、共通の三次構造を共有し、共通の原種から進化してきた。セルピンは、凝固、線維素溶解、補体活性化、排卵、血管新生、炎症、新生物、ウイルス病原生、およびアレルギー性反応を含む多くのプロセスを調節する。

セルピンは、自殺阻害剤として作用し、標的プロテイナーゼと一度だけ反応してドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）安定複合体を形成する。これらの複合体は、解離して、α_１ＡＴ結晶構造に見られるものと同様の切断された阻害剤と共に遊離活性酵素を産生し得る（Gettins, P. G. W., and Olson, S. T. (2016) Inhibitory serpins. New insights into their folding, polymerization, regulation and clearance. Biochem. J. 473, 2273-2293を参照のこと）。

ＰＡＩ－１は、ＰＡ系の主要な調節因子の１つと考えられる。これは、５０ｋＤａの分子量を有する一本鎖糖タンパク質であり（Van Mourik J A et al., J Biol Chem (1984) 259:14914-14921を参照のこと）、そしてｔＰＡおよびｕＰＡの一本鎖形態および二本鎖形態について公知の最も効率的な阻害剤である（Lawrence D et al., Eur J Biochem (1989) 186:523-533を参照のこと）。ＰＡＩ－１はまた、プラスミンおよびトリプシンを阻害し（Hekman C M et al., Biochemistry (1988) 27:2911-2918を参照のこと）、トロンビンおよび活性化プロテインＣを阻害するが、効率ははるかに低い。

ＰＡＩ－１ｃＤＮＡは、典型的な分泌シグナル配列を含む４０２個のアミノ酸のタンパク質をコードする（Ny et al., supra; Ginsburg et al., 1986, supraを参照のこと）。細胞培養物から単離された成熟ヒトＰＡＩ－１は、ほぼ等しい大きさの３８１個および３７９個のアミノ酸の２つの変異体から構成される。図１０は、ヒト野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；ヒト野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；およびヒト成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）を提供する。

ＰＡＩ－１は、１５～２０％の炭水化物を含む３つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である（Van Mourik J A et al., supra）。成熟ＰＡＩ－１は、システイン残基を含まず、大腸菌由来の組み換えＰＡＩ－１の効率的な発現および単離を容易にする。大腸菌で産生されるＰＡＩ－１は、グリコシル化されていないが、機能的には天然のＰＡＩ－１と非常に類似している。組み換えＰＡＩ－１は、本質的に活性な形態で大腸菌から単離することができ（下記を参照のこと）、これは、哺乳動物細胞培養物から精製されたＰＡＩ－１と対照的である（Lawrence et al., 1989, supra; Hekman et al., 1988, supra）。

ＰＡＩ－１は、細胞によって産生され、培養培地中に分泌される際に活性型で存在し、時間とともに培養培地中に蓄積する不活性型または潜在型で存在する（Hekman C M et al, J Biol Chem (1985) 260:11581-11587, Levin E G et al, Blood (1987) 70:1090-1098を参照のこと）。活性型は、３７℃で約１時間の半減期で、自発的に潜在型に変換する（Lawrence et al., supra, Hekman et al., supra; Levin E G et al, 1987, supraを参照のこと）。

潜在型は、変性剤である負に荷電したリン脂質またはＶｎで処理することによって、活性型に変換することができる（Lambers et al, supra, Hekman et al, supra; Wun T-C et al, J Biol Chem (1989) 264:7862-7868を参照のこと）。ウサギに注入された潜在ＰＡＩ－１は、未知のメカニズムによりインビボで再活性化された。おそらくコンフォメーション変化による活性構造と潜在構造との間の可逆的な相互変換は、他のセルピンと比較してＰＡＩ－１の特有の特徴である。潜在型は、よりエネルギー的に有利であるように思われる。

潜在型のＰＡＩ－１の三次元構造を解いた。この構造において、反応中心ループのＮ末端側の全体はβシートＡ中に中心のストランドとして挿入され（Mottonen et al., supraを参照のこと）、これは、増加した安定性（Lawrence, D. A. et al., Biochemistry 33:3643-3648 (1994)を参照のこと）、ならびに阻害活性の欠如を説明している。

２つのプラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）および組織型プラスミノーゲンアクチベーターの活性は、線維素溶解および創傷治癒を調節するセリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）であるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ－１）によって調節され、血栓症および線維性疾患と関連している。セルピンは、セルピンの反応中心ループの切断に続く特有のメカニズムによってセリンプロテアーゼを阻害するように機能し、これはセルピンのコンフォメーション変化を誘導し、結果としてプロテアーゼ阻害を生じる（レビューについては、（Gettins, P. G. W., and Olson, S. T. (2016) Biochem. J. 473, 2273-2293）を参照のこと）。一旦、セルピンがプロテアーゼと複合体を形成すると、複合体は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）に結合することによって、肝臓中の血液循環から迅速に除去される（Kounnas, M. Z., Church, F. C., Argraves, W. S., and Strickland, D. K. (1996) J. Biol. Chem. 271, 6523-6529を参照のこと）。

ＬＲＰ１はもともと、アルファ_２－マクログロブリンプロテアーゼ複合体の除去に関与する肝臓受容体（Ashcom, J. D., et al., (1990) J. Cell Biol. 110, 1041-1048; Moestrup, S. K., and Gliemann, J. (1989) J. Biol. Chem. 264, 15574-15577を参照のこと）およびカイロミクロンレムナントリポタンパク質粒子の受容体（Rohlmann, A., et al., (1998) J. Clin. Invest. 101, 689-695を参照のこと）として同定された。そのエンドサイトーシスの役割に加えて、ＬＲＰ１はまた、種々のシグナル伝達経路を調節する（Gonias, S. L. (2018) Arter. Thromb Vasc Biol. 38, 2548-2549; Strickland, D. K., et al., (2014) Thromb. Vasc. Biol. 34, 487-498を参照のこと）。この大きな受容体の細胞外ドメインは、ＬＤＬａリピート、ＥＧＦ様リピート、およびβ－プロペラドメインのクラスタからなるモジュールから構成されている。新しく合成されたＬＲＰ１の細胞表面への効率的な送達には、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）と呼ばれる小胞体内在性シャペロンの関与を必要とする（Strickland, D. K., et al., (1991) J. Biol. Chem. 266, 13364-13369; Willnow, T. E., et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 4537-41; Bu, G., et al., (1995) EMBO J. 14, 2269-80を参照のこと）。

ＬＲＰ１が比較的高い親和性を有する多数の構造的に無関係なリガンドを認識するという事実は、リガンド／受容体相互作用の性質に関して疑問を提起している。これがどのように起こり得るかについての見識は、Ｋ２５６およびＫ２７０が、ＲＡＰの第３のドメインがＬＲＰ１に結合するために必須であるという認識から（Migliorini, M. M., et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, 17986-17992を参照のこと）、およびＬＤＬ受容体由来の２つのＬＤＬａリピートとの複合体におけるＲＡＰの第３ドメインの結晶構造（Fisher, C., et al., (2006) Mol. Cell. 22, 277-283を参照のこと）から生じる。これらの研究は、ＲＡＰのＫ２５６およびＫ２７０のε－アミノ基が受容体上に酸性ポケットを形成するＬＤＬａリピート内のアスパラギン酸残基のカルボン酸塩と塩架橋を形成することを明らかにした。現在まで、アルファ２－マクログロブリン（α_２Ｍ）を含むいくつかのリガンド（Arandjelovic, S., Hall, B. D., and Gonias, S. L. (2005) Arch. Biochem. Biophys. 438, 29-35を参照のこと）および血液凝固因子ＶＩＩＩ（van den Biggelaar, et al., (2015) J. Biol. Chem. 290, 16463-76; Young, P. A., et al., (2016) J. Biol. Chem. 291, 26035-26044を参照のこと）は、重要なリシン残基を含む相互作用を介してＬＲＰ１と相互作用する。

リシン残基は、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用に寄与するように思われている（Horn, I., et al., (1998) Thromb. Haemost. 1, 20-22; Rodenburg, K. W., et al., (1998) Biochem. J. 329, 55-63; Gettins, P. G. W., and Dolmer, K. (2016) J. Biol. Chem. 291, 800-812を参照のこと）が、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用を調査した研究の結果、矛盾するデータが得られた。第１に、ＰＡＩ－１対プロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１に対する相対的な親和性に関して疑問が存在する。ほとんどの研究は、プロテアーゼとの複合体中のＰＡＩ－１のみが、高い親和性でＬＲＰ１に結合することを実証した（Horn, I., et al., (1998) Thromb. Haemost. 1, 20-22; Stefansson, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6358-6366; Nykjaer, A., et al., (1992) J. Biol. Chem. 267, 14543-14546; Horn, I. R., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 13608-13613を参照のこと）。対照的に、他の研究（Gettins, P. G. W., and Dolmer, K. (2016) J. Biol. Chem. 291, 800-812; Jensen, J. K., et al., (2009) J. Biol. Chem. 284, 17989-17997を参照のこと）は、ＰＡＩ－１が単独で、ＬＲＰ１に由来する断片に高い親和性で結合することを報告している。第２に、プロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体がＰＡＩ－１単独よりも高い親和性でＬＲＰ１に結合するという所見に基づいて、何人かは、ＰＡＩ－１とのプロテアーゼ複合体の形成が、ＬＲＰ１によって認識されるＰＡＩ－１の潜在的エピトープを露出させることを提案した（Horn, I., et al., (1998) Thromb. Haemost. 1, 20-22; Stefansson, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6358-6366を参照のこと）。対照的に、他者はプロテアーゼ自体がＬＲＰ１と相互作用し、高親和性相互作用に寄与し得ることを主張した（Skeldal, S., et al., (2006) FEBS J. 273, 5143-5159を参照のこと）。最後に、多くの研究が、種々の塩基性残基がアラニンに変異した場合のＬＲＰ１に対するＰＡＩ－１の親和性の変化を報告している（Horn, I., et al., (1998) Thromb. Haemost. 1, 20-22; Stefansson, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6358-6366; Skeldal, S., et al., (2006) FEBS J. 273, 5143-5159を参照のこと）が、リシン残基が結合部位を構成するというコンセンサスはほとんどないように見受けられる。

本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験では、ＰＡＩ－１およびプロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相対的な結合親和性を明らかにした。さらに、プロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合が主にＰＡＩ－１の決定基に起因するかどうかを決定するための実験を行った。さらに、ＬＲＰ１へのそれらの結合に関与する標的プロテアーゼ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ））との複合体における遊離ＰＡＩ－１およびＰＡＩ－１中の特異的アミノ酸残基を決定するための実験を行った。実際に、変異解析により、ＬＲＰ１結合とＰＡＩ－１の低分子阻害剤であるＣＤＥ－０９６の結合部位との重複が明らかになり、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用においてはＫ２０７が、ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用においてはＫ２０７、Ｋ８８、およびＫ８０が重要な役割を果たしていた。

本発明のための実施形態を開発する過程で行われた実験では、セルピンマッピング技術を利用し、ＮＥＴｓ環境内でＮＥを効率的に阻害可能なＮＥの阻害剤として、変異体型のＰＡ１－Ｉ（例えば、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有する）を同定した。このような変異体型のＰＡ１－Ｉは、ＮＥＴｓの主成分であるＤＮＡに結合したＮＥを不可逆的に阻害することが示された。ここで、ＦＤＡが承認したＡｒａｌａｓｔと商標付けられたヒト血漿由来のＡ１ＡＴは効果がない。特定の実施形態において、このような変異体型のＰＡＩ－１は、ヒトＩｇＧ－Ｆｃとさらに結合する。

したがって、本発明は、ＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｆｃドメインの単量体または部分のＮ末端またはＣ末端に融合されたＰＡＩ－１変異体を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分は、ポリペプチドの安定性を増加させるか、または薬物動態を改善する。

いくつかの実施形態において、本発明はＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであって、当該変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、配列番号５に示されるように、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドであって、当該変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するポリペプチドであることを特徴とする。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内の以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインの単量体または部分と結合したＰＡＩ－１変異体は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを含む（配列番号７）。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、ＮＥを阻害すること、特に、ＮＥＴｓに結合したＮＥを阻害することが可能である。

図１１は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１の核酸配列（配列番号４）を提供し；野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号５）を提供する。

図１２は、野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃ核酸配列（配列番号６）を提供し；野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃアミノ酸配列（配列番号７）を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を増加させるために、免疫グロブリンのＦｃドメイン単量体またはＦｃドメインの断片に融合されたＰＡＩ－１変異体を含み得る。Ｆｃドメイン単量体に融合したＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドは、二量体中にＦｃドメインを形成する２つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を通して、二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成し得る。当該分野で従来から知られているように、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＣ末端に見られるタンパク質構造である。Ｆｃドメインは、Ｃ_Ｈ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体化される２つのＦｃドメイン単量体を含む。野生型Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶに結合する最小限の構成を形成する。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、「デッド」Ｆｃドメインに典型的なエフェクター機能を欠くように変異され得る。例えば、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用を最小限に抑えることが知られている特定のアミノ酸置換を含み得る。

本発明のポリペプチドは、宿主細胞から産生され得る。宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドおよび融合ポリペプチドをそれらの対応する核酸から発現させるために必要な細胞成分（例えば、オルガネラ）を含むビヒクルをいう。核酸は、当該分野で公知の従来技術（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、感染など）によって宿主細胞に導入され得る核酸ベクターに含まれ得る。核酸ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、真核生物（例えば、哺乳動物）または原核生物（例えば、細菌）由来のいずれかである。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当該分野で公知の種々の方法によって調製され得る。これらの方法としては、オリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異導入およびＰＣＲ変異導入が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、通常の技術（例えば、遺伝子合成）を用いて得られ得る。あるいは、野生型ＰＡＩ－１をコードする核酸分子が当該分野で通常の技術（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて、特定のアミノ酸置換を含むように変異させ得る。核酸分子は、ヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を用いて合成することができる。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、原核または真核宿主細胞において核酸分子を複製および発現することが可能なベクターに挿入され得る。多くのベクターは、当該分野で利用可能であり、本発明の目的のために使用され得る。各ベクターは、特定の宿主細胞との相溶性のために調節および最適化され得る種々の成分を含み得る。例えば、ベクター成分は、複製の起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、目的のタンパク質をコードする核酸配列、および転写終結配列を含み得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、本発明のための宿主細胞として使用され得る。哺乳動物細胞型の例としては、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内生的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、大腸菌細胞はまた、本発明のための宿主細胞として使用され得る。大腸菌株の例としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ－１０２５）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられるが、これらに限定されない。種々の宿主細胞は、タンパク質生成物の翻訳後の処理および修飾（例えば、グリコシル化）のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現されるポリペプチドの正確な改変および処理を確実にするように選択され得る。上述した発現ベクターは、当該分野における従来技術、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および直接マイクロインジェクションを用いて、適切な宿主細胞に導入され得る。一旦ベクターがタンパク質産生のために宿主細胞に導入されると、宿主細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なように改変された従来の栄養培地中で培養される。治療用タンパク質の発現方法は、当該分野において公知であり、例えば、Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed. 2004 and Vladimir Voynov and Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed. 2012を参照されたい。

本発明のポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、当該分野で公知であり、選択された宿主細胞の培養に適切な培地中で増殖され得る。哺乳動物宿主細胞に適した培地の例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ－１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に適した培地の例としては、選択剤（例えば、アンピシリン）などの必要なサプリメントが加えられたＬｕｒｉａｂｒｏｔｈ（ＬＢ）が挙げられる。宿主細胞は、約２０℃．～約３９℃．など（例えば、２５℃．～約３７℃．、好ましくは３７℃．）の適切な温度、および５～１０％などのＣＯ_２レベルで培養される。培地のｐＨは、一般的に、主に宿主生物に依存して、約６．８～７．４（例えば、７．０）である。誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適切な条件下で誘導される。

いくつかの実施形態において、使用される発現ベクターおよび宿主細胞に依存して、発現されたタンパク質は、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）から細胞培養培地中に分泌され得る。タンパク質回収は、細胞培養培地を濾過して、細胞残屑を除去することを含み得る。タンパク質はさらに精製され得る。本発明のポリペプチドは、タンパク質精製の分野で公知の任意の方法（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度）によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。例えば、タンパク質は、プロテインＡカラム（例えば、ＰＯＲＯＳプロテインＡクロマトグラフィー）とクロマトグラフィーカラム（例えば、ＰＯＲＯＳＨＳ－５０陽イオン交換クロマトグラフィー）などのアフィニティーカラム、濾過、限外濾過、塩析、および透析法を適切に選択し、組み合わせることによって単離および精製することができる。

他の実施形態において、宿主細胞は、発現されたタンパク質を回収するために、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解によって破壊され得る。一旦細胞が破壊されると、細胞残屑は、遠心分離または濾過によって除去され得る。いくつかの例において、ポリペプチドは、精製を容易にするために、マーカー配列（例えば、ペプチド）にコンジュゲートされ得る。マーカーアミノ酸配列の例は、ヘキサヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）であり、これは、マイクロモーラーの親和性でニッケルが官能基化されたアガロースアフィニティカラムに結合する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグが挙げられるが、これらに限定されない（Wilson et al., Cell 37:767, 1984を参照のこと）。

あるいは、本発明のポリペプチドは、例えば、遺伝子治療という文脈において、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター（ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクター）など）を投与することによって、対象（例えば、ヒト）の細胞によって産生され得る。ベクターは、対象の細胞内に入ると（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、感染などによって）、ポリペプチドの発現を促進し、次いで、ポリペプチドは細胞から分泌され得る。疾患または病気の治療が所望の結果である場合、さらなる処置は必要とされ得ない。タンパク質の収集が所望される場合、血液は対象から収集され得、タンパク質は当該分野で公知の方法によって血液から精製され得る。

本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＰＡＩ－１変異体（例えば、野生型ＰＡＩ－１（配列番号１）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するＰＡＩ－１変異体）を含むポリペプチド）を含む薬学的組成物であることを特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、治療用タンパク質として、Ｃ末端伸長（例えば、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の追加アミノ酸）を有するＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、治療用タンパク質としての部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、またはその二量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換を有するＦｃドメイン（例えば、二量体化を減少させる１つ以上の置換））に融合されたＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、第１の部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、またはその二量体、野生型Ｆｃドメイン、アミノ酸置換を有するＦｃドメイン（例えば、二量体化を減少させる１つ以上の置換））に融合されたＰＡＩ－１変異体を含むポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを含む本発明の薬学的組成物は、他の剤（例えば、治療用生物学的製剤および／もしくは小分子）または組成物と組み合わせて、治療において使用され得る。治療有効量のポリペプチドに加えて、薬学的組成物は、当業者に公知の方法によって製剤化することができる、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））、またはこのような核酸分子を含むベクターを含む。

薬学的組成物中の許容される担体および賦形剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒である。許容される担体および賦形剤は、緩衝液（リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、およびＴＡＥなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンなど）、防腐剤（塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール、および塩化ベンザルコニウムなど）、タンパク質（ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、および免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、ヒスチジン、およびリジンなど）、ならびに炭水化物（グルコース、マンノース、スクロース、およびソルビトールなど）を含み得る。本発明の薬学的組成物は、注射可能な製剤の形態で非経口的に投与することができる。注射用薬学的組成物は、無菌溶液または任意の薬学的に許容される液体をビヒクルとして用いて製剤化することができる。薬学的に許容されるビヒクルとしては、滅菌水、生理食塩水、および細胞培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α－改変イーグル培地（α－ＭＥＭ）、Ｆ－１２培地）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤化方法は当該分野で公知であり、例えば、Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing and Delivery Systems (3rd ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2015)を参照されたい。

本発明の薬学的組成物は、ヒドロキシルメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどのマイクロカプセル中で調製され得る。本発明の薬学的組成物はまた、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセルなどの他の薬物送達システムにおいて調製され得る。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22^thedition (2012)に記載されている。インビボ投与のために使用される薬学的組成物は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に行うことができる。

本発明の薬学的組成物はまた、徐放性製剤として調製され得る。徐放性製剤の適切な例としては、本発明のポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、含水ゲル、ポリアクタイド（polyactides）、Ｌ－グルタミン酸とｙ－エチル－Ｌ－グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。いくつかの徐放性製剤は、数ヶ月（例えば、１～６ヶ月）にわたって分子の放出を可能にし、一方、他の製剤は、より短い期間（例えば、数日～数週間）にわたって本発明の薬学的組成物を放出する。

薬学的組成物は、必要に応じて単位用量の形態で形成され得る。薬学的調製物に含まれる活性成分（例えば、本発明のポリペプチド）の量は、指定された範囲内の適切な投与量が与えられるような量である（例えば、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の投与量）。

遺伝子治療のための薬学的組成物は、許容される希釈剤中に存在することができ、または遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含むことができる。送達方法として流体力学的注入が使用される場合、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする核酸分子を含む薬学的組成物または核酸分子を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）は、大量の輸液で静脈内に迅速に送達される。インビボ遺伝子送達ビヒクルとして使用され得るベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、改変ワクシニアアンカラなどのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

治療用タンパク質として本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は、例えば、静脈内投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与のために製剤化され得る。薬学的組成物はまた、経口、経鼻、スプレー、エアロゾル、直腸、または膣投与のために製剤化され得るか、またはそれらを介して投与され得る。注射可能な製剤については、種々の有効な薬学的担体が当該分野で公知である。例えば、ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 18th ed. (2014)を参照のこと。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含む薬学的組成物、またはこのような核酸分子を含むベクターは、遺伝子送達によって投与され得る。遺伝子送達の方法は、当業者に周知である。インビボ遺伝子送達および発現に使用され得るベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は、対象に直接投与され得る。

本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸分子を含むベクターは、ハイドロダイナミック注入のプラットフォームを用いて投与され得る。ハイドロダイナミック注入法において、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子組み換えされたプラスミド（例えば、ウイルスプラスミド）中の強力なプロモーターの制御下に置かれる。プラスミドは、多くの場合、大量の輸液で静脈内に迅速に送達される。流体力学的注入は、制御された静脈内の流体力学的圧力を用いて、細胞透過性を増強するため、大量の輸液の迅速な注入から上昇した圧力は、静脈からの輸液およびプラスミドの溢出をもたらす。核酸分子の発現は、主に肝臓によって駆動される。マウスでは、尾静脈へのプラスミドの注入によって流体力学的注入が行われることが多い。特定の実施形態において、本明細書中に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は、流体力学的注入を用いて投与され得る。

本発明の薬学的組成物の投与量は、投与経路、治療される疾病、および対象の物理的特性（例えば、年齢、体重、全身の健康）を含む因子に依存する。本発明の薬学的組成物は、０．０１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｇ／ｋｇ）、より具体的な実施形態において、約０．１～約３０ｍｇ／ｋｇ、より具体的な実施形態において、約０．３～約３０ｍｇ／ｋｇの範囲の本発明のポリペプチドの投与量を含み得る。投与量は、疾患の程度および対象の異なるパラメータなどの従来の因子にしたがって、医師によって適合され得る。

薬学的組成物は、投薬処方と適合する様式で、そして症状の改善（improvement）または改善（remediation）をもたらすために治療的に有効であるような量で投与される。薬学的組成物は、種々の投薬形態、例えば、静脈内投薬形態、皮下投薬形態、および経口投薬形態（例えば、摂取可能な溶液、薬物放出カプセル）で投与される。一般的に、治療用タンパク質は、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１～５０ｍｇ／ｋｇで投与される。本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は、それを必要とする対象に、例えば、１回以上（例えば、１～１０回またはそれ以上）、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、四半期毎、隔年、毎年、または医学的に必要に応じて投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は、それを必要とする対象に、毎週、隔週、毎月、隔月、または四半期毎に投与され得る。投与量は、単回投与方式または複数回投与方式のいずれかで与えられ得る。投与の間のタイミングは、病状が改善するにつれて、または患者の健康が増加するにつれて、減少し得る。

本発明は、ヒトＰＡＩ－１由来の１つ以上の特定のアミノ酸を置換することにより、ＮＥ活性を阻害し、ＮＥがＮＥＴｓ内に結合しているＮＥ活性を阻害することが可能になるという発見に基づく。これらのＰＡＩ－１変異体の特性は、異常なＮＥ活性および／または欠損したＡ１ＡＴ活性によって特徴付けられる疾患の治療において使用され得る有用な治療薬を作製する。

別の態様において、本発明は、それを必要な対象におけるＮＥ活性を阻害する方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＮＥＴｓに結合したＮＥ活性を阻害する方法を特徴とする。当該方法は、本明細書に記載されるポリペプチド、核酸分子、もしくはベクトル、または本明細書に記載される薬学的組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む。

対象におけるＮＥ活性またはＮＥＴｓ内に結合したＮＥの活性を阻害する方法のいくつかの実施形態において、対象は、ＩＰＦおよび／または異常なＮＥ活性を特徴とする状態（例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫）を有する。対象におけるＮＥ活性またはＮＥＴｓ内に結合したＮＥの活性を阻害する方法のいくつかの実施形態において、対象は、Ａ１ＡＴ活性および／または発現欠損を有する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、ＩＰＦを有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、嚢胞性線維症を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、ＣＯＰＤを有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、肺気腫を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、虚血再潅流傷害を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、エタノール誘導慢性膵炎を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、関節リウマチ（ＲＡ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、クローン病を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、好中球病理を伴う皮膚疾患を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、Ａ１ＡＴ活性および／または発現欠損を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、異常なＮＥ活性および／または発現を有することを特徴とする任意の状態を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の、ポリペプチド、核酸分子、もしくはベクター、または本明細書に記載の薬学的組成物の、治療有効量を、欠損したＡ１ＡＴ活性および／または発現を有することを特徴とする任意の状態を有する対象に投与することによって、当該対象を治療する方法であることを特徴とする。

上記の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、対象は、異常なＮＥ活性を有することを特徴とする状態（例えば、ＩＰＦ、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、肺気腫）を有するか、または発症する危険性がある。

上記の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、対象は、欠損したＡ１ＡＴ活性および／または発現を有することを特徴とする状態を有するか、または発症する危険性がある。

当業者は、上記が単に、本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明を表すことを容易に認識するであろう。上述した組成物および方法の種々の改変および変更は、当該分野で利用可能な専門知識を用いて容易に達成することができ、本発明の範囲内である。

〔実験〕
〔実施例Ｉ．〕
本実施例において、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体がＰＡＩ－１単独よりも高い親和性でＬＲＰ１に結合することを実証する。

ＬＲＰ１に対するＰＡＩ－１およびプロテアーゼ：ＰＡＩ－１複合体の相対的な親和性に関する文献に存在する矛盾を解決するために、最初の実験は、遊離ＰＡＩ－１およびＬＭＷｕＰＡに複合したＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合を比較した。特に、ＬＭＷｕＰＡ自体はＬＲＰ１に結合しない。野生型ＰＡＩ－１は比較的不安定であり、潜在型に急速に変換するので、本実施例における実験およびすべてのその後の研究（特に指定しない限り）では、ＰＡＩ－１の安定性を２．０時間の半減期から１８．４時間に延長するＰＡＩ－１のＩ９１Ｌ変異体（Berkenpas, M. B., Lawrence, D. A., and Ginsburg, D. (1995) EMBO J. 14, 2969-77を参照のこと）を使用した。Ｉ９１ＬＰＡＩ－１とＬＭＷｕＰＡとの複合体を形成する実験を行い、平衡ＳＰＲ測定を用いて、当該複合体のＬＲＰ１への結合を遊離ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合と比較した。データ（図１Ａ）から、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体がＰＡＩ－１単独よりもＬＲＰ１にほぼ２桁強く結合することは明らかである（ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＫ_Ｄ＝０．９±０．２ｎＭ、一方ＰＡＩ－１のＫＤ＝７４±１３ｎＭ）。

〔実施例ＩＩ．〕
本実施例において、ＰＡＩ－１のリシン残基がＰＡＩ－１およびＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の両方のＬＲＰ１への結合に必須であることを実証する。

ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用に対するリシン残基の寄与を測定するために、これらの残基を、リシン残基の第１級アミンと安定な共有アミド結合を形成するスルホ－ＮＨＳ－アセテートで化学的に修飾した。この修飾は、ＰＡＩ－１がＬＭＷｕＰＡと安定な複合体を形成することを妨げない（図１Ｂ）。しかしながら、注目すべきことに、この修飾は、遊離ＰＡＩ－１（図１Ｃ）およびＬＭＷｕＰＡと修飾ＰＡＩ－１との複合体（図１Ｄ）の両方の結合がＬＲＰ１に結合することを妨げた。これらの結果から、ＰＡＩ－１のリシン残基がＰＡＩ－１およびＬＭＷｕＰＡ：ＰＡ１－１複合体の両方のＬＲＰ１への結合に寄与することは明らかである。

〔実施例ＩＩＩ．〕
本実施例において、２つの荷電残基がＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合に関与することを実証する。

次に、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合におけるイオン強度の効果を調べる実験を行った。これらの実験の結果から、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合がイオン強度に依存することは明らかである（図２Ａ）。図２Ｂは、Ｌｏｇ_１０Ｋ_Ｄをイオン強度に対してプロットした、Ｄｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロットの形でプロットされたデータを示す。これらの結果は、傾き（傾き＝１．５±０．１）によって示されるように、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との結合における２つのイオン相互作用の関与を示唆している。これは、リガンドにある特定のリシン残基の２つ（またはそれ以上）のε－アミノ基がＬＤＬａリピート内のアスパラギン酸残基のカルボン酸塩と塩架橋を形成する、ＬＤＬ受容体ファミリーメンバーへのリガンドの結合のための標準モデルと一致する（Fisher, C., et al., (2006) Mol. Cell. 22, 277-283）。

〔実施例ＩＶ．〕
本実施例において、動態解析がＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合についての２価モデルを支持することを実証する。

図２のデータは、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用における以上の２つの荷電残基の関与を示唆しており、高い親和性結合が、荷電残基をそれぞれ含むＰＡＩ－１の２つの領域の、ＬＲＰ１の２つのＬＤＬａリピートとの相互作用によって媒介されるアビディティー効果から生じる２価結合モデルの可能性を高めている（図３Ａ）。同様のモデルが、ＦＶＩＩＩのＬＲＰ１への結合について提案されている（１６）。このモデルを試験するために、表面プラズモン共鳴実験を用いて、Ｉ９１ＬＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合を調べる動態測定を行った。潜在的なメカニズムについての見識を得るために、最初に、ＬＲＰ１からのＰＡＩ－１解離の動態を、種々の濃度のリガンドで比較した（図３Ｂ）。これらの結果から、解離動態が２つの相：速い相とそれに続くはるかに遅い相で起こることは明らかである。さらに、２価モデルについて予想されるように、解離動態はリガンド濃度とは無関係である。実験データのフィッティングから決定された解離速度定数を、会合および解離動態が同時にグローバル２価モデルにフィットする場合の解離相についての初期推定値として使用した。このフィッティングによって、実験データが２価結合モデルによって十分に説明されることが明らかとなった（図３Ｃ）。最良のフィッティングからの動態データ（表Ｉ）から、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との急速な会合が複合体Ｉを形成し、複合体ＩＩへの変換が９７秒の半減期であることは明らかである。重要なことに、動態解析（６５±６ｎＭ）から導出された平衡結合定数Ｋ_Ｄの値は、ＳＰＲデータの平衡解析によって決定された５６±４ｎＭのＫ_Ｄ値に近い。Ｉ９１ＬＰＡＩ－１および野生型ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合の間に何らかの差が生じるかどうかを究明するために、野生型ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との詳細な結合動態も調べた。動態および平衡結合データを表Ｉにまとめ、Ｉ９１Ｌ安定変異体の速度定数およびＫ_Ｄ値と類似している野生型ＰＡＩ－１の速度定数およびＫ_Ｄ値を明らかにしている。

ＬＲＰ１のリガンド結合領域は、主にクラスタＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと呼ばれるＬＤＬａリピートのクラスタに局在する（図４Ａ）。これらのクラスタのうち、ほとんどのリガンドは、クラスタＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに結合する。したがって、クラスタＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶへのＰＡＩ－１の結合も調べた実験を行った。最初の実験から、Ｉ９１ＬＰＡＩ－１がクラスタＩＩおよびＩＶに対して類似の親和性で相互作用するが、クラスタＩＩＩに対してはるかに弱い親和性で相互作用することが明らかになった。次に、ＬＲＰ１の主要なリガンド結合領域であるクラスタＩＶを用いて、詳細な実験を行った。図４Ｂから、クラスタＩＶからのＰＡＩ－１の解離も２相で起こり、ＰＡＩ－１濃度とは無関係であることを確認している。実験データとのフィッティングの比較から、結合が２価結合モデルと一致することを明らかにしている（図４Ｃ）。最良のフィッティングパラメータを表Ｉにまとめ、ＳＰＲデータの平衡解析によって推定された４９±１８ｎＭのＫ_Ｄ値に近い動態データから導かれた５５±５ｎＭのＫ_Ｄ値が明らかになっている。したがって、これらの結果から、クラスタＩＶへのＩ９１ＬＰＡＩ－１の結合が全長ＬＲＰ１へのその結合に類似していることを明らかになっている。

〔実施例Ｖ．〕
本実施例において、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合におけるＫ２０７の重要な役割を実証する。

ＰＡＩ－１の化学修飾によってＬＲＰ１との相互作用におけるリシン残基の重要な役割を明らかにしたので、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合に寄与する特定のリシン残基を同定するために研究を始めた。ＰＡＩ－１のＬＲＰ１との相互作用に重要であり得るＰＡＩ－１の領域についてのさらなる見識を得るために、ＣＤＥ－０９６がＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合をブロックする可能性を試験した。ＣＤＥ－０９６は、ＰＡＩ－１に可逆的に結合し、アロステリック機構を介してＰＡＩ－１のプロテアーゼとの相互作用を阻害する小分子阻害剤である（Li, S.-H., et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E4941-9を参照のこと）。ＣＤＥ－０９６は、ｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体にも結合する。ＣＤＥ－０９６をＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体に加えた場合、ＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合の用量依存的阻害が観察された（図５Ａ）。７０ｎＭのＩＣ_５０を、ＣＤＥ－０９６濃度に対する会合曲線の最初の傾きを再プロットすることによって決定した（図５Ｂ）。

構造研究から、Ｋ２０７およびＫ２６３がＣＤＥ－０９６のＰＡＩ－１との結合に寄与することを明らかにしている（Li, S.-H., et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E4941-9を参照のこと）。したがって、クラスタＩＩからのＬＤＬａリピートへのＰＡＩ－１の結合に重要であると以前に同定されてきたＫ６９、Ｋ８０、およびＫ８８と共に、分析にＰＡＩ－１のこれらの変異体を含む実験を行った（Gettins, P. G. W., and Dolmer, K. (2016) J. Biol. Chem. 291, 800-812を参照のこと）。これらの研究では、ＳＰＲ平衡測定によってＫ_Ｄ値を決定し、そのデータを表ＩＩにまとめた。データは、Ｋ２０７のアラニンへの変異がＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合に最大の影響を及ぼし、親和性を１９倍低下させたことを実証している。さらに、Ｋ６９、Ｋ８０、およびＫ８８のアラニンへの変異はそれぞれ、ＬＰＲ１に対する親和性の７倍、７倍、および９倍の低下をもたらした。興味深いことに、Ｋ８０およびＫ２０７の両方に変異を有するＰＡＩ－１分子、またはＫ８０、Ｋ２０７、およびＫ８８がすべてアラニンに置換された変異体は、Ｋ２０７Ａ変異体単独のものよりも結合の親和性を実質的に低下させず、それぞれ２０倍および２１倍のＫ_Ｄの上昇をもたらした。

表ＩＩのデータはまた、ＰＡＩ－１の３次元構造に基づく特定の側鎖の比表面積を示す。側鎖基のアクセス可能な表面積の割合は、タンパク質の溶媒にアクセス可能な面積を、拡張されたＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙトリペプチド内の残基について計算されたアクセス可能な表面積で割ったものであり（Willard, L., et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31, 3316-3319を参照のこと）、１に近い値は完全にアクセス可能であり、ゼロに近い値は埋もれている。Ｒ７６ＥＰＡＩ－１変異体は、ＬＲＰ１結合が不十分である（Stefansson, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 6358-6366を参照のこと）。Ｒ７６は、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合に直接関与することが提案されている（Gettins, P. G. W., and Dolmer, K. (2016) J. Biol. Chem. 291, 800-812を参照のこと）。しかしながら、０．２４のＡＳＡ値から、この残基が埋もれており、ＬＲＰ１との直接的な相互作用に利用できないことを明らかにしている。同様に、以前の研究で関係があるとされていたＫ２６３およびＫ１２２も、部分的に構造に埋もれているので、ＬＲＰ１との直接的な相互作用には利用できない。

〔実施例ＶＩ．〕
本実施例において、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合が複雑なメカニズムを介して起こることを説明する。

ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡ１のＬＲＰ１への結合を特徴付けるために、結合のイオン強度依存性を調べる実験を行った。図６Ａに示される結果は、イオン強度に対する結合の有意な依存性を実証している。Ｄｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロット（図６Ｂ）は、２．４±０．３の傾きを生じ、結合における２～３イオン相互作用の関与を示唆している。

相互作用の動態を調べると、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のより高い濃度で解離速度が変化することが観察された（図７Ｂ）。これは図７Ｃのデータからも明らかであり、より速い解離がより高いＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１濃度で認められ、これは複数の結合機構を示唆している。これは、ＲＡＰドメインＤ１Ｄ２のＬＲＰ１への結合について以前に観察された（Prasad, J. M., et al., (2016) J. Biol. Chem. 291, 18430-18439を参照のこと）。したがって、実験に、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体がＬＲＰ１の第２の別個の部位に結合して１価の複合体を形成することができる第２のスキームもモデルに組み込んだ（複合体ＩＩＩ、図７Ａ、スキームＩＩ）。モデルを単純化するために、スキームＩＩにおけるｋ_ａ１およびｋ_ｄ１はスキームＩにおける最初の段階でｋ_ａ１とｋ_ｄ１とが同一であると仮定した。実験ＳＰＲデータをスキームＩおよびスキームＩＩの両方を含むモデルにフィッティングさせると、優れたフィッティングが得られ（図７Ｃ）、速度パラメータを表ＩＩＩにまとめた。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への高い親和性結合は、ＰＡＩ－１単独のＫ_Ｄよりも約１００倍大きいＫ_Ｄが確認され、これは主にＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の解離速度が遅いことに起因する（表ＩのＰＡＩ－１のｋ_ｄ１およびｋ_ｄ２を表ＩＩＩのＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のそれらの値と比較されたい）。

実験において、ＳＰＲチップ上に固定化されたＬＲＰ１のクラスタＩＶへのＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の結合も試験した。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１の全長ＬＲＰ１への結合と同様に、解離速度はリガンド濃度とは無関係ではないため（図８Ａ）、実験において、データを図７Ａに記載のモデルにフィッティングさせた。データはフィッティングによって十分に説明され（図８Ｂ）、これらのフィッティングから得られたパラメータを表ＩＩＩにまとめ、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体は、全長ＬＲＰ１よりもクラスタＩＶにわずかに弱く結合することを明らかにしている。これらの結果は、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体が、クラスタＩＶの外側にあるＬＲＰ１の領域とも相互作用し得ることを示唆する。

〔実施例ＶＩＩ．〕
本実施例において、ＰＡ１－Ｉ変異体がＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用にさらなる残基が関与していることを明らかにすることを実証する。

ＰＡＩ－１の類似のリシン残基がｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１との相互作用にも関与しているかどうかを決定するために、ＬＭＷｕＰＡと変異体ＰＡＩ－１分子との複合体も形成し、これらの複合体のＬＲＰ１への結合を測定する実験を行った。これらの研究の結果を表ＩＩにまとめている。興味深いことに、ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合とは異なり、ＰＡＩ－１の個々の変異体（Ｋ６９Ａ、Ｋ８８Ａ、およびＫ２０７Ａ）はＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合に最小限の影響しか与えなかったが、Ｋ８０Ａは５．８倍のＫ_Ｄの低下をもたらした。Ｋ８０ＡとＫ２０７Ａの二重変異を含むＰＡＩ－１分子は、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合を２３倍減少させた。驚くべきことに、Ｋ８０Ａ、Ｋ２０７Ａ、およびＫ８８Ａの三重変異は、２４４倍の親和性の低下をもたらし（表ＩＩ）、ＬＲＰ１への結合のためのＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体におけるこれらの３つの残基の重要な役割を明らかにした。

次に、実験において、二重または三重変異を含むＰＡＩ－１分子から形成されたＰＡＩ－１とＬＭＷｕＰＡとの複合体の細胞取り込みを試験した（図９）。その結果、ＬＭＷｕＰＡと複合体を形成した場合、ＰＡＩ－１の二重および三重変異体はＬＲＰ１を発現する細胞に効果的に取り込まれなかったことを明らかにしている。

〔実施例ＶＩＩＩ．〕
本実施例において、実施例Ｉ～ＶＩＩに利用される材料および方法を記載する。

（試薬）
ＬＭＷｕＰＡ、ＨＭＷｕＰＡ、ＷＴＰＡＩ－１ＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体およびＩ９１ＬＰＡＩ－１は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓから購入した。変異体ＰＡＩ－１タンパク質を、記載されるように産生し、精製した。ＬＲＰ１を、記載されるようにヒト胎盤から精製した（Ashcom, J. D., et al., (1990) J. Cell Biol. 110, 1041-1048を参照のこと）。ＬＲＰ１リガンド結合クラスタＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶは、ＲｎＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した。ＣＤＥ０９６は、記載されるように合成した（Li, S.-H., et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E4941-9を参照のこと）。Ｂｉａｃｏｒｅ研究に使用したＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体は、ＰＡＩ－１をＰＢＳ中１．２倍モル過剰のＬＭＷｕＰＡと共に室温で１時間インキュベートすることによって形成した。複合体形成は４～２０％トリス－ｇｌｙゲル（Ｎｏｖｅｘ）上でタンパク質を分析し、コロイドブルー染色で染色することによって確認した。

（Ｉ９１ＬＰＡＩ－１の化学修飾）
リシン側鎖中の第１級アミンをブロックするためのＩ９１ＬＰＡＩ－１の化学修飾を、Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－アセテート（Ｔｈｅｒｍｏ－ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。スルホ－ＮＨＳ－酢酸を５０ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解した。５５ｕｇのＩ９１ＬＰＡＩ１を、ＰＢＳ中のＩ９１ＬＰＡＩ－１中の全アミノ基に対して５０倍過剰のスルホ－ＮＨＳ－アセテートと共に４℃で３時間インキュベートした。改変Ｉ９１ＬＰＡＩ－１タンパク質を、ＮＡＰ（商標）－５ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて０．０１ＭＨＥＰＥＳ、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ７．４中で脱塩し、過剰のスルホ－ＮＨＳ－アセテートを除去した。

（表面プラズモン共鳴）
精製したＬＲＰ１を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の２０μｇ／ｍｌのＬＲＰ１の作業溶液を用いて、１０，０００応答単位のレベルまでＣＭ５センサチップ表面上に固定化した。ＬＲＰ１リガンド結合クラスタＩＶを、製造業者の説明書（ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ）に従って、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４中の２０μｇ／ｍｌのクラスタＩＶの作業溶液を用いて、２，０００応答単位のレベルまでＣＭ５センサチップ表面上に固定化した。追加のフローセルを活性化し、タンパク質を含まない１Ｍエタノールアミンでブロックして、対照表面として作用させた。特に明記しない限り、結合実験は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で行った。イオン強度依存性のために、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、．０００５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ、１ｍＭＣａＣｌ２と、様々な濃度のＮａＣｌ（０．１５Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、および１．０Ｍ）とを用いて、ｐＨ７．４の緩衝液を作製した。全ての実験は、２５℃、２０μｌ／分の流速で、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器で行った。１００ｍＭのリン酸を１００μｌ／分の流量で１５秒注入することによって、センサチップ表面を再生した。

（ＳＰＲデータ分析）
解離速度は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアを用いて２－expential減衰にフィッティングさせた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｈｏｔｗａｒｅで利用可能な数値積分アルゴリズムを用いて、動態データを２価モデル（スキーム１）に対して分析した：

式中、Ａはリガンドを表し（ＰＡＩ－１またはＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体）、ＢはＬＲＰ１を表し、ＡＢ１はサイト１のリガンド：ＬＲＰ１複合体を表し、ＡＢ２はサイト２のリガンド：ＬＲＰ１複合体を表す。フィッティング処理を容易にするために、ｋ_ｄ１とｋ_ｄ２の推定値を、２つの指数関数的減衰モデルにグローバルに解離データをフィッティングすることによって得た。次いで、これらの値を、フィッティング処理における初期推定値として用いた。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の場合、データは先に記載したように、以下のスキームにフィッティングさせた：

平衡結合データはＲｅｑを得るために、擬一次処理に会合速度をフィッティングさせることによって決定した。次いで、Ｒｅｑを全リガンド濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７．０４ソフトウェアにおける非線形回帰分析を用いて結合等温線にフィットさせた：
ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｌ／（ＫＤ＋Ｌ）
式中、Ｂｍａｘは飽和時のＲｅｑ値であり、Ｌは遊離リガンド濃度であり、ＫＤは平衡結合定数である。遊離リガンド濃度はこれらの実験では未知であるので、この式の使用は、添加されたリガンドの総量がＳＰＲチップに結合したＬＲＰ－１に結合したリガンドの量よりもはるかに多いと仮定している。

（ＣＤＥ－０９６による阻害）
ＨＭＷｕＰＡ－ＰＡＩ－１複合体を、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．０００５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ、０．１％のＤＭＳＯ、０～５００ｎＭのＣＤＥ－０９６を含むｐＨ７．８中で２ｎＭに希釈した。ＢｉａｃｏｒｅにおけるＬＲＰ１への結合は、泳動緩衝液が０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．０００５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔＰ、０．１％のＤＭＳＯ、ｐＨ７．８であったこと以外は、上記のように行った。

（細胞によるＬＭＷｕＰＡＰＡＩ－１複合体の取り込み）
ＷＩ３８細胞を、予めポリ－Ｄ－リジンヒドロブロミド（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした１２ウェル組織培養プレートにプレーティングした。ヨウ素化された複合体で処理する前に、細胞をアッセイ緩衝液（ＤＭＥＭ、１％のＢＳＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）中で１時間インキュベートした。ＬＭＷｕＰＡを、１ｍＭの６－アミノカプロン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ中のＩｏｄｏ－ｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、Ｉ－１２５ヨウ化ナトリウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＮＥＺ０３３）でヨウ素化した。ヨウ素化されたタンパク質を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳ中で脱塩して遊離ヨウ素を除去した。標識された複合体を、Ｉ９１ＬＰＡＩ－１およびその変異体（０．８ｕＭ）をＩ－１２５ＬＭＷｕＰＡ（０．４ｕＭ）と共に室温で１時間インキュベートすることによって形成した。得られた複合体を、アッセイ緩衝液単独または１ｕＭＲＡＰを含むアッセイ緩衝液中で５ｎＭに希釈し、３７℃で６時間細胞上に置いた。培地を除去し、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５０ｕｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むトリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５－０５２０）で処理した。細胞を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを計数して内在化したモルを決定した。

〔実施例ＩＸ．〕
本実施例において、大腸菌における野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを有するＰＡＩ－１変異体（以下、「ＭＤＩ－１００３）の精製を記載する。

上清を遠心清澄化した２００ｍｌのＭＤＩ－１００３ファーメンターライセートを、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．６に対して透析し、次いで、室温で約０．５ｍｌ／分の流速でヘパリン－セファロース６Ｂカラム（１０×５．０ｃｍ）においてクロマトグラフィーにかけた。ヘパリン－セファロース６Ｂカラムを、２Ｌの０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．６で洗浄した後、同じ緩衝液中の１．０Ｍの塩化ナトリウムへの６００ｍｌ勾配溶出を行った。ＰＡＩ－１含有画分をプールし、固体硫酸アンモニウムを１８％飽和まで加えた。０．０５Ｍのリン酸カリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．６、３０％の飽和硫酸アンモニウム中で予め平衡化したフェニル－セファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＬｏｗＳｕｂ）カラム（１０×２．５ｃｍ）において、室温で約０．５ｍｌ／分の流速で、ＰＡＩ－１をクロマトグラフィーにかけた。フェニル－セファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラムを、５００ｍｌの０．０５Ｍのリン酸カリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．６、３０％の飽和硫酸アンモニウムで洗浄した後、同じ緩衝液中の０％硫酸アンモニウムへの４００ｍｌの勾配溶出を行った。ＰＡＩ－１含有画分をプールし、固体硫酸アンモニウムを６５％飽和まで加えることによって沈殿させた。沈殿物を０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの塩化ナトリウム、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．６で３．５ｍｇ／ｍｌに溶解し、次いで同じ緩衝液に対して大規模に透析した。ヘパリン－セファロース６Ｂカラム後の収率は、８０ｍｇのタンパク質を含む９０ｍｌであった（レーン１）。フェニル－セファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラム後の収率は、４７ｍｇのタンパク質を含む８０ｍｌであった（レーン２）。最終収量は、３８ｍｇの高度に精製されたＨＰＡＩ－ＡＶＩ－ＡＫタンパク質を含む１２ｍｌであった。

〔実施例Ｘ．〕
（エラスターゼ濃度のためのＣＦ痰滴定）
ＣＦ患者由来の痰を、１ｇ痰あたり２ｍＬの冷ＰＢＳ中で抽出し、次いで、滑らかになるまで手でホモジナイズする。１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し（４℃）、エラスターゼ滴定のために上清（sup）を保存する。次に、精製したＨＮＥを４０ｎＭに希釈し、０、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、および２０ｕＬを各ウェル（黒いプレート）に加え、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０で量を１００ｕＬにする。５００ｕＭのＭｅＯＳｕｃ－ＡＡＰＶ－ＡＭＣ１００ｕＬを加え、速度論的に１０分ｅｘ３７０ｅｍ４４０を読み取る。傾きおよび切片に注意されたい。

ＣＦ痰を希釈し、各ウェルに０、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、および２０ｕＬを加え、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣＬ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０で体積を１００ｕＬにし、５００ｕＭのＭｅＯＳｕｃ－ＡＡＰＶ－ＡＭＣ１００ｕＬを加え、速度論的に１０分のｅｘ３７０、ｅｍ４４０を読み取る。精製したＨＮＥの傾きおよび切片を用いて、ＣＦ痰中のエラスターゼ濃度を逆算する。

（ＩＣ_５０／速度）
５０ｎＭのＨＮＥまたはＣＦ痰＋／－サケ精子ＤＮＡまたはヘパリンを室温で３０分間インキュベートする。ブラックプレート（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ－２０で希釈）中にエラスターゼ阻害剤を段階的に希釈し、最終容量を９０ｕＬとする。１０ｕＬのＨＮＥ／ＤＮＡ／ヘパリンを上記から９０ｕＬの阻害剤に加える。必要に応じて、３０秒間、１分間、２分間、またはそれ以上、室温でインキュベートする。５００ｕＭのＭｅＯＳｕｃＡＡＰＶ－ＡＭＣ１００ｕＬを各ウェルに加え、速度論的に１０分ｅｘ３７０、ｅｍ４４０を読み取る。

（ｅ速度計算）
Ｋ_ｏｂｓ＝Ｌｎ（ｎＭエラスターゼ残量／ｎＭエラスタンス開始））／時間（秒）
阻害剤の濃度およびＶ_ｍａｘおよびＫ_ｍに対してプロットされたＫ_ｏｂｓは、非線形フィットミカエリス－メンテンによって決定される。

Ｋ_ｉ＝Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ
（ＡＶＩおよびＡＶＩ－ＡＫのＰＫ試験）
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスに２０ｍｇ／ｋｇを静脈内（ＩＶ）ボーラス投与し、ＡＶＩまたはＡＶＩ－ＡＫの薬物動態特性を評価した。血液を０．５、１、２、６、および２４時間後に採取し、血漿中のＰＡＩ－１の量を測定した。

（ＬＰＳ注射による急性肺水腫）
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄８週齢）にＬＰＳ（２ｍｇ／ｍＬで２５マイクロＬ）を気管内注入し、続いてビヒクル、ＡＶＩ、ＡＶＩ－ＡＫ、またはアラスト（１．３ｍｇ／ｍＬで３０マイクロＬ）を気管内治療した。１８時間後、動物をＰＢＳ潅流し、湿潤肺重量および総エラスターゼを得た。

（肺抽出と均質化）
全肺湿重量を得る。０．４ＭのＨｅｐｅｓ２５０ｕＬ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１％のＴｘ－１００を加え、ホモジナイザーで高速で１分間粉砕する。１０，０００×ｇ（４℃）で１０分間遠心分離し、新しい管に上清を移し、１０，０００×ｇ１０分間再スピンさせる。アッセイのために新しいチューブに上清を移す。

（線維症アッセイ）
線維症アッセイは、本質的に記載の通りであった（Blood, 2011, 118:2313-2321）。簡潔には、重量および年齢が一致した（６～８週齢で１８～２２ｇ）ＷＴマウスを、０日目に、１回用量の気管内ブレオマイシン（５０Ｌの無菌ＰＢＳ中１．１５ｕ／ｋｇ）で処理して、肺線維症を誘導した。１日目に開始して、マウスに、ＭＤＩ－１００１、ＭＤＩ－１００２、ＭＤＩ－１００３、または生理食塩水のいずれかを１日２回投与して（４ｍｇ／ｋｇＩＰ）、急性損傷相（acute injury phase）を治療する。２１日目にマウスを屠殺し、記載のヒドロキシプロリン測定値から肺線維症を決定する（Blood, 2011, 118:2313-2321を参照のこと）。

（ＨＦｃ－ＡＶＩ－ＡＫ発現ベクターおよびトランスフェクトＣＨＯ細胞株の構築）
部位特異的変異導入（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＫｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）によってヒトＰＡＩ－１ｃＤＮＡの成熟形態に以下の変異を導入した：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖ。変異体Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖ、Ｉ９１Ｌ（ＡＶＩ）は安定した活性ＰＡＩ－１表現型を伝えるのに対し、変異体Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ（ＡＫ）は還元ビトロネクチン結合フェノタイプを導入する。改変ｃＤＮＡ（ＡＶＩ－ＡＫと命名）を、ヒンジ領域配列（ＨＦｃ）を含むドメイン２および３からなるヒト免疫グロビン（ＩｇＧ１）定常領域からなるＮ末端融合ペプチド配列を有するｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴプラスミドにクローニングした。コンストラクトの完全性は、制限消化物スクリーニングおよびＤＮＡ配列決定により確認した。検証したＨＦｃ－ＡＶＩ－ＡＫ融合プラスミドをＧｅｎｅＪｕｉｃｅ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）Ｆｌｐ－Ｉｎ細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にｐＯＧ４４プラスミド（Ｆｌｐ組み換え酵素遺伝子を有する）を９：１の割合で同時トランスフェクトし、融合タンパク質配列の単一コピーの組み込みを促進した。トランスフェクトした細胞を３７℃、６％のＣＯ２で４８時間インキュベートした後、１００ｕｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加えて、組み込まれたＡＶＩ－ＡＫｃＤＮＡを有する細胞を選択した。Ｈａｍ’ｓＦ１２培地（１０％のウシ胎児血清およびハイグロマイシンを補充）中でのトランスフェクト細胞の選択および増殖に続いて、細胞培養物を無血清培地（ＣＨＯｇｒｏ、ＭｉｒｕｓＢｉｏ）中での増殖に適応させて、非接着増殖を促進し、細胞密度を増幅し、精製を単純化した。タンパク質発現は、構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって調節され、したがって、ＨＦｃ－ＡＶＩ－ＡＫを含有する細胞上清媒体を、下流処理のために約３～５日ごとに回収した。

（ＨＦｃ－ＡＶＩ－ＡＫの精製）
条件培地をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で１：１に希釈して、ＰＢＳ中で平衡化した１５～２０ｍｌのタンパク質Ａ／タンパク質Ｇレジンを含むカラムに適用し、次いでＰＢＳで十分に洗浄した。結合した融合タンパク質を、０．１Ｍのグリシン、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０で溶出し、０．５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６に集めて、ｐＨを安定化させ、＞９５％の純粋なタンパク質を得た。次いで、タンパク質溶出液を、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．６中で平衡化したヘパリンセファロースに直ちに適用し、次いで洗浄し、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．６で溶出した。この第２の工程は、ＰＡＩ－１の特有の特性を利用して、タンパク質を濃縮し、＞９９％の純度を達成している。

（結果）
－ＭＤＩ－１００１－野生型成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の安定化変異を有するＰＡＩ－１変異体：Ｉ９１Ｌ、およびＮＥ阻害を可能にする変異体Ｖ３４３ＡおよびＲ３４６Ｖ
－ＭＤＩ－１００２－ＭＤＩ－１００１変異体を有するＦｃ融合タンパク質
－ＭＤＩ－１００３－ＰＡＩ－１のビトロネクチン結合機能を無効にする野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内にさらなる変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを有するＭＤＩ－１００１のＰＡＩ－１変異体
－ＭＤＩ－１００４－ＭＤＩ－１００３変異体を有するＦｃ融合タンパク質
図１３は、ＭＤＩ－１００１がＡｒａｌａｓｔよりも良好に炎症性ｎｅｔｓを標的とすることを示す。

図２５は、Ｆｃ融合体がＰＫを改善することを示す。

図２６は、好中球エラスターゼプラスまたはマイナスＤＮＡＮＥＴに対する阻害曲線を示す。このデータは、好中球エラスターゼに対する最適な活性を与えた変異がクリアランス受容体への結合を減少させる表ＩＩに示される変異の各々と組み合わせることができることを示す。その結果、分子の薬物動態が改善される。全部で７つの変異体があり、６つは単一の受容体結合変異を有し、１つは２つの受容体結合変異を有する。後者の二重変異体は、クリアランス受容体結合においてさらに大きな減少の可能性のある変異を組み合わせることができることを示している。これらは、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖの変異も含む。

各変異体のＭＤＩの名称は以下の通りである：
Ｋ６９ＡはＭＤＩ－１００５である
Ｋ８０ＡはＭＤＩ－１００６である
Ｋ８８ＡはＭＤＩ－１００７である
Ｋ１７６ＡはＭＤＩ－１００８である
Ｋ２０７ＡはＭＤＩ－１００９である
Ｋ２６３ＡはＭＤＩ－１０１０である
Ｋ６９Ａ－Ｋ２０７ＡはＭＤＩ－１０１１である
これらの変異は、ＤＮＡの存在下でＮＥＴ結合および好中球エラスターゼの阻害を保持しながら、クリアランス受容体への結合の低下を実証している。好ましい変異はＫ２０７Ａであるが、これは遊離阻害剤のクリアランス受容体結合を１９倍減少させるが、阻害されたプロテアーゼ複合体の結合を１．６倍しか減少させないからである（本願の表ＩＩを参照のこと）。これにより、この変異を有する阻害剤の薬物動態は有意に増加するが、阻害後でもエラスターゼ複合体の除去が可能である。

本発明を完全に説明してきたが、本発明の範囲またはその任意の実施形態に影響を及ぼすことなく、広範かつ同等の範囲の条件、製剤、および他のパラメータ内で同じことを実施できることが、当業者には理解されるであろう。本明細書に記載された全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。

〔参照による組み込み〕
本明細書で言及される特許文献および科学論文（本明細書に記載される参考文献が挙げられるが、これらに限定されない）の各々の開示全体はすべての目的のために、参照により組み込まれる。

〔等価物〕
本発明は、その精神または本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態内で実施されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で説明される本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の同等の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。

ＰＡＩ－１およびＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合に対するＰＡＩ－１のリシン残基の必須の役割。Ａ．ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体および遊離ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合はＳＰＲによって分析し、Ｒｅｑ値は平衡測定によって決定した。３つの独立した実験を行い、平均±ＳＥをプロットした。ＫＤ値（ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１については０．９±０．２ｎＭ、ＰＡＩ－１については７４±１３ｎＭ）を非線形回帰分析によって決定した。Ｂ．ＰＡＩ－１（レーン１）および化学修飾ＰＡＩ－１（レーン２）は、ＬＭＷｕＰＡと複合体を形成する（それぞれレーン３および４）。レーン５、ＬＭＷｕＰＡ。Ｃ．スルホ－ＮＨＳ－酢酸で化学修飾された２５０ｎＭのＰＡＩ－１および３００ｎＭのＰＡＩ－１を、ＬＲＰ１を固定化したＳＰＲチップ上に注入した。Ｄ．９ｎＭのＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体および化学修飾されたＰＡＩ－１で形成された８０ｎＭの複合体を、ＬＲＰ１が固定化されたＳＰＲチップ上に注入した。ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合は、イオン強度に依存する。Ａ．漸増濃度のＮａＣｌを含む緩衝液中の漸増濃度のＰＡＩ－１を、ＬＲＰ－１が被覆されたＳＰＲチップ上に注入し、Ｒｅｑ値を決定した。データを、各ＮａＣｌ濃度についてＲｍａｘに正規化している。上の曲線から下へのＮａＣｌの濃度：１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭ。Ｂ．ＬＲＰ１に結合するＰＡＩ－１のＤｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロット。各イオン強度（１５０、２５０、５００、７５０、および１０００ｍＭのＮａＣｌ）におけるＫＤ値を、平衡ＳＰＲ測定によって測定した。３つの独立した実験を行い、プロットした値は平均±ＳＥである。１．５±０．１の傾きを、線形回帰分析によって決定した。傾きについては、個々の実験の線形回帰分析の結果を平均することによって、類似の値が得られた。ＰＡＩ－１のＬＲＰ１への結合は、２価結合モデルによって十分に説明される。（Ａ）ＰＡＩ－１の２つの異なる領域のＬＲＰ１の相補的部位との相互作用に関する２価結合モデルの模式図。（Ｂ）漸増濃度のＰＡＩ－１（９．４、３７．５、７５、３００ｎＭ）を、ＬＲＰ１が結合したＳＰＲチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。データを２指数関数的減衰（青線）にフィッティングした。Ｃ．漸増濃度のＰＡＩ－１（３．９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５ｎＭ）をＬＲＰ１が結合したチップ上に注入した。実験データ（黒線）の２価結合モデルへのフィッティングは、青線で示す。示されたデータは、実施された６つの独立した実験の代表の実験である。ＬＲＰ１のクラスタＩＶへのＰＡＩ－１の結合は、２価結合モデルによくフィットする。（Ａ）ＬＲＰ１のドメイン構成を示す模式図。リガンド結合リピートのクラスタ（赤丸）をＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと標識した。（Ｂ）漸増濃度のＰＡＩ－１（９．４、１５．６、３１、６２．５、１２５ｎＭ）をＬＲＰ１クラスタＩＶが結合したＳＰＲチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。データを２指数関数的減衰にフィッティングした（青線）。Ｃ．漸増濃度のＰＡＩ－１（３．９、７．８、１５．６、３１．２、６２．５、１２５ｎＭ）を、ＬＲＰ１クラスタＩＶが結合したチップ上に注入した。実験データ（黒線）の２価結合モデルへの適合は、青線で示す。示されたデータは、実施された３つの独立した実験の代表である。ＣＤＥ－０９６は、ＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合を阻害する。Ａ．１ｎＭのＨＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、ＣＤＥ－０９６の非存在下（上の曲線）および漸増濃度のＣＤＥ－０９６（１５．６、３１．２、６２．５、１２５、２５０、５００ｎＭ）存在下で、ＬＲＰ１が結合したＳＰＲチップ上に流した。Ｂ．パネルＡからの会合相（association phase）の最初の傾き対ＣＤＥ－０９６濃度のプロット。７０±１１ｎＭのＩＣ５０を、非線形回帰分析によって決定した。データは、２つの独立した実験の代表の実験である。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合は、イオン強度に依存する。Ａ．漸増濃度のｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、漸増濃度のＮａＣｌの存在下で、ＬＲＰ－１が被覆したＳＰＲチップ上に流し、Ｒｅｑ値を決定した。データを、各ＮａＣｌ濃度についてＲｍａｘに正規化する。上の曲線から下へのＮａＣｌ濃度：１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭ。Ｂ．ＬＲＰ１に結合するＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＤｅｂｙｅ－Ｈｕｃｋｅｌプロット。各イオン強度（１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、および１０００ｍＭのＮａＣｌ）におけるＫＤ値を、平衡ＳＰＲ測定によって測定した。３つの独立した実験を行い、平均±ＳＥをプロットした。２．４±０．４の傾きを、線形回帰分析によって決定した。個々の実験の線形回帰分析の結果を平均することによって、同一の値が得られた。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体は、複合体動態モデルを介してＬＲＰ１に結合する。Ａ）ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体のＬＲＰ１への結合を分析するために使用されるモデル。スキームＩにおいて、ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１は、２価モデルを介して結合する。より高濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１では、結合の１価モデルが生じる（スキームＩＩ）。Ｂ）漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体（３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０ｎＭ）を、ＬＲＰ１が結合したチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。Ｂ．漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１（０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎＭ）をＬＲＰ１に結合したチップ上に注入した。スキームＩおよびＩＩを含むモデルへの実験データ（黒線）のフィッティングを示す（青線）。データは、３つの独立した実験の代表である。ＬＲＰ１のクラスタＩＶに結合するＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体の動態解析。Ａ）漸増濃度のｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体（０．６、１．２、２．５、５、１０、２０、および４０ｎＭ）を、ＬＲＰ１に結合したチップ上に注入した。各濃度の解離をＳＰＲデータから測定し、ｔ＝０での初期値を１００％に正規化した。Ｂ）漸増濃度のＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１（０．６、１．２、２．５、５、１０、２０および４０ｎＭ）をＬＲＰ１結合チップ上に注入した。実験データ（黒線）のスキームＩおよびＩＩモデル（青線）へのフィッティング。データは、３つの独立した実験の代表である。ＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１のＬＲＰ１を介した細胞への取り込みは、リシン残基の変異を含むＰＡＩ－１と複合体を形成するときに低下する。Ｉ９１ＬＰＡＩ－１または示された変異体ＰＡＩ－１分子と形成された５ｎＭの１２５Ｉ標識したＬＭＷｕＰＡ：ＰＡＩ－１複合体を、過剰のＲＡＰの非存在下または存在下で、３７℃で６時間、ＷＩ－３８ヒト線維芽細胞とインキュベートした。インキュベーション後、内在化した複合体の量を定量した。実験は３回行った。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号１）；野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号２）；および成熟野生型ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）が提供される。野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異体：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１核酸配列（配列番号４）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異体：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号５）が提供される。野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃ核酸配列（配列番号６）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃアミノ酸配列（配列番号７）が提供される。野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃ核酸配列（配列番号６）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃアミノ酸配列（配列番号７）が提供される。野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するポリペプチドをコードする成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃ核酸配列（配列番号６）；ならびに野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する成熟変異体ＰＡＩ－１／Ｆｃアミノ酸配列（配列番号７）が提供される。図１３は、ＭＤＩ－１００１がＡｒａｌａｓｔよりも良好に炎症性ｎｅｔｓを標的とすることを示す。図１４は、Ａｒａｌａｓｔ、Ａｖｅｌｅｓｔａｔ、ＭＤＩ－１００２、ＭＤＩ－１００３、およびＭＤＩ－１００４のインビトロでの比較を示す。図１５は、ＭＤＩ－１００３がＣＦ痰中のＮＥＴｓを標的とすることを示す。図１６は、エラスターゼ活性を阻害剤濃度の関数として示す。図１７は、ＭＤＩ－１００２が急性肺損傷から保護することを示す。図１８は、ＭＤＩ－１００２が肺線維症から保護することを示す。図１９は、ＭＤＩ－１００２がブレオマイシン後の回復を改善しないことを示す。図２０は、吸入されたＭＤＩ－１００３が急性肺損傷から保護することを示す。図２１は、ＭＤＩ－１００３がＭＤＩ－１００１よりも良好に肺線維症から保護することを示す。図２２は、ＭＤＩ－１００３がブレオマイシン後の回復を改善することを示す。図２３は、ＭＤＩ－１００２およびＭＤＩ－１００４のＦｃ融合体のコンストラクトを示す。図２４は、ＭＤＩ－１００２およびＭＤＩ－１００４のＦｃ融合体の発現を示す。図２５は、Ｆｃ融合体がＰＫを改善することを示す。図２６は、ＬＲＰ１結合残基の変異がＤＮＡＮＥＴｓの存在下で好中球エラスターゼの阻害に影響を及ぼし、それによって、ＮＥＴｓにおけるクリアランス受容体、ＬＲＰ１との相互作用の減少、およびエラスターゼに対する活性の保持を実証することを示す。図２６は、ＬＲＰ１結合残基の変異がＤＮＡＮＥＴｓの存在下で好中球エラスターゼの阻害に影響を及ぼし、それによって、ＮＥＴｓにおけるクリアランス受容体、ＬＲＰ１との相互作用の減少、およびエラスターゼに対する活性の保持を実証することを示す。

Claims

野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖの１つ以上を有するプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ－１）変異体を含む、ポリペプチド。
前記変異体は、Ｆｃドメインの単量体または部分に結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。
前記変異体は、Ｆｃドメインまたは部分に結合されている、請求項２に記載のポリペプチド。
前記変異の少なくとも１つは、Ｋ２０７Ａ、Ｋ８８Ａ、およびＫ８０Ａから選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
Ｆｃドメインまたは部分に結合されている前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有するか、
ｂ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを有するか、
ｃ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｋ６９Ａ、Ｋ８０Ａ、Ｋ８８Ａ、Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ１７６Ａ、Ｋ２０７Ａ、Ｋ２６３Ａ、Ｖ３４３Ａ、およびＲ３４６Ｖを有するか、または
ｄ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ２０７Ａ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する、
請求項４に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドは、
ａ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列を有するか、
ｂ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｒ１０１ＡおよびＱ１２３Ｋを有するか、
ｃ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有するか、または
ｄ）野生型ヒト成熟ＰＡＩ－１アミノ酸配列（配列番号３）内に以下の変異：Ｉ９１Ｌ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１２３Ｋ、Ｋ２０７Ａ、Ｖ３４３Ａ、Ｒ３４６Ｖを有する、
請求項１に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドは、以下の特徴
ａ）好中球エラスターゼ（ＮＥ）活性を阻害することができる、
ｂ）ビトロネクチンに結合する能力が減少する、および
ｃ）ＬＲＰ１に結合する能力が減少する、
のうち１つ以上を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドは、好中球エラスターゼ活性を阻害することができ、
前記好中球エラスターゼは、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）内に結合している、
請求項１に記載のポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
請求項９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
請求項１に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、請求項９に記載の核酸分子または請求項１０に記載のベクターを含み、
前記核酸分子または前記ベクターは、前記宿主細胞において発現される、宿主細胞。
請求項１に記載のポリペプチドを調製する方法であって、
前記方法は、
ａ）請求項１１に記載の核酸分子または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞を準備する工程、および
ｂ）ポリペプチドの形成を可能にする条件下で、前記宿主細胞中で前記核酸分子または前記ベクターを発現させる工程を含む、方法。
請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、または請求項１０に記載のベクター、および１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
前記ポリペプチドは治療有効量である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
ＮＥ活性の阻害を必要とする対象におけるＮＥ活性を阻害する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
前記対象は、ＩＰＦ、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、肺気腫、虚血再潅流障害、エタノール誘発慢性膵炎、関節リウマチ（ＲＡ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病、または好中球病理を伴う皮膚疾患を有する、請求項１５に記載の方法。
前記対象は、異常なＮＥ活性および／または欠損したＡ１ＡＴ活性を有することを特徴とする任意の疾患を有する、請求項１５に記載の方法。
ＩＰＦを有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
嚢胞性線維症を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
ＣＯＰＤを有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
肺気腫を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
虚血再潅流障害を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
エタノール誘発慢性膵炎を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
関節リウマチ（ＲＡ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
クローン病を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
好中球病理を伴う皮膚疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、または請求項１３に記載の薬学的組成物の、治療有効量を前記対象に投与する、方法。