BR112020023168A2 - proteína de fusão de fviii aprimorada e uso da mesma - Google Patents
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Abstract
proteína de fusão de fviii aprimorada e uso da mesma. trata-se de uma proteína de fusão de fator de coagulação viii que é conjugada com polialquileno glicol e que tem uma meia-vida cíclica prolongada, um método de preparação para a mesma e um uso da mesma, em que a fração ativa do fator de coagulação viii é diretamente ligada ou indiretamente ligada por um ligante de peptídeo a um parceiro de fusão, e a proteína de fusão é adicionalmente conjugada a um polialquileno glicol. a meia-vida é significativamente aumentada em comparação com uma proteína de fusão de fviii modificada sem polialquileno glicol.
Description
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente chinesa 201810481941.X depositado no Escritório de patentes chinês em 18 de maio de 2018, intitulado "IMPROVED FVIII FUSION PROTEIN AND USE THEREOF", cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0002] A presente revelação se refere ao campo de proteínas de fusão de fator de coagulação VIII humanas recombinantes, em particular, a um polipeptídeo de fusão com meia-vida prolongada, e um método de preparação e uso da mesma.
[0003] A hemofilia A é um transtorno de sangramento hereditário causado pela atividade insuficiente ou disfunção de fator de coagulação VIII (FVIII), e pela qual, o suplemento de FVIII ativo é um tratamento terapêutico eficaz. O gene de FVIII é um dos genes mais longos clonados até o momento, e a molécula de FVIII é um fármaco proteico com o maior peso molecular usado na prática clínica. A proteína de FVIII compreende 6 domínios: três domínios A (A1, A2, A3), um domínio central não essencial (domínio B) e dois domínios C (C1, C2). O nível de expressão de FVIII recombinante in vitro é significativamente menor que aquele de outros genes com propriedades semelhantes. Por exemplo, o nível de expressão de FVIII é apenas 1 % daquele de FIX. Além disso, devido à meia-vida curta de FVIII no sangue, apenas 8-12 horas, pacientes com hemofilia A grave devem receber tratamento preventivo e devem ser injetados intravenosamente (i.v.) cerca de 3 vezes por semana.
[0004] Uma proteína de fusão de Fc de FVIII recombinante híbrido de monômero e dímero (Eloctato) desenvolvido pela Bioverativ (EUA) foi aprovada para comercialização pelo FDA dos EUA em junho de 2014. Os dados clínicos mostram que sua meia-vida no corpo humano é apenas estendido em 1,5 a 1,7 vezes (Dumont JA et al., Blood, 2012, 119: 3024-3030; Powell JS et al., Blood, 2012, 119: 3031-3037), e a injeção é necessária a cada 3 a 5 dias. No entanto, em células HEK-293 transfectadas com vetor de expressão duplo de rFVIII Fc e Fc construído por Bioverativ, homodímeros de rFVIIIFc não foram detectados nos produtos de expressão conforme esperado, e apenas a proteína de fusão de rFVIIIFc hídrida de monômero e dímero e dímero de Fc foram expressos. Para isso, os pesquisadores das empresas especularam que, a célula hospedeira falhou em secretar a proteína de homodímero de rFVIIIFc com um peso molecular de cerca de 400 kDa devido ao peso molecular excessivo do homodímero, ou os monômeros de rFVIIIFc falharam em polimerizar devido ao impedimento estérico. (Peters RT et al., J Thromb Haemost, 2013, 11(1): 132-41). Pode-se ver que a produção de proteína de fusão de FVIII na forma de homodímero é um tanto difícil.
[0005] Para a preparação de formulações de ação prolongada de fármacos proteicos, os polímeros com alta solubilidade (como polietileno glicol (PEG)) são convencionalmente usados para modificar quimicamente a superfície dos fármacos proteicos. Em geral, quanto maior a taxa de modificação, mais óbvia a redução da antigenicidade e atividade da proteína. Exemplos de uso de polietileno glicol (PEG) para prolongar a meia-vida de FVIII foram relatados, por exemplo, Novonordisk (N8-GP), Bayer
(BAY94-9027) e Baxter (Bax 855), todos, desenvolveram produtos de FVIII de ação prolongada PEGilados que entraram na pesquisa clínica. No entanto, os dados da pesquisa farmacocinética mostraram que FVIII PEGilados não obtiveram uma meia-vida significativamente prolongada (Tiede A et al., J Thromb Haemost. 2013; 11: 670-678); (Coyle T et al., Haemophilia. 2012; 18( Supl 3): 22); (Turecek PL et al., Hamostaseologie, 2012, 32 Supl 1: S29-38).
[0006] As estratégias para desenvolver fármacos proteicos de ação prolongada incluem glicosilação, PEGilação, formação de proteína de fusão com albumina, transferrina, Fc, XTEN e assim por diante. Atualmente, os fármacos de ação prolongada comerciais usam apenas uma das estratégias acima para prolongar a meia-vida da proteína. Não há relato na literatura quanto a combinação de duas ou mais das estratégias acima, especialmente a combinação de PEGilação e fusão com proteína, e não há literatura relatando que duas ou mais estratégias possam tornar a meia-vida mais longa do que quando uma única estratégia é adotada.
[0007] Pacientes com hemofilia precisam de uma transfusão por toda a vida de fatores de coagulação para parar o sangramento e impedir o sangramento. Portanto, pesquisadores buscam constantemente fatores de coagulação com uma meia-vida mais longa para reduzir o número de administrações. Além disso, como manter a boa atividade biológica enquanto estende a meia-vida é um problema difícil enfrentado pelos pesquisadores.
[0008] Após anos de pesquisa e experimentos a longo prazo, os inventores constataram que, quando o fator de coagulação VIII for fundido com um parceiro de fusão (como segmento de Fc,
albumina, XTEN ou transferrina), e a proteína de fusão resultante é adicionalmente conjugada com um polímero, como polialquileno glicol, por exemplo, PEG, incluindo mPEG, que pode efetivamente aprimorar a estabilidade da proteína in vivo, especialmente quando a parte conjugada tiver uma estrutura ramificada, e quando o peso molecular da parte conjugada for maior ou igual a 35 kDa, como 40 kDa. Com base nisso, a presente revelação foi concluída.
[0009] A presente revelação fornece as seguintes soluções técnicas.
[0010] 1. Uma proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, que é uma proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, em que o fator de coagulação VIII (FVIII) como fração ativa é diretamente ligada ou indiretamente ligada por um ligante de peptídeo a um parceiro de fusão para prolongar a meia-vida para formar a proteína de fusão, e a proteína de fusão é adicionalmente conjugada a um polialquileno glicol.
[0011] 2. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com uma modalidade, em que o fator de coagulação VIII como a fração ativa é derivado de seres humanos, como fator de coagulação VIII humano truncado ou de comprimento total (por exemplo, fator de coagulação VIII deletado de domínio B humano); em que o fator de coagulação VIII humano truncado ou de comprimento total pode conter 1 ou mais mutações de aminoácido, contanto que ainda retenha a atividade de FVIII, por exemplo, o fator de coagulação VIII como a fração ativa compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 2, ou tem pelo menos 90 %, 95 % ou maior identidade com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 2.
[0012] 3. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com uma outra modalidade, em que o parceiro de fusão é um fragmento Fc de imunoglobulina, albumina, transferrina ou XTEN, e o parceiro de fusão é derivado de, por exemplo, ser humano, de preferência, um fragmento Fc de IgG, por exemplo, um fragmento Fc de IgG com efeito de ADCC reduzido e/ou efeito de CDC e/ou afinidade de ligação intensificada com o receptor de FcRn, com mais preferência, um fragmento Fc de IgG que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
[0013] (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3,
[0014] (ii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e
[0015] (iii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5.
[0016] 4. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com algumas modalidades, em que
[0017] o polialquileno glicol é polipropileno glicol ou polietileno glicol;
[0018] o polialquileno glicol pode ser capeado na extremidade, por exemplo, capeado na extremidade com um grupo alcóxi como metóxi;
[0019] o polialquileno glicol é linear ou ramificado, de preferência, ramificado, por exemplo, polietileno glicol ramificado, especialmente polietileno glicol terminado em metóxi especialmente ramificado;
[0020] o peso molecular do polialquileno glicol pode ser ≥1, ≥10, ≥20, ≥30, ≥40 , ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥110, ≥120,
≥130, ≥140, ≥150 ou ≥160 kDa, por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 kDa, ou entre quaisquer dois dos valores.
[0021] 5. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com algumas modalidades, em que a posição de conjugação da proteína de fusão e polialquileno glicol está em uma posição aleatória ou específica, e a posição de conjugação é selecionada a partir do grupo que consiste em um grupo amino livre, grupo sulfidrila, grupo açúcar e/ou grupo carboxila, de preferência, grupo amino livre.
[0022] 6. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com uma outra modalidade, em que um modificador, ou seja, polialquileno glicol ou um polialquileno glicol modificado nesse relatório descritivo, é usado para a conjugação, e o modificador pode estar na forma de um éster ativado, por exemplo, o modificador é selecionado a partir de modificadores representados pela fórmula (1), (2) e (3): (1)
[0023] em que 0≤m1≤6, e m1 é, de preferência, 5; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi;
(2)
[0024] em que 0≤m2≤6, e m2 é, de preferência, 2; 0≤m3≤6, e m3 é, de preferência, 1; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi; ou (3)
[0025] em que, 0≤m4≤6, e m4 é, de preferência, 2; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi.
[0026] 7. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com algumas modalidades, em que a fração ativa de fator de coagulação VIII está ligada ao parceiro de fusão por meio de um ligante de peptídeo, e o ligante de peptídeo inclui um segmento de peptídeo flexível e/ou um segmento de peptídeo rígido, por exemplo, incluindo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dos segmentos de peptídeo rígido.
[0027] 8. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com uma outra modalidade, em que o segmento de peptídeo flexível compreende 2 ou mais resíduos de aminoácido selecionados dentre glicina, serina, alanina e treonina,
[0028] de preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma fórmula geral (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d, em que a, b, c e d são números inteiros maiores ou iguais a 0, e a+b+c+d≥1,
[0029] com mais preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
[0030] (i) GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6);
[0031] (ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 7);
[0032] (iii) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8);
[0033] (iv) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9); e
[0034] (v) GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 10).
[0035] 9. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com algumas modalidades, em que o segmento de peptídeo rígido é o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana, ou o segmento de peptídeo rígido tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana; o segmento de peptídeo rígido pode compreender 1, 2 ou mais sítios de glicosilação;
[0036] de preferência, o segmento de peptídeo rígido compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
[0037] (i) PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 11);
[0038] (ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 12);
[0039] (iii) SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 13); e
[0040] (iv) SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14);
[0041] com mais preferência, o ligante de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
15.
[0042] 10. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do conjugado da presente revelação, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0043] 11. Um método para prevenir e/ou tratar doenças hemorrágicas, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do conjugado da presente revelação ou a composição farmacêutica da presente revelação, em que as doenças hemorrágicas são, de preferência, selecionadas dentre doenças hemorrágicas em pacientes com deficiência congênita ou adquirida de FVIII, e sangramento espontâneo ou cirúrgico em pacientes com hemofilia A.
[0044] 12. Um método para aprimorar a meia-vida de fator de coagulação VIII, em que a fração ativa de fator de coagulação VIII é diretamente ligada ou indiretamente ligada por um ligante de peptídeo a um parceiro de fusão para prolongar a meia-vida, e então, é adicionalmente conjugada a um polialquileno glicol.
[0045] 13. O método de acordo com uma modalidade, em que o parceiro de fusão é um fragmento Fc de imunoglobulina, albumina, XTEN ou transferrina, e o parceiro de fusão é derivada a partir de, por exemplo, ser humano, de preferência, um fragmento Fc de IgG, por exemplo, um fragmento Fc de IgG com efeito de ADCC reduzido e/ou efeito de CDC e/ou afinidade de ligação intensificada com o receptor de FcRn, com mais preferência, um fragmento Fc de IgG que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
[0046] (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3,
[0047] (ii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e
[0048] (iii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5.
[0049] 14. O método de acordo com algumas modalidades, em que
[0050] o polialquileno glicol é polipropileno glicol ou polietileno glicol;
[0051] o polialquileno glicol pode ser capeado na extremidade, por exemplo, capeado na extremidade com um grupo alcóxi como metóxi;
[0052] o polialquileno glicol é linear ou ramificado, de preferência, ramificado, por exemplo, polietileno glicol ramificado, especialmente polietileno glicol terminado em metóxi especialmente ramificado;
[0053] o peso molecular do polialquileno glicol pode ser ≥1, ≥10, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥110, ≥120, ≥130, ≥140, ≥150 ou ≥160 kDa, por exemplo, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 kDa, ou entre quaisquer dois dos valores.
[0054] 15. O método de acordo com algumas modalidades, em que a conjugação da proteína de fusão e polialquileno glicol está em uma posição aleatória ou específica, e a posição de conjugação é selecionada a partir do grupo que consiste em um grupo amino livre, grupo sulfidrila, grupo açúcar e grupo carboxila, de preferência, grupo amino livre.
[0055] 16. O método de acordo com algumas modalidades, em que um modificador, que é, polialquileno glicol ou um polialquileno glicol modificado nesse relatório descritivo, é usado para a conjugação e, de preferência, o modificador pode estar na forma de um éster ativado, com mais preferência, o modificador é selecionado dentre modificadores representados pela fórmula (1), (2) e (3)
[0056] em que qualquer modificador na forma de éster ativado é usado para a conjugação, por exemplo, o modificador é selecionado dentre modificadores representados pela fórmula (1), (2) e (3): (1)
[0057] em que 0≤m1≤6, e m1 é, de preferência, 5; mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi; e o peso molecular do modificador na fórmula (1) é entre 5 a 60 kDa; (2)
[0058] em que 0≤m2≤6, e m2 é, de preferência, 2; 0≤m3≤6, e m3 é, de preferência, 1; mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi; e o peso molecular do modificador na fórmula (2) é entre 5 a 100 kDa, de preferência, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, com mais preferência, 40 kDa; (3)
[0059] em que, 0≤m4≤6, e m4 é, de preferência, 2; mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi; e o peso molecular do modificador na fórmula (3) é entre 5 a 100 kDa.
[0060] 17. O método de acordo com algumas modalidades, em que o fator de coagulação VIII está ligado ao parceiro de fusão por meio de um ligante de peptídeo, e o ligante de peptídeo inclui um segmento de peptídeo flexível e/ou um segmento de peptídeo rígido, por exemplo, incluindo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dos segmentos de peptídeo rígido.
[0061] 18. O método de acordo com uma modalidade, em que o segmento de peptídeo flexível compreende 2 ou mais resíduos de aminoácido selecionados dentre glicina, serina, alanina e treonina,
[0062] de preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma fórmula geral (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d, em que a, b, c e d são números inteiros maiores ou iguais a 0, e a+b+c+d≥1,
[0063] com mais preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
[0064] (i) GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6);
[0065] (ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 7);
[0066] (iii) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8);
[0067] (iv) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 9); e
[0068] (v) GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 10).
[0069] 19. A proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol de acordo com algumas modalidades, em que o segmento de peptídeo rígido é o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana, ou o segmento de peptídeo rígido tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana; o segmento de peptídeo rígido pode compreender 1, 2 ou mais sítios de glicosilação;
[0070] de preferência, o segmento de peptídeo rígido compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre:
[0071] (i) PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 11);
[0072] (ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 12);
[0073] (iii) SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 13); e
[0074] (iv) SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14);
[0075] com mais preferência, o ligante de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
15.
[0076] A fim de explicar as modalidades da presente revelação e as soluções técnicas da técnica anterior mais claramente, o que segue introduzi brevemente os desenhos que precisam ser usados nas modalidades e na técnica anterior. Obviamente, os desenhos na descrição a seguir representam apenas algumas modalidades da presente revelação. Para aqueles de habilidade comum na técnica, outras modalidades podem ser obtidas com base nesses desenhos sem trabalho criativo.
[0077] A Figura 1A mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc (FF-0) sem modificação de mPEG.
[0078] A Figura 1B mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc modificada com mPEG de 5 kDa de peso molecular (FF-5L).
[0079] A Figura 1C mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc modificada com mPEG de 10 kDa de peso molecular (FF-10L).
[0080] A Figura 1D mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc modificada com mPEG de 20 kDa de peso molecular (FF-20L).
[0081] A Figura 1E mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc modificada com mPEG de 30 kDa de peso molecular (FF-30L).
[0082] A Figura 1F mostra os resultados da detecção de SEC-HPLC de FVIII-Fc modificada com mPEG de 40 kDa de peso molecular (FF-40L).
[0083] A Figura 2A mostra os resultados de detecção de SEC-HPLC de FVIII-Linker1-Fc (FL1F-0) sem modificação de mPEG (pureza>99 %, agregado <1 %).
[0084] A Figura 2B mostra os resultados de detecções de SEC-HPLC de FVIII-L1-Fc modificado com mPEG de 20 kDa de peso molecular (FL1F-20L) (pureza>95 %, agregado <5 %, não reticulado <1 %).
[0085] A Figura 2C mostra os resultados de detecções de SEC-HPLC de FVIII-L1-Fc modificado com linear, 30 kDa de mPEG (FL1F-30L) (pureza>95 %, agregado <5 %, não reticulado <1 %).
[0086] A Figura 2D mostra os resultados de detecção de SEC-HPLC de FVIII-L1-Fc modificado com linear, 40 kDa de mPEG (FL1F-40L) (pureza>95 %, agregado <5 %, não reticulado <1 %).
[0087] A Figura 2E mostra os resultados de detecção de SEC-HPLC de FVIII-L1-Fc modificado com linear, 50 kDa de mPEG (FL1F-50L) (pureza>95 %, agregado <5 %, não reticulado <1 %).
[0088] A Figura 2F mostra os resultados de detecções de SEC-HPLC de FVIII-L1-Fc modificado com 40 kDa de mPEG em formato de Y (FL1F-40Y) (pureza>95 %, agregado <5 %, não reticulado <1 %).
[0089] A Figura 3A mostra os resultados da detecção de SDS-PAGE da solução de estoque de hFVIII-Fc (FF-0) sem modificação de mPEG antes e depois da troca com G25 (sendo que
H representa as condições de redução, F representa as condições de não redução).
[0090] A Figura 3B mostra os resultados da detecção de SDS-PAGE (não redução) de hFVIII-Fc reticulado com mPEG com pesos moleculares diferentes (FF-5L a FF-40L).
[0091] A Figura 3C mostra os resultados da detecção de SDS-PAGE (redução) de hFVIII-Fc reticulado com mPEG com pesos moleculares diferentes (FF-5L a FF-40L).
[0092] A fim de tornar os objetivos, soluções técnicas e vantagens da presente revelação mais claras, o que segue descreve adicionalmente a presente revelação em detalhes com referência aos desenhos e às modalidades. Obviamente, as modalidades descritas são apenas uma parte das modalidades da presente revelação, em vez de todas as modalidades. Com base nas modalidades da presente revelação, todas as outras modalidades obtidas por aqueles de habilidade comum na técnica sem trabalho criativo devem estar dentro do escopo de proteção da presente revelação.
[0093] O termo "fator de coagulação VIII", também chamado de fator VIII, ou FVIII, se refere a uma glicoproteína grande e complexa principalmente produzida por células hepáticas. O termo "fração ativa de fator de coagulação VIII" se refere a uma fração ativa da proteína de fusão da presente revelação que exibe atividade de FVIII. FVIII humano natural consiste em 2351 aminoácidos, incluindo peptídeo de sinalização, assim como diversos domínios diferentes definidos por homologia: três domínios A, um domínio B e dois domínios C na ordem de NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. No sangue, FVIII é secretado como um heterodímero que consiste em duas cadeias (clivadas na delimitação de B-A3), que são ligadas por íons de metal divalentes. A cadeia de A1-A2-B é chamada de cadeia pesada (HC), e a cadeia A3-C1-C2 é chamada de cadeia leve (LC).
[0094] As moléculas de Fator VIII endógenas circulam no corpo como um agrupamento de moléculas com domínios B de diferentes tamanhos. A clivagem enzimática gradual de domínio B pode ocorrer in vivo, resultando em um agrupamento de molecular com domínios B de diferentes tamanhos. Acredita-se, geralmente, que a ocorrência da clivagem na posição 740 (a última parte do domínio B é extirpada no presente documento) esteja relacionada à ativação de trombina.
[0095] O "fator de coagulação VIII" na presente revelação pode se referir à sequência do tipo selvagem natural (como SEQ ID NO: 1), e também suas variantes, por exemplo, uma proteína variante obtida por meio de substituições, deleções ou inserções de um ou mais aminoácidos, enquanto retém a atividade de fator de coagulação VIII.
[0096] Em uma modalidade, o fator de coagulação VIII é uma molécula deletada por domínio B, em que os domínios restantes correspondem substancialmente aos aminoácidos 1-745 e 1640-2332 na SEQ ID NO:1. Além disso, a molécula deletada por domínio B da presente revelação pode ter ligeiras diferenças da sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, ou seja, os domínios restantes (isto é, três domínios A e dois domínios C) podem ter substituições, adições ou deleções de um ou mais aminoácidos com base na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, por exemplo, têm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais diferenças de aminoácido ou cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 % ou 5 % de diferença da sequência mostrada na SEQ ID NO: 2. Tais diferenças podem mudar a habilidade de ligação de fator VIII a vários outros componentes (como LRP, múltiplos receptores, outros fatores de coagulação, superfície celular), ou introduzem e/ou eliminam grupos glicosila, enquanto retêm a atividade básica de fator VIII.
[0097] O termo "parceiro de fusão" se refere a um polipeptídeo que é fundido com o polipeptídeo-alvo (um polipeptídeo cuja meia-vida é desejada que seja prolongada). O parceiro de fusão pode mudar as propriedades da proteína de fusão através de uma variedade de mecanismos diferentes, como prolongando a meia-vida do polipeptídeo-alvo in vivo.
[0098] Em uma modalidade, o parceiro de fusão atrasa o espaçamento in vivo de FVIII interagindo-se com o receptor de Fc neonatal (FcRn). Em uma modalidade, o parceiro de fusão é uma região de Fc de imunoglobulina (região de Fc), albumina, transferrina, XTEN ou uma porção da mesma. Em uma modalidade preferencial, a Fc de IgG é preferencial devido a sua meia-vida relativamente longa.
[0099] O domínio de Fc também pode ser modificado para alterar suas funções, como ligação de complemento e/ou ligação a determinados receptores de Fc. As mutações nas posições 234, 235 e 237 no domínio de Fc de IgG normalmente resultam na ligação reduzida a receptores de FcyRI, e também podem levar à ligação reduzida a receptores de FcyRIIa e FcyRIII. Tais mutações não mudam a ligação ao receptor de FcRn, que promove uma meia-vida de longa circulação através da endocitose e trajetória de recirculação. De preferência, o domínio de Fc de IgG modificado da proteína de fusão na presente revelação contém uma ou mais de tais mutações, algumas mutações (L234A, L235E e G237A) levam à afinidade diminuída para determinados receptores de Fc, e outras (A330S e P331S) levam à ligação de complemento mediada por C1q diminuída.
[0100] O termo "polialquileno glicol" é um polímero hidrofílico que é conjugado m uma posição específica no fator de coagulação VIII e/ou parceiro de fusão na presente revelação. O polialquileno glicol pode ser linear ou ramificado, e pode conter uma ou mais frações poliméricas independentemente selecionadas. De preferência, o polialquileno glicol é polietileno glicol (incluindo sua forma terminada em metóxi, m-PEG), polipropileno glicol (incluindo mPPG), etc.
[0101] O polialquileno glicol na presente revelação pode ser polietileno glicol (PEG), e pode ser linear ou ramificado. A cadeia principal de um polímero ramificado é bem conhecida na técnica. Geralmente, o polímero ramificado tem uma porção de núcleo ramificado central e uma ou mais cadeias de polímero linear conectadas ao núcleo ramificado central. A presente revelação usa, de preferência, a forma ramificada de PEG. Em uma modalidade, o polietileno glicol ramificado pode ser representado pela fórmula geral R(-PEG-OH)m, em que R representa a parte de núcleo, como glicerol ou pentaeritritol, e m representa o número de braços/ramificações.
[0102] Em uma modalidade, o número de ramificações em um PEG ramificado (como mPEG) é 2, então também é chamado PEG "do tipo Y" (como mPEG), que é, um PEG ramificado que contém dois PEGs ou um PEG ramificado que contém PEG de metóxi linear.
[0103] Exemplos de outros polímeros adequados incluem, mas sem limitação, outros polialquileno glicóis (por exemplo, polipropileno glicol (PPG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol), polióis polioxietilados, álcool oléfmico, polivinilpirrolidona, poli-hidroxipropilmetacrilamida, poli(ácido [α]-hidróxi), álcool polivinílico, polifosfazeno,
polioxazolina, poliN-acriloilmorfolina e copolímeros, terpolímeros e misturas dos mesmos.
[0104] Em uma modalidade da presente revelação, a modificação de PEG (isto é, conjugação), e com mais preferência, modificação de mPEG é usada, em que a modificação está em uma posição aleatória ou específica, e a posição da modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em um grupo amino livre, grupo sulfidrila, grupo açúcar e/ou grupo carboxila, de preferência, grupo amino livre.
[0105] Em uma modalidade específica da presente revelação, o modificador, ou seja, polialquileno glicol ou um polialquileno glicol modificado neste relatório descritivo, usado para a modificação aleatória no grupo amino livre pode ser selecionado dentre mPEG-SS (metóxi polietileno glicol-succinato de succinimidila), mPEG-SC (metóxi polietileno glicol-carbonato de succinimidila), mPEG-SPA (metóxi polietileno glicol-propionato de succinimidila) e mPEG-SG (metóxi polietileno glicol-glutarato de succinimidila) e assim por diante. Para a modificação de N-terminal, um dentre mPEG-ALD (metóxi polietileno glicol-acetaldeído), mPEG-pALD (metóxi polietileno glicol-propionaldeído) e mPEG-bALD (metóxi polietileno glicol -butiraldeído) e assim por diante é selecionado. Os modificadores mPEG-SS, mPEG-SC, mPEG-SPA, mPEG-SG, mPEG-ALD, mPEG-pALD, mPEG-bALD são lineares ou ramificados.
[0106] Em uma modalidade específica da presente revelação, o modificador usado para modificação aleatória em grupos sulfidrila livre é mPEG-mal (metóxi polietileno glicol-maleimida), mPEG-OPSS (metóxi polietileno glicol-Dissulfeto de Ortopiridila), mPEG-Vinilssulfona
(metoxipolietileno glicol-vinilssulfona) e mPEG-Tiol (metoxipolietileno glicol-tiol), etc.
[0107] Em uma modalidade específica da presente revelação, o modificador usado para modificação aleatória no grupo açúcar e/ou grupo carboxila é mPEG-ZH (metóxi polietileno glicol-hidrazida).
[0108] Em uma modalidade da presente revelação, o modificador para modificação tem a estrutura mostrada na fórmula (1): (1)
[0109] em que 0≤m1≤6, e m1 é, de preferência, 5; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi. O modificador representado pela fórmula (1) tem um peso molecular de 5 -60 kDa (kDa, quilodaltons), de preferência, 40 kDa. De preferência, em uma modalidade da presente revelação, o modificador representado pela fórmula (1) é usado para uma modificação de mPEG aleatória no grupo amino livre.
[0110] Em uma modalidade da presente revelação, o modificador para modificação tem a estrutura mostrada na fórmula (2): (2)
[0111] em que 0≤m2≤6, e m2 é, de preferência, 2; 0≤m3≤6, e m3 é, de preferência, 1; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi. O modificador representado pela fórmula (2) tem um peso molecular de 5 -60 kDa, de preferência, 40 kDa. De preferência, em uma modalidade da presente revelação, o modificador representado pela fórmula (2) é usado para uma modificação de mPEG aleatória no grupo amino livre.
[0112] Em uma modalidade da presente revelação, o modificador para modificação tem a estrutura mostrada na fórmula (3): (3)
[0113] em que, 0≤m4≤6, e m4 é, de preferência, 2; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi. O modificador representado pela fórmula (3) tem um peso molecular de 5-60 kDa, de preferência, 40 kDa. De preferência, em uma modalidade da presente revelação, o modificador representado pela fórmula (3) é usado para uma modificação de mPEG aleatória no grupo sulfidrila livre.
[0114] O tamanho da cadeia principal de polímero pode variar, mas a típica faixa de tamanho de polímeros (como PEG, mPEG, PPG ou mPPG) é cerca de 0,5 kDa a cerca de 160 kDa, por exemplo, cerca de 1 kDa a cerca de 100 kDa. Mais especificamente, o tamanho de cada polímero hidrofílico conjugado na presente revelação varia principalmente nas seguintes faixas: cerca de 1 kDa a cerca de 80 kDa, cerca de 2 kDa a cerca de 70 kDa; cerca de 5 kDa a cerca de 70 kDa; cerca de 10 kDa a cerca de 60 kDa, cerca de 20 kDa a cerca de 50 kDa; cerca de 30 kDa a cerca de 50 kDa ou cerca de 30 kDa a cerca de 40 kDa. Deve-se compreender que esses tamanhos representam valores aproximados, medições não precisas, conforme reconhecido na técnica.
[0115] Em uma modalidade específica, o tamanho de PEG ou mPEG usado na presente revelação está acima de 35 kDa (isto é, não menos que 35 kDa), de preferência, não menos que 40 kDa, não menos que 45 kDa, não menos que 50 kDa, não menos que 55 kDa, não menos que 60 kDa, não menos que 65 kDa ou não menos que 70 kDa, por exemplo, o peso molecular é especificamente 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 110 kDa, 120 kDa, 130 kDa, 140 kDa, 150 kDa ou 160 kDa.
[0116] O termo "meia-vida de circulação aprimorada" significa que as moléculas da presente revelação têm uma meia-vida de circulação alterada (meia-vida de plasma), de preferência, uma meia-vida de circulação aumentada em comparação com o fator VIII do tipo selvagem. A meia-vida de circulação é, de preferência, aumentada em pelo menos 10 %, de preferência, pelo menos 15 %, de preferência, pelo menos 20 %, de preferência, pelo menos 25 %, de preferência, pelo menos 30 %, de preferência, pelo menos 35 %, de preferência, pelo menos 40 %, de preferência, pelo menos 45 %, de preferência, pelo menos 50 %, de preferência, pelo menos 55 %, de preferência, pelo menos 60 %, de preferência, pelo menos 65 %, de preferência, pelo menos 70 %, de preferência, pelo menos 75 %, de preferência, pelo menos 80 %, de preferência, pelo menos 85 %, de preferência, pelo menos 90 %, de preferência, pelo menos 95 %, de preferência, pelo menos 100 %, com mais preferência, pelo menos 125 %, com mais preferência, pelo menos 150 %, com mais preferência, pelo menos 175 %, com mais preferência, pelo menos 200 %, e com máxima preferência, pelo menos 250 % ou 300 %. Ainda com mais preferência, a molécula tem uma meia-vida de circulação aumentada em pelo menos 400 %, 500 %, 600 % ou até mesmo 700 %.
[0117] O termo "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui, mas sem limitação: solução salina, tampão, glicose, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos. Geralmente, a preparação farmacêutica deve ser adequada para o modo de administração. A composição farmacêutica da presente revelação pode ser produzida em uma forma de injeção, por exemplo, por meio de métodos convencionais com solução salina fisiológica ou uma solução aquosa que contém glicose e outros adjuvantes. A composição farmacêutica deve ser fabricada sob condições assépticas. A quantidade de ingrediente ativo administrada é uma quantidade terapeuticamente eficaz. A preparação farmacêutica da invenção também pode ser produzida em uma preparação de liberação sustentada. Exemplos Exemplo 1 Preparação e Purificação de Proteína de Fusão de hFVIII modificada por mPEG
1.1. Preparação de proteína de fusão de hFVIII modificada por mPEG
[0118] 1.1.1 Uma série de plasmídeos de expressão de proteína de fusão de hFVIII foram construídos de acordo com a tecnologia de clonagem molecular bem conhecida por aqueles que são versados na técnica, e os plasmídeos de expressão foram respectivamente transfectados para células de CHO deficientes em DHFR (vide Patente US 4.818.679) para expressar cada proteína de fusão de hFVIII (Tabela 1). Para as etapas de preparação específicas da proteína de fusão, vide a Patente chinesa ZL201610692838.0, que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
Tabela 1 Composição e estrutura de proteína de fusão Nome e abreviatura Parte de Parceiro de Ligante da proteína de hFVIII fusão fusão de hFVIII hFVIII-Fc (FF-0) hFVIII* Fragmento Fc Nenhum deletado por de IgG 2 de domínio B ser humano (SEQ ID NO: natural 2) hFVIII-L1-Fc hFVIII SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 7 (FL1F-0) deletado por - SEQ ID NO: domínio B 12** (SEQ ID NO: 2) hFVIII-L2-Fc hFVIII SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 6 (FL2F-0) deletado por - SEQ ID NO: domínio B 11** (SEQ ID NO: 2) hFVIII(comprimento hFVIII de SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 7 total)-L1-Fc’, comprimento - SEQ ID NO: F(comprimento total (SEQ ID 12 total)L1F’-0 NO: 1) hFVIII(comprimento hFVIII de SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7 total)-L2-Fc’’, comprimento - SEQ ID NO: F(comprimento total (SEQ ID 12 total)L2F’’-0 NO: 1)
Nota: *hFVIII deletado por domínio B é abreviado como BDD FVIII,
que consiste em uma cadeia pesada de A1-A2 de 90kD e uma cadeia leve de 80kD.
[0119] **SEQ ID NO: 7-SEQ ID NO: 12 significa que o ligante é formado conectando-se o segmento de peptídeo rígido mostrado na SEQ ID NO: 12 ao C-terminal do segmento de peptídeo flexível mostrado na SEQ ID NO: 7; e SEQ ID NO: 6-SEQ ID NO: 11 significa que o ligante é formado conectando-se o segmento de peptídeo rígido mostrado na SEQ ID NO: 11 ao C-terminal do segmento de peptídeo flexível mostrado na SEQ ID NO: 6.
[0120] 1.1.2. O caldo de fermentação de cada proteína de fusão em 1.1.1 foi centrifugado, filtrado e, então, submetido à cromatografia de afinidade/cromatografia de interação hidrofóbica/cromatografia de troca de íon/cromatografia de exclusão de tamanho para obter cinco proteínas de fusão de hFVIII FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F(comprimento total)L1F’-0 e F(comprimento total)L2F’’-0, para as quais, a detecção de SEC-HPLC mostrou que o agregado era menor que 5 %. Cinco proteínas de fusão de hFVIII foram respectivamente formuladas para as soluções de estoque de proteína de fusão de hFVIII com uma concentração de proteína de 0,95 mg/ml.
[0121] 1.1.3. 5 ml de cada uma das cinco soluções de estoque de proteína de fusão de hFVIII preparadas em 1.1.2 foram submetidos a cromatografia de peneira molecular G25 (GE Healthcare). O processo específico era conforme segue.
[0122] Preparação de tampão: Hepes 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl2 5,0 mM, 0,02 % de Tween8.0, pH 7,0;
[0123] Cromatografia
[0124] (1) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de Tampão de Ligação, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão,
e a taxa de fluxo era estável a 150 cm/h.
[0125] (2) Carregamento de amostra: a taxa de fluxo foi controlada a 150 cm/h.
[0126] (3) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de tampão, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão, e a taxa de fluxo era estável a 150 cm/h.
[0127] (4) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com tampão, e picos com A280/A260 maiores que 1,8 foram coletados.
[0128] (5) Limpeza in situ da coluna de cromatografia: a coluna foi limpa reversamente com 1,5 vezes o volume de coluna de NaOH 0,2 M em uma taxa de fluxo de 60 cm/h, e neutralizada com tampão;
[0129] (6) Armazenamento da coluna cromatográfica: após o experimento, a coluna foi limpa com 3 vezes o volume de coluna de água purificada em uma taxa de fluxo de 100 cm/h e, então, foi armazenada com 2 vezes o volume de coluna de 20 % de etanol.
[0130] Concentração de ultrafiltração: cinco soluções de estoque de proteínas de fusão de hFVIII (FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F(comprimento total)L1F’-0 e F(comprimento total)L1F’’-0) após troca G25 foram concentradas por meio de ultrafiltração com um tubo de filtro de ultrafiltração de 50 kDa, e concentradas por meio de centrifugação a 3.800 rpm, 4 °C, para uma concentração de proteína, de preferência, de 1,5 mg/ml.
[0131] 1.1.4. mPEG-SC desejado (mPEG-SC em formato em L linear com a estrutura mostrada na fórmula (1) com um peso molecular de 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa, 40 kDa, respectivamente, e mPEG-SC com formato em Y ramificado com a estrutura mostrada na fórmula (2) com um peso molecular de 40 kDa) (Beijing jenkem Technology Co., Ltd.) foi pesado de acordo com a razão molar de proteína de fusão de hFVIII para mPEG-SC de 1:10-1:100. O mesmo foi adicionado à proteína de fusão de hFVIII concentrada após ultrafiltração em 1.1.3 e permitida a reagir por 4 horas. Então, a histidina em uma razão molar de 10 vezes para a proteína de fusão de hFVIII de substrato foi adicionada para terminar a reação, para obter proteína de fusão de hFVIII modificada por mPEG-SC com diferentes pesos moleculares. O número e a composição de alguns produtos modificados são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2 Nome/Abreviatura Peso molecular e Parte da proteína formato de mPEG-SC de fusão FF-0 Solução “MultiBic” hFVIII-Fc FF-5L 5 kDa, forro hFVIII-Fc FF-10L 10 kDa, forro hFVIII-Fc FF-20L 20 kDa, forro hFVIII-Fc FF-30L 30 kDa, forro hFVIII-Fc FF-40L 40 kDa, forro hFVIII-Fc FL1F-0 Solução “MultiBic” hFVIII-L1-Fc FL1F-10L 10 kDa, forro hFVIII-L1-Fc FL1F-20L 20 kDa, forro hFVIII-L1-Fc FL1F-30L 30 kDa, forro hFVIII-L1-Fc FL1F-30Y 30 kDa, com formato em hFVIII-L1-Fc
Y FL1F-40L 40 kDa, forro hFVIII-L1-Fc FL1F-40Y 40 kDa, com formato em hFVIII-L1-Fc
Y FL1F-50L 50 kDa, forro hFVIII-L1-Fc
Nome/Abreviatura Peso molecular e Parte da proteína formato de mPEG-SC de fusão FL1F-60L 60 kDa, forro hFVIII-L1-Fc FL2F-0 Solução “MultiBic” hFVIII-L2-Fc FL2F-10L 10 kDa, forro hFVIII-L2-Fc FL2F-20L 20 kDa, forro hFVIII-L2-Fc FL2F-30L 30 kDa, forro hFVIII-L2-Fc FL2F-30Y 30 kDa, com formato em hFVIII-L2-Fc
Y FL2F-40L 40 kDa, forro hFVIII-L2-Fc FL2F-40Y 40 kDa, com formato em hFVIII-L2-Fc
Y FL2F-50L 50 kDa, forro hFVIII-L2-Fc FL2F-60L 60 kDa, forro hFVIII-L2-Fc F(comprimento Solução “MultiBic” hFVIII(comprimento total)L1F’-0 total)-L1-Fc’ F(comprimento 40 kDa, forro hFVIII(comprimento total)L1F’-40L total)-L1-Fc’ F(comprimento 40 kDa, com formato em hFVIII(comprimento total)L1F’-40Y Y total)-L1-Fc’ F(comprimento 50 kDa, forro hFVIII(comprimento total)L1F’-50L total)-L1-Fc’ F(comprimento Solução “MultiBic” hFVIII(comprimento total)L2F’’-0 total)-L2-Fc’’ F(comprimento 40 kDa, forro hFVIII(comprimento total)L2F’’-40L total)-L2-Fc’’ F(comprimento 40 kDa, com formato em hFVIII(comprimento total)L2F’’-40Y Y total)-L2-Fc’’
Nome/Abreviatura Peso molecular e Parte da proteína formato de mPEG-SC de fusão F(comprimento 50 kDa, forro hFVIII(comprimento total)L2F’’-50L total)-L2-Fc’’
[0132] 1.2 Purificação de proteína de fusão de hFVIII modificada por mPEG
[0133] 1.2.1. Cada proteína de fusão de hFVIII modificada por mPEG preparada em 1.1.4. do Exemplo 1 foi submetida à cromatografia de peneira molecular S200 (GE Healthcare), respectivamente. O processo específico era conforme segue.
[0134] Preparação de tampão: Histidina 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl2 5,0 mM, 0,02 % Tween8.0, pH 7,0
[0135] Cromatografia
[0136] (1) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de Tampão de Ligação, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão, e a taxa de fluxo era controlada a 150 cm/h.
[0137] (2) Carregamento de amostra: a taxa de fluxo de amostra é controlada a 150 cm/h.
[0138] (3) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de tampão, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão, e a taxa de fluxo era controlada a 150 cm/h.
[0139] (4) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com tampão, e picos com A280/A260 maiores que 1,8 foram coletados.
[0140] (5) Limpeza in situ da coluna de cromatografia: a coluna foi limpa reversamente com 1,5 vezes o volume de coluna de NaOH 0,2 M em uma taxa de fluxo de 60 cm/h, e neutralizada com tampão.
[0141] (6) Armazenamento da coluna cromatográfica: após o experimento, a coluna foi limpa com 3 vezes o volume de coluna de água purificada em uma taxa de fluxo de 100 cm/h e, então, foi armazenada com 2 vezes o volume de coluna de 20 % de etanol.
[0142] 1.2.2. Os produtos cromatográficos obtidos em 1.2.1. Foram submetidos à cromatografia de ânion Source 15Q (GE Healthcare).
[0143] Preparação de tampão
[0144] Tampão de ligação: Histidina 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl2 5,0 mM, 0,02 % Tween8.0, pH 7,0; tampão de elução: Histidina 20 mM, NaCl 2,0 M, CaCl2 5,0 mM, 0,02 % de Tween 8.0, pH 7,0; CIP: NaOH 0,5 M.
[0145] Cromatografia
[0146] (1) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de Tampão de Ligação, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão, e a taxa de fluxo era controlada a 150 cm/h.
[0147] (2) Carregamento de amostra: a taxa de fluxo era uniformemente 150 cm/h.
[0148] (3) Equilíbrio: a coluna de cromatografia foi equilibrada com 3 vezes o volume da coluna de tampão de ligação, até que o pH e a condutividade fossem iguais àquelas do tampão, e a taxa de fluxo era controlada a 150 cm/h.
[0149] (4) Eluição: A amostra foi eluída com 20 vezes o volume de coluna de tampão B em 0-100 % de gradiente linear, em uma taxa de fluxo uniforme de 100 cm/h. Os picos de eluição com A280/A260 maior que 1,8 foram coletados em tubos separados e submetidos à detecção de SEC-HPLC.
[0150] (5) Limpeza in situ da coluna de cromatografia: a coluna foi limpa reversamente com 1,5 vezes o volume de coluna de NaOH 0,5 M em uma taxa de fluxo de 60 cm/h, e neutralizada com tampão de ligação.
[0151] (6) Armazenamento da coluna cromatográfica: após o experimento, a coluna foi limpa com 3 vezes o volume de coluna de água purificada em uma taxa de fluxo de 100 cm/h e, então, foi armazenada com 2 vezes o volume de coluna de 20 % de etanol.
[0152] 1.2.3. Detecção de SEC-HPLC
[0153] Os produtos cromatográficos obtidos em 1.2.2. foram submetidos à detecção de SEC-HPLC.
[0154] Coluna: G3000/G4000; Taxa de fluxo: 0,5 ml/min; Comprimento de onda de detecção: 280 nm; Temperatura de coluna: 25 °C; Volume de injeção: 100 µl (quantidade de injeção: 20 µg); Fase móvel: cloreto de sódio 0,30 M, imidazol 0,02 M, cloreto de cálcio 0,01 M, 25 ppm de Tween 80, 10 % de etanol, pH 7,0; Tempo de execução: 35-50 min.
[0155] Os resultados de detecção de FF-0 a FF-40L são mostrados na Figura 1A-1F. Os resultados da detecção de FL1F-0 a FL1F-50L e FL1F-40Y são mostrados na Figura 2A-2F. Esses resultados mostram que, para FL1F-0 a FL1F-60L, a pureza é >95 %, a polímero é <5 %, e a não reticulado <1 %.
[0156] 1.2.4. Detecção de eletroforese de gel de SDS-PAGE
[0157] Os produtos obtidos em 1.2.2. foram submetidos à detecção de SDS-PAGE.
[0158] (1) Preparação de gel. Tampão de eletroforese 1×Tris-glicina: SDS 0,4 g, Tris base 1,21 g, glicina 7,5 g e água destilada dupla para constituir 400 ml.
[0159] 5 % de gel de empilhamento: água destilada dupla 4,1 ml, Tris-HCl 1 M (pH 6,8) 0,75 ml, 30 % (p/v) poliacrilamida 1 ml, 10 % (p/v) de persulfato de amônio 60 µl, 10 % (p/v) SDS
60 µl, TEMED 6 µl.
[0160] 6 % de gel de separação: água destilada dupla 4,9 ml, Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 3,8 ml, 30 % (p/v) poliacrilamida 6 ml, 10 % (p/v) de persulfato de amônio 150 µl, 10 % (p/v) SDS 150 µl, TEMED 6 µl.
[0161] (2) 5×tampão de carregamento de proteína: glicerol 5 ml, Tris-HCl 1 M (pH 6,8) 2,5 ml, bromofenol azul 0,05 g, SDS 1 g, água destilada dupla para constituir 10 ml, armazenado a 4 °C, e β-mercaptoetanol 0,5 ml foi adicionado antes do uso.
[0162] (3) Preparação de amostra: a amostra a ser testada foi misturada com um volume igual de tampão de carregamento. Para SDS-PAGE redutor, 0,1 mg/ml de 2-mercaptoetanol foi adicionado no mesmo volume que a amostra, e para SDS-PAGE não redutor, nenhum 2-mercaptoetanol foi adicionado. Após a amostra ser misturada com o tampão de carregamento, o mesmo foi aquecido em água fervente por 10 minutos.
[0163] (4) Eletroforese: 10 µl da amostra a ser testada e o marcador de proteína foram carregados para os poços do gel, respectivamente, e submetido à eletroforese em uma tensão de 60 V. Após pigmento de bromofenol azul ter entrado no gel de separação, a tensão foi aumentada para 120 V, até que o pigmento de bromofenol azul chegou ao fundo do gel de separação, então, a energia foi desligada.
[0164] (5) Coloração: o gel de SDS-PAGE foi cuidadosamente removido e colocado em uma caixa plástica que contém solução que contém Azul de Coomassie Brilhante e, então, a caixa foi colocada em um forno de micro-ondas para aquecer por 1 minuto.
[0165] (6) Descoloração: o gel SDS-PAGE corado foi colocado na solução de descoloração e descolorado sob agitação, a solução de descoloração foi alterada a cada 2 horas, e parada após o aparecimento de uma banda mais clara visível ao olho nu
[0166] (7) Registro: o gel de SDS-PAGE concluído foi fotografado ou seco e armazenado. As Figuras 3a-3c mostram os resultados de detecção de SDS-PAGE de FF-5L para FF-40L. Exemplo 2
[0167] Determinação indireta de Atividade In vitro de Proteína de Fusão de hFVIII modificada por mPEG por meio de Ensaio de Substrato Cromogênico
[0168] O ensaio de substrato cromogênico foi usado para determinar a atividade da proteína de fusão de hFVIII modificada por mPEG preparada no Exemplo 1. O kit ChromogenixCoatest FVIII (Chromogenix, Ref. K824086) foi usado. O princípio de detecção é: após ativado por trombina, na presença de fosfolipídios e íons de cálcio, FVIIIa se liga com FIXa para formar um complexo enzimático, que pode ativar o fator X para converter o mesmo em sua forma ativa Xa, então, Xa ativo pode, por sua vez, clivar seu substrato cromogênico (S-2765) e liberar o cromóforo pNA. Medindo-se a quantidade de pNA a 405 nm, a atividade de FXa que é diretamente proporcional à quantidade de FXa pode ser determinada. Uma vez que o teor do fator IXa e fator X no sistema é excessivo, a atividade de FXa só está diretamente relacionada ao teor de FVIIIa. Os resultados da determinação indireta de atividade biológica de FVIII por meio de ensaio de substrato cromogênico são mostrados na Tabela 3. Tabela 3 Determinação indireta de atividade biológica de FVIII por meio de ensaio de substrato cromogênico Atividade biológica Atividade de FVIII por meio de Nome relativa a ensaio de substrato Eloctato cromogênico (IU/mg)
Atividade biológica Atividade de FVIII por meio de Nome relativa a ensaio de substrato Eloctato cromogênico (IU/mg) Eloctato 8460 100 % FF-0 8500 100 % FF-5L 7800 92,23 % FF-10L 7300 86,3 % FF-20L 6500 76,8 % FF-30L 6000 70,9 % FF-40L 5000 59,1 % FF1F-0 8500 100 % FF2F-0 8520 100,7 % FF1F-10L 3187 37,7 % FF2F-10L 3287 38,9 % FF1F-20L 4038 47,7 % FF2F-20L 4042 47,8 % FF1F-30L 4641 54,9 % FF2F-30L 4621 54,6 % FF1F-40L 3995 47,2 % FF2F-40L 3925 46,4 % FF1F-40Y 3145 37,2 % FF2F-40Y 3245 38,2 % FF1F-50L 3230 38,4 % FF2F-50L 3830 45,3 % FF1F-60L 2720 32,2 % FF2F-60L 2920 34,5 % F(comprimento 3900 46,1 % total)L1F’-40L
Atividade biológica Atividade de FVIII por meio de Nome relativa a ensaio de substrato Eloctato cromogênico (IU/mg) F(comprimento 3400 40,2 % total)L1F’-40Y F(comprimento 3010 35,6 % total)L1F’-50L F(comprimento 3800 44,9 % total)L2F’’-40L F(comprimento 3500 41,4 % total)L2F’’-40Y F(comprimento 3100 36,6 % total)L2F’’-50L Nota: O Elocato é uma proteína de fusão de VIII Fc recombinante comercializada pela Bioverativ. O mesmo não é modificado por mPEG. Exemplo 3 Determinação de Título de Fator VIII Humano
[0169] O ensaio para determinação de título de fator de coagulação VIII usado na presente revelação também é referido como ensaio de coagulação em um estágio. Para etapas específicas, refere-se à terceira parte da Farmacopeia chinesa (versão de 2010). O ensaio de coagulação em um estágio para atividade biológica de FVIII se baseou na habilidade de corrigir o plasma deficiente em FVIII para prolongar o tempo de coagulação. O kit Coagulation Factor VIII Deficient Plasma (nº de Cat. OTXW17) da empresa Siemens (Alemanha) foi usado. O ensaio foi realizado como: primeiro, o standard substance WHO International Standard
8th International Standard Standard Factor VIII Concentrate (nº de Cat. 07/350) com um título conhecido foi diluído para 4 IU/ml e, então, submetido a uma diluição de gradiente para chegar aos títulos diferentes (IU/ml); essas amostras padrão foram misturadas com plasma deficiente em FVIII para medir o tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT); regressão linear de logaritmo do título (IU/ml) da solução padrão ativa de FVIII contra o logaritmo do tempo de coagulação correspondente (s) foi usada para estabelecer uma curva padrão; então, a amostra a ser testada foi diluída e misturada com plasma deficiente em FVIII, e a medição de APTT foi realizada.
Ajustando-se à curva padrão, a potência das amostras de FVIII pode ser determinada, e a atividade específica em IU/mg das amostras de FVIII podem ser calculadas.
Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Determinação direta de atividade biológica por meio de ensaio de coagulação em um estágio Atividade biológica de FVIII Atividade determinada por Nome relativa a meio de coagulação Eloctato em um estágio (IU/mg) Eloctato 7933 100 % FF-0 8200 103 % FF-5L 7400 93,3 % FF-10L 7000 88,2 % FF-20L 6400 80,7 % FF-30L 5800 73,1 % FF-40L 4800 60,5 %
Atividade biológica de FVIII Atividade determinada por Nome relativa a meio de coagulação Eloctato em um estágio (IU/mg) FF1F-0 8200 103,4 % FF2F-0 8300 104,6 % FF1F-10L 3075 38,8 % FF2F-10L 3075 38,8 % FF1F-20L 4046 51,0 % FF2F-20L 4026 50,8 % FF1F-30L 4590 57,9 % FF2F-30L 4520 57,0 % FF1F-40L 3995 50,4 % FF2F-40L 3925 49,5 % FF1F-40Y 3145 39,6 % FF2F-40Y 3245 40,9 % FF1F-50L 3230 40,7 % FF2F-50L 3220 40,6 % FF1F-60L 2720 34,3 % FF2F-60L 3220 40,6 % F(comprimento 3900 49,2 % total)L1F’-40L F(comprimento 3200 40,3 % total)L1F’-40Y F(comprimento 3100 39,1 % total)L1F’-50L
Atividade biológica de FVIII Atividade determinada por Nome relativa a meio de coagulação Eloctato em um estágio (IU/mg) F(comprimento 3800 47,9 % total)L2F’’-40L F(comprimento 3000 37,8 % total)L2F’’-40Y F(comprimento 3200 40,3 % total)L2F’’-50L
[0170] A Tabela 3 e a Tabela 4 mostram que a atividade biológica de FL1F-40Y, FL2F-40Y, F(comprimento total)L1F’-40Y e F(comprimento total)L2F’’-40Y medidas pelo ensaio de substrato cromogênico e o ensaio de coagulação em um estágio é menor que aquela de Eloctato/FL1F-0/FL2F-0 sem modificação de mPEG. Isso se deve ao efeito de modificação de mPEG na estrutura espacial da proteína modificada, e outras proteínas modificadas por mPEG (por exemplo, PEG-INTRON, Pegfilgrastim) na técnica anterior mostram resultados semelhantes. Inesperadamente, as proteínas de fusão de Fc de FVIII modificadas com mPEG de 40kD ou mais ainda podem manter a atividade relativamente alta. Além disso, os experimentos em seguida verificaram adicionalmente que a meia-vida dessas proteínas é enormemente prolongada.
[0171] Exemplo 4
[0172] Teste de Farmacodinâmica que Usa Modelo de Sangramento de Transseção de Veia de Cauda de Camundongo com
Hemofilia A
[0173] Nesse exemplo, a meia-vida de cada uma dentre as proteínas de fusão de hFVIII modificadas por mPEG em camundongos com hemofilia A (camundongos HA) foi comparada pelos experimentos de transsecção de veia de cauda (TVT).
[0174] 4.1. De acordo com os métodos relatados na literatura, os camundongos HA machos de 10-12 semanas de idade (adquiridos junto à Shanghai Southern Model Biological Research Center) foram e divididas aleatoriamente em grupos de 12 camundongos por grupo. Os camundongos foram administrados com os fármacos, ou seja, as proteínas de fusão modificadas por mPEG da presente revelação ou Eloctato de controle positivo, por meio da veia de cauda em uma dose de 15 IU/kg, respectivamente. 48 h após a administração de fármaco, a cauda foi medida e marcada com uma cânula com 2,7 mm de diâmetro interno, e a transsecção foi realizada na veia da lateral esquerda com uma lâmina cirúrgica de gume reto calibre 11. Após transseção, a cauda foi imediatamente substituída em um tubo que contém 13 ml de solução salina pré-aquecida e o tempo de sangramento foi registrado. Após o sangramento ter parado (nenhum fluxo sanguíneo óbvio da incisão), a cauda do camundongo foi removida do tubo de solução salina e, então, o camundongo foi colocado em um coxim de aquecimento a 37 °C para manter sua temperatura corporal, com cuidado para não tocar na ferida. Após o camundongo ter acordado, o mesmo foi colocado em uma gaiola com papel branco no fundo, cada animal em uma única gaiola. O papel branco ou a gaiola foi substituída após cada observação a fim de determinar o grau de sangramento. A taxa de sobrevivência de camundongos dentro das 48 horas e o número de novo sangramento dentro de 12 horas (um total de 12 horas foi contado, e o sangramento múltiplo dentro de uma hora foi contado como um sangramento) após a transseção da cauda foram contados. Os resultados são mostrados na Tabela
5.
[0175] A taxa de novo sangramento se refere à proporção de camundongos com novo sangramento durante o período de experimento. A taxa de sangramento severa se refere à proporção de camundongos com sangramento grave (+++) ou múltiplos sangramentos moderados (++) no período de 12 h. Dentre os mesmos, o sangramento moderado (++) se refere a: há muitas manchas de sangue no papel branco com uma área de cobertura não menor que 30 %, e as manchas de sangue são médias em cor, mas não há agrupamento de sangue com área grande (área> 3 cm2); o sangramento grave (+++) se refere a: há muitas manchas de sangue no papel branco com uma área de cobertura não menor que 30 %, as manchas de sangue são pesadas em cor, e há agrupamentos de sangue com área grande; em alguns casos, mesmo se a área de cobertura for pequena, os camundongos podem ser contados com sangramento grave quando os camundongos perdem muito sangue, o alcance do movimento é reduzido, e o papel branco é seriamente embebido com sangue. Tabela 5 48 h de taxa de sobrevivência e 12 h de taxa de novo sangramento em experimento de TVT 48 h após administração de fármaco Nome 12 h de taxa Taxa de 48 h de taxa de de novo sangramento sobrevivência sangramento grave Eloctato 66,7 % (8/12) 16,7 % 75,0 % (9/12) (2/12) FL1F-0 83,3 % 33,3 % 25,0 % (3/12) (10/12) (4/12)
Nome 12 h de taxa Taxa de 48 h de taxa de de novo sangramento sobrevivência sangramento grave FL1F-20L 83,3 % 33,3 % 41,7 % (5/12) (10/12) (4/12) FL1F-40L 66,7 % (8/12) 16,7 % 75,0 % (9/12) (2/12) FL1F-40Y 58,3 % (7/12) 8,3 % (1/12) 83,3 % (10/12) FL1F-50L 75,0 % (9/12) 25,0 % 58,3 % (7/12) (3/12) FL1F-60L 66,7 % (8/12) 25,0 % 66,7 % (8/12) (3/12) FL2F-0 83,3 % 33,3 % 33,3 % (4/12) (10/12) (4/12) FL2F-20L 75,0 % (9/12) 25,0 % 41,6 % (5/12) (3/12) FL2F-40L 75,0 % (9/12) 16,7 % 66,7 % (8/12) (2/12) FL2F-40Y 63,3 % (7/11) 9,1 % (1/11) 81,8 % (9/11) FL2F-50L 66,7 % (8/12) 16,7 % 58,3 % (7/12) (2/12) FL2F-60L 66,7 %(8/12) 25,0 % 50,0 % (6/12) (3/12) F(comprimento 75,0 % (9/12) 16,7 % 66,7 % (8/12) total)L1F’-40L (2/12) F(comprimento 66,7 (8/12) 8,3 % (1/12) 83,3 % (10/12) total)L1F’-40Y F(comprimento 66,7 % (8/12) 25,0 % 50,0 % (6/12) total)L1F’-50L (3/12)
Nome 12 h de taxa Taxa de 48 h de taxa de de novo sangramento sobrevivência sangramento grave F(comprimento 75,0 % (9/12) 8,3 % (1/12) 58,3 % (7/12) total)L2F’’-40L F(comprimento 58,3 % (7/12) 8,3 % (1/12) 83,3 % (10/12) total)L2F’’-40Y F(comprimento 75,0 % (9/12) 16,7 % 58,3 % (7/12) total)L2F’’-50L (2/12)
[0176] Os resultados mostraram que, em comparação com os grupos Elocato/FL1F-0/FL2F-0 sem modificação de mPEG, o grupo FL1F-40Y, o grupo FL2F-40Y, o grupo F(comprimento total)L1F’-40Y e o grupo F(comprimento total)L2F’’-40Y têm taxa de sobrevivência de 83,3 %, 75,0 %, 83,3 % e 83,3 %, respectivamente, significativamente maior que aquele dos outros grupos. Além disso, esses grupos têm taxa de novo sangramento de 12 h significativamente baixa e taxa de sangramento de grave baixa em comparação com outros grupos. Portanto, FL1F-40Y, FL2F-40Y, F (comprimento total) L1F'-40Y e F (comprimento total) L2F "-40Y fornecem tempo de proteção mais longo no modelo de veia de cauda transseção de camundongos com hemofilia A.
[0177] 4.2. O mesmo método descrito em 4.1 foi usado para realizar o experimento de TVT em camundongos HA machos com 10-12 semanas de idade, 12 camundongos por grupo, a 84 h após administração de fármaco. Os resultados são mostrados na Tabela
6. Tabela 6 48 h de taxa de sobrevivência e 12 h de taxa de novo sangramento em experimento de TVT 48 h após administração de fármaco Nome 48 h de taxa de 12 h de taxa de novo sobrevivência sangramento Eloctato 66,7 % (8/12) 83,3 % (10/12) FL1F-40L 50 % (6/12) 83,3 % (10/12) FL2F-40L 58,3 % (7/12) 91,7 % (11/12) FL1F-40Y 66,7 % (8/12) 75,0 % (9/12) FL2F-40Y 75,0 % (9/12) 75,0 % (9/12) FL1F-50L 50 % (6/12) 100 % (12/12) FL2F-50L 33,3 % (4/12) 100 % (12/12) FL1F-60L 58,3 % (7/12) 83,3 % (10/12) FL2F-60L 41,7 % (5/12) 83,3 % (10/12) F(comprimento 66,7 % (8/12) 75,0 % (9/12) total)L1F’-40L F(comprimento 75,0 % (9/12) 66,7 % (8/12) total)L1F’-40Y F(comprimento 58,3 % (7/12) 91,7 % (11/12) total)L1F’-50L F(comprimento 41,7 % (5/12) 91,7 % (11/12) total)L2F’’-40L F(comprimento 75,0 % (9/12) 75,0 % (9/12) total)L2F’’-40Y F(comprimento 58,3 % (7/12) 91,7 % (11/12) total)L2F’’-50L
[0178] Os resultados mostraram que, em comparação com Eloctato e outros grupos sem modificação de PEG, o grupo FL1F-40Y, o grupo FL2F-40Y, o grupo F(comprimento total)L1F’-40Y e o grupo F(comprimento total)L2F’’-40Y têm taxa de sobrevivência de 66,7 %, 75,0 %, 75,0 % e 75,0 %,
respectivamente, significativamente maior que aquela de outros grupos, e a taxa de novo sangramento é significativamente reduzida. Portanto, FL1F-40Y, FL2F-40Y, F(comprimento total)L1F'-40Y e F(comprimento total)L2F"-40Y ainda mostram determinado efeito na prevenção de sangramento no modelo e transseção de veia de cauda de camundongos com hemofilia A 84 h após a administração de fármaco.
[0179] 4.3. O mesmo método que o descrito em 4.1 foi usado para realizar o experimento de TVT em camundongos HA de 10-12 semanas de idade, 20 camundongos (10 mnachos e 10 fêmeas)/grupo, 90 horas após a administração de fármaco. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7 48 h de taxa de sobrevivência e 12 h de taxa de novo sangramento em experimento de TVT 90 h após administração de fármaco Nome 48 h de taxa de 12 h de taxa de novo sobrevivência sangramento Eloctato 70 % 80 % FL1F-40L 55 % 70 % FL2F-40L 63,2 % 73,68 % FL1F-50L 84,2 % 68,4 % FL2F-50L 40 % 90 %
[0180] Os resultados mostraram que o FL1F-50L tem taxa de sobrevivência e taxa de novo sangramento semelhantes em comparação com o grupo de Elocateato sem modificação de PEG. Devido aos animais experimentais não serem de único sexo, os resultados experimentais não são comparados com outros experimentos de único sexo.
[0181] 4.4. O mesmo método conforme descrito em 4.1 foi usado para realizar um experimento de TVT em camundongos HA machos com 10-12 semanas de idade, 12 camundongos/grupo, a 96 h após administração de fármaco. Os resultados são mostrados na Tabela
8. Tabela 8 48 h de taxa de sobrevivência e 12 h de taxa de novo sangramento em experimento de TVT 96 h após administração de fármaco 48 h de taxa de 12 h de taxa de novo Nome sobrevivência sangramento Eloctato 50 % 91,7 % FL1F-30Y 8,3 % 91,7 % FL2F-30Y 16,7 % 83,3 % FL1F-40Y 63,6 % 54,5 % FL2F-40Y 54,5 % 54,5 % FL1F-50L 16,7 % 91,7 % FL2F-50L 25,0 % 83,3 %
[0182] Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo de Eloctato sem modificação de PEG, FL1F-40Y/FL2F-40Y tem taxa de sobrevivência ligeiramente aprimorada, e taxa de novo sangramento de 12 h significativamente reduzida. FL1F-40Y/FL2F-40Y têm taxa de sobrevivência significativamente aprimorada em comparação com outros grupos, e taxa de novo sangramento de 12 h significativamente reduzida em comparação com outros grupos. Portanto, os grupos FL1F-40Y/FL2F-40Y têm um tempo de prevenção mais longo do que outros grupos no modelo transsectados de veia de cauda de camundongos com hemofilia A.
[0183] O exposto acima são apenas modalidades preferenciais da presente revelação e não se destinam a limitar a presente revelação.
Qualquer modificação, substituição equivalente ou aprimoramento feito dentro do espírito e do princípio da presente revelação devem estar incluídos no escopo de proteção da presente revelação.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES1. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol caracterizada pelo fato de que uma fração ativa de fator de coagulação VIII (FVIII) é direta ou indiretamente ligada a um parceiro de fusão para prolongar a meia-vida por meio de um ligante de peptídeo para formar a proteína de fusão, e a proteína de fusão é adicionalmente conjugada ao polialquileno glicol, e em que fração ativa de fator de coagulação VIII compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 2.2. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o parceiro de fusão é um fragmento Fc de IgG que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre: (i) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, (ii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e (iii) a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:5.3. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o polialquileno glicol é polipropileno glicol ou polietileno glicol; o polialquileno glicol é capeado na extremidade com metóxi; o polialquileno glicol é linear ou ramificado, de preferência, polietileno glicol ramificado, especialmente polietileno glicol terminado em metóxi especialmente ramificado; o peso molecular do polialquileno glicol pode ser ≥1, ≥10, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80, ≥90, ≥100, ≥110, ≥120, ≥130, ≥140, ≥150 ou ≥160 kDa.4. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a conjugação da proteína de fusão e do polialquileno glicol está em uma posição aleatória ou específica, e a posição de conjugação é selecionada a partir do grupo que consiste em um grupo amino livre, grupo sulfidrila, grupo açúcar e/ou grupo carboxila, de preferência, grupo amino livre.5. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que um modificador é usado para a conjugação, e o modificador pode estar na forma de um éster ativado, por exemplo, o modificador é selecionado dentre modificadores representados pela fórmula (1), (2) ou (3): (1) em que 0≤m1≤6, e m1 é, de preferência, 5; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi;(2) em que 0≤m2≤6, e m2 é, de preferência, 2; 0≤m3≤6, e m3 é, de preferência, 1; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi; ou (3) em que, 0≤m4≤6, e m4 é, de preferência, 2; e mPEG representa um grupo polietileno glicol terminado em monometóxi.6. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a fração ativa de fator de coagulação VIII está ligada ao parceiro de fusão por meio de um ligante de peptídeo, e o ligante de peptídeo inclui um segmento de peptídeo flexível e/ou um segmento de peptídeo rígido, por exemplo, incluindo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dos segmentos de peptídeo rígido.7. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o segmento de peptídeo flexível compreende 2 ou mais resíduos de aminoácido selecionados dentre glicina, serina, alanina e treonina, de preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma fórmula geral (GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d, em que a, b, c e d são números inteiros maiores ou iguais a 0, e a+b+c+d≥1, com mais preferência, o segmento de peptídeo flexível tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6); (ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 7); (iii) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 8); (iv) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 9); e (v) GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 10).8. Proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o segmento de peptídeo rígido é o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana, ou o segmento de peptídeo rígido tem pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com o peptídeo de terminal carbóxi de subunidade β de gonadotropina coriônica humana; o segmento de peptídeo rígido pode compreender 1, 2 ou mais sítios de glicosilação; de preferência, o segmento de peptídeo rígido compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre: (i) PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 11); (ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 12); (iii) SSSSKAPPPS (SEQ ID NO: 13); e (iv) SRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 14); com mais preferência, o ligante de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15.9. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade eficaz da proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um carreador farmaceuticamente aceitável.10. Uso da proteína de fusão de fator de coagulação VIII conjugada com polialquileno glicol conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para prevenir e/ou tratar doenças hemorrágicas, em que a doença hemorrágica é selecionada dentre doenças hemorrágicas em pacientes com deficiência congênita ou adquirida de FVIII, e sangramento espontâneo ou cirúrgico em pacientes com hemofilia A.
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