RU2789085C2 - Улучшенный белок слияния fviii и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат слитого белка фактора свертывания крови VIII с полиалкиленгликолем для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний, фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний и способ предотвращения или лечения геморрагических заболеваний. В одном варианте реализации конъюгат содержит активную составляющую фактора свертывания крови VIII с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или 2 и полиалкиленгликоль представляет собой разветвленный полиэтиленгликоль с молекулярной массой 40 кДа. Изобретение расширяет арсенал средств для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка испрашивает приоритет китайской патентной заявки 201810481941.X, поданной в Китайское патентное ведомство 18 мая 2018 г. под названием «IMPROVED FVIII FUSION PROTEIN AND USE THEREOF», содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области рекомбинантных белков слияния фактора свертывания крови VIII человека, в частности к полипептиду слияния с пролонгированным периодом полужизни, а также к способу их получения и их применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гемофилия А - это наследственное нарушение свертываемости крови, вызванное недостаточной активностью или дисфункцией фактора свертывания крови VIII (FVIII), при котором добавка активного FVIII является эффективным терапевтическим лечением. Ген FVIII - один из самых длинных клонированных генов, а молекула FVIII - это белковый лекарственный препарат с наибольшей молекулярной массой, используемое в клинической практике. Белок FVIII содержит 6 доменов: три домена Α (Α1, А2, A3), необязательный центральный домен (В-домен) и два домена С (C1, С2). Уровень экспрессии рекомбинантного FVIII in vitro значительно ниже, чем у других генов со схожими свойствами. Например, уровень экспрессии FVIII составляет только 1% от уровня экспрессии FIX. Кроме того, поскольку период полужизни FVIII в крови составляет только 8-12 часов, пациентам с тяжелой формой гемофилии А необходимо проводить профилактическое лечение и вводить его внутривенно (в/в) около 3 раз в неделю.

Гибрид мономера-димера рекомбинантного белка слияния FVIII-Fc (Элокейт), разработанный Bioverativ (США), был одобрен для продажи FDA США в июне 2014 года. Клинические данные демонстрируют, что его период полужизни в организме человека увеличивается только в 1,5-1,7 раза (Dumont JA et al., Blood, 2012, 119: 3024-3030; Powell JS et al., Blood, 2012, 119: 3031-3037), а инъекции необходимы каждые 3-5 дней. Однако в клетках HEK-293, трансфицированных двойным вектором экспрессии rFVIII Fc и Fc, сконструированным Bioverativ, гомодимеры rFVIIIFc не были обнаружены в продуктах экспрессии, как ожидалось, и были экспрессированы только гибридный мономер-димер белка слияния rFVIIIFc и Fc димер. Для этого исследователи компании предположили, что клетка-хозяин не может секретировать гомодимерный белок rFVIIIFc с молекулярной массой около 400 кДа из-за избыточной молекулярной массы гомодимера, или что мономеры rFVIIIFc не могут полимеризоваться из-за стерических затруднений. (Peters RT et al., J Thromb Haemost, 2013, 11(1): 132-41). Можно видеть, что производство белка слияния FVIII в гомодимерной форме довольно сложно.

Для приготовления лекарственных средств длительного действия белковых составов обычно используют полимеры с высокой растворимостью (такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ)) для химической модификации поверхности белковых лекарственных препаратов. Как правило, чем выше скорость модификации, тем очевиднее снижение антигенности и активности белка. Сообщалось о примерах применения полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения полужизни FVIII, например, Novonordisk (N8-GP), Bayer (BAY94-9027) и Baxter (Вах 855) все разработали ПЭГилированные продукты FVIII длительного действия, которые вошли в клинические исследования. Однако данные фармакокинетических исследований продемонстрировали, что ПЭГилированный FVIII не имеет значительно продленного периода полужизни (Tiede A et al., J Thromb Haemost. 2013; 11: 670-678); (Coyle Τ et al., Haemophilia. 2012; 18 (Suppl 3): 22); (Turecek PL et al., Hamostaseologie, 2012, 32 Suppl 1: S29-38).

Стратегии разработки белковых лекарственных препаратов длительного действия включают гликозилирование, ПЭГилирование, образование белка слияния с альбумином, трансферрином, Fc, XTEN и так далее. В данное время в коммерческих лекарственных препаратах длительного действия используется только одна из вышеперечисленных стратегий для увеличения периода полужизни белка. В литературе нет сообщений о комбинации двух или более из вышеперечисленных стратегий, особенно о комбинации ПЭГилирования и слияния с белком, и нет сообщающей в литературе о том, что две или более стратегии могут увеличить период полужизни, чем когда адаптируется только одна стратегия.

Больным гемофилией необходимо пожизненное переливание факторов свертывания крови, чтобы остановить кровотечение и предотвратить кровотечение. Поэтому исследователи постоянно ищут факторы свертывания с более длительным периодом полужизни, чтобы уменьшить количество введений. Кроме того, поддержание хорошей биологической активности при увеличении периода полужизни является трудной проблемой, с которой сталкиваются исследователи.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

После многих лет исследований и длительных экспериментов изобретатели обнаружили, что, когда фактор свертывания VIII сливается с партнером по слиянию (таким как сегмент Fc, альбумин, XTEN или трансферрин), и полученный белок слияния дополнительно конъюгирован с полимером, таким как полиалкиленгликоль, например, ПЭГ, включая мПЭГ, который может эффективно улучшать стабильность белка in vivo, особенно когда конъюгированная часть имеет разветвленную структуру и когда молекулярная масса конъюгированной части больше чем или равна 35 кДа, например 40 кДа. На этом и было завершено данное изобретение.

Данное изобретение предоставляет следующие технические решения.

1. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем, который представляет собой белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем, при этом фактор свертывания крови VIII (FVIII) в качестве активного фрагмента прямо или косвенно связан пептидным линкером с партнером слияния для продлевания периода полужизни с образованием белка слияния, и белок слияния дополнительно конъюгирован с полиалкиленгликолем.

2. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения, при этом фактор свертывания крови VIII в качестве активной части получен от человека, такой как полноразмерный или усеченный фактор свертывания крови VIII человека (например, фактор свертывания крови VIII с удаленным В-доменом человека); при этом полноразмерный или усеченный фактор свертывания крови VIII человека может содержать 1 или более аминокислотных мутаций при условии, что он все еще сохраняет активность FVIII, например, фактор свертывания крови VIII в качестве активного фрагмента содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2, или имеет по меньшей мере 90%, 95% или более идентичности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1 или 2.

3. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом партнер слияния представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина, альбумин, трансферрин или XTEN, а партнер слияния получен от, например, человека, предпочтительно, Fc-фрагмента IgG, например, Fc-фрагмента IgG со сниженным эффектом ADCC и/или эффектом CDC и/или повышенной аффинностью связывания с рецептором FcRn, более предпочтительно Fc фрагмент IgG, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из:

(i) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3,

(ii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и

(iii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5.

4. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом

полиалкиленгликоль представляет собой полипропиленгликоль или полиэтиленгликоль;

полиалкиленгликоль может иметь кэппирован на конце, например, кэппирован на конце алкоксигруппой, такой как метокси;

полиалкиленгликоль является линейным или разветвленным, предпочтительно разветвленным, например, разветвленным полиэтиленгликолем, особенно разветвленным полиэтиленгликолем с концевыми метоксигруппами;

молекулярная масса полиалкиленгликоля может быть >1, >10, >20,>30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >110, >120, >130, >140, >150 или >160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или между любыми двумя значениями.

5. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом положение конъюгации белка слияния и полиалкиленгликоля находится в случайном или специфическом положении, и положение конъюгирования выбрано из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и/или карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.

6. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в этом описании, используется для конъюгации, и модификатор может быть в форме активированного сложного эфира, например, модификатор выбирается из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3):

где 0≤m₁≤6 и m1 предпочтительно равняется 5; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси;

где 0≤m₂≤6 и m₂ предпочтительно равняется 2; 0≤m₃≤6 и m₃ предпочтительно равны 1; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; или

где 0≤m₄≤6 и m₄ предпочтительно равняется 2; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси.

7. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом активный фрагмент фактора свертывания крови VIII связан с партнером по слиянию через пептидный линкер, и пептидный линкер содержит гибкий пептидный сегмент и/или жесткий пептидный сегмент, например, включая 1, 2, 3, 4, 5 или более жестких пептидных сегментов.

8. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, при этом гибкий пептидный сегмент содержит 2 или более аминокислотных остатков, выбранных из глицина, серина, аланина и треонина,

предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет общую формулу (GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d, где а, b, с и d являются целыми числами, большими чем или равными 0, и a+b+c+d≥1,

более предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

9. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом жесткий пептидный сегмент представляет собой карбоксиконцевой пептид β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или жесткий пептидный сегмент содержит не менее 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичности карбоксиконцевому пептиду β-субъединицы хорионического гонадотропина человека; жесткий пептидный сегмент может содержать 1, 2 или более сайтов гликозилирования;

предпочтительно, жесткий пептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

более предпочтительно, пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.

10. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Способ предотвращения и/или лечения геморрагических заболеваний, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, конъюгата по данному описанию или фармацевтической композиции по данному описанию, при этом геморрагические заболевания предпочтительно выбираются из геморрагических заболеваний у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом FVIII, и спонтанным или хирургическим кровотечением у пациентов с гемофилией А.

12. Способ увеличения периода полужизни фактора свертывания крови VIII, при этом активная часть фактора свертывания крови VIII прямо или косвенно связана пептидным линкером с партнером по слиянию для продления периода полужизни, а затем дополнительно конъюгирована с полиалкиленгликолем.

13. Способ согласно варианту осуществления данного изобретения, в котором партнер слияния представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина, альбумин, XTEN или трансферрин, а партнер слияния происходит, например, от человека, предпочтительно Fc-фрагмента IgG, например, Fc-фрагмента IgG со сниженным эффектом ADCC и/или эффектом CDC и/или повышенным сродством связывания с рецептором FcRn, более предпочтительно с Fc фрагментом IgG, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из:

(i) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 3,

(ii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4, и

(iii) аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5.

14. Способ согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, в котором

полиалкиленгликоль представляет собой полипропиленгликоль или полиэтиленгликоль;

полиалкиленгликоль может иметь кэппирован на конце, например, кэппирован на конце алкоксигруппой, такой как метокси;

полиалкиленгликоль является линейным или разветвленным, предпочтительно разветвленным, например, разветвленным полиэтиленгликолем, особенно разветвленным полиэтиленгликолем с концевыми метоксигруппами;

молекулярная масса полиалкиленгликоля может быть >1, >10, >20, >30, >40, >50, >60, >70, >80, >90, >100, >110, >120, >130, >140, >150 или >160 кДа, например 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 кДа, или между любыми двумя значениями.

15. Способ в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, в котором конъюгация белка слияния и полиалкиленгликоля происходит в случайном или конкретном положении, и положение конъюгирования выбирается из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.

16. Способ в соответствии с другим вариантом осуществления данного изобретения, в котором модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в этом описании, используется для конъюгации, и модификатор может быть в форме активированного сложного эфира, более предпочтительно модификатор выбирается из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3)

где любой модификатор активированной сложноэфирной формы используется для конъюгации, например, модификатор выбран из модификаторов, представленных формулами (1), (2) и (3):

где 0≤m₁≤6 и m₁ предпочтительно равняется 5; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (1) составляет между 5 до 60 кДа;

где 0≤m₂≤6, и m₂ предпочтительно равняется 2; 0≤m₃≤6, и m₃ предпочтительно равно 1; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (2) составляет между 5 до 100 кДа, предпочтительно 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, более предпочтительно 40 кДа;

где 0≤m₄≤6 и m₄ предпочтительно равняется 2; мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси; и молекулярная масса модификатора в формуле (3) составляет между 5 до 100 кДа.

17. Способ согласно некоторым вариантам осуществления данного изобретения, в котором фактор свертывания крови VIII связан с партнером по слиянию через пептидный линкер, и пептидный линкер содержит гибкий пептидный сегмент и/или жесткий пептидный сегмент, например, включая 1, 2, 3, 4, 5 или более жестких пептидных сегментов.

18. Способ согласно варианту осуществления данного изобретения, в котором гибкий пептидный сегмент содержит 2 или более аминокислотных остатка, выбранных из глицина, серина, аланина и треонина,

предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет общую формулу (GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d, где а, b, с и d являются целыми числами, большими чем или равными 0, и a+b+c+d≥1,

более предпочтительно, гибкий пептидный сегмент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

19. Белок слияния фактора свертывания крови VIII, конъюгированный с полиалкиленгликолем в соответствии с некоторыми вариантами осуществления данного изобретения, при этом жесткий пептидный сегмент представляет собой карбоксиконцевой пептид β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, или жесткий пептидный сегмент содержит не менее 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичности карбоксиконцевому пептиду β-субъединицы хорионического гонадотропина человека; жесткий пептидный сегмент может содержать 1, 2 или более сайтов гликозилирования;

предпочтительно, жесткий пептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

более предпочтительно, пептидный линкер содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Для более ясного объяснения вариантов осуществления данного изобретения и технических решений предшествующего уровня техники ниже кратко представлены графические материалы, которые необходимо использовать в вариантах осуществления данного изобретения и предшествующем уровне техники. Очевидно, что графические материалы в нижеследующем описании представляют только некоторые варианты осуществления данного изобретения. Для специалистов в данной области техники другие варианты осуществления данного изобретения могут быть получены на основе этих графических материалов без творческой работы.

На Фиг. 1А продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc (FF-0) с помощью SEC-HPLC без модификации мПЭГ.

На Фиг. 1 В продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 5 кДа (FF-5L).

На Фиг. 1С продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 10 кДа (FF-10L).

На Фиг. 1D продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДа (FF-20L).

На Фиг. 1Е продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 30 кДа (FF-30L).

На Фиг. 1F продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FF-40L).

На Фиг. 2А продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Линкер 1-Fc (FL1F-0) с помощью SEC-HPLC без модификации мПЭГ (чистота >99%, агрегация <1%).

На Фиг. 2В продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДа (FL1F-20L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).

На Фиг. 2С продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 30 кДа (FL1F-30L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).

На Фиг. 2D продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FL1F-40L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).

На Фиг. 2Е продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного линейным мПЭГ с молекулярной массой 50 кДа (FL1F-50L) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).

На Фиг. 2F продемонстрированы результаты обнаружения FVIII-Ll-Fc с помощью SEC-HPLC, модифицированного Y-образным мПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (FL1F-40Y) (чистота >95%, агрегация <5%, несшитый <1%).

На Фиг. 3А продемонстрированы результаты обнаружения исходного раствора hFVIII-Fc (FF-0) с помощью SDS-PAGE без модификации мПЭГ до и после обмена с G25 (Н представляет восстанавливающие условия, F представляет невосстанавливающие условия).

На Фиг. 3В продемонстрированы результаты обнаружения (невосстановления) hFVIII-Fc с помощью SDS-PAGE, поперечно сшитого с мПЭГ с различными молекулярными массами (от FF-5L до FF-40L).

На Фиг. 3С продемонстрированы результаты обнаружения (восстановления) hFVIII-Fc с помощью SDS-PAGE, поперечно сшитого с мПЭГ с различными молекулярными массами (от FF-5L до FF-40L).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Чтобы определить цели, технические решения и преимущества данного описания более ясно, нижеследующее дополнительно подробно описывает данное описание со ссылкой на графические материалы и варианты осуществления данного изобретения. Очевидно, что описанные варианты осуществления данного изобретения являются только частью вариантов осуществления данного изобретения, а не всеми вариантами осуществления данного изобретения. На основе вариантов осуществления данного изобретения все другие варианты осуществления данного изобретения, полученные специалистами в данной области без творческой работы, должны подпадать под объем защиты данного описания.

Термин «фактор свертывания крови VIII», также называемый фактором VIII или FVIII, относится к большому и сложному гликопротеину, в основном продуцируемому клетками печени. Термин «активный фрагмент фактора свертывания крови УШ» относится к фрагменту белка слияния по данному изобретению, который проявляет активность FVIII. Природный FVIII человека состоит из 2351 аминокислот, включая сигнальный пептид, а также из нескольких различных доменов, определяемых гомологией: три домена А, один домен В и два домена С в порядке NH2-A1-A2-B-A3-C1-С2-СООН. В крови FVIII секретируется в виде гетеродимера, состоящего из двух цепей (расщепленных на границе В-А3), которые связаны ионами двухвалентных металлов. Цепь А1-А2-В называется тяжелой цепью (НС), а цепь А3-С1-С2 называется легкой цепью (LC).

Молекулы эндогенного фактора VIII циркулируют в организме в виде пула молекул с В-доменами разного размера. Постепенное ферментативное расщепление В-домена может происходить in vivo, приводя к образованию пула молекул с В-доменами разного размера. Обычно считается, что возникновение расщепления в положении 740 (здесь вырезается последняя часть В-домена) связано с активацией тромбина.

«Фактор свертывания крови VIII» в данном описании может относиться к природной последовательности дикого типа (такой как SEQ ID NO: 1), а также его вариантам, например, вариантному белку, полученному путем замен, делеций или вставок одной или более аминокислот, при сохранении активности фактора свертывания крови VIII.

В одном из вариантов осуществления данного изобретения, фактор свертывания крови VIII представляет собой молекулу с удаленным В-доменом, при этом оставшиеся домены по существу соответствуют аминокислотам 1-745 и 1640-2332 в SEQ ID NO: 1. Кроме того, молекула с удаленным В-доменом по данному описанию может иметь небольшие отличия от последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, то есть оставшиеся домены (т.е. три домена А и два домена С) могут иметь замены, добавления или делеций одной или более аминокислот на основе аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, например, имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных различий или около 1%, 2%, 3%, 4% или 5% отличия от последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2. Такие различия могут изменять связывающую способность фактора VIII с различными другими компонентами (такими как LRP, множественные рецепторы, другие факторы свертывания крови, поверхность клетки), или вводить и/или устранять гликозильные группы, сохраняя при этом основную активность фактора VIII.

Термин «партнер слияния» относится к полипептиду, который слит с целевым полипептидом (полипептид, период полужизни которого желательно увеличить). Партнер слияния может изменять свойства слитого белка с помощью множества различных механизмов, таких как увеличение периода полужизни целевого полипептида in vivo.

В одном из вариантов осуществления данного изобретения, партнер слияния задерживает клиренс FVIII in vivo за счет взаимодействия с неонатальным рецептором Fc (FcRn). В одном из вариантов осуществления данного изобретения, партнер слияния представляет собой Fc-участок иммуноглобулина (Fc-участок), альбумин, трансферрин, XTEN или их часть. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, Fc IgG является предпочтительным из-за его относительно длительного периода полужизни.

Домен Fc также можно модифицировать для изменения его функций, таких как связывание комплемента и/или связывание с определенными рецепторами Fc. Мутации в положениях 234, 235 и 237 в домене Fc IgG обычно приводят к снижению связывания с рецепторами FcyRI, а также могут приводить к снижению связывания с рецепторами FcyRIIa и FcyRIII. Такие мутации не изменяют связывание с рецептором FcRn, что способствует продлению периода полужизни циркуляции в кровотоке за счет путей эндоцитоза и рециркуляции. Предпочтительно, модифицированный домен Fc IgG гибридного белка в данном описании содержит одну или более таких мутаций, некоторые мутации (L234A, L235E и G237A) приводят к снижению аффинности к определенным рецепторам Fc, а другие (A330S и P331S) приводят к снижению C1q-опосредованного связывания комплемента.

Термин «полиалкиленгликоль» представляет собой гидрофильный полимер, который конъюгирован в определенном положении с фактором свертывания крови VIII и/или партнером слияния в данном описании. Полиалкиленгликоль может быть линейным или разветвленным и может содержать один или более независимо выбранных полимерных фрагментов. Предпочтительно полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (включая его форму с концевыми метоксигруппами, м-ПЭГ), полипропиленгликоль (включая mPPG) и т.д.

Полиалкиленгликоль в данном описании может быть полиэтиленгликолем (ПЭГ) и может быть линейным или разветвленным. Основная цепь разветвленного полимера хорошо известна в данной области техники. Обычно разветвленный полимер имеет центральную разветвленную часть ядра и одну или более цепей линейного полимера, соединенных с центральным разветвленным ядром. В данном описании предпочтительно используется разветвленная форма ПЭГ. В одном варианте осуществления данного изобретения, разветвленный полиэтиленгликоль может быть представлен общей формулой R(-PEG-OH)_m, где R представляет собой часть ядра, такую как глицерин или пентаэритрит, a m представляет собой количество плечей/ветвей.

В варианте осуществления данного изобретения, количество ветвей в разветвленном ПЭГ (таком как мПЭГ) равно 2, поэтому он также называется ПЭГ «Υ-типа» (например, мПЭГ), то есть разветвленный ПЭГ, содержащий два ПЭГ, или разветвленный ПЭГ содержащий линейный метокси-ПЭГ.

Примеры других подходящих полимеров включают, но не ограничиваются ими, другие полиалкиленгликоли (например, полипропиленгликоль (PPG), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля), полиоксиэтилированные полиолы, олефиновый спирт, полив инилпирролидон, полигидроксипропилметакриламид, поли([α]-гидроксикислота), поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-N-акрилоилморфолин и сополимеры, терполимеры и их смеси.

В варианте осуществления данного изобретения, используется модификация ПЭГ (т.е. конъюгация) и более предпочтительно модификация мПЭГ, при этом модификация находится в случайном или определенном положении, и положение модификации выбрано из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и/или карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, то есть полиалкиленгликоль или модифицированный полиалкиленгликоль в данном изобретении, используемый для случайной модификации свободной аминогруппы, может быть выбран из мПЭГ-SS (метоксиполиэтиленгликоль- сукцинимидилсукцинат), мПЭГ-SC (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилкарбонат), мПЭГ-SPA (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилпропионат) и мПЭГ-SG (метоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилглутарат) и так далее. Для N-концевой модификации выбирается один из мПЭГ-ALD (метоксиполиэтиленгликоль-ацетальдегид), мПЭГ-pALD (метоксиполиэтиленгликоль-пропиональдегид) и мПЭГ-bALD (метоксиполиэтиленгликоль-бутиральдегид) и так далее. Модификаторы мПЭГ-SS, мПЭГ-SC, мПЭГ-SPA, мПЭГ-SG, мПЭГ-ALD, мПЭГ-pALD, мПЭГ-bALD являются линейными или разветвленными.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, используемый для случайной модификации свободных сульфгидрильных групп, представляет собой мПЭГ-мал (метоксиполиэтиленгликоль-малеимид), мПЭГ-OPSS (метоксиполиэтиленгликольортопиридилдисульфид), мПЭГ-винилсульфон (метоксиполиэтиленгликоль-винилсульфон) и мПЭГ-тиол (метоксиполиэтиленгликоль-тиол) и др.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, модификатор, используемый для случайной модификации сахарной группы и/или карбоксильной группы, представляет собой мПЭГ-ZH (метоксиполиэтиленгликоль-гидразид).

В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (1):

где 0≤m₁≤6 и m₁ предпочтительно равняется 5; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (1), имеет молекулярную массу 5-60 кДа (кДа, килодальтон), предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (1), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной аминогруппе.

В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (2):

где 0≤m₂≤6 и m₂ предпочтительно равняется 2; 0≤m₃≤6 и m₃ предпочтительно равняется 1; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (2), имеет молекулярную массу 5-60 кДа, предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (2), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной аминогруппе.

В варианте осуществления данного изобретения, модификатор для модификации имеет структуру, продемонстрированную в формуле (3):

где 0≤m₄≤6 и m₄ предпочтительно равняется 2; и мПЭГ представляет собой группу полиэтиленгликоля с концевыми монометокси. Модификатор, представленный формулой (3), имеет молекулярную массу 5-60 кДа, предпочтительно 40 кДа. Предпочтительно, в одном из вариантов осуществления данного изобретения, модификатор, представленный формулой (3), используется для случайной модификации мПЭГ по свободной сульфгидрильной группе.

Размер остова полимера может варьироваться, но типичный диапазон размеров полимеров (таких как ПЭГ, мПЭГ, PPG или mPPG) составляет от около 0,5 кДа до около 160 кДа, например от около 1 кДа до около 100 кДа. Более конкретно, размер каждого гидрофильного полимера, конъюгированного в данном описании, в основном варьируется в следующих диапазонах: от около 1 кДа до около 80 кДа, от около 2 кДа до около 70 кДа; от около 5 кДа до около 70 кДа; от около 10 кДа до около 60 кДа, от около 20 кДа до около 50 кДа; от около 30 кДа до около 50 кДа или от около 30 кДа до около 40 кДа. Следует понимать, что эти размеры представляют собой приблизительные значения, а не точные измерения, как известно в данной области техники.

В конкретном варианте осуществления данного изобретения, размер ПЭГ или мПЭГ, используемые в данном описании, составляет более 35 кДа (т.е. не менее чем 35 кДа), предпочтительно не менее чем 40 кДа, не менее чем 45 кДа, не менее чем 50 кДа, не менее чем 55 кДа, не менее чем 60 кДа, не менее чем 65 кД или не менее чем 70 кДа, например, молекулярная масса конкретно составляет 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 110 кДа, 120 кДа, 130 кДа, 140 кДа, 150 кДа или 160 кДа.

Термин «улучшенный период полужизни циркуляции» означает, что молекулы по данному описанию имеют измененный период полужизни циркуляции (период полужизни плазме), предпочтительно увеличенный период полужизни циркуляции по сравнению с фактором VIII дикого типа. Период полужизни циркуляции предпочтительно увеличивается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 25%, предпочтительно по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 35%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 100%, более предпочтительно по меньшей мере 125%, более предпочтительно по меньшей мере 150%, более предпочтительно по меньшей мере 175%, более предпочтительно по меньшей мере 200%, и более предпочтительно по меньшей мере 250% или 300%. Еще более предпочтительно, чтобы период полужизни циркуляции молекулы увеличивался по меньшей мере на 400%, 500%, 600% или даже 700%.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает, но не ограничивается ими: физиологический раствор, буфер, глюкозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Как правило, фармацевтический препарат должен подходить для способа введения. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть изготовлена в форме инъекции, например, обычными способами с физиологическим раствором или водным раствором, содержащим глюкозу и другие адъюванты. Фармацевтическая композиция должна производиться в асептических условиях. Количество вводимого активного ингредиента является терапевтически эффективным. Фармацевтический препарат по данному изобретению также может быть приготовлен в виде препарата с замедленным высвобождением.

Примеры

Пример 1

Получение и очистка мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII 1,1. Получение мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII

1.1.1 Серии плазмид для экспрессии белка слияния hFVIII были сконструированы в соответствии с технологией молекулярного клонирования, хорошо известной специалистам в данной области техники, и плазмиды для экспрессии были соответственно трансфицированы в DHFR-дефицитные клетки СНО (см. Патент США 4818679) для экспрессии каждого белка слияния hFVIII (таблица 1). Для конкретных стадий получения белка слияния см. китайский патент ZL201610692838.0, который полностью включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.

означает, что линкер образован путем соединения жесткого пептидного сегмента, показанного в SEQ ID NO: 11 с С-концом гибкого пептидного сегмента, показанного в SEQ ID NO: 6.

1.1.2. Бульон ферментации каждого белка слияния в 1.1.1 центрифугировали, фильтровали и затем подвергали аффинной хроматографии/хроматографии гидрофобного взаимодействия/ионообменной хроматографии/эксклюзионной хроматографии для получения пяти белков слияния hFVIII FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F (полноразмерный) L1F'-0 и F (полноразмерный) L2F"- 0, для которых обнаружение с помощью SEC-HPLC показало, что агрегация составляла менее чем 5%. Пять белков слияния hFVIII были соответственно составлены в исходные растворы белков слияния hFVIII с концентрацией белка 0,95 мг/мл.

1.1.3. 5 мл каждого из пяти исходных растворов белка слияния hFVIII, приготовленных в 1.1.2, подвергали хроматографии на молекулярных ситах G25 (GE Healthcare). Конкретный процесс заключался в следующем.

Приготовление буфера: 20 мМ Hepes, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl₂, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0;

Хроматография

(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока была стабильной на уровне 150 см/ч.

(2) Загрузка образца: скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.

(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока была стабильной на уровне 150 см/ч.

(4) Равновесие: хроматографическая колонка уравновешивается буфером, и пики собирались с А280/А260 более чем 1,8.

(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,2 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали буфером.

(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.

Концентрация ультрафильтрации: концентрировали исходные растворы пяти белков слияния hFVIII (FF-0, FL1F-0, FL2F-0, F (полноразмерный) L1F'-0 и F (полноразмерный) L1F''- 0) после обмена G25 путем ультрафильтрации с помощью фильтрующей пробирки для ультрафильтрации для 50 кДа, и концентрировали центрифугированием при 3800 об/мин, 4°С до концентрации белка предпочтительно 1,5 мг/мл.

1.1.4. Требуемый мПЭГ-SC (линейный L-образный мПЭГ-SC со структурой, показанной в формуле (1) с молекулярной массой 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа или 30 кДа, 40 кДа, соответственно, и разветвленный Y-образный мПЭГ-SC со структурой, показанной в формуле (2), с молекулярной массой 40 кДа) (Beijing jenkem Technology Co., Ltd.) взвешивали в соответствии с молярным отношением белка слияния hFVIII к мПЭГ-SC, равным 1:10-1:100. Его добавляли к концентрированному белку слияния hFVIII после ультрафильтрации в 1.1.3 и давали реагировать в течение 4 часов. Затем для прекращения реакции добавляли гистидин в 10-кратном молярном соотношении к субстрату белку слияния hFVIII, чтобы получить белок слияния hFVIII, модифицированный мПЭГ-SC, с различными молекулярными массами. Количество и состав некоторых модифицированных продуктов показаны в Таблице 2 ниже.

1.2 Очистка мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII.

1.2.1. Каждый белок слияния hFVIII, модифицированный мПЭГ, полученный согласно 1.1.4. Примера 1, подвергали хроматографии на молекулярных ситах S200 (GE Healthcare) соответственно. Конкретный процесс заключался в следующем.

Приготовление буфера: 20 мМ гистидин, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl₂, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0.

Хроматография

(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.

(2) Загрузка образца: скорость потока образца контролировалась на уровне 150 см/ч.

(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.

(4) Равновесие: хроматографическая колонка уравновешивается буфером, и пики собирались с А280/А260 более чем 1,8.

(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,2 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали буфером.

(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.

1.2.2. Хроматографические продукты, полученные согласно 1.2.1. подвергали анионной хроматографии Source 15Q (GE Healthcare).

Приготовление буфера

Связывающий буфер: 20 мМ гистидин, 0,1 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl₂, 0,02% Твин 8,0, рН 7,0; буфер для элюирования: 20 мМ гистидин, 2,0 Μ NaCl, 5,0 мМ CaCl₂, 0,02% Твин 8. 0, рН 7,0; CIP: 0,5М NaOH.

Хроматография

(1) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.

(2) Загрузка образца: скорость потока была равномерной на уровне 150 см/ч.

(3) Равновесие: хроматографическая колонка была уравновешена 3-кратным объемом колонки связывающего буфера до тех пор, пока рН и проводимость не стали такими же, как у буфера, и скорость потока контролировалась на уровне 150 см/ч.

(4) Элюирование: Образец элюировали буфером В в 20 раз превышающим объем колонки с линейным градиентом 0-100% при равномерной скорости потока 100 см/ч. Пики элюирования с А280/А260 более чем 1,8 собирали в отдельные пробирки и подвергали определению с помощью SEC-HPLC.

(5) Очистка хроматографической колонки in situ: колонку очищали в обратном порядке с 0,5 Μ NaOH в объеме в 1,5 раза превышающим объем колонки при скорости потока 60 см/ч и нейтрализовали связывающим буфером.

(6) Хранение хроматографической колонки: после эксперимента колонку очищали очищенной водой в объеме в 3 раза превышающей объем колонки, при скорости потока 100 см/ч, а затем хранили с 2-кратным объемом колонки 20% этанола.

1.3.2. Обнаружение при помощи SEC-HPLC.

Хроматографические продукты, полученные в 1.2.2. подвергали обнаружению при помощи SEC-HPLC.

Колонка: G3000/G4000; Скорость потока: 0,5 мл/мин; Длина волны обнаружения: 280 нм; Температура колонки: 25°С; Объем инъекции: 100 мкл (количество инъекции: 20 мкг); Мобильная фаза: 0,30 Μ хлорида натрия, 0,02 Μ имидазола, 0,01 Μ хлорида кальция, 25 ч/млн Твин 80, 10% этанола, рН 7,0; Время запуска: 35-50 мин.

Результаты обнаружения от FF-0 до FF-40L показаны на Фиг. 1A-1F. Результаты обнаружения от FL1F-0 до FL1F-50L и FL1F-40Y показаны на Фиг. 2A-2F. Эти результаты показывают, что для FL1F-0 до FL1F-60L чистота составляет >95%, полимер составляет <5%, а количество несшитых частиц составляет <1%.

1.2.4. Обнаружение при помощи гель-электрофореза в SDS-PAGE.

Продукты, полученные согласно 1.2.2. подвергали обнаружению с помощью SDS-PAGE.

(1) Приготовление геля. 1 × Трис-глициновый буфер для электрофореза: SDS 0,4 г, трис-основа 1,21 г, глицин 7,5 г и бидистиллированная вода чтобы довести до 400 мл.

5% стекирующий гель: бидистиллированная вода 4,1 мл, 1М трис-HCl (рН 6,8) 0,75 мл, 30% (мас./об.) полиакриламид 1 мл, 10% (мас./об.) персульфат аммония 60 мкл, 10% (мас./об.) SDS 60 мкл, TEMED 6 мкл.

6% разделяющий гель: бидистиллированная вода 4,9 мл, 1,5 Μ Трис-HCl (рН 8,8) 3,8 мл, 30% (мас./об.) полиакриламид 6 мл, 10% (мас./об.) персульфат аммония 150 мкл, 10% (мас./об.) SDS 150 мкл, TEMED 6 мкл.

(2) 5 × буфер для загрузки белка: глицерин 5 мл, 1М трис-HCl (рН 6,8) 2,5 мл, бромфеноловый синий 0,05 г, SDS 1 г, бидистиллированная вода чтобы довести до 10 мл, хранимая при 4°С, и 0,5 мл β-меркаптоэтанола добавляли перед использованием.

(3) Подготовка образца: образец для тестирования смешивали с равным объемом буфера для загрузки. Для восстановления SDS-PAGE добавляли 0,1 мг/мл 2-меркаптоэтанола в том же объеме, что и образец, а для невосстанавливаемого SDS-PAGE 2-меркаптоэтанол не добавляли. После того, как образец был смешан с буфером для загрузки, его нагревали в кипящей воде в течение 10 минут.

(4) Электрофорез: 10 мкл тестируемого образца и белковый маркер загружали в лунки геля соответственно и подвергали электрофорезу при напряжении 60 В. После того, как краситель бромфеноловый синий попал в разделяющий гель, напряжение увеличивали до 120 В, пока краситель бромфеноловый синий не достигал дна разделяющего геля, затем электропитание отключали.

(5) Окрашивание: гель SDS-PAGE осторожно удаляли и помещали в пластиковую коробку, содержащую окрашивающий раствор кумасси бриллиантовый синий, а затем коробку помещали в микроволновую печь для нагревания в течение 1 минуты.

(6) Обесцвечивание: окрашенный гель SDS-PAGE помещали в обесцвечивающий раствор и обесцвечивали при встряхивании, обесцвечивающий раствор меняли каждые 2 часа и прекращали после появления прозрачной полосы, видимой невооруженным глазом.

(7) Запись: готовый гель SDS-PAGE фотографировали или сушили и хранили. На Фиг. 3а-3с показаны результаты обнаружения FF-5L в FF-40L с помощью SDS-PAGE.

Пример 2

Непрямое определение активности in vitro белка слияния мПЭГ-модифицированного hFVIII с помощью анализа хромогенного субстрата

Анализ хромогенного субстрата использовали для определения активности мПЭГ-модифицированного белка слияния hFVIII, полученного в Примере 1. Использовали набор ChromogenixCoatest FVIII (Chromogenix, Ref. K824086). Принцип обнаружения представляет собой: после активации тромбином, в присутствии фосфолипидов и ионов кальция, FVIIIa связывается с FLXa с образованием ферментного комплекса, который может активировать фактор X, чтобы преобразовать его в его активную форму Ха, тогда активный Ха может, в свою очередь, расщеплять свой специфический хромогенный субстрат (S-2765) и высвобождает хромофор pNA. Измеряя количество pNA при 405 нм, можно определить активность FXa, которая прямо пропорциональна количеству FXa. Поскольку содержание фактора ГХа и фактора X в системе избыточно, активность FXa напрямую связана только с содержанием FVIIIa. Результаты непрямого определения биологической активности FVIII с помощью анализа хромогенного субстрата представлены в Таблице 3.

Пример 3

Определение титра фактора VIII человека.

Анализ для определения титра фактора свертывания VIII, используемый в данном описании, также упоминается как одностадийный анализ свертывания. Конкретные шаги, относятся к третьей части Китайской фармакопеи (версия 2010 г.). Одностадийный анализ свертывания на биологическую активность FVIII был основан на способности корректировать плазму с дефицитом FVIII для продления времени свертывания. Использовали набор плазмы с дефицитом фактора свертывания VIII (кат. № OTXW17) от фирмы Siemens (Германия). Анализ выполняли как: во-первых, концентрат фактора VIII Международного стандартного стандарта ВОЗ 8-го международного стандартного вещества (кат. No. 07/350) с известным титром разбавляли до 4 МЕ/мл, а затем подвергали градиентному разбавлению для достижения различных титров (МЕ/мл); эти стандартные образцы были смешаны с плазмой, дефицитной по FVIII, для измерения активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ); для построения стандартной кривой использовали линейную регрессию логарифма титра (МЕ/мл) активного стандартного раствора FVIII против логарифма соответствующего времени(времен) свертывания; затем исследуемый образец разбавляли и смешивали с плазмой, дефицитной по FVIII, и проводили измерение АРТТ. Путем подбора стандартной кривой можно определить активность образцов FVIII, и специфическая активность в МЕ/мг образцов FVIII была рассчитана. Результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 3 и Таблица 4 показывают, что биологическая активность FL1F-40Y, FL2F-40Y, F(полноразмерный) L1F'-40Y и F(полноразмерный) L2F''-40Y, измеренная с помощью анализа хромогенного субстрата и одностадийного анализа свертывания ниже, чем у Элокейт/FL1F-0/FL2F-0 без модификации мПЭГ. Это связано с влиянием модификации мПЭГ на пространственную структуру модифицированного белка, и другие мПЭГ-модифицированные белки (например, PEG-INTRON, Pegfilgrastim) в предшествующем уровне техники показывают аналогичные результаты. Неожиданно белки слияния FVIII Fc, модифицированные мПЭГ 40 кДа или выше, все еще могут сохранять относительно высокую активность. Кроме того, последующие эксперименты верифицировали, что период полужизни этих белков значительно продлен.

Пример 4

Фармакодинамический тест с использованием модели кровотечения из пересеченной хвостовой вены у мышей с гемофилией А.

В этом примере время полужизни каждого из мПЭГ-модифицированных белков слияния hFVIII у мышей с гемофилией А (мыши НА) сравнивали с помощью экспериментов по пересечению хвостовой вены (TVT).

4,1. В соответствии с методами, описанными в литературе, самцов мышей НА в возрасте 10-12 недель (приобретенных в Шанхайском Южном центре модельных биологических исследований) случайным образом делили на группы по 12 мышей в каждой группе. Мышам вводили лекарственные средства, то есть белки слияния, модифицированные мПЭГ, по данному изобретению или положительный контроль Элокейт через хвостовую вену в дозе 15 МЕ/кг соответственно. Через 48 часов после введения лекарственного средства хвост был измерен и помечен канюлей с внутренним диаметром 2,7 мм, и выполнено пересечение левой боковой вены хирургическим лезвием с прямым краем калибра 11. После пересечения хвост сразу помещали в пробирку, содержащую 13 мл предварительно нагретого физиологического раствора, и записывали время кровотечения. После остановки кровотечения (отсутствие очевидного кровотечения из разреза) хвост мыши вынимали из пробирки с физиологическим раствором, а затем мышь помещали на грелку при 37°С для поддержания температуры тела, стараясь не прикасаться к ране. После того, как мышь просыпалась, ее помещали в клетку с белой бумагой на дне, каждое животное в отдельную клетку. Белую бумагу или клетку заменяли после каждого наблюдения, чтобы определить степень кровотечения. Подсчитывали выживаемость мышей в течение 48 часов и количество повторных кровотечений в течение 12 часов (подсчитывали всего 12 часов, и многократное кровотечение в течение одного часа считали одним кровотечением) после пересечения хвоста. Результаты представлены в Таблице 5.

Частота повторного кровотечения относится к доле мышей с повторным кровотечением в течение периода эксперимента. Уровень тяжелого кровотечения относится к доле мышей с тяжелым кровотечением (+++) или множественными умеренными кровотечениями (++) в течение 12-часового периода. Среди них к умеренному кровотечению (++) относится: на белой бумаге много пятен крови с площадью покрытия не менее чем 30%, а пятна крови не очень яркого цвета, но лужа крови большой площади (площадь >3 см²); к тяжелому кровотечению (+++) относятся: на белой бумаге много пятен крови с площадью покрытия не менее чем 30%, пятна крови яркого цвета, и есть лужи крови с большой площадью; в некоторых случаях, даже если зона покрытия мала, мышей можно считать имеющими сильное кровотечение, когда мыши теряют много крови, диапазон движений уменьшается, а белая бумага сильно пропитана кровью.

Результаты показывают, что по сравнению с группами Элокейт/РЫР-0/РЬ2Р-0 без модификации мПЭГ, группой FL1F-40Y, группой FL2F-40Y, группой Р(полноразмерный) L1F'-40Y и группой Р(полноразмерный) L2F''-40Y группа имеет уровень выживаемости 83,3%, 75,0%, 83,3% и 83,3% соответственно, что значительно выше, чем у других групп. Кроме того, в этих группах частота повторных кровотечений в течение 12 часов и частота сильных кровотечений значительно ниже, чем в других группах. Следовательно, FL1F-40Y, FL2F-40Y, Р(полноразмерный) L1F'-40Y и Р(полноразмерный) L2F''-40Y обеспечивают более длительное время защиты в модели пересечения хвостовой вены у мышей с гемофилией А.

4,2. Тот же метод, описанный в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на самцах мышей НА в возрасте 10-12 недель, 12 мышей в группе, через 84 часа после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 6.

Результаты показывают, что по сравнению с Элокейт и другими группами без модификации ПЭГ, группа FL1F-40Y, группа FL2F-40Y, группа F (полноразмерный) L1F'-40Y и группа F (полноразмерный) L2F''- 40Y частота выживаемости составляет 66,7%, 75,0%, 75,0% и 75,0% соответственно, что значительно выше, чем в других группах, а частота повторного кровотечения значительно снижена. Таким образом, FL1F-40Y, FL2F-40Y, F (полноразмерный) L1F'-40У и F (полноразмерный) L2F''-40У по-прежнему демонстрируют определенный эффект на предотвращение кровотечения в модели пересечения хвостовой вены у мышей с гемофилией А 84 ч после приема препарата.

4.3. Тот же метод, что описан в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на мышах НА в возрасте 10-12 недель, 20 мышей (10 самцов и 10 самок)/группа через 90 часов после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 7.

Результаты показывают, что FL1F-50L имеет аналогичную выживаемость и частоту повторного кровотечения по сравнению с группой Elocateate без модификации ПЭГ. Поскольку экспериментальные животные не однополые, экспериментальные результаты не сравниваются с другими экспериментами с однополыми животными.

4.4. Тот же метод, описанный в 4.1, использовали для проведения эксперимента TVT на самцах мышей НА в возрасте 10-12 недель, 12 мышей/группа, через 96 часов после введения лекарственного препарата. Результаты представлены в Таблице 8.

Результаты показывают, что по сравнению с группой Элокейт без модификации ПЭГ, FL1F-40Y/FL2F-40Y имеет немного улучшенную частоту выживаемости и значительно снижает частоту повторного кровотечения в течение 12 часов. FL1F-40Y/FL2F-40Y значительно улучшили частоту выживаемости по сравнению с другими группами и значительно снизили частоту повторного кровотечения в течение 12 часов по сравнению с другими группами. Следовательно, группы FL1F-40Y/FL2F-40Y имеют более длительное время предотвращения, чем другие группы в модели мышей с пересечением хвостовой веной А.

Вышеупомянутые являются только предпочтительными вариантами осуществления данного изобретения и не предназначены для ограничения данного изобретения. Любая модификация, эквивалентная замена или улучшение, выполненные в соответствии с духом и принципом данного изобретения, должны быть включены в объем защиты данного изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Beijing Furen Ruihui Biomedical Research Institute Co., Ltd. etc.

<120> УЛУЧШЕННЫЙ БЕЛОК СЛИЯНИЯ FVIII И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> OP190320

<160> 15

<170> PatentIn версия 3.2

<210> 1

<211> 2332

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

740 745 750

Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys

755 760 765

Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn

770 775 780

Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro

785 790 795 800

His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe

805 810 815

Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser

820 825 830

Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val

835 840 845

Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly

850 855 860

Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser

865 870 875 880

Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala

885 890 895

Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His

900 905 910

Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro

915 920 925

Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp

930 935 940

Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp

945 950 955 960

Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys

965 970 975

Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys

980 985 990

Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala

995 1000 1005

Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu

1010 1015 1020

Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu

1025 1030 1035

Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp

1040 1045 1050

Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr

1055 1060 1065

Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly

1070 1075 1080

Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys

1085 1090 1095

Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His

1100 1105 1110

Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln

1115 1120 1125

Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe

1130 1135 1140

Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr

1145 1150 1155

Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn

1160 1165 1170

Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His

1175 1180 1185

Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr

1190 1195 1200

Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr

1205 1210 1215

Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg

1220 1225 1230

Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu

1235 1240 1245

Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys

1250 1255 1260

His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu

1265 1270 1275

Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys

1280 1285 1290

Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr

1295 1300 1305

Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu

1310 1315 1320

Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr

1340 1345 1350

Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser

1355 1360 1365

Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala

1370 1375 1380

Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser

1385 1390 1395

Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser

1400 1405 1410

Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val

1415 1420 1425

Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu

1430 1435 1440

Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu

1445 1450 1455

Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys

1460 1465 1470

Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr

1475 1480 1485

Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys

1490 1495 1500

Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu

1505 1510 1515

Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile

1520 1525 1530

Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg

1535 1540 1545

Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp

1550 1555 1560

Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu

1565 1570 1575

Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys

1580 1585 1590

Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His

1595 1600 1605

Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu

1610 1615 1620

Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln

1625 1630 1635

Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr

1640 1645 1650

Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile

1655 1660 1665

Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp

1670 1675 1680

Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr

1685 1690 1695

Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser

1700 1705 1710

Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro

1715 1720 1725

Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe

1730 1735 1740

Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

1745 1750 1755

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val

1760 1765 1770

Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser

1775 1780 1785

Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

1790 1795 1800

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys

1805 1810 1815

Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

1820 1825 1830

Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

1835 1840 1845

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu

1850 1855 1860

Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu

1865 1870 1875

Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu

1880 1885 1890

Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu

1895 1900 1905

Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly

1910 1915 1920

Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln

1925 1930 1935

Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile

1940 1945 1950

His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys

1955 1960 1965

Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe

1970 1975 1980

Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val

1985 1990 1995

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu

2000 2005 2010

Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala

2015 2020 2025

Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr

2030 2035 2040

Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser

2045 2050 2055

Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val

2060 2065 2070

Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly

2075 2080 2085

Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile

2090 2095 2100

Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn

2105 2110 2115

Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser

2120 2125 2130

Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr

2135 2140 2145

Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg

2150 2155 2160

Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu

2165 2170 2175

Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser

2180 2185 2190

Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala

2195 2200 2205

Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val

2210 2215 2220

Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met

2225 2230 2235

Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr

2240 2245 2250

Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly

2255 2260 2265

His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe

2270 2275 2280

Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp

2285 2290 2295

Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp

2300 2305 2310

Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala

2315 2320 2325

Gln Asp Leu Tyr

2330

<210> 2

<211> 1438

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His

740 745 750

Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile

755 760 765

Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp

770 775 780

Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

785 790 795 800

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly

805 810 815

Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser

820 825 830

Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser

835 840 845

Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

850 855 860

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr

865 870 875 880

Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile

885 890 895

Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe

900 905 910

Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His

915 920 925

Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe

930 935 940

Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro

945 950 955 960

Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln

965 970 975

Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr

980 985 990

Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro

995 1000 1005

Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg

1010 1015 1020

Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu

1025 1030 1035

Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met

1040 1045 1050

Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val

1055 1060 1065

Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn

1070 1075 1080

Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys

1085 1090 1095

Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His

1100 1105 1110

Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln

1115 1120 1125

Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile

1130 1135 1140

Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg

1145 1150 1155

Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro

1160 1165 1170

Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His

1175 1180 1185

Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr

1190 1195 1200

Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp

1205 1210 1215

Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe

1220 1225 1230

Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro

1235 1240 1245

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser

1250 1255 1260

Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn

1265 1270 1275

Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp

1280 1285 1290

Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr

1295 1300 1305

Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn

1310 1315 1320

Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val

1325 1330 1335

Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly

1340 1345 1350

Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile

1355 1360 1365

Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn

1370 1375 1380

Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro

1385 1390 1395

Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg

1400 1405 1410

Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu

1415 1420 1425

Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1430 1435

<210> 3

<211> 227

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 4

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 5

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 6

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 6

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 7

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 8

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 9

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 9

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ser

35

<210> 10

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 10

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 11

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 11

Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

20 25 30

Gln

<210> 12

<211> 28

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 12

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 13

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 14

Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

1 5 10

<210> 15

<211> 55

<212> БЕЛОК

<213> синтетический

<400> 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys

20 25 30

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

35 40 45

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

50 55

<---

Claims (23)

1. Конъюгат слитого белка фактора свертывания крови VIII с полиалкиленгликолем для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний, при том что активная составляющая фактора свертывания крови VIII (FVIII) прямо или косвенно связана с партнером по слиянию для продления периода полужизни через пептидный линкер для образования слитого белка, и слитый белок дополнительно конъюгирован с полиалкиленгликолем,

и при этом

активная составляющая фактора свертывания крови VIII содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или 2,

полиалкиленгликоль представляет собой разветвленный полиэтиленгликоль с молекулярной массой 40 кДа, и

партнер по слиянию представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина.

2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что партнер по слиянию представляет собой Fc-фрагмента IgG, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из:

(i) аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 3,

(ii) аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и

(iii) аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5.

3. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что полиэтиленгликоль является линейным или разветвленным, предпочтительно разветвленным полиэтиленгликолем, более предпочтительно разветвленным полиэтиленгликолем с концевыми метоксигруппами.

4. Конъюгат по любому одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что конъюгация слитого белка и полиэтиленгликоля происходит в произвольном или специфическом положении, причем положение конъюгации выбрано из группы, состоящей из свободной аминогруппы, сульфгидрильной группы, сахарной группы и карбоксильной группы, предпочтительно свободной аминогруппы.

5. Конъюгат по п. 4, отличающийся тем, что для конъюгации использован модификатор, который может быть в форме активированного сложного эфира, предпочтительно, модификатор выбран из модификаторов, представленных формулой (2):

где 0≤m₂≤6 и m₂ предпочтительно равняется 2; 0≤m₃≤6 и m₃ предпочтительно равняется 1; и мПЭГ представляет собой полиэтиленгликоль с концевыми монометокси группами.

6. Конъюгат по любому одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что активная составляющая фактора свертывания VIII связана с партнером по слиянию через пептидный линкер, и пептидный линкер содержит гибкий пептидный сегмент и жесткий пептидный сегмент.

7. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что гибкий пептидный сегмент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(i) GSGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 6) и

(ii) GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 7).

8. Конъюгат по п. 6 или 7, отличающийся тем, что жесткий пептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:

(i) PRPQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 11); и

(ii) SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 12).

9. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний, содержащая эффективное количество конъюгата, как заявлено по любому одному из пп. 1-8, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом геморрагические заболевания представляют собой геморрагические заболевания у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом FVIII или спонтанного или хирургического кровотечения у пациентов с гемофилией А.

10. Способ предотвращения или лечения геморрагических заболеваний, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, конъюгата, как заявлено по любому одному из пп. 1-8, или фармацевтической композиции, как заявлено по п. 9, при этом геморрагические заболевания представляют собой геморрагические заболевания у пациентов с врожденным или приобретенным дефицитом FVIII и спонтанного или хирургического кровотечения у пациентов с гемофилией А.

Images