JP2015521471A - 組み換え第Ｘａ因子誘導体の精製のための方法 - Google Patents

Abstract

セリンプロテアーゼを精製するための方法およびキットが、本明細書で開示される。本方法は、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフに、セリンプロテアーゼを充填することと、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する薬剤を含む溶出緩衝液で、セリンプロテアーゼを溶出することとを伴う。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する競合薬などの薬剤を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩および／または界面活性剤を更に含む。【選択図】 図１０Ａ

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１２年６月１４日に出願された米国仮出願第６１／６５９，８２１号に対する利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。

抗凝固剤は、例えば、凝固障害を有する、一定期間の不動状態を余儀なくされた、または医療手術を受けている患者などの、血栓を形成する傾向のある患者における望ましくない血栓症の治療または予防に関する、市場における要求に応える。しかしながら、抗凝固療法の主な制限の１つは、治療に随伴する出血の危険性、および過剰投与の際にまたは緊急の外科的処置が求められる場合に抗凝固活性を急速に反転させる能力に制限があることである。それ故、抗凝固療法の全ての形態に対して特異的かつ有効な解毒剤が非常に望ましい。安全性を考慮して、新たな抗凝固薬の開発の中で凝固剤と解毒剤とのペアを得ることも有利である。

以前に報告された第Ｘａ因子（ｆＸａ）タンパク質の修飾された誘導体は、米国特許第８，１５３，３９０号および第８，２６８，７８３号に記載されるものなど、ｆＸａを標的とする凝固剤に対する解毒剤として有用である。ｆＸａタンパク質の修飾された誘導体は、凝固剤に結合し、かつ／または凝固剤を実質的に中和する。しかしながら、これらのｆＸａ誘導体に導入される特定の修飾は、凝固因子の精製のための従来の方法が、これらの修飾されたｆＸａタンパク質に対して有効でないことがあるため、精製に対するいくつかの課題を提起する。

米国特許第８，１５３，３９０号明細書 米国特許第８，２６８，７８３号明細書

セリンプロテアーゼを精製するための方法およびキットが、本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、樹脂またはカラムなどの大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフに、セリンプロテアーゼを充填することと、溶出緩衝液でポリペプチドを溶出することとを伴う。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する競合薬などの薬剤を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩および／または界面活性剤を更に含む。

一実施形態では、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフにセリンプロテアーゼを充填することと、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する薬剤を含む溶出緩衝液でセリンプロテアーゼを溶出することとを含む、セリンプロテアーゼを精製する方法が提供される。

一部の態様では、溶出緩衝液は、塩、界面活性剤、および／またはカオトロピック剤を更に含む。

一部の態様では、薬剤は、ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン、アルギニン、小分子ｆＸａ阻害剤、ペプチドｆＸａ阻害剤、およびペプチド模倣ｆＸａ阻害剤からなる群から選択され得る競合薬である。一部の態様では、競合薬はアルギニンである。

一部の態様では、セリンプロテアーゼは、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、配列番号１もしくは２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有し、Ｇｌａドメインの少なくとも一部の欠失、および活性部位での変異を有するポリペプチドである。

一部の態様では、セリンプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸配列、または、配列番号２に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し、Ｇｌａドメインの少なくとも一部の欠失、および活性部位での変異を有するポリペプチドを含む。一部の態様では、セリンプロテアーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、溶出緩衝液のｐＨは約４．５〜約１０．５である。一部の態様では、溶出緩衝液のｐＨは約５．０である。一部の態様では、溶出緩衝液のｐＨは約７．４である。

一部の態様では、溶出緩衝液は約２５０ｍＭのアルギニン〜約１０００ｍＭのアルギニンを含む。一部の態様では、溶出緩衝液は約５００ｍＭのアルギニンを含む。一部の態様では、溶出緩衝液のｐＨは約５．０である。

一部の態様では、方法は、溶出されたセリンプロテアーゼを、イオン交換カラムでの精製に供することを更に含む。

本開示の方法によって調製される、精製されたセリンプロテアーゼも提供される。

一実施形態では、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフ、およびＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する競合薬を含む溶出緩衝液を含むキットが提供される。

一部の態様では、溶出緩衝液はアルギニンを更に含む。一部の態様では、溶出緩衝液のｐＨは約４．５〜約１０．５である。一部の態様では、溶出緩衝液は約２５０ｍＭのアルギニン〜約１０００ｍＭのアルギニンを含む。一部の態様では、キットは、中性ｐＨにある約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を更に含む。

配列番号１、すなわち、アミノ酸１０６〜１１１においてリンカー−ＲＫＲＲＫＲ−（配列番号３）を有するｆＸａ誘導体（ｒ−解毒剤前駆体とも称される）を示す。 配列番号２、すなわち、リンカーがｒ−解毒剤前駆体から除去されたｆＸａ誘導体（ｒ−解毒剤とも称される）を示す。 実施例１に記載されるように、ベンズアミジン−アガロース親和性樹脂上で精製されたｒ−解毒剤を使用した充填プロフィルを示す。 実施例１に記載されるように、Ｌ−リシン−アガロース親和性樹脂上で精製されたｒ−解毒剤を使用した充填プロフィルを示す。 実施例１に記載されるように、アプロチニン−アガロース親和性樹脂上で精製されたｒ−解毒剤を使用した充填プロフィルを示す。 実施例１に記載されるように、ＳＴＩ−アガロース親和性樹脂上で精製されたｒ−解毒剤を使用した充填プロフィルを示す。 （実施例２に記載されるように）機能タンパク質がＳＴＩ樹脂によって捕捉されることを実証する、細胞培養から採取された馴化培地（採取された細胞培養液）を使用したＳＴＩ−アガロース充填プロフィルを示す。 実施例２に記載されるように、（フロースルーモードで）ＨＱ−セファロースプレカラム上で採取された細胞培養液を使用した充填プロフィルを示す。 機能タンパク質がＳＴＩ樹脂によって捕捉されることを実証する、ＳＴＩ−アガロースに充填されたＨＱ−セファロースＦＴ−画分の充填プロフィルを示す。 実施例２に記載されるように、結合タンパク質が１Ｍのベンズアミジンで溶出されることを示す。１Ｍのベンズアミジンを使用した溶出プロフィルが図１０Ａに示され、ＳＴＩで溶出されプールされた画分でのウエスタンブロット法が図１０Ｂに示される。分子マーカは、図１０Ｂのレーン１および１Ａに充填され、ＦＸａは、レーン２および２Ｂに充填され、ＳＴＩ−アガロースカラムから溶出されたｒ−解毒剤は、レーン４および４Ｂに充填される。 実施例２に記載されるように、結合タンパク質が１Ｍのベンズアミジンで溶出されることを示す。１Ｍのベンズアミジンを使用した溶出プロフィルが図１０Ａに示され、ＳＴＩで溶出されプールされた画分でのウエスタンブロット法が図１０Ｂに示される。分子マーカは、図１０Ｂのレーン１および１Ａに充填され、ＦＸａは、レーン２および２Ｂに充填され、ＳＴＩ−アガロースカラムから溶出されたｒ−解毒剤は、レーン４および４Ｂに充填される。 実施例２に記載されるように、ベンズアミジン勾配での溶出プロフィルを示す。 実施例２に記載されるように、スケールアップ法の溶出プロフィルを示す。 ２５Ｌの培地（ウエーブバッグ（ｗａｖｅ ｂａｇ））のｒ−解毒剤精製スキームを示す。ＵＦ＝限外濾過、ＭＷＣＯ＝分画分子量、ＵＦ／ＤＦ＝限外濾過／透析濾過。 実施例２に記載されるように、精製されたｒ−解毒剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。 実施例３に記載されるように、アルギニン溶出緩衝液を使用したＳＴＩ親和性カラムの溶出プロフィルを示す。 実施例３に記載されるように、異なるＳＴＩ樹脂（Ａ〜Ｅ）での様々なＳＴＩ親和性カラムからの充填された溶出剤で還元された銀染色ゲルを示す。アルギニン緩衝液での溶出は、ベンズアミジンでの溶出と類似した生成物プロフィルをもたらした。

定義
本開示の実施は、別途指示がない限り、従来の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの技術を用い、これらは当技術分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅを参照されたい。

本明細書で使用される場合、用語「約」は、概して、述べられる値のプライスマイナス１０％の範囲である値を意味する。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上、別途明確に指示がない限り、複数形の指示対象を含む。

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は同じ意味で使用され、それらの最も広い意味において、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質の配列、またはペプチドの配列を含んでもよいアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然、もしくは合成のいずれかである、グリシンおよびＤとＬとの両方の光学異性体を含むアミノ酸、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣体を指す。「ペプチド模倣体」は、ペプチドを模倣するように設計された小さいタンパク質様鎖である。それらは、既存のペプチドの修飾から、またはペプトイドおよびβ−ペプチドなどの、ペプチドを模倣する類似の系を設計することによって、作製され得る。

ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」または「組み換え」は、他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されているポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指すためにも本明細書で使用され、精製されたポリペプチドおよび組み換えポリペプチドの両方を包含するものとする。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、それがその天然または自然環境において関連付けられる、例えば染色体上の３’および５’隣接ヌクレオチドから分離される。当業者には明らかであるように、天然には存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片（複数可）は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。

タンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドの「生物学的等価物」という用語は、少なくとも約８０％の相同性もしくは配列同一性、あるいは、少なくとも約８５％、またはあるいは、少なくとも約９０％、またはあるいは、少なくとも約９５％、またはあるいは、少なくとも９８％の相同性もしくは配列同一性を有するものを指し、参照タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等の生物活性を呈する。

「ハイブリダイゼーション」は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得るハイブリダイゼーション反応を指す。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当技術分野において周知であり、公開されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎｆｒａ．を参照されたい。関連する条件の例としては（ストリンジェンシーを増大させるため）、２５℃、３７℃、５０℃、および６８℃のインキュベーション温度；１０倍ＳＳＣ、６倍ＳＳＣ、１倍ＳＳＣ、０．１倍ＳＳＣの緩衝液濃度（ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、および１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）、および他の緩衝液システムを使用したそれらの等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間、および期間を増加させた、頻度を増加させた、または緩衝液濃度を低下させた洗浄が挙げられる。

ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）が、別の配列との一定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有するということは、整列したときに、それら２つの配列を比較すると塩基（またはアミノ酸）の割合が同一であることを意味する。整列、および相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野において既知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１に記載のソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータを整列に対して使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。具体的には、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準、フィルタ＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝６０、期待値＝１０、マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、記述＝５０配列、ソート手段＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見つけることができる。

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２個のペプチド間または２個の核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列し得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較配列における位置を同一の塩基またはアミノ酸が占めている場合、分子は、その位置で相同である。配列間の相同の度合いは、配列が共有するマッチング位置または相同位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、またはあるいは、２５％未満の同一性を共有する。

タンパク質単離の文脈で使用される場合の用語「画分」は、プロフィルに基づいて分離された物質の一群を指す。プロフィルは、非限定的な例として、大きさ、質量、等電点、電荷などを含み得る。

「第Ｘａ因子」または「ｆＸａ」または「ｆＸａタンパク質」は、不活性第Ｘ因子（ｆＸ）から生成される、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼを指す。第Ｘａ因子は、内因性Ｘａｓｅとして既知の複合体における第ＩＸａ因子とその補因子である第ＶＩＩＩａ因子、または外因性Ｘａｓｅとして既知の複合体における第ＶＩＩａとその補因子である組織因子のいずれかによって活性化される。ｆＸａは、第Ｖａ因子と共に膜結合プロトロンビナーゼ複合体を形成し、かつプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒するプロトロンビナーゼ複合体中の活性成分である。トロンビンは、最終的に血栓形成を引き起こすフィブリノゲンのフィブリンへの変換を触媒する酵素である。

本明細書で使用される場合の「ｆＸａ誘導体」は、プロトロンビナーゼ複合体を組み立てする際にｆＸａと競合せず、なおかつｆＸａ阻害剤などの抗凝固剤に結合するおよび／または抗凝固剤を実質的に中和する、修飾されたｆＸａタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ｆＸａ誘導体は、低下した凝固促進活性を有するか、あるいは凝固促進活性を有しない。ｆＸａ誘導体の例は、配列番号２（図２）またはその生物学的等価物として、本明細書で提供される。

用語「活性部位」は、化学反応が起こる酵素または抗体の部分を指す。「修飾活性部位」は、増加したまたは減少した化学反応性または特異性を活性部位に提供するように構造的に修飾された活性部位である。活性部位の例としては、２３５〜４８８個のアミノ酸残基を含むヒト第Ｘ因子の触媒ドメイン、およびｆＸａの１９５〜４４８個のアミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。修飾活性部位の例としては、Ａｒｇ３０６位、Ｇｌｕ３１０位、Ａｒｇ３４７位、Ｌｙｓ３５１位、Ｌｙｓ４１４位、またはＡｒｇ４２４位において少なくとも１つのアミノ酸置換を有するヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインが挙げられるが、これに限定されない。

上で述べたように、本発明の誘導体は、修飾Ｇｌａドメインを有してよく、または全Ｇｌａドメインが除去されてもよい。ｆＸａのＧｌａドメインは、野生型ｆＸａタンパク質のアミノ酸残基１〜４５を指す。いくつかの実施形態では、誘導体は、Ｇｌａドメインの完全な（１〜４５）または部分的な（例えば、１〜４４、１〜３９、または６〜３９）欠失を有する。

「ｒ−解毒剤前駆体」は、ヒト野生型ｆＸａに対応する３つの変異を含む、配列番号１で表されるｆＸａ誘導体を指す。第１の変異は、６〜３９位における野生型ｆＸタンパク質のＧｌａドメインにおける欠失である。第２の変異は、活性化ペプチド配列１４３〜１９４アミノ酸を、−ＲＫＲ−で置き換える。これは、軽鎖および重鎖を接続する−ＲＫＲＲＫＲ−（配列番号３）リンカーを生成する。分泌の際に、このリンカーはＣＨＯ中で切断され、切断された二本鎖ポリペプチドをもたらす。用語「切断された二本鎖ポリペプチド」は、二本鎖を有し、ジスルフィド結合によって共に連結された、配列番号２のポリペプチド、または配列番号２に対して８０％の同一性を有するポリペプチドを指す。Ｎ末端鎖は配列番号２のアミノ酸１〜１０５から成り、Ｃ末端鎖は配列番号２のアミノ酸１０６〜３５９から成る。任意的に、ＬＣ鎖は、リンカーの１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸残基を含んでもよい。そのような追加的な残基は、リンカーポリペプチドの不完全な除去に起因する。第３の変異は、活性部位残基Ｓ３７９のＡｌａ残基（分泌されるヒトｆＸ配列に基づくアミノ酸番号）への変異である。このアミノ酸置換は、それぞれ配列番号１および２のアミノ酸２９６および２９０に対応する。

用語「ｒ−解毒剤」は、リンカー（配列番号１）の除去前、またはリンカー（配列番号２）の除去後のポリペプチドを指し得る。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／７６６，６５２号は、一本鎖ｒ−解毒剤前駆体を、ｆＸａ阻害剤に対する解毒剤として作用する切断された二本鎖ｒ−解毒剤タンパク質に処理する改善または強化された方法および細胞を説明する。

「ＳＴＩ」または「大豆トリプシンインヒビター」は、大豆、またはその生物学的等価物から単離されたトリプシン阻害剤を指す。トリプシン阻害剤は、大きさにして約２０ｋＤａであり、トリプシン（タンパク質分解酵素）だけでなく、血漿カリクレイン、第Ｘａ因子、および血漿活性も減少させる。ＳＴＩは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）などの販売業者から市販されている。ＳＴＩの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２３８６１１の、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆）由来のＫＴＩ３クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）トリプシン阻害剤である。

用語「競合薬」は、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の電荷−電荷相互作用の妨害によって、あるいはセリンプロテアーゼへの結合に対してＳＴＩと競合することによって、ＳＴＩ親和性カラムからのセリンプロテアーゼの溶出を助けることができる分子である。非限定的な例としては、ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン、アルギニン、小分子ｆＸａ阻害剤、ペプチドｆＸａ阻害剤、およびペプチド模倣ｆＸａ阻害剤が挙げられる。

用語「第Ｘａ因子阻害剤」または「第Ｘａ因子の阻害剤」は、インビトロおよび／またはインビボでのプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する第Ｘａ因子の凝血活性を直接または間接的に阻害することができる化合物、ペプチド、ペプチド模倣体を指す。既知のｆＸａ阻害剤の例としては、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ−９０６５ａ（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．１９９６ ２７６（３）：１０３０−８に記載されるもの）、ＹＭ−６０８２８（例えば、Ｔａｎｉｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９８ ７９（３）：５４３−８に記載されるもの）、ＹＭ−１５０（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．ｅｔ．ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００５；１０６（１１），Ａｂｓｔｒａｃｔ １８６５に記載されるもの）、アピキサバン、リバロキサバン、ＰＤ−３４８２９２（例えば、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ：Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ−Ｒｅａｃｈｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ Ｍａｒｋｅｔ，２００７に記載されるもの）、オタミキサバン、ラザキサバン（ＤＰＣ９０６）、ＢＡＹ５９−７９３９（例えば、Ｔｕｒｐｉｅ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５，３（１１）：２４７９−８６に記載されるもの）、ＤＵ−１７６ｂ（例えば、Ｈｙｌｅｋ ＥＭ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ ２００７ ８（９）：７７８−７８３に記載されるもの）、ＬＹ５１７７１７（例えば、Ａｇｎｅｌｌｉ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７ ５（４）：７４６−５３に記載されるもの）、ＧＳＫ９１３８９３、ベトリキサバン（以下に記載されるもの）、およびこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）もまた、第Ｘａ因子阻害剤であると考えられる。

用語「カオトロピック剤」は、タンパク質および核酸などの高分子の構造を妨害し、高分子を変性させる物質を意味する。カオトロピック剤には、例えば、ブタノール、エタノール、塩化グアニジン、過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、および尿素が含まれる。
方法

本開示は、セリンプロテアーゼを含む試料から活性型のセリンプロテアーゼを精製するための方法を説明する。これらの方法は、セリンプロテアーゼの精製のための従来の方法よりも優れている。更に、これらの方法は、更に修飾されたセリンプロテアーゼの精製において有効であり、この修飾、例えば、野生型ｆＸａと比較したｒ−解毒剤における修飾は、プロテアーゼの結合および／または酵素活性に影響する。

第Ｘａ因子および他のセリンプロテアーゼは、ベンズアミジン−セファロース親和性クロマトグラフを使用して精製され得ることが示されている。初期試験（例えば、実施例１を参照）は、Ｇｌａドメインを欠く特定のｆＸａ誘導体が、Ｇｌａドメインの欠失のため、Ｑ−セファロースなどの従来のイオン交換クロマトグラフに対して低い親和性を有することを示す。意外にも、ｒ−解毒剤は、ベンズアミジン−セファロース親和性クロマトグラフ、または他の類似した市販の小リガンドの親和性クロマトグラフに結合しない。本開示は、ＳＴＩ系親和性クロマトグラフ、ならびに競合薬と任意に塩および界面活性剤とを用いた溶出ステップを使用するセリンプロテアーゼの精製を説明する。

セリンプロテアーゼは、例えば第１３／７６６，６５２号において前述の通りに、または当技術分野で既知の他の組み換えタンパク質生成方法によって、組み換え生成され得る。例えば、タンパク質は、ＤＮＡ構築物（即ち、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、発現ベクター、ファージミド、フォスミド、ならびに、細菌人工染色体、酵母人工染色体、およびヒト人工染色体などの人工染色体）にクローン化され、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびポリフェクションなどの化学系トランスフェクション、ならびに、エレクトロポレーション、光学トランスフェクション、および電気的遺伝子導入などの非化学系トランスフェクションなどの遺伝子導入技法によって、好適な宿主細胞に導入されてもよい。好適な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、およびヒト細胞を含むがこれらに限定されない、原核および真核細胞が挙げられる。その後細胞を、超音波処理もしくは凍結融解などの物理的技法によって、または界面活性剤、もしくは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、およびｐＨ８．０にある５０ｍＭのトリスを含むＲＩＰＡ緩衝液（放射性免疫沈降アッセイ）などの溶解緩衝液の使用によって、または遠心分離もしくは濾過などの物理的分離によって、溶解し、哺乳類細胞培養由来の浄化された採取培養液を得ることができる。その後、得られた可溶性タンパク質抽出物は、本明細書に記載される精製方法において使用され得る。

タンパク質抽出物を、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフに適用する。大豆トリプシンインヒビターは２０ｋＤａのタンパク質であり、特定のタンパク質の精製のために固相担体樹脂上で固定され得る。大豆トリプシンインヒビターに加えて、血清、ライマメ、ウシ膵臓、もしくはオボムコイド、またはこれらの修飾形態から単離されたものなどの他のタンパク質性トリプシン阻害剤もまた使用できる。特定のプロテアーゼ阻害剤、具体的にはセリンプロテアーゼ阻害剤を使用して、ｒ−解毒剤、セリンプロテアーゼ、または他の第Ｘａ因子誘導体を精製する目的で親和性樹脂を調製し得ることもまた意図される。これらのプロテアーゼ阻害剤から好適なものを同定することは、本明細書で開示される方法を用いて行うことができる。

その後、セリンプロテアーゼを、競合薬、塩、界面活性剤、またはカオトロピック剤を含む溶出緩衝液で溶出してもよい。競合薬は、セリンプロテアーゼへの結合に対してＳＴＩと競合することによって、ＳＴＩとセリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する。競合薬の非限定的な例としては、ベンズアミジン、アルギニン、小分子ｆＸａ阻害剤、ペプチドｆＸａ阻害剤、またはペプチド模倣ｆＸａ阻害剤が挙げられる。第Ｘａ因子直接阻害剤としては、ＮＡＰ−５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ−９０６５ａ、ＹＭ−６０８２８、ＹＭ−１５０、アピキサバン、リバロキサバン、ＴＡＫ−４４２、ＰＤ−３４８２９２、オタミキサバン、エドキサバン、ＬＹ５１７７１７、ＧＳＫ９１３８９３、ラザキサバン、ベトリキサバン、またはこれらの薬学的に許容される塩、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ｆＸａのペプチド阻害剤としては、全ての目的のために参照により組み込まれるＢｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｂｙ ａ Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−α−ｋｅｔｏｔｈｉａｚｏｌｅ Ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ｔｗｏ Ｓｔｅｐｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），３８，１４５８２−１４５９１に記載されるトリペプチドケトチアゾールおよび対応するアルデヒドが挙げられる。

一実施形態では、競合薬はアルギニンである。アルギニンでの溶出は、それがＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）賦形剤であり、精製されたタンパク質から除去する必要がないことから、有益である。アルギニンの追加的な利益は、それが実際にセリンプロテアーゼ（例えば、ｒ−解毒剤）の溶解度を向上させ、最終製剤において賦形剤として使用できることである。

溶出緩衝液中に用いられるアルギニンまたは競合薬の濃度は、約２５０ｍＭ〜約１０００ｍＭであってもよい。一実施形態では、溶出緩衝液中のアルギニンまたは競合薬の濃度は、約５００ｍＭである。更なる実施形態では、濃度は、約２５０ｍＭ、または約３００ｍＭ、または約３５０ｍＭ、または約４００ｍＭ、または約４５０ｍＭ、または約５５０ｍＭ、または約６００ｍＭ、または約６５０ｍＭ、または約７００ｍＭ、または約７５０ｍＭ、または約８００ｍＭ、または約８５０ｍＭ、または約９００ｍＭ、または約１Ｍである。溶出緩衝液は、任意に、塩、界面活性剤、またはカオトロピック剤を更に含む。本明細書で開示される方法およびキットの溶出緩衝液において有用な塩としては、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムなどが挙げられる。本明細書で開示される方法およびキットの溶出緩衝液において有用な界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０、尿素、グアニジンなどが挙げられる。

本明細書に記載される方法およびキットにおける溶出緩衝液のｐＨは、セリンプロテアーゼの不活性化および／または沈降を引き起こすことなく、樹脂上に吸収されたセリンプロテアーゼタンパク質の有効な溶出を可能にするものである。ｒ−解毒剤などの特定のｆＸａ誘導体は、低いｐＨにおいて不活性化されるか、または沈降する。特定の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは約４．５〜約１０．５である。別の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは約５．０である。別の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは約７．４である。あるいは、溶出緩衝液のｐＨは、少なくとも約４．５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８．０、約８．５、約９、約９．５、または少なくとも約１０である。別の実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８．０、約８．５、約９、約９．５、約１０より高くない、または約１０．５より高くない。一実施例では、溶出緩衝液のｐＨは、ベンズアミジンが競合薬として使用される場合には約７．４、アルギニンが競合薬として使用される場合にはｐＨ５．０である。

特定の実施形態では、セリンプロテアーゼは、例えば、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、配列番号１もしくは２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドである、ｆＸａ誘導体である。いくつかの実施形態では、配列番号１または２に対して配列同一性を有するポリペプチドは、配列番号１または２と実質的に同一の活性を有する。配列番号１で表されるｆＸａ誘導体は、ｆＸａに対応する３つの変異を含む。第１の変異は、野生型タンパク質中の６〜３９位における、ＦＸのＧｌａドメインにおける欠失である。第２の変異は、活性化ペプチド配列１４３〜１９４アミノ酸を、−ＲＫＲ−で置き換える。これは、軽鎖および重鎖を接続する−ＲＫＲＲＫＲ−（配列番号３）リンカーを生成した。分泌すると、このリンカーはＣＨＯ中で切断され、二本鎖ｆＸａ分子（配列番号２）をもたらす。第３の変異は、活性部位残基Ｓ３７９のＡｌａ残基（分泌されるヒトｆＸアミノ酸配列に基づく）への変異である。このアミノ酸置換は、それぞれ配列番号１および２の２９６位および２９０位におけるアミノ酸に対応する。ｆＸａ誘導体は、プロトロンビナーゼ複合体を組み立てすることにおいてｆＸａと競合しないが、その代わりに、ｆＸａ阻害剤などの抗凝固剤に結合する、および／または抗凝固剤を実質的に中和する。解毒剤として有用な誘導体は、阻害剤に結合する能力を保持しながら、内因性凝固促進および抗凝固活性を低下させるまたは除去するように修飾される。構造的には、誘導体は、凝固促進活性を提供しないか、または低下した凝固促進活性を提供するかのどちらかであるように修飾される。「凝固促進活性」は、本明細書では、血液凝固または血栓形成を引き起こす薬剤の能力を指す。低下した凝固促進活性とは、凝固促進活性が、野生型ｆＸａと比較した場合に、少なくとも約５０％、または約９０％以上、または約９５％以上低下していることを意味する。関連する実施形態では、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、野生型第Ｘａ因子と比較して低下した凝固促進活性を有する。更なる実施形態では、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、プロトロンビナーゼ複合体を組み立てしない。

一実施例では、セリンプロテアーゼのカラム上への吸収を可能にする条件下でセリンプロテアーゼをカラムに添加（充填）してもよく、そして、カラムを洗浄緩衝液で洗浄し、これは、カラムおよびフロースルー中の汚染タンパク質または分子を、セリンプロテアーゼのカラムへの継続した吸収を可能にし得る。一実施形態では、洗浄緩衝液は塩を含んでもよく、中性ｐＨであってもよい。用語「中性ｐＨ」は、約６〜約８のｐＨを意味するように意図される。特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、中性ｐＨにある約２００〜約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。他の実施形態では、ｐＨは約６、または約７、または約８である。

本明細書に記載の方法は、例えば、濾過、イオン交換クロマトグラフィー、混合モード樹脂、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィー、または等電点電気泳動法などの、他の精製およびクロマトグラフステップを更に含んでもよい。一実施形態では、方法は、ポリペプチドを含む溶液をイオン交換カラムに適用することを更に含む。

好適な陽イオン交換樹脂は、幅広いｐＨ範囲にわたってポリペプチドを結合することが可能なものを含む、当技術分野で既知の多種多様な物質を含む。例えば、カルボキシメチル化、スルホン酸化、アガロース系、またはポリマーポリスチレン／ジビニルベンゼン陽イオン交換マトリクスが特に好ましい。他の有用なマトリクス物質としては、繊維性、小粒状、および玉状マトリクスなどのセルロースマトリクス、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、およびポリエーテルマトリクス、ならびに合成物が挙げられるが、これらに限定されない。陽イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に対する他の好適な物質は、当業者の知るところである。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、当技術分野で既知のような、そのために適切な媒体を使用して行われる。好適な媒体としては、例えば、ポリマーポリスチレン／ジビニルベンゼン樹脂およびアガロース系樹脂、ならびにアガロース玉、デキストラン玉、ポリスチレン玉、不溶性物質を含む媒体、第３級または第４級アミノ基で誘導体化された微粒子担体、およびトリメチルアミノエチル基で誘導体化された担体が挙げられる。好適なそのような媒体の例としては、ＤＥ９２（ジエチルアミノエチルセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ）；ＤＥＡＥ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ（Ｓｉｇｍａ）、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ ４０ｍｕ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｉｎｃ．）；ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＤＥＡＥ−６５０（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ ＥＭＤ ＴＭＡＥ−６５０（Ｓ）ＴＭ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）、ＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＳＰＷ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）、ＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ−６ＢＴ”、およびキレートＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）などのＤＥＡＥ樹脂、ＤＥＡＥ ＭＥＲＥ ＳＥＰ．ＩＯＯＯＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ならびにＤＥＡＥ ＳＰＨＥＲＯＤＥＸ（Ｓｅｐｒａｃｏｒ）；ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＱＴｍおよびＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＱＳＦＦ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）；ＭＡＣＲＯ−ＰＥＰ ＱＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｑ−ＨＹＰＥＲＤ（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓ）などが挙げられる。他の好適な陰イオン交換クロマトグラフィー物質、ならびに本出願のためのこれらの物質の選択および使用は、当技術分野において常用されている。

イオン交換クロマトグラフィー、濾過、ナノ濾過、または追加的な精製ステップは、ＳＴＩ親和性クロマトグラフィーの前または後であり得る。追加的なステップはまた、例えば、タンパク質抽出物の溶媒および界面活性剤処理による、またはナノ濾過を通した、ウイルス不活性化ステップを含んでもよい。

概して「精製」は、試料中のタンパク質またはペプチドの濃度および／または純度を増加させることを指す。いくつかの実施形態では、精製過程は試料を分別に供して様々な他の成分を除去し、その間タンパク質またはペプチドはその生物活性を実質的に保持する。組成物中の実質的に精製されたタンパク質またはペプチドは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または試料溶液中の乾燥成分中のタンパク質よりも多くを構成するなど、組成物の主要成分を形成する。

タンパク質またはペプチドの精製の度合いを定量化するための様々な方法が、本開示を踏まえて当業者に理解されるであろう。これらは、例えば、活性画分の比活性度を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内のポリペプチドの量を評価することを含む。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性度を算出すること、それを初期抽出物の比活性度と比較すること、および従って、本明細書では「−倍精製数」によって評価される純度を算出することである。活性量を表すために使用される実際の単位は、当然ながら、精製を追うために選択される特定のアッセイ技法、および発現するタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を呈するか否かによるであろう。

タンパク質精製における使用に対して好適な様々な技法が、当業者にとって周知となるであろう。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、抗体などを用いての、または熱変性後の遠心分離による沈降、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、および親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、ならびにそのような技法、および他の技法の組み合わせを含む。

本明細書で開示される更なる態様は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または、配列番号１もしくは２に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有し、本明細書で開示される方法によって精製されるポリペプチドを含む、精製されたセリンプロテアーゼに関する。いくつかの実施形態では、配列番号１または２に対して配列同一性を有するポリペプチドは、配列番号１または２と実質的に同一の活性を有する。

本出願はまた、大豆トリプシンインヒビター親和性樹脂、競合薬および／またはアルギニンを含む溶出緩衝液、ならびに使用説明書を含むキットを説明する。一実施形態では、キットは洗浄緩衝液を更に含む。関連する実施形態では、洗浄緩衝液は、中性ｐＨにある約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む。

本開示は、本開示の純粋な例であるように意図される以下の実施例への参照によって、更に理解される。本開示は、本開示の一態様の例示のみとして意図される、例証される実施形態によって範囲を制限されない。機能的に同等であるいかなる方法も、本開示の範囲内である。本明細書に記載されるものに加えて、本開示の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る。

別途記述のない限り、全ての温度はセ氏である。また、これらの実施例および他の部分において、略語は以下の意味を有する。

実施例１
市販の親和性樹脂のスクリーニング

市販の親和性樹脂を、ｒ−解毒剤の精製におけるその有効性に対してスクリーニングした。様々な親和性樹脂を、樹脂１ｍＬを用いてカラム（ＧＥのＴｒｉｃｏｒｎカラムなど）に詰めた。製造業者の推奨に従う消毒の次に、カラムをｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓ／１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化し、次に、同じ緩衝液中でｒ−解毒剤を結合するその能力を試験した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の０．１４５ｍｇ／ｍＬの濃度にあるｒ−解毒剤を、注射（１ｍＬ）によって、１ｍＬ／分の流量でカラムに充填した。意外にも、ベンズアミジン−アガロース（カタログ＃Ａ７１５５、Ｓｉｇｍａ）（図３）、Ｌ−リシン−アガロース（カタログ＃Ｌ５６３１）（図４）、およびアプロチニン−アガロース（カタログ＃Ａ２２６８）（図５）親和性カラムへのｒ−解毒剤の結合は観察されなかった。対照的に、ｒ−解毒剤はＳＴＩ親和性樹脂（図６）に結合することが見出された。
実施例２
ベンズアミジンを含む溶出緩衝液を用いたＳＴＩ親和性樹脂によるｒ−解毒剤の精製

ｒ−解毒剤を含む採取された細胞培養馴化培地を、まず、ｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓおよび２５０ｍＭのＮａＣｌの溶液中で緩衝化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（カタログ＃１７−０５１０−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プレカラムに通した。その後、ｒ−解毒剤を含むプレカラムからのフロースルーを、ｒ−解毒剤のカラムへの吸収を可能にする条件下で、ＳＴＩ−アガロース（Ｓｉｇｍａ、Ｔ−０６３５）カラムに適用した。カラムを、ｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓおよび２５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液（１倍Ｑ−ＢＦ）で洗浄した。その後、０．５Ｍまたは１．０Ｍのどちらかであるベンズアミジンを伴う、ｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で、ｒ−解毒剤を溶出した。商用のデータインサートに基づくＳＴＩ−アガロース許容量は、１〜３ｍｇ／ｍＬのトリプシンである。

本実施例で説明される様々な試験において使用される細胞培地は、５０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）下で選択したＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１クローン（１Ｃ２として表される）から生成した。ＳＴＩ−アガロースカラムに充填する前に、細胞培地をＱ−セファロースプレカラムに対して使用したものと同じ緩衝液（ｐＨ７．４にある２０ｍＭのトリスおよび２５０ｍＭのＮａＣｌ）中に透析した。

５０ｍＬの透析した細胞培地をＳＴＩ−アガロース親和性カラム上に直接充填して、機能的ｒ−解毒剤をＳＴＩ樹脂によって捕捉した（図７）。フロースルー画分において機能的ｒ−解毒剤は検出されなかった（注記：ｆＸａ発色活性アッセイの記述が必要とされる。ｒ−解毒剤の適用から複写できる）。ｆＸａ阻害剤の存在下でｆＸａ発色活性アッセイを使用して、ｒ−解毒剤機能を検出した。ｒ−解毒剤は、阻害剤に結合することができる故に、その阻害活性を低下させる。ＦＸａ活性（％）を、ＦＸａ活性（％）＝ｆＸａ活性（阻害剤あり）／ｆＸａ活性（阻害剤なし）×１００によって算出した。

上に記載したばかりのＳＴＩ−アガロース樹脂（図７）とは異なり、同じ透析した細胞培地（５０ｍＬ）をＨＱ−セファロースプレカラム（１２５ｍＬ）上に充填すると、標的のタンパク質は、一方で、フロースルー画分中にあった（図８）。ＨＱ−セファロースプレカラムを、画分２５まで１倍Ｑ−ＢＦで洗浄した。画分２５で、洗浄緩衝液をｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌに切り替えた。ＨＱ−セファロースフロースルー画分を、ｆＸａ機能活性アッセイ（全４７５ｍＬ）に基づいてプールした。この結果は、ＨＱ−セファロースが、ＳＴＩ−アガロース親和性カラム前に使用されるプレカラムとして、またはＳＴＩ−アガロース親和性カラム後のステップで追従するものとして、ｒ−解毒剤に対するフロースルーモードにおいて使用され得ることを実証する。

ＨＱ−セファロースフロースルー画分からプールした画分を、ＳＴＩ−アガロース親和性樹脂（１０ｍＬ）上に充填し、その後、樹脂を１倍Ｑ−ＢＦで洗浄した。図９は、ｒ−解毒剤がＳＴＩ親和性樹脂上に吸収されたことを実証する。その後、結合したタンパク質を、ｐＨ７．４にある２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１Ｍのベンズアミジンの溶出緩衝液で溶出した。図１０Ａは、ベンズアミジン溶出緩衝液での溶出プロフィルを示す。溶出緩衝液中のベンズアミジンはｆＸａ機能活性アッセイに干渉するため、溶出画分中のｒ−解毒剤を、ヒトｆＸ／ｆＸａを認識する市販の対合抗体（ＦＸ−ＥＩＡ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量化した。ｒ−解毒剤を含む画分をプールし、ベンズアミジンをＰＢＳを用いた透析によって除去した。

親和性精製したｒ−解毒剤を、ヒトｆＸ／ｆＸａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を特異的に認識する抗体を使用して、ウエスタンブロット法（図１０Ｂ）によって分析した。図１０Ｂは、ｒ−解毒剤がベンズアミジンで溶出されることを示す。

ｒ−解毒剤をＳＴＩ−アガロース樹脂から溶出するために必要とされるベンズアミジン濃度を更に決定するために、ｒ−解毒剤のＳＴＩ−アガロースカラムからの溶出も、ベンズアミジン勾配を使用して実行した（図１１）。

細胞培地を、まず１ｍＬのＳＴＩ−アガロースカラム上に充填し、前述の通りに洗浄し（図７）、結合したｒ−解毒剤を、１０カラム体積（ＣＶ）の緩衝液Ａと緩衝液Ｂとを含む勾配によって溶出した。緩衝液Ａ（ｐＨ７．４にある２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ならびにｐＨ７．４にある２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１Ｍのベンズアミジンを含む緩衝液Ｂ。ベンズアミジン濃度（勾配）は、各画分中で２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって見積り、ｒ−解毒剤は、ＥＬＩＳＡによって分析した。標的のタンパク質溶出ピークは約２５０ｍＭのベンズアミジンであり、標的のタンパク質溶出は約５００ｍＭのベンズアミジンで終了した（図１１）。したがって、溶出緩衝液中の最適なベンズアミジン濃度は約５００ｍＭである。

精製手順は、より大量の生成物を得るためにスケールアップできる。例えば、１０Ｌの採取した細胞培養液からｒ−解毒剤を精製するためには、まず５００ｍＬのＨＱ−セファロースカラム、次に２００ｍＬのＳＴＩ−アガロースを使用してもよい。スケールアップ法における溶出は、１倍Ｑ−緩衝液中の１Ｍのベンズアミジンを用いて行った（図１２）。

故に、上の結果は、細胞培養液の様々な群（１０〜２５Ｌ）からのｒ−解毒剤精製に対する精製スキーム（図１３）に組み込まれてもよい。スケールアップスキームにおける精製したｒ−解毒剤の質を決定するために、３．５μｇの精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（還元した、１０％のビストリスゲル／ＭＥＳ緩衝液）の個別のウェルに充填した。１）分子量マーカ、２）ＦＸａタンパク質、３）ロット１〜１６Ｌ、４）ロット２〜８Ｌ、５）ロット４〜第１の２５Ｌ、６）ロット５〜第２の２５Ｌ、７）ロット６〜第３の２５Ｌ、および８）ロット７〜第４の２５Ｌ（各ロット番号の後に細胞培養液の開始体積が続く）をレーンに充填した。
実施例３
アルギニンを含む溶出緩衝液を用いたＳＴＩ親和性樹脂によるｒ−解毒剤の精製

ｒ−解毒剤をアルギニンで溶出できるかどうかを試験するために、５〜１０ｍｇの細胞培養由来ｒ−解毒剤タンパク質抽出物を、０．２ｍＬ／分（約６１ｃｍ／時間）でポンプを通して、１ｍＬのＳＴＩ−親和性カラム上に充填した。タンパク質を、ｐＨ５．０にある２５ｍＭのＮａ−アセテート中の０．５Ｍのアルギニンで溶出し、ｐＨを、適当量の１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）の追加によって、約ｐＨ７．４に即座に調整した。その後カラムを、ｐＨ５にある１．０Ｍのアルギニン、２５ｍＭのＮａ−アセテート、続いてｐＨ７．４にある０．５Ｍのベンズアミジン、２０ｍＭのトリス、および１５０ｍＭのＮａＣｌで除去した。図１５は、アルギニン溶出緩衝液での溶出プロフィルを表す。０．５Ｍのアルギニンを含む溶出緩衝液は、ｒ−解毒剤をＳＴＩ親和性樹脂から溶出することできる。追加的なｒ−解毒剤タンパク質は、１Ｍのアルギニンまたは０．５Ｍのベンズアミジンのどちらをもってしても、除去画分中に見出されなかった。

その上、アルギニン緩衝液での溶出は、ベンズアミジンでの溶出と類似した生成物プロフィルを生み出した（図１６）。故に、アルギニン含有溶出緩衝液を用いたＳＴＩ親和性系樹脂を使用して、細胞培養馴化培地由来のｒ−解毒剤を効果的に精製することができることを発見した。

様々な特異的に修飾されたＳＴＩ親和性樹脂の結合能を決定するために、樹脂（樹脂Ａ〜Ｋ）の結合能を類似の条件（１ｍＬカラム）下で試験した。結合したタンパク質を、０．５Ｍのアルギニンを含む溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出画分中のｒ−解毒剤を、ＥＬＩＳＡと２８０ｎｍにおける吸光度との両方によって定量化した。２８０ｎｍにおける吸光度に基づく結合能は、下で表にする。

本明細書で言及または引用される論文、特許、および特許出願の内容、ならびに全ての他の文書および電子的に利用可能な情報は、各個別の刊行物が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、いかなるそのような論文、特許、特許出願、または他の物理的および電子的文書からの一切の資料および情報をも、本出願に物理的に組み込む権利を保持する。

本開示は本明細書で幅広く一般的に説明された。一般的開示の範囲に入るより狭い種および亜属分類の各々もまた、本開示の一部を形成する。これは、切り取られた資料が本明細書で明確に引用されているか否かに関わらず、その属からいかなる対象物も除去する条件または否定的な制限を伴う本開示の一般的記述を含む。

他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、本開示が、それによりマーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の亜群についても記載されることを当業者は認識するであろう。

Claims (22)

1. セリンプロテアーゼを精製する方法であって、
   大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフに、セリンプロテアーゼを充填することと、
   前記ＳＴＩと前記セリンプロテアーゼとの間の相互作用を妨害する薬剤を含む溶出緩衝液で、前記セリンプロテアーゼを溶出することと、を含む、方法。
2. 前記溶出緩衝液が、塩、界面活性剤、および／またはカオトロピック剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記薬剤が、前記セリンプロテアーゼの前記ＳＴＩに競合的に結合する競合薬である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記競合薬が、ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン、アルギニン、小分子ｆＸａ阻害剤、ペプチドｆＸａ阻害剤、およびペプチド模倣ｆＸａ阻害剤からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記競合薬がアルギニンである、請求項４に記載の方法。
6. 前記セリンプロテアーゼが、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか、または、配列番号１もしくは２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有し、Ｇｌａドメインの少なくとも一部の欠失、および活性部位での変異を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
7. 前記セリンプロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸配列、または、配列番号２に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し、前記Ｇｌａドメインの少なくとも一部の欠失、および前記活性部位での変異を有するポリペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記セリンプロテアーゼが前記配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記溶出緩衝液のｐＨが約４．５〜約１０．５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記溶出緩衝液の前記ｐＨが約５．０である、請求項９に記載の方法。
11. 前記溶出緩衝液の前記ｐＨが約７．４である、請求項９に記載の方法。
12. 前記溶出緩衝液が約２５０ｍＭのアルギニン〜約１０００ｍＭのアルギニンを含む、請求項５に記載の方法。
13. 前記溶出緩衝液が約５００ｍＭのアルギニンを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記溶出緩衝液の前記ｐＨが約５．０である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記溶出されたセリンプロテアーゼを、イオン交換カラムでの精製に供することを更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記セリンプロテアーゼを溶出する前に、塩を含み、中性ｐＨにある洗浄緩衝液で前記クロマトグラフを洗浄することを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって調製される、精製されたセリンプロテアーゼ。
18. キットであって、
    大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）系親和性クロマトグラフと、
    前記ＳＴＩと前記セリンプロテアーゼとの間の前記相互作用を妨害する競合薬を含む溶出緩衝液と、を含む、キット。
19. 前記溶出緩衝液がアルギニンを更に含む、請求項１８に記載のキット。
20. 前記溶出緩衝液の前記ｐＨが約４．５〜約１０．５である、請求項１８に記載のキット。
21. 前記溶出緩衝液が約２５０ｍＭのアルギニン〜約１０００ｍＭのアルギニンを含む、請求項１９に記載のキット。
22. 中性ｐＨにある約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄緩衝液を更に含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のキット。
    

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