JP2545686B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

ポリペプチドの製造方法

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JP2545686B2 JP5040008A JP4000893A JP2545686B2 JP 2545686 B2 JP2545686 B2 JP 2545686B2 JP 5040008 A JP5040008 A JP 5040008A JP 4000893 A JP4000893 A JP 4000893A JP 2545686 B2 JP2545686 B2 JP 2545686B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】発現生産物に商業的用途が見出だ
されるその発現に利用できる遺伝子の数がだんだんと多
くなってきている。多くの場合に、初期の発現はＥ．コ
リー（Ｅ．ｃｏｌｉ）で観察されてきている。Ｅ．コリ
ーにおける発現は多くの不利益をもち、その１つは特に
エンテロトキシンの存在であり、これは生産物を汚染し
て哺乳動物への投与に適さないものにする。更に、バチ
ルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトマスセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）、又は酵母（例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ））のようなその他の微生物と比較て
Ｅ．コリーにおける生産物の生産に関しての広範囲の技
術が以前にはなかった。
【０００２】多くの場合に、まだ解明されていない理由
で、活性プロモーター及び高コピー数プラスミドにもか
かわらず、異種性生産物は微生物宿主中でほんの少量で
のみ生産される。そのプロセスの経済性は、所望の生産
物の発現に用いられる栄養分の実質的な割合に依存する
ので、単細胞微生物中でのこれらの生産物の生産は有望
でないことは明らかである。それ故に、宿主の生存度及
び成長特性に実質的に害を与えることなしに所望のポリ
ペプチドの生産を大きく増強する方法およびシステムが
実質的に必要とされている。
【０００３】
【従来の技術】Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等は、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７
８）７５：３７２７〜３７３１頁において、Ｅ．コリー
における発現のためのペニシリナーゼのＮ−末端に連結
されたプロインシュリンをコードする融合配列を記載し
ている。Ｐａｕｌ等は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．（１９８３）３１：１７１〜１７４頁に
おいて、Ｅ．コリーにおける発現のためのトリプトファ
ンＥ遺伝子生産物の一部のＣＯＯＨ−末端に連結された
プロインシュリンをコードする融合配列を記載してい
る。
【０００４】Ｇｏｅｄｄｅｌ等は、同書（１９７９）７
６：１０６〜１１０頁において、Ｅ．コリーにおいて融
合ポリペプチドを提供するためにＥ．コリーβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子に融合したヒトインシュリンＡ及びＢ
鎖についての合成遺伝子を記載している。Ｓｔｅｐｉｅ
ｎ等は、Ｇｅｎｅ（１９８３）２４：２８９〜２９７頁
において、酵母における融合生産物としてのインシュリ
ンの発現を記載しており、その場合に、プロインシュリ
ン遺伝子を、酵母における発現のためにＧＡＬ１のＮ−
末端をコードする配列に融合させている。
【０００５】
【発明の要旨】異種性のポリペプチドを真核微生物宿主
中で高収率で生産するための方法が提供され、それによ
って完全に異種性の融合生産物が発現され、そのペプチ
ドの一部はそのような宿主中で他とは無関係に高収率で
発現されることが示されている生産物であり、そしてそ
の生産物の残りの部分は関心のあるポリペプチドであ
り、高収率での融合生産物の生産がもたらされる。
【０００６】その２つのポリペプチドをコードする配列
はオープンリーディングフレームを合わせて融合され、
この場合に高収率ポリペプチドをコードする配列は５′
−末端又は３′−末端のいずれかにあり得る。その発現
生産物中に含まれる２つのポリペプチドは選択的に開裂
できる結合によって連結されていてもよく、その結果と
してその２つのポリペプチドは各々のポリペプチドを高
収量で提供ために分離されてもよい。
【０００７】他の方法としては、融合蛋白質の開裂がそ
の意図された用途にとって必要でないならば、その開裂
部位は存在しなくてもよい。特に、高収率のポリペプチ
ドがスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）場合には
酵母宿主が用いられる。
【０００８】
【特定の態様の説明】ポリペプチドをコードする配列を
用いることによって、真核生物、特に酵母、中での異種
性生産物の生産を増強する新規な方法及び組成物が提供
され、それは選択的に開裂できる部位によって連結され
た２つのポリペプチド領域の組み合わせである。その２
つの領域は、宿主中で他とは無関係に高収率で生産され
るポリペプチドである第一域、及びそれ自体として注目
されそして活性である第二のポリペプチド、特に、宿主
中ではなかなか得られないものである。
【０００９】関心のある宿主としては真核単細胞微生
物、特に菌類、例えばフイコミセテス（Ｐｈｙｃｏｍｙ
ｃｅｔｅｓ）、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）、バシジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）及びデューテロミセテス（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｔｅ
ｃｅｓ）、一層特定的にはアスコミセテス、例えば酵
母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）、及びクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ）等がある。Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のよ
うな原核宿主を用いてもよい。
【００１０】融合において第一領域として用いられる安
定なポリペプチドは経験的に決定できる。従って、異種
性ポリペプチドは種々の宿主生物中で発現されるので、
全蛋白質に対するポリペプチドの収率は容易に求められ
る。宿主によって生産される全蛋白質の５％以上の量で
生産されるポリペプチドに関して、そのようなポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列は本発明で用いてもよい。
【００１１】ＤＮＡ配列はその配列をコードする異種性
遺伝子と同じでもよく、異種性遺伝子の突然変異種でも
よく、または置換された１種以上のコドンをもってい
て、この場合にそのコドンは宿主によって好まれるコド
ンとして選択されてもよい。好ましいコドンは、遺伝暗
号の縮重に基づいて、宿主中で個々の最大の豊富さで生
産される蛋白質中の、そのようなコドンを見出だす数学
的な確率よりも実質的に大きく見いだされるコドンであ
る。特に、酵母においては、解糖酵素は好ましいコドン
を決定する基礎であり得る。
【００１２】宿主中でポリペプチドを所望の高収率で提
供する遺伝子全体又は遺伝子のいずれかの部分を用いて
もよい。従って、安定なポリペプチドが関心のあるポリ
ペプチドよりも経済的価値がかなり低い場合には、遺伝
子の一部を切り取って、遺伝子全体及びそれのポリペプ
チド生産物の所望の特性をまだ保持しながら、一方全融
合生産物中の安定化ポリペプチドの割合を低下させるよ
うな断片にすることが望ましいかもしれない。酵母中の
安定なポリペプチド生産物をコードする遺伝子の例とし
ては、スーパーオキシドジスムターゼ、特にヒトスーパ
ーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子がある。
【００１３】２つのポリペプチド、即ち安定化ポリペプ
チド及び関心のあるポリペプチド、をコードするＤＮＡ
配列は種々の方法で得ることができる。ポリペプチドを
コードする配列は天然源から誘導することができ、この
場合にメッセンジャーＲＮＡ又は染色体ＤＮＡは適切な
プローブにより同定することができ、このプローブはコ
ード配列又は非コード配列の一部と相補的である。メッ
センジャーＲＮＡから、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡが慣用の
技術に従って逆転写酵素を用いて調製され得る。
【００１４】そのｓｓＤＮＡ相補鎖を次いで、ポリペプ
チドをコードする領域を含む二重鎖（ｄｓ）ｃ ＤＮＡ
を提供するための第二鎖を調製するための鋳型として用
いることができる。染色体ＤＮＡを用いる場合には、コ
ードする領域を含む領域をプローブを用いて検出し、制
限酵素マッピングし、そして適切な技法を用いて非翻訳
５′及び３′領域を本質上含まない領域を単離する。コ
ード配列の一部のみが得られる場合には、その残りの部
分は、コード部分に連結することができしかも特定の機
能又は特徴を提供するその他の配列に連結するための便
利な末端を提供するアダプター合成によって提供されて
もよい。
【００１５】２つの遺伝子が天然源から完全に又は一部
として得られる場合には、その２つの遺伝子を適当なリ
ーディングフレーム内に連結させることが必要である。
融合蛋白質の開裂が必要ならば、それらの連結部が選択
可能な開裂部位を定義しない場合には、遺伝子は選択的
に開裂できる部位によって分離される。選択的に開裂で
きる部位はある程度は遺伝子の性質に依存する。即ち、
開裂のための手段は一方または両方の遺伝子のアミノ酸
配列に依存して変化する。
【００１６】他方、開裂が必要でない場合があり、また
ある場合には望ましくない。融合蛋白質は診断薬とし
て、アフイニテイーカラムに、配列の決定のための源と
して、免疫源として融合蛋白質を用いての抗体の生産、
等に用いられる。２つの遺伝子は普通にはイントロンを
含まない。なぜならｍＲＮＡのスプライシングは関心の
ある真核単細胞微生物に広範囲には用いられていないか
らである。
【００１７】関心のあるポリペプチドは、原核性源又は
真核性源から誘導された、天然の又は合成のいずれか
の、あらゆるポリペプチドであり得る。普通には、ポリ
ペプチドは少なくとも１５個のアミノ酸（４５bpの遺伝
子）、一層普通には３０個のアミノ酸（９０bpの遺伝
子）をもち、そして３００個以上のアミノ酸（９００bp
以上の遺伝子）であってもよい。
【００１８】関心のあるポリペプチドとしては、酵素、
ウイルス蛋白質（例えば、エイズ（ＡＩＤＳ）に関連し
たウイスル、例えばｐ１８，ｐ２５，ｐ３１，gp４１等
からの蛋白質）、哺乳動物蛋白質、例えば調節機能に関
連するもの、例えばリンフォカイン、成長因子、ホルモ
ン又はホルモン前駆体（例えば、プロインシュリン、イ
ンシュリン様成長因子、例えば、ＩＧＦ−Ｉ及び−II
等）、等、血液凝固因子、血餅溶解因子、免疫グロブリ
ン等がある。ポリペプチドのフラグメントまたはフラク
ションは、そのようなフラグメントが生理学的活性、例
えば免疫活性（例えば親蛋白質との交差反応活性）、ア
ゴニストまたはアンタゴニストとしての生理学的活性、
等をもつ場合に用いられる。
【００１９】選択可能な開裂のための方法の１つは、米
国特許第４，３６６，２４６号に記載されている臭化シ
アノゲンの使用である。この技術は、開裂部位以外に利
用できるメチオニンがないこと、または開裂されるメチ
オニンとポリペプチド配列内のメチオニンとを選択的に
区別できること、を必要とする。他の方法としては、特
定タイプのアミノ酸によって特定される部位を識別して
開裂するプロテアーゼを用いてもよい。
【００２０】通常のプロテアーゼとしてはトリプシン、
キモトリプシン、ペプシン、ブロメライン、パパイン等
がある。トリプシンは塩基性アミノ酸に対して特異的で
ありそしてリシンまたはアルギニンのいずれかについて
のペプチド結合のカルボキシル基側で開裂させる。更
に、アミノ酸の特定の配列に対して特異的なペプチダー
ゼ、例えばポリペプチドからの分泌リーダーシグナルの
選択的開裂に関与するペプチダーゼ、を用いることがで
きる。
【００２１】これらの酵素は酵素中のα−因子及びキラ
ートキシンで見出だされるような配列に特異的であり、
例えば、ＫＥＸ２エンドペプチダーゼは塩基性残基の対
に対して特異的である（Ｊｕｌｉｕｓ等、Ｃｅｌｌ（１
９８４）３７：１０７５〜１０８９頁）。また、アミノ
酸の特定の配列で開裂させる酵素が存在する。ウシエン
テロキナーゼ（Ｌｉｇｈｔ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．（１９８０）１０６：１９９〜２０６）はアスパラ
ギン酸、グルタミン酸、又はカルボキシメチルシステイ
ンの酸残基によって先行されるリジンまたはアルギニン
のカルボキシル基側を開裂する。
【００２２】多くの種中のトリプシノゲンの活性ペプチ
ドの一部として天然に見出だされる配列（Ａａｐ）４Ｌ
ｙｓは特に有用である。特定の配列を認識し、そして開
裂するその他の酵素としては、コラゲナーゼ（Ｇｅｒｍ
ｉｎｏ及びＢａｔｉａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（１９８４）８１：４６９２〜４６９６
頁）；因子ｘ（Ｎａｇａｉ及びＴｈｙｇｅｒｓｅｎ、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０〜８１２頁）；
及びポリウビクイチン・プロセッシング酵素（Ｏｚａｋ
ａｙｎａｋ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：６６
３〜６６６頁）がある。
【００２３】開裂可能な部位を含むアミノ酸に加えて、
その２つの融合ポリペプチドを更に分離することが有益
であり得る。そのような″ヒンジ″は立体融通性を可能
にしそれで融合ポリペプチドはおそらく相互にあまり妨
害せず、従って開裂部位の誤った折りたたみ、阻止等が
防止される。
【００２４】″ヒンジ″アミノ酸配列は種々の長さであ
ることができ、アミノ酸側鎖が開裂可能な部位で破壊さ
せるのに用いられる作用方式を、またはいずれかの融合
ポリペプチド、において必要とされる相互作用、例えば
イオン結合、疎水性結合又は水素結合を妨害しない限り
は、いかなるアミノ酸側鎖を含んでいてもよい。好まし
くは、ヒンジを含むアミノ酸は側鎖をもち、それは中性
で且つ極性または非極性のいずれかであり、そして１個
以上のプロリンを含んでいてもよい。
【００２５】そのヒンジ域は少なくとも１つのアミノ酸
をもち、そして２０個以上のアミノ酸をもっていてもよ
く、普通には１５個以下のアミノ酸をもち、特に非極性
アミノ酸Ｇ，Ａ，Ｐ，Ｖ，Ｉ，Ｌ，及び中性の極性アミ
ノ酸Ｎ，Ｑ，Ｓ，及びＴを持つ。 例示としてヒンジ配列はＮ−Ｓ；Ｑ−Ａ；Ｎ−Ｓ−Ｇ−
Ｓ−Ｐ；Ａ−Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｐ；Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｐ−Ｔ−Ｐ
−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｐ；Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ａ；等で
あるが、これらに限定されるものではない。そのような
ヒンジ配列は融合ポリペプチド間の分離を更に増加させ
るために繰り返し単位として用いてもよい。
【００２６】″ヒンジ″アミノ酸は、関心のある最終の
開裂したポリペプチドに結合されないようにするため
に、他方とは無関係に高収率で生産されるポリペプチド
（スーパーオキシドデイスムターゼ）と開裂可能な部位
配列との間に″ヒンジ″を入れるように本発明を実施す
ることが望ましいが、しかし必須ではない。
【００２７】１個以上のアミノ酸が開裂部位に関与する
場合には、そのような配列をコードするコドンは、合成
的に調製され、そして全てのコドンが適切なリーディン
グフレーム内にありそして選択可能な開裂部位が２つの
ポリペプチドを連結している融合蛋白質を提供するよう
に、ポリペプチドをコードする配列に連結されるであろ
う。
【００２８】融合コード配列のほんの小部分を合成的に
調製する代りに、全配列を合成的に調製してもよい。こ
のことはコドンの選択においてある種の融通性を可能に
し、それによって好ましいコドン、制限部位、を提供す
ることができるようになり、ＤＮＡ及びメッセンジャー
ＲＮＡ等の特定の内部構造を避けるかまたは提供するこ
とができるようになる。
【００２９】ほとんどの場合について、融合コード配列
は単一体として調製されるが、それは種々の断片として
調製されてもよく、これらの断片は種々の非翻訳領域に
連結されて特定の機能を提供し、そして最終的にそのコ
ード配列を次の段階で結合されてもよいことを認識すべ
きである。しかしながら、表現を明確にするために、解
説を主として、コードする配列が単一体として調製さ
れ、次いで発現ベクターに移す場合に向けられている。
【００３０】融合コード配列の部分を構成する種々の配
列を、クローニングベクターに第１の断片を導入するこ
とにより連結することができる。次に、生ずるクローン
を、コード配列、及び失われたコドンを置き換えそして
次の断片への連結のための便利な末端を有する、導入さ
れたアダプターの内側の部位において制限開裂すること
ができる。
【００３１】末端は使用する特定のヌクレオチドに依存
して付着末端又は平滑末端である。一緒にされた第１断
片及びアダプターのクローニングの後、アダプターによ
り提供される制限部位においてベクターを制限切断し、
そして第２断片の残りのコード配列をベクターに導入し
て連結及びクローニングを行う。生ずる融合配列は適当
な制限部位を両端に有すべきであり、これによって完全
配列がクローニングベクターから容易に取り出され、そ
して発現ベクターに移される。
【００３２】発現ベクターは適切なコピー数を有するよ
うに、そして安定な染色体外での維持をもたらすように
選択される。他の方法として、ベクターは宿主ゲノム配
列に相同の配列を含有し、これにより組込み及び増幅が
可能にされる。発現ベクターは通常、発現宿主中での選
択を可能にするマーカーを有する。好ましくは、ある状
況下で使用される殺生物剤の使用を回避するため、補完
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用い、この場
合、宿主は栄養要求性でありそしてマーカーは原栄養性
をもたらす。
【００３３】他の方法として、エピゾーム因子は、短時
間の供給において必須栄養素又は代謝産物を利用する増
強された能力を宿主に与えることにより選択における利
点をもたらすであろう。重要な因子は、染色体外クロー
ニングベクターが好ましくは、融合蛋白質の生産の間に
ベクターを自然に失う宿主に比べて、ベクターを含有す
る宿主について選択における利点をもたらすことであ
る。
【００３４】クローニングベクターはまた、宿主の生存
を深刻に妨害しない活性な転写開始制御領域を含むであ
ろう。特に興味ある領域は、解糖に関する酵素；酸性ホ
スファターゼ；熱ショック蛋白質；メタロチオネイン等
の発現と関連するであろう。解糖系に関与する酵素には
アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナ
ーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホフ
ラクトキナーゼ等が含まれる。
【００３５】種々の転写制御領域を用いることができ、
これらの領域はＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写開始
と関連する領域（″プロモーター領域″）（これらの２
つの領域はタンデムに配置される）、又は通常プロモー
タ領域の５′にある転写開始制御領域（″調節領域″）
のみを含み、ここで調節領域は通常、前記プロモーター
又は野性型宿主中の他のプロモーターと関連する。調節
領域は誘導的制御をもたらし、ここで誘導は物理的変
化、例えば温度の変化、又は化学的変化、例えば栄養又
は代謝産物、例えばグルコース又はトリプトファンの濃
度の変化、あるいはpH又はイオン強度の変化の結果であ
ろう。
【００３６】特に興味あるのは、ハイブリド転写開始制
御領域の使用である。好ましくは、このハイブリド転写
開始領域は解糖系酵素のプロモーター領域を使用するで
あろう。調節領域は、宿主の種々の発現生成物の調節領
域、例えばＡＤＨII，ＧＡＬ４，ＰＨＯ５等の調節領域
に由来することができる。
【００３７】転写開始制御領域は野性型遺伝子の５′領
域の約５０〜１０００塩基対（bp）の範囲であることが
できるＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する領域に加え
て、他の制御シグナル、例えばキャッピング配列、転写
開始配列、エンハンサー、誘導的転写のための転写制御
領域等が存在することもできる。
【００３８】転写開始制御領域は一般にポリリンカーに
よりターミネーター領域から分離され、このポリリンカ
ーは多数のユニーク制御部位、通常２個以上、そして約
１０個以下、通常６個以下のユニーク制限部位を有す
る。ポリリンカーは一般に約１０〜５０bpであろう。ポ
リリンカーの次にターミネーター領域が続くであろう。
この領域は、２つの領域が使用される場合に効果的な転
写開始及び停止が達成される限り、プロモーター領域が
得られたのと同じ野性型遺伝子から、又は異る野性型遺
伝子から得られる。
【００３９】発現ベクターを適当な制限酵素で消化する
ことにより、ポリリンカーが開裂され、そして融合ポリ
ペプチドをコードするオープンリーディングフレームが
挿入される。ポリリンカーが区別可能な末端を許容する
場合、融合遺伝子が１つの方向に挿入することができ、
他方末端が同一であれば、融合遺伝子の挿入は２つの異
る方向を有するプラスミドをもたらし、その内の１つの
みが正しい方向を有する。ともかく、単離及び精製のた
めに原核性複製糸を有する発現ベクターをクローン化
し、そして次に適当な真核性宿主、例えば酵母宿主に導
入する。外来性ＤＮＡの真核宿主への導入は種々の方
法、例えばカルシウム−ポリエチレングリコール処理ス
フェロプラスド、リポゾームの使用、接合等により行う
ことができる。
【００４０】次に、発現することができる融合遺伝子を
含有するプラスミドを含む宿主細胞を、宿主のために適
切な栄養培地中で増殖せしめる。誘導性の転写開始制御
領域を用いる場合、宿主細胞を高濃度に増殖せしめ、そ
して融合ポリペプチドの発現について開始をターン・オ
ンする。プロモータが誘導的でない場合、目的とする融
合ポリペプチドの構成的生産が起こるであろう。
【００４１】生成物がもはや増加しなくなるまで、又は
生成物の生産と消費される栄養との比率が所定の値より
低くなるまで、細胞を増殖せしめ、この時点で細胞を回
収し、溶菌、そして融合蛋白質を得、そして常法に従っ
て精製する。これらの方法には、クロマトグラフィー、
例えばＨＰＬＣ；電気泳動；抽出；密度勾配遠心等が含
まれる。融合蛋白質を得た後、これを、選択的に開裂可
能な連結の種類に従って選択的に開裂せしめる。これ
は、種々の連結の記載との関連においてすでに記載され
ている。
【００４２】幾つかの場合には、分泌リーダー及びプロ
セシングシグナルを、融合ポリペプチドの部分として含
めることができる。種々の分泌リーダー及びプロセシン
グシグナル、例えばα−ファクター、酵母キラートキシ
ン等が知られている。これらのポリペプチドシグナルを
コードするＤＮＡ配列を、融合ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列の５′−末端（センス鎖の転写の方向にお
いて）にリーディングフレームを合わせて連結し、プレ
ー融合ポリペプチドの転写及び翻訳をもたらすことがで
きる。
【００４３】この発明に従えば、宿主の全蛋白質に対し
て５重量％以上、好ましくは６重量％以上、そしてさら
に好ましくは約１０％以上の生成物を生産することがで
きる。同様にして、使用される栄養は目的生成物への転
換のために効果的に利用される。
【実施例】次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明
する。但し、これによりこの発明の範囲を限定するもの
ではない。
【００４４】例１．ＳＯＤ−プロインシュリン融合蛋白
質のための発現ベクターの造成及び発現 ｐＹＳＩ１の造成 ＧＡＰプロモーター及びターミネーターの制御のもとに
ヒト−プロインシュリン遺伝子のアミノ末端に融合した
ヒトＳＯＤ遺伝子を含有する酵母発現プラスミドｐＹＳ
Ｉ１を造成した。融合蛋白質のプロセシングを可能にす
るため、ＳＯＤ遺伝子及びプロインシュリン遺伝子の間
にメチオニンをコードするトリプレットを含有せしめ
た。ＳＯＤ配列は、化学合成された最初の２０コドンを
除き、ヒト−肝臓ライブラリーから単離されたｃＤＮＡ
に対応する。
【００４５】プロインシュリン配列は、Ｂｅｌｌ等，１
９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：５２５〜５２７により
報告されたアミノ酸配列に従って、しかし酵母において
好ましいコドンを用いて化学合成した。ＧＡＰプロモー
ター及びターミネーター配列は酵母ライブラリーから単
離された酵母ＧＡＰ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ及びＨｏｌ
ｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７２，２５
４：５４６６−５４７４）から得た。
【００４６】プラスミドｐＹＳＩ１を次のようにして造
成した。３つの断片、すなわち、ｐｈＳＯＤ（ｐＳＯＤ
Ｎｃｏ５とも称する）から単離された４５４bpＮｃｏ
Ｉ−Ｓａｕ３Ａ断片〔この断片は、ヒトスーパーオキシ
ドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）の最後の３個の３′−コド
ンを除く全配列を含む）；ｈＳＯＤの最後の３個のコド
ン、メチオニン、及びプロインシュリンの最初の１４コ
ドンをコードする５１bpＳａｕ３Ａ−ＨｉｎｄIII 合成
アダプター；及び最初の１４アミノ酸を除くプロインシ
ュリンをコードする、ｐＩＮＳ５から単離された２３１
bpＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片、を使用した。
【００４７】これらの断片を一緒に連結し、そして次
に、ＮｃａＩ及びＳａｌＩによりあらかじめ消化されそ
してアルカリ性ホスファターゼで処理されたプラスミド
ｐＰＧＡＰに導入した。得られたプラスミドｐＳＩ１を
ＢａｍＨＩで消化して発現カセットを得、これをプラス
ミドｐＣ１／１にクローン化してｐＹＳＩ１を得た。
【００４８】プラスミドｐｈＳＯＤ（ｐＳＯＤＮｃｏ５
とも称される）はｐＢＲ３２２由来細菌性発現ベクター
であって、１９８４年５月１１日に出願された米国特許
出願６０９，４１２号明細書に記載されているように、
ｈＳＯＤをコードする完全なｃＤＮＡ（最初の２０コド
ンは化学的に合成された）。プラスミドｐＩＮＳ５はｐ
ＢＲ３２２由来ベクターであり、Ｂｅｌｌ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ，１９７９，２８２：５２５−５２７により報告さ
れたアミノ酸配列に従って化学的に合成されたプロイン
シュリンコード配列を含有する。なお、ヒト−Ｃｎ・Ｚ
ｎ型スーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸配列、及
びそれをコードする塩基配列の１例を次に示す。
【化１】
【００４９】プラスミドｐＰＧＡＰは前記の特許出願N
o. ６０９，４１２号明細書中に記載されているｐＢＲ
３２２由来ベクターであって、クローニングのための複
数の単一制限部位をもたらすポリリンカーを介してＧＡ
Ｐプロモーター及びＧＡＰターミネータ（Ｈｏｌｌａｎ
ｄ及びＨｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
９７９，２５４：５４６６−５４７４を含有する。プラ
スミドｐＣ１／１は、ｐＢＲ３２２配列、２μプラスミ
ド配列及び選択マーカーとしての酵母遺伝子ＬＥＬ２を
含有する酵母発現ベクターである。ＥＰＯ８３／３０６
５０７．１を参照のこと。
【００５０】ｐＹＳＩ２の造成 Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ｓをコードするコドンの″ス
ペーサ″によりプロインシュリン遺伝子から分離され
て、転写の方向において５′−末端に、ｈＳＯＤコード
配列を有する融合遺伝子を調製するため、次の断片すな
わち、ＧＡＰプロモーター、プロインシュリン遺伝子及
びスペーサーアミノ酸を含有する６７１bpＢａｍＨＩ−
ＳａｌＩ断片；両遺伝子の連結部として最後のスペーサ
ーアミノ酸をコードする１４bpＳａｌＩ−ＮｃｏＩ合成
アダプター；並びに、前記の特許出願書No. ６０９，４
１２号明細書に記載されているｐＣ１／１ ＳＡＰＳＯ
Ｄから単離された１．５kbＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ｈＳＯＤコード領域、５６bpのｈＳＯＤターミネータ
ー及び９３４bpのＧＡＰターミネーター領域を含有す
る）を連結した。得られるクローン化断片を単離し、そ
してＢａｍＨＩ消化されそしてアルカリ性ホスファター
ゼ処理されたｐＣ１／１中に挿入した。
【００５１】プラスミドｐＰＫＩ１及びｐＰＫＩ２ ｐＹＳＩ１及びｐＹＳＩ２に類似するプラスミドを、ｈ
ＳＯＤ遺伝子の代わりに酵母ピルベートキナーゼ（ＰＹ
Ｋ）を用いて造成した。ｐＰＫＩ１は、酵母ＰＹＫプロ
モーター及び酵母ＧＡＰターミネーターの制御のもと
に、ヒト−プロインシュリン遺伝子のアミノ末端に融合
したＰＹＫコード配列を含有する。ｐＰＫＩ２は、Ｋ−
Ｒ−Ｓ−Ｔ−Ｓをコードするコドンの″スペーサー″に
よりプロインシュリン遺伝子から分離されて、転写の方
向において３′−末端に、ＰＹＫコード配列を含有す
る。
【００５２】ｐＹＡＳＩ１の造成 この酵母発現ベクターはｐＹＳＩ１に類似し、そしてメ
チオニンコドンを介してヒト−プロインシュリン遺伝子
のアミノ末端に融合したｈＳＯＤ遺伝子を含有する。こ
の融合遺伝子はハイブリド誘導性プロモーターＡＤＨ２
−ＧＡＰ（酵母アルコールデヒドロゲナーゼ２）及びＧ
ＡＰターミネーターの制御のもとにある。ｐＹＳＩ１か
らのＧＡＰプロモーター配列をハイブリドＡＤＨ２−Ｇ
ＡＰプロモーター配列で置き換えることにより約３Kbp
ＢａｍＨＩ発現カセットを造成した。
【００５３】このプロモーターのＡＤＨ２部分を次のよ
うにして造成した。すなわち、野性型ＡＤＨ２遺伝子を
含有するプラスミド（プラスミドｐＡＤＲ２，Ｂｅｉｅ
ｒ及びＹｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８２，３００，
７２４−７２８を参照のこと）を制御酵素ＥｃｏＲ５で
切断した。この制限酵素は、ＡＴＣ開始コドンに対して
＋６６位、及びＡＤＨ２領域外のｐＡＤＲ２中の他の２
つの部位を切断する。ベクター断片及び２つの小断片の
混合物をＢａｌ３１エキソヌクレアーゼで切り取って約
３００bpを除去した。
【００５４】Ｂａｌ３１処理されたＤＮＡに合成Ｘｈｏ
Ｉリンカーベクター断片（約５kb）をカラムクロマトグ
ラフィーによりリンカーから分離し、制限酵素ＸｈｏＩ
で切断し、再連結し、そしてこれを用いてＥ．コリをア
ンピシリン耐性に形質転換した。ＸｈｏＩリンカー付加
の位置をＤＮＡ配列決定により決定した。ＡＤＨ２遺伝
子の５′−非転写領域（ＡＴＧから−２３２位）内に位
置するＸｈｏＩリンカーを含有する１つのプラスミドを
制限酵素ＸｈｏＩで切断し、ヌクレアーゼＳ１で処理
し、そして次に制限酵素ＥｃｏＲＩで処理してＸｈｏＩ
リンカーの部位に１つの平滑末端、及びＥｃｏＲＩ末端
を有する線状ベクター分子を形成した。
【００５５】プロモーターのＧＡＰ部分を、プラスミド
ｐＰＧＡＰ（前掲）を酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで
切断し次に０．４kbp ＤＮＡ断片を単離することにより
造成した。プラスミドｐＪＳ１０４を、ＡｌｕＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ ＧＡＰプロモーター断片を上記の線状ベクター
上に存在するＡＤＨ２断片に連結することにより造成し
た。
【００５６】プラスミドｐＪＳ１０４をＢａｍＨＩ（こ
れは、ＡＤＨ２領域の上流を切断する）及びＮｃｏＩ
（これは、ＧＡＰ領域の下流を切断する）により消化し
た。ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーターを含有する約１．３
kbp 断片をゲル精製し、そしてｐＹＳＩ１（前記）中に
存在するＧＡＰターミネーター及びｈＳＯＤ−プロイン
シュリン融合ＤＮＡ配列を含有する約１．７kbp 断片に
連結した。この３kbp 発現カセットを、ＢａｍＨＩ消化
されそしてホスファターゼ処理されたｐＣ１／１にクロ
ーン化してｐＹＡＳＩ１を得た。
【００５７】トリプシン及びエンテロキナーゼ開裂部位
を含有するｐＹＡＳＩ１の誘導体の造成 ｐＹＡＳＩ１から一連のプラスミドを造成した。ここで
は、ＧＰＡターミネーターをα−ファクターターミネー
ター（Ｂｒａｋｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：４６４２）により置
き換え、そしてＳＯＤとプロインシュリンとの開裂部位
をトリプシン又はエンテロキナーゼプロセシング部位を
コードするように変形した。
【００５８】Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする配列を用いて
ｐＹＡＳＩ１中のメチオニンコドンを置換してトリプシ
ン部位を得た。別法として、開裂部位に（Ａｓｐ）4 Ｌ
ｙｓをコードする配列を用いてエンテロキナーゼ部位を
得た。さらに、余分のヒンジアミノ酸をコードする配列
をＳＯＤと開裂部位との間に挿入して他の造成も行っ
た。
【００５９】融合蛋白質の発現 酵母２１５０−２−３株（Ｍａｔａ，ａｄｅＩ，ｌｅｕ
２−０４，ｃｉｒ°）又はＰ０１７株（Ｍａｔａ，Ｌｅ
ｕ２−０４，ｃｉｒ°）を異るベクターにより、Ｈｉｎ
ｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ（１
９７８）７５：１９２９−１９３３に従って形質転換し
た。構成的ＧＡＰ制御ベクターを担持する単一形質転換
体コロニーを２mlのｌｅｕ- 選択培地に後対数増殖期又
は定常期まで増殖せしめた。
【００６０】誘導性ＡＤＨ２−ＧＡＰ制御ベクターをｌ
ｅｕ- 選択培地中で飽和まで増殖せしめ、次にＹＥＰ
（３％エタノールを含み、２〜３．５mMＣｕＳＯ4 を含
むか又は含まない）中に１：２０（ｖ／ｖ）に稀釈し、
そしてこの培地中で飽和まで増殖せしめた。ＳＤＳ及び
還元剤の存在下で細胞を溶解し、そしてこの細胞溶解物
を遠心分離により透明にした。透明な細胞溶解物をポリ
アクリルゲル電気泳動にかけた（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７０）２７７：６８０）。クマーシーブ
ルーにより染色した後、約２８kDal（キロダルトン）の
バンドが観察され、そのサイズは融合蛋白質であること
を予想せしめた。
【００６１】このバンドは、発現ベクターにより形質転
換された細胞においては観察されたが、対照（ｐＣ１／
１）プラスミドを担持する細胞の抽出物には存在しなか
った。バンド当りの蛋白質の量を、クマーシーブルー染
色されたゲルのデンシトメーターによる分析により決定
した。ｐＹＳＩ１，ｐＹＳＩ２又はｐＹＡＳＩ１で形質
転換された細胞における染色ゲルから算定した場合、融
合蛋白質は全細胞蛋白質の１０％以上であり、他方ｐＹ
ＰＫＩ１又はｐＹＰＫＩ２による形質転換体においては
０．５％より少ない（第１表を参照のこと）。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】ＰＹＫ：ピルベートキナーゼ遺伝子 ＳＯＤ：ヒトＳＯＤ遺伝子 ＢＣＡ５：プロインシュリン遺伝子 Ｐ，Ｇ，Ｄ，Ｎ，Ｍ，Ｋ，Ｒ，Ｓ，Ｔ：１文字アミノ酸
コード ＧＡＰp ：ＧＡＰプロモーター ＧＡＰt ：ＧＡＰターミネーター ＰＹＫp ：ＰＹＫプロモーター ＰＹＫt ：ＰＹＫターミネーター （ＡＤＨ２−ＧＡＰ）p ：ハイブリドＡＤＨ２−ＧＡＰ
プロモーター α−ファクターt ：α−ファクターターミネーター。
【００６５】第１表に示す結果は、ＰＹＫ−プロインシ
ュリン融合体の発現レベルはプロインシュリンのみにつ
いて得られたそれに匹敵する（それぞれ約０．５％及び
０．１％）がｈＳＯＤ−プロインシュリンの発現レベル
は約２０〜１００倍高いことを示している。
【００６６】誘導性ＡＤＨ２−ＧＡＰハイブリド転写開
始制御領域が好ましい。なぜなら、大規模培養における
構成的生産は不安定な発現をもたらすからである。酵母
により合成されたｈＳＯＤ−プロインシュリン蛋白質を
さらにウェスタンブロットにかけた。上記のようにして
調製された透明な酵母細胞溶解物をポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動し（Ｌａｅｍｍｌｉ，前掲）、そして
次に蛋白質をニトロセルロースフィルター上に電的的に
ブロットした（Ｔｏｗｂｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７６：３４５
０）。
【００６７】２枚の同じフィルターにブロットした。こ
のフィルターをＰＢＳ中１％ＢＳＡと共に１時間プレイ
ンキュベートし、そして次にラビット抗−ｈＳＯＤ又は
モルモット抗−インシュリン抗体により４℃にて１２時
間処理した。いずれの血清も、１０％やぎ血清中ｐＣ１
／１対照細胞溶解物により前吸着しておいたものであ
る。
【００６８】フィルターを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄
し、そしてホースラディッシュパーオキシダーゼと接合
した第２ヤギ抗−ラビット抗体又は抗−モルモット抗体
を加えた。最後に、フィルターをホースラディッシュパ
ーオキシダーゼ発色剤（ビオーラド）と共にインキュベ
ートし、そして洗浄した。ウェスタン分析は、融合蛋白
質が両抗体と反応したことを示した。
【００６９】融合蛋白質の開裂 ２１５０（ｐＹＡＳＩ１）の飽和培養物をＳＤＣ（−ロ
イシン＋スレオリンおよびアデニン、２％グルコース含
有）中で増殖せしめた。これを、炭素源として３％エタ
ノールを含有するＹＥＰを収容する１０ｌファーメンタ
ーに接種した。３０℃にて４８時間の後、細胞を遠心分
離（シャープレス）により集め、秤量し（１２４ｇ）、
そして冷水で洗浄した。
【００７０】１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．０，１mM
ＥＤＴＡ，１μｇ／mlペプスタチンＡ及び１mMＰＭＳＦ
を含有する緩衝液を用いてガラスビーズ破砕機（ダイノ
ミル）により細胞を溶解した。この混合物をＪＡ１０ロ
ータ（ベックマン）中で８，０００rpm にて２０分間遠
心分離した。ペレットを１００mlの緩衝液中に再懸濁
し、そして液体をビーズから離した。約５００mlの緩衝
液が使用されるまでこれを反復して、すべてのペレット
物質をガラスビーズから十分に離した。再懸濁されたペ
レットを遠心分離し、そしてこのペレットを再度洗浄し
た。次にペレットを１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で３
０分間抽出した。
【００７１】ＳＤＳ可溶性画分を５００mlの溶剤Ａ（Ｋ
ｏｍｉｇｓｂｅｒｇ及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９８
３，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚ．９１，２５４−２５９
頁）を用いてイオン対（ｉｏｎ−ｐａｉｒ）抽出し、ペ
レットを溶剤Ａで一回及びアセトンで１回洗浄した。
【００７２】真空デシケーターで乾燥した後、粉末を１
４０mlの１００％蟻酸中に溶解した。６０mlの水及び２
０ｇのＣＮＢｒを加えた。暗中室温にて２４時間置いた
後、さらに２０ｇのＣＮＢｒを加え、そして反応を２４
時間続けた。この時点で、この材料を４ｌの水に対して
一夜、２０００MWカットオフチューブ（スペクトラポー
ル）を用いて透析した。次に０．１％酢酸に対して第２
回目の透析を行った。凍結乾燥した後、ほとんどＳＯＤ
−ホモセリンとプロインシュリンとからなる粉末を１．
１ｇ得た。
【００７３】この粉末を７％尿素、９％亜硫酸ナトリウ
ム、及び８．１％ナトリウムテトラチオネート・２Ｈ2
Ｏの溶液（pH７．５）２００mlに溶解した。３７℃にて
３時間インキュベートした後、Ｓ−スルホネート生成物
を１０mMＴｒｉｓ（pH８．０）に対して２回、そして２
０mMＴＥＡＢ（炭素水素トリメチルアンモニウム（pH
７．３）に対して１回透析した。
【００７４】Ｓ−スルホネートを凍結乾燥により回収
し、そして２４０mlのＤＥＡＥカラム緩衝液（Ｗｅｔｚ
ｅｌ等、Ｇｅｎｅ，１９８１，１７：６３−７１）に溶
解し、そして６０mlのカラムに負荷した。２カラム容積
を用いて洗浄した後、プロインシュリン−Ｓ−スルホネ
ートを、カラム緩衝液中０〜０．４Ｍ ＮａＣｌのグラ
ジエント６００mlにより溶出した。プロインシュリンＳ
−スルホネートを含有する画分をプールし、そして１０
mMＴｒｉｓ（pH７．５）に対して２回、そして１mMＴｒ
ｉｓに対して１回透析した。
【００７５】生成物、すなわち約９０％純度のプロイン
シュリン−Ｓ−スルホネートはpH９でのゲル電気泳動
（Ｌｉｎｅ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８
０，１０７：１６５−１７６）において予想通りに泳動
することが示され、そして正しい１５Ｎ−末端残基を有
する。分析において、アミノ酸組成は予想のそれと非常
に近似しており、但し低レベルの不純物の存在のために
完全には正しくなかった。収量は１５０mgであった。
【００７６】次の方法により、再生（ｒｅｎａｔｕｒａ
ｔｉｏｎ）についての予備的結果が得られた。プロイン
スリン−Ｓ−スルホネートは、pH１０．５にてβ−メル
カプトエタノールを用いて再生することができる（Ｆｒ
ａｎｋ等，１９８１，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｖｅ
ｎｔｈ Ａｍｅｒｅｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐ
ｑｓｉｕｍ，Ｒｉｃｈ及びＧｒｏｓｓ編、ピアス・ケミ
カル社，ロックフォード，ＩＬ，７２９〜７３８頁）。
【００７７】予備実験において、正しく再生されたプロ
インシュリンの収量を、トリプシン及びカルボキシペプ
チダーゼＢによる消化によって生成するインシュリンの
生成によりモニターした。この方法により精製されたプ
ロインシュリン−Ｓ−ＳＯ3は、ブタ−プロインシュリ
ン−Ｓ−ＳＯ3 と同様に再生するようにである。この方
法は、インシュリンの予想量の７０％をもたらすことが
報告されている。この方法により製造されたインシュリ
ンは、アミノ酸配列決定により決定した場合、Ａ鎖およ
びＢ鎖のそれぞれに正しいＮ−末端１５残基を有する。
【００７８】例２．ＳＯＤ−ｐ３１融合タンパク質用の
発現ベクターの造成及び発現 ＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）〔Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐ
ｅｓｃａｄｏｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２
７：４８４〕のｐｏｌ遺伝子のエンドヌクレアーゼ領域
のアミノ末端に融合したヒトＳＯＤ遺伝子を含む酵母発
現プラスミドｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ
２を造成した。ＳＯＤ−ｐ３１の発現は非構成性であ
り、ハイブリッドＡＤＨ−ＧＡＰプロモーターの調節下
にある。
【００７９】ｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ
２誘導体の造成 酵母内で発現すべき融合タンパク質ＳＯＤ−ｐ３１の遺
伝子を造成するためにプラスミド（ｐＳ１４／３９−
２）を使用した。このプラスミドは、ｐＹＡＳ１と同じ
態様で、ＡＤＨ−２／ＧＡＰプロモーターの制御下にプ
ロインシュリン遺伝子に融合したＳＯＤ遺伝子を含有し
ている。プロインシュリン遺伝子はＥｃｏＲＩ制御部位
をＳａｌＩ制限部位との間に位置する。
【００８０】プロインシュリン遺伝子をｐ３１断片によ
って置き換えために、ホスホラミディト（ｐｈｏｓｐｈ
ｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して、２種のオリゴマ
ー（各々、ＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０１と称
す）を合成した。その配列は、２種のオリゴマーをアニ
ーリングした際に、分子の各側部にＥｃｏＲＩ用および
ＮｃｏＩ用の付着端部を発生する。ＡＲＶ−３００およ
びＡＲＶ−３０１は以下の配列をもつ。 ARV-300 ５′AATTCAGGTGTTGGAGC （配列番号：１） GTCCACAACCTCGGTAC ５′ARV-301 （配列番号：２）
【００８１】ＥｃｏＲＩで線状化したｐＳ１４３９−２
の２μｇを、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下
において、リン酸化ＡＲＶ−３００および脱リン酸化Ａ
ＲＶ−３０１の各々１００ピコモルに連結した（最終容
量３５μｌ）。反応を１４℃で１８時間実施した。ＤＮ
ＡをＳａｌＩで更に消化し、断片を１％低融点アガロー
スゲル上で分離し、前記ベクターとＳＯＤ遺伝子（〜
６．５kb）とを含む断片を前記と同様に精製し、そして
ＴＥ（１０mMのＴｒｉｓ，１mMのＥＤＴＡ，pH８）５０
μｌ中に再懸濁した。
【００８２】５μｌのこの調製物を１４℃で１８時間ｐ
３１断片（ＡＲＶ２４８ＮＬ，後記参照）５μｌに連結
した（最終容量２０μｌ）。コンピテントＨＢ１０１細
胞の形質転換には５μｌを使用した。得られたプラスミ
ドをｐＳＢ３１と称する。このプラスミド２０μｇをＢ
ａｍＨＩで消化し、約２９００bpの断片をゲル電気泳動
によって単離し、ＴＥ中に再懸濁し、そして、予めＢａ
ｍＨＩで切断しておいたｐＣ１／１に連結した。このＤ
ＮＡを使用してＨＢ１０１を形質転換し、ＢａｍＨＩカ
セットをもつ形質転換細胞を得た。このｐＣ１／１−ｐ
ＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２誘導対によって酵母菌株Ｐ
Ｏ１７（Ｍａｔａ，ｌｅｕ２−０４，ｃｉｒ°）を形質
転換した。
【００８３】ＡＲＶ２４８ＮＬすなわちｐ３１コード断
片の調製 ８００bpＡＲＶ２４８ＮＬ断片は、前記Ｓａｎｃｈｅｚ
−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献の第２図に示すように、ｐ
ｏｌタンパク質の末端に向かって、アミノ酸７３７個を
コードするものである。前記の調製は以下の手順によっ
て行った。
【００８４】ｐｏｌ遺伝子の３′末端とｏｒｆ−１，ｅ
ｎｖ，及びｏｒｆ−２の５′末端とを含み、予め１％低
融点アガロース〔シー・パック（Ｓｅａ−Ｐａｃｋ）〕
ゲル上を泳動せしめそして６５℃でフェノールによって
抽出したＡＲＶ−２（９Ｂ）のＫｐｎＩ消化体〔前記の
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献参照〕から
５．２kbＤＮＡ断片を単離し、１００％エタノールで沈
澱し、そしてＴＥ中に再懸濁した。この材料８μｌを、
３７℃で１時間ＳｓｔＩで更に消化した（最終容量１０
μｌ）。
【００８５】酵素の加熱不活性化の後で、前記の消化物
１．２５μｌを、予めＫｐｎＩおよびＳｓｔＩで切断し
た２０μｇのＭ１３ｍｐ１９に、ＡＴＰの存在下で連結
した（最終容量２０μｌ）。反応を室温で２時間進行さ
せた。この混合物５μｌを使用してコンピテントＥ．コ
リＪＭ１０１の形質転換を行った。透明なプラークが生
長した。ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｉｒａ，Ｇｅｎｅ
（１９８２）１９：２６９−２７６に記載のとおりにし
て一本鎖ＤＮＡを調製した。
【００８６】Ｍ１３鋳型中のＤＮＡ配列を部位特異的変
質誘発によって変更して、ＮｃｏＩによって認識される
制限部位（CCATGG）を生成した。３８４５位置〔前記の
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献の第１図〕
のＣとＡとを変えそして３８５１位置のＴとＡとを変え
たオリゴデオキシヌクレオチドを、固相ホスホラミディ
ト法によって合成した。これらの変化は両者とも、アミ
ノ酸配列に関しては影響を与えない。
【００８７】第２の変化を導入して非対応（ｈｅｔｅｒ
ｏｌｏｇｏｕｓ）分子の安定性を低下させた。このオリ
ゴマーをＡＲＶ−２１６と称する。このオリゴマーは配
列 ５′−TTAAAATCACTTGCCATGGCTCTCCAATTACTG （配列番号：３） をもち、非コード鎖に相当する。なぜなら、Ｍ１３誘導
体鋳型０１１０Ｄ４８４は一本鎖であってコード鎖を含
むからである。
【００８８】５′脱リン酸化Ｍ１３配列決定プライマ
ー，５０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８），２０mMのＫＣ
ｌ，７mMのＭｇＣｌ2 および０．１mMのＥＤＴＡ。ＤＮ
Ａ二重鎖５０ng／μｌ，ｄＮＴＰ１５０μＭ，ＡＴＰ１
mM，トリス−アセテート（pH７．８）３３mM，酢酸カリ
ウム６６mM，酢酸マグネシウム１０mM，ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）５mM，Ｔ４ポリメラーゼ１２．５単位，
Ｔ４遺伝子３２プロテイン１００μｇ／mlおよびＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ５単位を含む１００μｌ中で重合反応を実
施した。
【００８９】この反応混合物を３０℃で３０分間インキ
ュベートし、そしてＥＤＴＡおよびＳＤＳ（最終濃度で
各々１０mMおよび０．２％）を添加して反応を停止し
た。コンピテントＪＭ１０１Ｅ．コリ細胞を前記重合生
成物の１：１０希釈物１μｌ，２μｌおよび４μｌで形
質転換し、ＹＴプレートにプレーティングした。プラー
クを吸着によってニトロセルロースフィルターに上げ、
０．２ＮのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｌ中で変性
し、続いて０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（pH７．３）およ
び３ＭのＮａＣｌ中で中和し、そして６ｘＳＳＣ中で平
衡化した。フィルターをブロッティングして乾燥し、８
０℃で２時間ベーキングし、そして０．２％ＳＤＳ，１
０ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）６ｘＳＳＣ中で３
７℃で前アニーリングした。
【００９０】１時間後ラベル付ＡＲＶ−２１６の７．５
×１０6 cpm をフィルターに加え、更に２時間３７℃で
インキュベーションした。フィルターを６ｘＳＳＣ中で
２０分間４２℃で洗い、ブロッティングで乾かし、そし
て補助（ｉｎｔｅｎｓｉ−ｆｙｉｎｇ）スクリーンを使
用する−７０℃における１時間のフィルム露出に使用し
た。ハイブリッド性の強いプラークが生長した。これか
ら一本鎖ＤＮＡを調製し、配列決定用の鋳型として使用
した。配列決定が示すところによれば、鋳型Ｕ１０２１
７８５はＮｃｏＩ部位と前記の第２置換とを含んでい
た。
【００９１】第２オリゴマーを合成し、ｐｏｌ遺伝子の
末端コドンの直後にＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位
を挿入した〔前記Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等
の文献の第１図、４６４７位置〕。このオリゴマーをＡ
ＲＶ−２４８と称する。配列は以下のとおりである。 ５′−GGTGTTTTACTAAAGAATTCCGTCGACTAATCCTCATCC （配列番号：４）
【００９２】ハイブリッド形成後のフィルター洗浄を６
５℃で実施すること以外は前記と同様にして、鋳型０１
０２０７８５を使用して部位特異的変異誘発を実施し
た。前記と同様に、ハイブリッド性の強いプラーク８個
が生長し、一本鎖ＤＮＡを配列決定した。鋳型０１０３
１９８５の配列が示すところによれば、それは意図した
とおり、ＮｃｏＩ，ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ用の制限
部位を含んでいる。
【００９３】透明プラーク６個を各々３７℃で５時間２
ｘＹＴ（酵母抽出液０．５％，トリプトン０．８％，Ｎ
ａＣｌ０．５％，寒天１．５％）１．５ml中で生長させ
ることにより、Ｍ１３ ０１０３１０９８鋳型の複製型
（ＲＦ）を調製した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，１９８２に記載のとおりにして二本鎖ＤＮＡを得、
プールし、最終容量１００μｌ中に再懸濁した。
【００９４】ＲＦのアリコート２０μｌを、消化緩衝液
４０μｌ容量中で、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで切断し
た。この断片を酵母中でのｐ３１発現に使用した。試料
を１％低融点アガロース〔シー・パック（Ｓｅａ−Ｐａ
ｃｋ）〕ゲル上で泳動させ、臭化エチジウムによる蛍光
によってＤＮＡを可視化した。８００bpバンドを切出
し、前記と同様の方法でＤＮＡをゲルから抽出し、そし
てＴＥ１０μｌ中に再懸濁した。この断片をＡＲＶ２４
８ＮＬと称する。
【００９５】ｐＣ１／１−ｐＳＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ
２の誘導 ３種類の異なる誘導を行った。 １）ＹＥＰ／１％グリコース培地またはｌｅｕ- ／３％
エタノール培地のいずれか１０ml中で２４時間、Ｐ０１
７コロニーを誘導させた。各混合物からの酵母ペレット
を、ＡＩＤＳ患者からの血清を使用するＷｅｓｔｅｒｎ
ｓおよびポリアクリルアミドゲルの両者によって、ｐ３
１に関して分析した。クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ
ｅ）染色ゲルは陰性の結果を示すが、どちらの場合で
も、Ｗｅｓｔｅｒｎｓは正確な分子量のバンドを示し
た。
【００９６】２）ＹＥＰ／１％エタノール培地３０ml中
で４８時間、Ｐ０１７コロニーを誘導した。誘導の際の
種々の時点において、アリコートをＰＡＧＥによって分
析した。クーマシー染色ゲルは正しい分子量範囲（４７
−５０kd）にバンドを示し、これはＹＥＰ／１％エタノ
ール中で１４時間後に現われ、そして誘導の２４時間後
に最大強度に達する。ＡＩＤＳ患者からの血清を使用す
るＳＯＤｐ３１に関するＷｅｓｔｅｒｎの結果は、誘導
の２４時間および４８時間に強いバンドを示し、クーマ
シー染色ゲルと良好に相関する。
【００９７】酵母からのＳＯＤ−ｐ３１の精製及び特徴
づけ 冷凍された酵母（細菌）細胞を室温で解凍し、そして溶
菌緩衝液〔細菌のためには、２０mMのＴｒｉｓ−Ｃｌ，
pH＝８．０，２mMのＥＤＴＡ，及び１mMのフェニルメチ
ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）：酵母のために
は、５０mMのＴｒｉｓ−Ｃｌ，pH＝８．０，２mMのＥＤ
ＴＡ，及び１mMのＰＭＳＦ〕１．５容積中に懸濁し、そ
して酸で洗浄されたガラスビーズ１容積と共に混合し
た。
【００９８】−２０℃の冷却ユニットに連結されている
Ｄｙｎｏｍｉｌｌユニットのガラスチャンバーを用いて
３，０００rpm で非連続的に１５分間細胞を破壊した。
カラスビーズを氷上で２〜３分間デカントし、そして細
胞溶解物を取り出した。デカントされたガラスビーズを
４０℃で溶菌緩衝液３０mlにより２度洗浄した。細胞溶
解物を３９，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。
【００９９】上記の遠心分離から得られたペレットを溶
菌緩衝液により１度洗浄し、その後かきまぜ、そして４
℃でそのペレットを懸濁した（上と同じ遠心分離を行っ
た）。洗浄されたペレットを溶菌緩衝液中０．２％ＳＤ
Ｓ（細菌のためには）及び０．１％ＳＤＳ（酵母のため
には）により処理し、そして４℃で１０分間揺動するこ
とによって攪拌した。溶解物を３９，０００ｘｇで３０
分間遠心分離した。ペレットをサンプル緩衝液（６７．
５mMのＴｒｉｓ−Ｃｌ，pH＝７．０，５％β−メルカプ
トエタノール，及び２．３％ＳＤＳ）中において１０分
間煮沸し、そして３９，０００ｘｇで１０分間遠心分離
した。
【０１００】上清液を回収し、そして０．４５μｍフィ
ルターを通した。上のフィルターからの上清液をリン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）および０．１％ＳＤＳにより平衡化
されたゲル濾過カラム（２．５×９０cm，ＡＣＡ３４Ｌ
ＫＢ）上に０．３〜０．４ml／分の流量で負荷した（最
大５０mgのタンパク質）。ＳＯＤ−ｐ３１を含む画分を
プールし、そして真空透析するか、又は４０psi でＹＭ
５Ａｍｉｃｏｎ膜を用いるかいづれかによって濃縮し
た。このタンパク質を濃厚溶液として−２０℃で貯蔵し
た。
【０１０１】ゲル電気泳動分析は、約４６kdの分子量を
有するＳＯＤ−ｐ３１タンパク質が泳動し、そして９０
％以上の純度であることを示した。類似する構成及び結
果が、Ｅ．コリ中において細菌のｔｒｐ−ｌａｃプロモ
ーターの制御下でＳＯＤ−ｐ３１融合体を発現すること
によって得られた。このＳＯＤ−ｐ３１融合タンパク質
は、体液中のＡＩＤＳに対する抗体の存在を検出するた
めの免疫検定に使用できる。好効果がＳＯＤ−ｐ３１融
合タンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ及びストリップ検定
において得られた。
【０１０２】例３： ＳＯＤ−ＩＧＦ−２融合タンパク
質のための発現ベクターの造成及び発現 ＩＧＦ２遺伝子のアミノ末端に融合したヒトＳＯＤ遺伝
子を含む酵母発現プラスミドｐＹＬＵＩＧＦ２−１４
（ＥＰＯ １２３２２８を参照のこと）を造成した。Ｓ
ＯＤ−ＩＧＦ２の発現は非構成的であり、そしてそれは
ハンブリッドＡＤＨ−ＧＡＰプロモーターの制御下にあ
る。
【０１０３】ｐＹＬＵＩＧＦ２−１４の造成 酵母中で発現されるべき融合タンパク質ＳＯＤ−ＩＧＦ
２のための遺伝子の造成のために、プラスミドｐＹＳ１
８を使用した。プラスミドｐＹＳ１８はＡＤＨ−ＧＡＰ
プロモーター及びα−因子ターミネーターの制御下にプ
ロインシュリン遺伝子に融合したＳＯＤ遺伝子を含む
（第１表を参照のこと）。プラスミドｐＹＳ１８をＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。１８３０bpの断
片（ＡＤＨ−ＧＡＰプロモーター及びＳＯＤ遺伝子を含
む）をゲル電気泳動によって精製した。
【０１０４】第２のＢａｍＨＩ（４６０bp）フラグメン
ト（ＩＧＲ−２のアミノ酸残基４１〜２０１及びα−因
子ターミネーターをコードする）（ＥＰ０１２３２２８
を参照のこと）を次のリンカー：Ｅｃｏ ＲＩ ＳａｌＩ AATTCCATG GCTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGG （配列番号：５） GGTAC CGAATGTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACTTAACCAGCT （配列番号：６） に連結した。このリンカーはＥｃｏＲＩオーバーハン
グ、メチオニンのためのＡＴＧコドン及びＩＧＦ２のコ
ドン１〜４０並びにＳａｌＩオーバーハングを提供す
る。
【０１０５】ＩＧＦ−２遺伝子及びα−因子ターミネー
ターを含む得られるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（５１
０bp）を、ＡＤＨ−ＧＡＰプロモーター及びＳＯＤを含
む１８３０bpのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片に連結した
（上記を参照のこと）。この得られるＢａｍＨＩ断片
（２３４０bp）を、ＢａｍＨＩにより消化され、そして
ホスファターゼにより処理されたｐＡＢ２４（下記を参
照のこと）にクローンし、ｐＹＬＵＩＧＦ２−１４を得
た。
【０１０６】ｐＡＢ２４は、完全な２μ配列〔Ｂｒｏａ
ｃｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙｇ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（１９
８１）１：４４５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ出版〕及びｐＢＲ３２２配列を含む酵母発現ベクタ
ーである。これはまた、プラスミドＹＥｐ２４に由来す
る酵母ＵＲＡ３遺伝子〔Ｂｏｔ−ｓｔｅｉｎなど，Ｇｅ
ｎｅ（１９７９）８：１７〕及びプラスミドｐＣ１／１
に由来する酵母ＬＥＵ２d 遺伝子（ＥＰ０１１６２０１
を参照のこと）を含む。発現カセットの挿入はｐＢＲ３
２２のＢａｍＨＩ部位においてであり、従って、テトラ
サイクリンに対する細菌耐性のための遺伝子を中断し
た。
【０１０７】ＳＯＤ−ＩＧＦ２の発現 酵母ＡＢ１１０（Ｍａｔα，ｕｒａ３−５２，ｌｅｕ２
−０４又はｌｅｕ２−３及びｌｅｕ２−１１２の両者，
ｐｅｐ４−３，ｈｉｓ４−５８０，ｃｉｒ°）をｐＹＬ
ＵＩＧＦ２−１４により形質転換した。形質転換体をｕ
ｒａ- 選択プレート上で増殖せしめた。形質転換コロニ
ィーを３mlのｌｅｕ - 選択培地に移し、そして３０℃の
シェーカー内で２４時間増殖せしめた。
【０１０８】この培養物の１×１０-4希釈物１００μｌ
をｕｒａ - プレート上にプレートし、そして個々の形質
転換体を約４８〜７２時間増殖せしめた。個々の形質転
換体を３mlのｌｅｕ - 培地に移し、そして３０℃のシェ
ーカー内で２４時間増殖せしめた。これらの培養物のお
のおのの１mlを２４mlのＵＥＰ及び１％グルコース培地
中に希釈し、そして細胞をＳＯＤ−ＩＧＦ２の最大収得
のために１６〜２４時間増殖した。
【０１０９】細胞を遠心分離し、そして水により洗浄し
た。細胞を溶菌緩衝液〔リン酸緩衝液，pH＝７．３（５
０〜１００mM），０．１％Ｔｒｉｔｏｎ×１００〕２溶
積中に再懸濁した。酸により洗浄されたガラスビーズ２
溶積を添加し、そしてその懸濁液を交互にかきまぜるか
又は氷上においた（５ｘ，１分のおのおののサイク
ル）。懸濁液を遠心分離し、そして上清液をデカントし
た。不溶性ペレットを室温で３０分間１％ＳＤＳの溶菌
緩衝液中においてインキュベートした。この懸濁液を遠
心分離し、そして上清液を凍結乾燥せしめた。
【０１１０】２つの他の造成物：ｐＹＬＵＩＧＦ２−１
５及びｐＹＵＩＧＦ２−１３を非融合ＩＧＦ２の発現の
ための対照として使用した。細胞内発現のための前者の
プラスミド（ｐＹＬＵＩＧＦ２−１５）は、ＧＡＰプロ
モーター及びα−因子ターミネーターの制御下にＩＧＦ
遺伝子を含む。ＩＧＦ２の分泌のための後者のプラスミ
ド（ｐＹＵＩＧＦ２−１３）は、ＧＡＰプロモーター、
α−因子リーダー及びα−因子ターミネーターの制御下
にＩＧＦ２の因子を含む。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】＊クーマシーブルー染色によって、ＳＯＤ
・ＩＧＦ２融合タンパク質は全細胞タンパク質の１０〜
１５％を示し、すなわち１ｌの培養物当り約１００〜３
００mgに相当する。ＩＧＦ２は融合タンパク質の約１／
３を代表し、従ってそれは１ｌの培養当り約３０〜１０
０mgに相当する。融合タンパク質とＣＮＢｒとの分析的
な開裂反応は、ＰＡＧＥ上に、ＩＧＦ２について予期さ
れる位置に移動するバンドをもたらした。
【０１１３】＋ＲＲＡ−ＩＧＦ２レベルをＨｏｒｎｅｒ
など．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９７
８）４７：１２８７及びＭａｒｓｈａｌｌなど．，Ｊ．
ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９７４）３９：２
８３に従って、胎盤膜のラジオレセプターアッセイ（Ｒ
ＲＡ）によって測定した。ＲＲＡのための胎盤膜を、Ｃ
ｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７２）６９：３１８の方法に
よって調製した。
【０１１４】ＳＯＤ・ＩＧＦ２のＮＢｒによる開裂のた
めの方法 酵母細胞のカラスビーズ溶菌からの不溶性画分を７０％
蟻酸に溶解した。ＣＮＢｒ結晶（〜／ｇのＣＮＢｒ／１
００mgの融合タンパク質）を添加し、そして室温で１２
〜１５時間暗中でインキュベートした。開裂が不完全で
ある場合、この段階を２４時間後くり返すことができ
る。
【０１１５】この方法を使用しなければむずかしく且つ
非能率的に生産されるポリペプチドを、融合タンパク質
（ここで、この融合タンパク質は、選択的に開裂可能な
部位によって他のポリペプチドに結合される比較的に短
い安定したポリペプチド配列を含む）を用いることによ
って、実質的に高められた収量をもたらすことができる
ことが上記の結果から明らかである。従って、高いレベ
ルの融合タンパク質を真核宿主、たとえば酵母中で得る
ことができ、そして該宿主とは異質の目的とするポリペ
プチドの効率的な製造を可能にする。
【０１１６】前述の発明は、明確に理解するために例示
的及び例的にいくらか詳細に記載されているけれども、
特許請求の範囲内で変更及び変性を行なうことができ
る。Ｓ．セレビシア（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株
２１５０−２−３（ｐＹＡＳＩ１）およびＡＢ１１０
（ｐＹＬＵＩＧＦ２−１４）をそれぞれ、１９８５年２
月２７日及び１９８６年３月１９日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．
にブダペスト条約に基き国際寄託し、そしてそれぞれ寄
託番号第２０７４５号及び２０７９６号を得た。
【０１１７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AATTCAGGTG TTGGAGC 17
【０１１８】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGGCTCCA ACACCTG 17
【０１１９】配列番号：３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TTAAAATCAC TTGCCATGGC TCTCCAATTA CTG 33
【０１２０】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGTGTTTTAC TAAAGAATTC CGTCGACTAA TCCTCATCC 39
【０１２１】配列番号：５ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AATTCCATGG CTTACAGACC ATCCGAAACC TTGTGTGGTG GTGAATTGG 49
【０１２２】配列番号：６ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TCGACCAATT CACCACCACA CAAGGTTTCG GATGGTCTGT AAGCCATGG 49
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 9/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ジェフリー アール．シャスター アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596，ウォルナット クリーク，３エ ー，コレ アベニュ 1810 (72)発明者 ジェイムズ ピー．メリーウェザー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94708，バークレイ，ヒルデイル 916

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵母以外の種に由来するポリペプチドを
    コードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列及
    びヒト−Ｃｕ・Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼを
    コードするオープンリーディングフレームＤＮＡ配列を
    含んで成るＤＮＡが発現条件下に導入された酵母宿主を
    用いて、酵母以外の種に由来するポリペプチド及びヒト
    −Ｃｕ・Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼを含んで
    成る融合ポリペプチドを発現させ、そして該融合ポリペ
    プチドを単離して該ポリペプチドを得ることを特徴とす
    るポリペプチドの製造方法。
  2. 【請求項２】 ２つのペプチドが選択的に開裂できる結
    合を形成するように連結されているかまたは２つのオー
    プンリーディングフレームが、選択的に開裂できる結合
    をコードする配列によって連結されている、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡ配列が解糖酵素のためのプロモー
    タ領域を含む転写開始制御領域の転写調節制御下にあ
    る、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 転写開始制御領域が誘導可能である、請
    求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 酵母以外の種に由来するポリペプチドが
    哺乳動物ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 発現のための条件が誘導可能な転写開始
    制御領域を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 転写開始調節域が本質的に解糖酵素プロ
    モーター領域およびＡＤＨ２調節域からなる、特許請求
    の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】 酵母以外の種に由来するポリペプチド及
    びヒト−Ｃｕ・Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼを
    含んで成る融合ポリペプチド。
  9. 【請求項９】 酵母以外の種に由来するポリペプチドが
    哺乳動物ポリペプチドである、特許請求の範囲第８項に
    記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 哺乳動物ポリペプチドがプロインシュ
    リンの少なくとも一部である、請求項９に記載のポリペ
    プチド。
  11. 【請求項１１】 哺乳動物ポリペプチドがＩＧＦ−１又
    はＩＧＦ−２の少なくとも一部である、請求項９に記載
    のポリペプチド。
JP5040008A 1985-03-28 1993-03-01 ポリペプチドの製造方法 Expired - Lifetime JP2545686B2 (ja)

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