LT4077B - Expression systems for amidating enzyme - Google Patents

Expression systems for amidating enzyme Download PDF

Info

Publication number
LT4077B
LT4077B LTIP1829A LTIP1829A LT4077B LT 4077 B LT4077 B LT 4077B LT IP1829 A LTIP1829 A LT IP1829A LT IP1829 A LTIP1829 A LT IP1829A LT 4077 B LT4077 B LT 4077B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
sequence
type
enzyme
alpha
host
Prior art date
Application number
LTIP1829A
Other languages
English (en)
Inventor
Arthur H Bertelsen
Nozer M Mehta
Gary Agide Beaudry
Original Assignee
Unigene Lab Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unigene Lab Inc filed Critical Unigene Lab Inc
Publication of LTIP1829A publication Critical patent/LTIP1829A/xx
Publication of LT4077B publication Critical patent/LT4077B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
    • C12Y114/17003—Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Hardware Redundancy (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Išradimas apima alfa-amidinimo fermentų gavimą rekombinantinės DNR metodais, iš dalies ekspresijos vektorius ir šeimininkus, gebančius didelėmis išeigomis ekspresuoti aukšto atgaminamo lygio ir didelio grynumo alfa-amidinimo fermentą.
Literatūroje gerai atspindėtas natyvių baltymų pirmtako formų viduląstelinis procesingas (funkcinių grupių atskėlimas ir/arba modifikacija) po transliacijos nuo koduojančių nukleino rūgščių sekų.
Apskritai, žinduolių ląstelėse ir kituose eukariotuose galima realizuoti tam tikras post-transliacinio procesingo metodikas, tuo tarpu prokariotuose tai nepavyksta. Kai kurie prokariotai, kaip E. coli, plačiai naudojami kaip šeimininkai žinduolių baltymams išskirti, panaudojant rekombinantinės DNR (rDNR) technologiją, kadangi juos nesunku išauginti grupinės fermentacijos metodais ir charakterizuoti. Tačiau daugumai žinduolių baltymų reikia keleto tipų posttransliacinio procesingo ir, jeigu, pavyzdžiui, šie baltymai gaunami E. coli genų inžinerijos metodais, tada dažnai post-transliacinis procesingas in vitro turi būti lydimas sudėtingų cheminių metodų, kurie ekonomiškai neapsimoka gamyboje.
Vienas procesingo tipas vykdo specifini, peptido arba baltymo karboksi-galinės aminorūgšties amidinimą. Daugelis gamtoje rastų hormonų ir peptidų turi tokią modifikaciją, kuri dažnai apsprendžia, ar baltymas bus biologiškai aktyvus. Pavyzdžiui, kalcitoninas, kuriame neamidinto prolino liekanos pakeitimas amidintu natyvios formos prolinu 3000 kartų sumažina biologini, aktyvumą. Kiti biologiniai peptidai, kurių aktyvumas visiškai išryškėja tik po post-transliacinio amidinimo, turi (bet neapsiriboja) augimo relising-faktorių, kitus kalcitoninus ir peptidą, surištą su kalcitonino genu.
Specifini, baltymo aminorūgšties karboksi-galini, amidinimą katalizuoja alfa-amidinimo fermentai. Daugeliui biologiškai svarbių baltymų, kurių maksimalus efektyvumas pasiekiamas amidinimo dėka, polipeptidinės sekos gali būti sukonstruotos genų inžinerijos metodais. Tačiau svarbus ir kartais esminis karboksigalo amidinimas dažnai turi būti atliekamas in vitro. Pageidautina šiuo momentu išvengti brangių ir varginančių cheminio amidinimo metodikų, todėl specifiniam amidinimui paranku panaudoti amidinantą fermentą. Tačiau alfa-amidinimo fermentą sunku gauti laisvoje būklėje.
Amidintų peptidų buvimas konkrečiame audinyje nebūtinai reiškia sinonimiškai dideli, alfa-amidinimo fermento aktyvumą. Pavyzdžiui, žiurkės adenohipofizio audinys pasižymi dideliu alfa-amidinimo aktyvumu, tačiau (neturi) nė vieno žinomo substrato (Eipper ir kt., PNAS 80, 5144-5148 (1983) . Žiurkės neurohipofizio audinyje yra amidinti peptidai (oksitocinas ir vazopresinas), tačiau labai žemas alfa-amidinimo aktyvumas (Eipper ir kt., Endo ... 116, 2497-2504 (1985). Taigi, kol alfaamidinimo aktyvumas tiriamas atskiruose audiniuose, negalima tikėtis rasti fermentą ar jo potencialų lygi.
Dar didesnė kliūtis iš natūralių šaltinių išskirto amidinimo fermento taikymui yra žemas jo grynumo laipsnis. Amidinimo fermentai, išskirti iš gamtinių šaltinių, dažniausiai yra užteršti proteolitiniais fermentais ir kitomis priemaišomis. Efektyvus amidinto produkto redukavimas labai apsunkintas, kai šie fermentai su priemaišomis panaudojami amidinti substratui, susidedančiam iš L-aminorūgščių. Proteazės gali suskaldyti substratą ir/arba amidintą produktą ir/arba patą amidinantą fermentą. Daugelis biologiškai svarbių polipeptidų susideda iš L-aminorūgščių ir lengvai veikiami proteolizės ir kitų trukdančių faktorių atsirandančių dėl amidinančio fermento preparatuose.
amidinimą priemaišų
Nesant pakankamai gamtinių šaltinių, dėl žemos alfaamidinimo fermentų išeigos ir nepakankamo grynumo, būtina sukurti efektyvius masinius alfa-amidinio fermento skyrimo metodus, duodančius geras aukšto grynumo fermento išeigas.
Šiame aprašyme terminai amidinimo fermentas ir alfaamidinimo fermentas reiškia bet kokią medžiagą, sugebančią katalizuoti peptidil-substrato konversiją į atitinkamą peptidil-amidą, turinti amino grupę vietoje C-galinės nurodyto substrato aminorūgšties.
Šio išradimo tikslas yra didelėmis išeigomis išskirti labai gryną alfa-amidinimo fermentą.
Kitas šio išradimo tikslas yra sukurti organizmusšeimininkus, sugebančius ekspresuoti alfa-amidinimo fermentus, išskiriamus su didele išeiga ir labai grynus.
Kitas šio vektorius, amidinimo išradimo turinčius fermentą.
tikslas yra DNR sekas, sukurti ekspresijos koduojančias alfaDar vienas šio išradimo tikslas yra sukurti ekspresijos vektorius, sugebančius ekspresuoti alfa-amidinimo fermentą tokiu būdu, kad ekspresuotas fermentas būtų lengvai išskiriamas ir išvalomas tokiu laipsniu, kad būtų efektyviai amidinami peptidilsubstratai, sudaryti iš L-aminorūgščių, pavyzdžiui, substratai, išskirti iš natūralių šaltinių, susintetinti cheminiu būdu arba gauti rekombinantiniais metodais.
Kitas šio išradimo tikslas yra sukurti ekspresijos vektorius, apsprendžiančius alfa-amidinimo fermento ekspresiją šeimininke-eukariote.
Dar vienas šio išradimo tikslas yra sukurti ekspresijos vektorius, apsprendžiančius alfa-amidinimo fermentų ekspresij a šeimininke-prokariote.
Kitas šio išradimo tikslas yra sukurti priemones efektyviai masinei alfa-amidinimo fermento gamybai.
Šie ir kiti tikslai pasiekiami, sukuriant šeimininką, gebanti, ekspresuoti alfa-amidinimo fermento polipeptidinę seką, be to šeimininkas turi ekspresijos vektorių, kuriame yra transkripcijos promotorius su žemiau pateikiama nurodytam šeimininkui svetima DNR seka, koduojančia amidinimo fermentą, be to nurodytas vektorius sugeba vykdyti polipeptidų ekspresiją šeimininke.
Tam tikruose šio išradimo įgyvendinimo variantuose siūlomas šeimininkas, kuris sugeba ekspresuoti alfaamidinimo fermento polipeptidų seką, be to šeimininke yra ekspresijos vektorius, turintis transkripcijos promotorių su žemiau pateikiama šeimininkui svetima DNR seka, kuri griežtose sąlygose hibridizuojasi su DNRseka, pavaizduota Fig. 5 kaip A tipo seka.
Kitame šio išradimo įgyvendinimo variante siūlomas šeimininkas, kuris sugeba ekspresuoti alfa-amidinimo fermento polipeptidų seką, kartu šeimininkas turi ekspresijos vektorių, kuriame yra transkripcijos promotorius su žemiau duota DNR seka, svetima nurodytam šeimininkui, kuri griežtose sąlygose hibridizuojasi su DNR seka, pavaizduota Fig. 6 kaip B tipo seka.
Šiame aprašyme terminas griežtos sąlygos reiškia 2 x SSC (0,3 M natrio chlorido ir 0,03M natrio.citrato) 62°C temperatūroje.
Šiame išradime taip pat pateikiami ekspresijos vektoriai alfa-amidinimo fermento ekspresijos įvykdymui prokariotinėse ir eukariotinėse sistemose. Pavyzdžiui, siūlomas ekspresijos vektorius, kuris sugeba prokariotiniame šeimininke ekspresuoti alfa-amidinimo fermento polipeptidų seką, be to nurodytame vektoriuje yra transkripcijos promotorius, kurio pirminė DNR seka pateikiama žemiau, ši DNR seka turi amidinimo fermento kodavimo sritį, minėta pirminė seka yra pakankamai homologiška natūraliai DNR sekai, kad ekspresuotų natūralus amidinimo fermentas, įvykstant hibridizacijai pagal nurodytą natūralią seką griežtose sąlygose, be to pirminė seka turi inicijuojantį apytikriai 50 nukleotidų metionin-kodoną nurodytos fermentą koduojančios srities pradžioje.
Analogiškai, siūlomas ekspresijos vektorius, kuris sugeba įvykdyti alfa-amidinimo fermento polipeptidų sekos ekspresiją eukariotiniame šeimininke, be to nurodytas vektorius turi transkripcijos promotorių su žemiau duota pirmine DNR seka, turinčia amidinimo fermento kodavimo sritį, nurodytoji pirminė seka yra pakankamai homologiška natūraliai DNR sekai kad ekspresuotų natūralus amidinimo fermentas, tam kad įvyktų hibridizacija su natūralia seka griežtose sąlygose, ir nurodyta pirminė seka turi stop kodoną aukščiau sekos, kuri antraip koduotų domeną, perdengiantį membraną.
Paskui tą pirminę seką turi eiti seka, specifikuojanti poli A prijungimą prie informacinės RNR, kuri generuota transkripcija nuo nurodyto promotoriaus.
Šiame aprašyme terminas domenas, perdengiantis membraną reiškia, DNR seką, kuri, kaip nustatė Kaitas ir Dulitlas J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982) (jo pilnas aprašymas įtrauktas, kaip nuoroda), koduoja aminorūgščių seką, kurios hidrofobiškumas, ilgis, struktūros pobūdis ir 1.1, yra pakankami tam, kad ji įsitvirtintų membranoje. Pavyzdžiui, taip gali įvykti tada, kai baltymas sintezuojamas ant su membrana susijusios ribosomos arba, alternatyviai, aminorūgščių seka, koduojama domeno, perdengiančio membraną, gali būti surišama su kitomis baltymo sritimis, kur ji tampa dalimi, taip kad seka tampa įterpta į hidrofobinę membranos terpę posttransliacijos pasėkoje. Domenai, perdengiantys membraną, detaliau aprašyti Von Heine (Sekų analizė molekulinėje biologijoje: lobis arba trivialūs radiniai. Academ. Press, 1987, p. 81-121) darbe, kurio teiginiai šiame aprašyme įtraukti, kaip nuoroda.
Čia naudojami bazių numeriai tai numeriai, kurie konkrečiai duodami bet kuriai DNR sekai, specialiai pateiktai kartu su bazių numerių nuorodomis. Visoms sekoms, kurioms bazių numeriai čia nėra konkrečiai skirti, bazės turi būti nuosekliai sunumeruotos nuo I bazės numerio, kuris reiškia pirmą bazę pirmo kodono, ekspresuoto aptariama seka, o aminorūgštys numeruotos nuosekliai nuo pirmos aminorūgšties, kurią išreiškia 13 bazės.
Trumpas brėžinių aprašymas
Fig. 1 pavaizduota žinduolių alfa-amidinimo fermento ekspresijos vektoriaus konstravimo schema.
Fig. 2 pavaizduota prokariotinio alfa-amidinimo fermento ekspresijos vektoriaus konstravimo schema.
Fig. 3 pavaizduota NaDS-PAGE-elektroforegrama (dažyta Kumasi mėliu) netirpios baltymo frakcijos iš _JM105 E. coli, nešančios nurodytas plazmides (kurių charakterizavimas duotas (1 pavyzdyje); kultyvuota mitybinėje terpėje su (+) arba be (-) IPTG. (C = netirpūs baltymai JM105 E. coli, nešančios pKK233-2) .
Fig. 4 pateikta 3 paveiksle pavaizduoto gelio Vesternblot analizė; baltymas, perkeltas ant nitroceliuliozės filtro tuoj pat apdorojamas triušio antiserumu AE ir anti-triušio imunoglobulinu kartu su šarmine fosfataze, vėliau apdorojant chromogeniniu šarminės fosfatazės substratu.
Fig. 5 pateikta A tipo seka.
Fig. 6 pateikta B tipo seka.
Pagal ši, išradimą gaunami ekspresijos vektoriai, tinkami prokariotinėms sistemoms, ir ekspresijos vektoriai, tinkami eukariotinėms sistemoms. DNR, koduojančią amidinimo fermentą, išreikštą šiuose vektoriuose, galima išskirti, kaip aprašyta Europos patento paraiškoje Nr. 0308067, kuri toliau yra išskleista šiame aprašyme. Alfa-amidinimo fermentai išskirti iš žiurkės skydliaukės karcinomos smegeninio audinio arba iš žiurkės ląstelių linijos kondicijonuotų terpių ir išvalyti iki homogeniškumo, kaip nurodyta aukščiau pateiktoje pagrindinėje paraiškoje ir pirminėje paraiškoje Nr. 655366, paduotoje 1984 m. rugsėjo 27 d. ir dabar publikuojamoje, kaip JAV patentas Nr. 4708934, kuri turi prioritetą ir šioje paraiškoje ji pilnai atskleidžiama, panaudojant ją kaip nuorodą. Nustatytos gryno alfa-amidinimo fermento aminorūgščių sekos, ir šios sekos panaudojamos projektavimui visos eilės oligonukleotidinių zondų, kurie pažymėti radioaktyviu izotopu amidinančio fermento kDNR išskyrimui.
ir naudojami
Išskirtos atrinkimui, žinomais metodais, kDNR panaudojamos gautų bibliotekų pavyzdžiui, iš žiurkės skydliaukės karcinomos smegeninio audinio pilnos RNR, iš ląstelių linijų, arba iš ląstelių linijų, žinomų kaip amidinimo fermento šaltinis, pavyzdžiui biologinio depozito IVI 10028 (In Vitro International, Liptikum, Mariland) (žiurkės MTC (karcinomos) audinys), arba giminingos ląstelių linijos IVI 10029. Pilna RNR gaunama ir Poli-A RNR atrenkama ogilo DT celiulioze. kDNR gaunama gerai panaudojant pirmą atvirkštinę transkriptazę ir po to DNR polimerazę. kDNR naudojama λ gtll, o infekuotame komerciniai ekstraktai, Laboratories, pvz. arba kDNR bibliotekų generavimui vektoriuje rekombinantines DNR supakuoja in vitro bakteriofage. Šiam tikslui yra prieinami
Promega Biotech arba Klontech gali būti gaunami šioje srityje gerai žinomais metodais. Faginis atrinkimas atliekamas radioaktyviais oligonukleotidiniais zondais, gautais, kaip aprašyta aukščiau. Atrinkimas (skriningas) bakteriofage, turinčiame alfa-amidinimo fermento kDNR faginio praskiedimo būdu ir nitroceliuliozės filtro.
Specifiškumas pasiekiamas, atliekant hibridizaciją dviem ar daugiau radioaktyvias žymes nešančiais AEspecifiniais oligonukleotidiniais zondais.
(AE kDNR), atliekamas užnešant fagą ant
Oligonukleotidiniai zondai, pažymėti AE4, AE5, AE8 ir AE9 Europos patento paraiškoje Nr. 0308067, 61-64 psl., specifiškai atrenkami iš bibliotekų, gautų iš biologinio depozito IVI 10029, kaip nurodyta aukščiau.
Iš daugelio bakteriofagų minėtu atrankos būdu ir oligonukleotidinės hibridizacijos metodais išskirtų AE kDNR analizė rodo, kad kDNR gali būti suskirstytos j, daugybę skirtingų tipų. Vieno tipo struktūra parodyta Fig. 5, kaip seka A, kur nukleotidai sunumeruoti pagal iniciatoriaus kodono sekos pateiktas baltymą koduojančių Skaičiai apvaliuose
I bazę, kaip pirmąją metionino bazę. Žemiau nukleotidinės vienaraidinis aminorūgščių kodas genų sekos transliacijai.
skliaustuose eilės gale nurodo aminorūgščių skaičius.
Kitas kDNR sekos tipas, išskirtas oligonukleotidinės hibridizacijos atrankos būdu, pateiktas Fig. 6 kaip seka B, kurioje numeravimas ir kiti žymėjimai tokie pat, kaip ir A tipo diagramoje.
Pareiškėjas panaudoja kDNR, išskirtas aukščiau aprašytu būdu, kaip prokariotinių, taip ir eukariotinių ekspresijos vektorių konstravimui, ir visa šeimininkų vektorius ekspresijai.
eilė buvo transformuoti, panaudojant šiuos efektyviai alfa-amidinimo fermento
Įgyvendindamas labiau variantus, pareiškėjas aukščiau minimos kDNR pageidaujamus šio išradimo atliko naujas modifikacijas atžvilgiu, turėdamas tikslą optimizuoti ne tik ekspresiją, bet ir amidinančio fermento laipsnis redukavimą. gali būti
Modifikacijos charakteris ir varijuojami priklausomai nuo pasirinkto šeimininko ir/arba vektoriaus. Pavyzdžiui, siekiamuose variantuose pareiškėjas Įterpė stop-kodoną aukščiau sekos, kuri antraip koduotų domeną, perdengiantį membraną. Membranas perdengiančių domenų buvimas gali būti nepageidaujamas rekombinantinės DNR ekspresijos sistemai, kadangi jie gali skatinti ekspresuotą baltymą asocijuotis su membrana ir, gal būt, būti neaktyviu šeimininko organizme arba ląstelių linijoje. Domenų, perdengiančių membraną, pavyzdžiai atsiranda dvejuose kDNR variantuose, parodytuose sekose A ir B (žiūr., atitinkamai, Fig. 5 ir Fig. 6) (apytikriai 2275-2355 bazės sekoje A ir apytikriai 2587-2667 bazės sekoje B) . kDNR diagramose A ir B, iš esmės identiškos šių transmembraninių domenų amininėje pusėje, išskyrus tai, kad, nuo 1178 bazės iki 1492 bazės, tikriausiai, yra kDNR tipo B intron-sritis.
Sekų A ir B kDNR koduoja maždaug 94 ir 105 kD baltyminius produktus atitinkamai. Abu šie baltymai didesni negu brandūs aktyvūs fermentai, kurie išgryninti iš gyvulinių ląstelių ekstraktų arba ląstelių linijų sekrecijų. Kiekvienas iš šių pirminės transliacijos produktų yra pre-profermentas, kuris turi membraną-perdengiančius domenus koduojančios sekos Cgalo 1/3 dalyje. Labiau pageidaujama, kad stop-kodonas išsidėstytų taip, kad ekspresuotas baltymas turėtų molekulinę masę apie 75 kD, ekspresuo j ant su kDNR iš sekos A (t.y., stop lokalizuotas tarp bazių 20252275) ir 87 kD, ekspresuoj ant su kDNR iš sekos B (tai yra, stop lokalizuotas apytikriai tarp 2340 ir 2690 bazės).
pašalintos genų sekos, signalo natūralią seką, lokalizuotas apytikriai
Brandaus E.coli alfa-amidinimo fermento citoplazminei ekspresijai, pavyzdžiui, labiau pageidaujama, kad būtų kurios koduoja sekretorinio kad iniciacijos kodonas būtų 50 nukleotidų apimtyje genų sekose, koduojančiose brandaus baltymo, atitinkančio alfa-amidinimo fermentą, startą, ir kad nebūtų transliuotos genų sekos, koduojančios membranos perdengimo domenus C-galo srityje. Iniciacijos kodonas, be abejo, yra rėmelyje su seka, kuri koduoja fermentą, ir, kai kuriuose pageidaujamuose variantuose, išsidėsto aukščiau srities, o kartais betarpiškai už tos srities.
Ekspresuojant AE kDNR E. coli, rasta, kad natūrali genų seka turi kriptinę E. coli ribosomos (RBS) surišimo sritį ir natūralių iniciacijos sekų vidinės iniciacijos kodoną. Taip gaunamas amidinimo fermento baltymas, nukirstas N-gale. Nors tai nesutrukdo gauti pageidaujamą E. coli produktą, tačiau tiesioginės iniciacijos ir vidinės iniciacijos produktų buvimas kartu apsunkina brendimą ir rekombinantinio produkto išgryninimą norimoje formoje, todėl nepageidaujamas. Norint atskirti netikėtą ir nepageidaujamą produktą, būtina atskelti arba ribosominio surišimo sritį, arba vidinės iniciacijos kodoną, arba abu.
įgyvendinimo žymiu mastu pirmenybę turinčiuose variantuose, pareiškėjas
Pavyzdžiui, kai kuriuose šio išradimo įgyvendinimo variantuose valin-kodonas, kuris prokariotinėse sistemose koduoja inicijuojantį metioniną, taškinės mutacijos būdu pakeičiamas ekvivalentišku neinicijuojančiu valin-kodonu ties 661-663 bazėmis (kDNR iš bet kurios A ar B tipo sekos) . Vietoje šios taškinės mutacijos, arba papildomai prie jos, kituose šio išradimo pašalino arba modifikavo bet kurią sritį, koduojančią ribosominio surišimo saitą, kuris sutinkamas betarpiškai virš vidinės iniciacijos saito, ir kas labiau pageidaujama bet kurią ribosominio surišimo vietą, kur ji bebūtų aptikta. Šios modifikacijos atliktos tam, kad būtų iš esmės eliminuota vidinė iniciacija, kad baltymas, ekspresuotas vidinės iniciacijos pasėkoje, po elektroforezės neišsiskirtų atskira juosta.
Norint ekspresuoti sekretuotą aktyvaus alfa-amidinimo fermento baltymą iš rekombinantinio eukariotinio šeimininko ląstelių linijos, būtina pašalinti genų sekas, koduojančias transmembraninį domeną, esantį natūralių genų sekų C-galo srityje. Tipo A kDNR tai įvykdoma, nukerpant baltymo kodavimo sritį, įvedant stop-kodoną toje vietoje arba arti tos vietos, kur natūralus amidinimo fermentas post-transliaciniu būdu pertvarkomas kai kuriose natūraliose sistemose, toliau tai paaiškinama smulkiau. Tipo B kDNR tai taip pat atliekama, įvedant naują stop-kodoną į tą fermento baltymo sritį, kur natūralus B tipo amidinimo fermentas perdirbamas post-transliacijos būdu (žr. žemiau). Tai nereiškia, kad išnyksta galimybė kai kuriose šeimininko ląstelių sistemose ekspresuoti pilnas, gamtoje pasitaikančias genų sekas. Kadangi B tipo kDNR turi sekas su neperdirbto introno charakteristikomis, gali susidaryti sunkumų ekspresuoj ant šitą kDNR kai kuriose eukariotinio šeimininko ląstelėse. Šios ląstelės gali neefektyviai produkuoti mRNR iš B tipo geno, dėl suporintų akceptoriaus ir sukirpimo donoro saitų. Todėl akceptoriaus saito eliminavimas gali būti neišvengiamas, norint užtikrinti efektyvią B tipo AEkDNR ekspresiją.
Pareiškėjas aptiko, kad gamtoje pasitaikančio alfaamidinimo fermento, kurio molekulinė masė 75 kD, karboksilinis galas randamas už aminorūgšties 709 padėties (814 tipui B) ribų. Norint gauti 75 kD baltymą (87 kD tipui B), rekombinantinės DNR šeimininko ląstelėje stop-kodonas introdukuotas į kDNR, atlikus lizino kodono mutaciją 716 aminorūgšties padėtyje (821 tipui B). Ši modifikacija atliekama, panaudojant kryptingą oligonukleotidinę mutagenezę. Tokia mutagenezė gali būti įvykdyta įvairiais būdais.
Šie būdai pakankamai išsamiai pateikti literatūroje iš molekulinės biologijos srities. Pagrindinis pareiškėjo panaudotas būdas yra aprašytas Dž. W. Teiloro su bendraautoriais, (1985) Nucl. Acids Res., 13: p. 87498764; Dž. W. Teiloro ir kt., (1985), Nucl. Acids Res.,
13: p. 8764-8785; K. Nakamae ir F. Ekšteino (1986),
Nucl
Acids Res
14: p. 9679-9698. Reagentai, reikalingi mutagenezei įvykdyti šiuo budu, pristatomi komplekte iš Amersham Corporation.
Sekos mutacija pakeičia lizino kodoną AAA i stop-kodoną TAA. Mutagenezei naudojamas oligonukleotidas atlieka ši, pakeitimą, tačiau kituose santykiuose yra identiškas tai sekai, kuri randama gamtoje kaip kDNR seka atitinkamam (A arba B tipo) mutavimui skirtam fermentui.
Pareiškėjas taip pat aptiko, kad gamtoje randama alfaamidinimo fermento baltymo sutrumpinta forma produkuojama B tipo baltymo brendimu vidinėje baltymo srityje, kuri yra unikali tipo B fermento baltymui. Pasėkoje susidaro fermentinis produktas, kurio molekulinė masė 43 kD. Pareiškėjas mano, kad DNR sekos, esančios aukščiau introno srities, pakanka koduoti polipeptidą, pasižyminti nemažu alfa-amidiniu aktyvumu. Taigi, polipeptidus, kurie be vargo redukuojąs! ir kurie sugeba ekspresuoti alfa-amidini aktyvumą, gali koduoti kDNR, kurios žymiai trumpesnės dėl stop-kodono, esančio kažkur B tipo kDNR introno srityje prieš arba tuoj po tos vietos, kurioje šis intronas yra laisvas nuo tipo A kDNR. Parankiausia, kai tas kirpimas Įvyksta dėl stop-kodono lokalizavimo apytikriai 30 bazių porų ribose nuo introno srities pradžios, geriausiai, žemiau jos. Norint garantuotai gauti pageidaujamą trumpesnę alfa-amidinimo fermento baltymo formą, rekombinantinėse šeimininko ląstelėse sukuriama modifikuota kDNR, kuri turi stop-kodoną vietoje lizino kodono 436-os aminorūgšties padėtyje B tipo kDNR. Ši mutacija gaunama Įvykdant kryptingą oligonukleotidinę B tipo kDNR mutagenezę.
Nežiūrint to, kad alfa-amidinimo fermento baltymo sutrumpinimas stop-kodono introdukavimu 436 aminorūgšties vietoje B tipo kDNR rezultate duoda baltymą, kuris labiausiai priartėja prie to, kuris gaunamas natūraliu proteolitiniu pirminio transliacijos produkto skaldymu (arba kai kurių kitų tarpinių skaldymo produktų biosintetiniame apykaitos kelyje), papildomas alfa-amidinimo fermento baltymo trumpinimas taip pat gali duoti aktyvų produktą rekombinantinės DNR šeimininko ląstelėse. Norėdamas sukurti trumpesnio baltymo formas pareiškėjas modifikavo AE kDNR keletu kitų būdų. Viename pavyzdyje pareiškėjas panaudoja kryptingą oligonukleotidinę sait-specifinę mutagenezę tirozino kodono performavimui 1 stop-kodoną 396 aminorūgšties padėtyje B tipo kDNR. Toks pakeitimas leidžia gauti 39 kD molekulinės masės baltymą, kai kDNR transliuojama ir perdirbama. Antruoju atveju pareiškėjas panaudoja gamtoje randamą Bam HI fermento atpažinimo vietą B tipo kDNR, norėdamas introdukuoti stop-kodoną linkerių (jungių) mutageneze. Šitas metodas gerai žinomas molekulinėje biologijoje, pirmiau paprastai atliekamas kDNR skaldymas, vėliau sujungiant su dvigrandžiu sintetinės jungės fragmentu, kuris komplementarus vienam iš perskeltos kDNR galų ir kuris introdukuoja rėmelyje stop-kodoną tuojau už skaldymo vietos ribų:
5' GATCCACTAATGATCA 3'
3' GTGATTACTAGTTCGA 5'
Ši jungė patalpina stop-kodoną tuoj po histidino kodono ties 469 aminorūgštimi. kDNR transliacijos ir procesingo rezultate gaunamas baltymas, kurio molekulinė masė 46 kD.
Pageidaujamas ribojančio stop-kodono lokalizavimas atliekamas apytikriai 15 bazių porų apimtyje DNR sekos, koduojančios iš eilės einančias bazines liekanas (dažniausiai Lys-Lys) , ypač, esančias betarpiškai aukščiau jos. Pareiškėjas mano, kad natūralus polipeptidas, kuri, koduoja B tipo kDNR, dėl posttransliacinių modifikacijų, kurios pasitaiko natūralios amidinimo fermento ekspresijos eigoje, ir dėl brendimo (procesingo) toje vietoje arba šalia tos vietos, kur paeiliui išsidėsto tokios bazinės liekanos, kaip pavyzdžiui, eilė lizinų, koduojamų B tipo kDNR introno srityje. Netgi kai įterpti stop-kodonai nėra skirti ekspresuoto polipeptido apribojimui nurodytu būdu, pageidaujama, kad įterptas stop-kodonas būtų lokalizuotas apytikriai 20 bazių porų apimtyje (pageidaujama, betarpiškai aukščiau jų) DNR sekų, koduojančių paeiliui einančias bazines aminorūgštis. Stop-kodonų įterpimas šiose padėtyse, matyt, ekspresuos polipeptidą, primenantį kai kuriuos natūralius amidinimo fermentus po to, kai jie patyrė posttransliacinį brendimą.
Norint įvykdyti citoplazminę ekspresiją prokariotinėse sistemose, bet kurios signalinės sekos kodavimo sritys (pvz., abiejų tipų A ir B kDNR, kurios aukščiau parodytos diagramomis), eliminuojamos, ir metionininiciatorius-kodonas insercijuojamas 50 nukleotidų apimtyje nuo pradžios srities, koduojančios amidinimo fermentą.
Alternatyviniame prokariotinės ekspresijos variante eliminuojamos bet kurios signalines sekas koduojančios sekos arba profermento sekos ir įterpiamas iniciatorius-metionin-kodonas 50 nukleotidų apimtyje pradžioje srities, koduojančios amidinimo fermentą. Daugelyje natūralių AE kDNR tai atitinka pradžią srities, koduojančios Ser-X-Ser (X reiškia Phe arba Leu) . Žr., pavyzdžiui, 124-132 bazės A arba B tipo kDNR sekoje, Kai kuriuose variantuose gali būti pageidaujama alfa-amidinimo fermento sekrecija. Tokiu atveju turėtų būti išsaugomos signalinės sekos kodavimo sritys, arba, alternatyviai, pakeistos heterologinėmis sekomis, kurios gali vykdyti analogiškas funkcijas, pavyzdžiui, signalinėmis bakterinio baltymo OMP A sekomis.
Šios srities specialistui suprantama, kad šio išradimo ribose galimi daugelis šiame aprašyme pateiktų mutacijų ir DNR sekų kirpimų amidinimo fermento kodavimui, ir kad tokios modifikuotos sekos koduos polipeptidus, sugebančius funkcionuoti kaip amidinimo fermentai. Todėl siūlomo išradimo formulė turi būti sudaryta taip, kad apimtų visus DNR sekų, ekspresijos vektorių ir šeimininko ląstelių funkcinius ekvivalentus.
Pavyzdžiai prokariotinių ekspresijos vektorių, kurie, pageidaujant, galėtų būti modifikuoti taip, kad turėtų DNR sekas, koduojančias amidinimo fermentą sutinkamai su šiuo išradimu, turi (bet neapsiriboja) pKK233-, PKK322-2, pKROK-I, pkT279, 280, 287, pPL liamda, pYEJ 001, pKC30, pPROK-C, jie visi - komerciniai pavyzdžiai. Prokariotiniai šeimininkai, kuriuos galima transfekuoti ekspresijos vektoriais sutinkamai su šiuo išradimu, turi (bet neapsiriboja) C600, LE392, RRI, DHI, SF8, be to visi jie prieinami rinkoje.
Eukariotiniai ekspresijos vektoriai, kurie norint gali būti modifikuoti taip, kad turėtų DNR sekas, koduojančias amidinimo fermentą, sutinkamai su šiuo išradimu, apimtų (bet neapsiribotų) pMAMlleo, pdBPVMMTNeo, pRSV, pcnKCI, pCHIIO, iš kurių visi jie prieinami rinkoje. Taip pat gali būti panaudoti atitinkami mielių vektoriai. Pageidaujami eukariotiniai šeimininkai gali būti transfekuoti ekspresijos vektoriais sutinkamai su šiuo išradimu, ir jie apima (bet neapsiriboja) IVI depozitą 10029, Hela, CVI, CI27, CHO (kinų žiurkėno kiaušidės) ir COS.
PAVYZDYS
Alfa-amidinimo fermento baltymų ekspresija E. coli.
Norint ekspresuoti alfa-amidinimo fermentą E. coli, (žr. diagramą Fig. 2, kDNR fragmentas, kurio seka A parodyta Fig. 5, apdorojamas KpnI ir Hind III ir išskiria apie 2,1 kb fragmentą. Norėdami vėl sukonstruoti amino galą, atitinkantį natūralų brandų fermentą, oligonukleotidinį linkerį, kurio seka
5' CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC 3'
3' AGTAAAAGGTTACTTACGGAAC 5' linijinis fragmentas prie linker-(jungės)Jungimo mišinys panaudojamas
E ._coli transformacijai.
prijungia prie šio DNR fragmento. Gautame fragmente yra Nco I-suderintas lipnus galas ir vienas lipnus Hind III galas. E. coli ekspresijos vektorius pKK233-2 perkamas iš Pharmacia Co. ir sukarpomas restrikcijos fermentais Ncol ir HindlII. Didysis išskiriamas ir prijungiamas adaptuoto kDNR-fragmento kompetentinio JM105
Transformantai atrenkami pagal atsparumą ampicilinui, išskirtuose klonuose rekombinantinė plazmidė tiriama restrikcijos fermentu, atliekama DNR sekų analizė tam, kad patvirtinti juose esančio ekspresijos vektoriaus struktūrą Edalee pAE12. Ekspresijos vektorius turi hibridinį trp-lac promotorių, kuris represuojamas lacrepresoriumi ir indukuojamas, apdorojant ląsteles izopropiltiogalaktozidu (IPTG). Aukščiau metioninoiniciatoriaus vektorius taip pat turi stipraus ribosominio surišimo saito sekas.
Alfa-amidinimo fermento ekspresavimui rekombinantines E. coli ląsteles augina kratiklyje LB-buljone, 37°C temperatūroje iki optinio tankio (OD600) , lygaus 0,4. IPTG pridedamas į kultūrą iki galinės koncentracijos 1 mM ir kultyvavimas tęsiamas 37°C temperatūroje kratiklyje, 3-5 valandas. Ląstelės surenkamos centrifūguoj ant kultūrą, supernatantas dekantuojamas.
Ląstelės resuspenduo j aruos buferiniame tirpale, kuriame yra proteazės inhibitorių mišinys, apdorojamos lizocimu, po to ultragarsu tam, kad būtų lizuotos ląstelės membranos. Lizatai centrifuguojami 12000 x g tirpiai ir netirpiai ląstelių frakcijoms atskirti. Kiekviena frakcija analizuojama elektroforeze poliakrilamido gelyje su Na dodecilsulfatu (EF PAAG su Na-DDS), baltymas nudažomas. Alfa amidinimo fermento baltymas nesunkiai identifikuojamas, kaip IPTGindukcijos produktas netirpioje baltymo frakcijoje. Kadangi pirminės ekspresijos plazmidėje nėra stopkodono, specifikuoto alfa-amidinimo fermento genų sekoms, susidaręs indukuojamas produktas turi sekas, specifikuotas žemiau esančiai vektorinei DNR, sintezuotai su alfa amidinimo fermento baltyminių sekų C-galu. Be to indukuotas netirpus baltymas turi ir specifini, amidinimo fermento baltymą, mažesni, negu tas, kuris susidaro, kaip baltymų sintezės vidinės iniciacijos kriptiniame RBS ir iniciacijos kodono produktas (221 aminorūgšties padėtis alfa-amidinimo fermento sekoje).
Nepageidaujamų sekų pašalinimui iš ekspresuoto produkto C-galinės dalies, A tipo sekoje atliekama lizin-kodono mutacija 716 padėtyje tam, kad šioje padėtyje būtų generuotas stop-kodonas TAA. Po to mutavusią DNR apdoroja su Κρη I ir Eco RI ir panaudoja pradinio KpnlEco RI fragmento pakeitimui pradiniame ekspresijos vektoriuje pAE12. Analogiškai B tipo kDNR sekos mutuojamos palyginamoje padėtyje (821 aminorūgštis) stop-kodonui sukurti, o fragmentas KpnI-Eco RI iš mutavusios B tipo kDNR panaudojamas atitinkamo pAE12 fragmento pakeitimui. Tokiu būdu sudarytos dvi ekspresijos plazmidės, pAE24 (tipas A) ir pAE25 (tipas B) vėliau panaudojamos JM105 transformacijai. Gauti kamienai kultyvuojami ekspresavimo tikslu, kaip aprašyta aukščiau pAE12-kamienų atveju. Aptikta, kad pAE24 produkuoja du IPTG- inicijuotus netirpius baltymus, kurių molekulinė masė apie 75 kD ir 55 kD, tuo tarpu rasta, kad pAE25 produkuoja du IPTGinicijuotus netirpius baltymus, kurių molekulinė masė apytikriai 87 kD ir 67 kD. Ir vėl, mažas baltymas kiekvienoje iš šių porų, tai - nepageidaujamas amino gale nukirptas produktas iš bet kurios A ar B tipo kDNR.
Siekdami eliminuoti baltymo sintezės iniciacija kriptinėje vidinėje ribosominio surišimo vietoje ir iniciacijos kodonus (aminorūgšties padėtis 221), startinį kodong GTG (GTG gali dirbti kaip MET-kodono iniciatorius bakterijose) paverčia kodonu GTT, nesugebančiu inicijuoti baltymo sintezės, tačiau vis dėl to koduojančiu valing, kuris paprastai būna šioje padėtyje natūralių genų koduojamuose alfa-amidinimo fermentų baltymuose. Kai mutavusi kDNR sritis pakeičiama natūralia ekspresijos vektorių pAE24 ir pAE25 seka, susikuria du nauji vektoriai, pAE31 ir pAE32. JM105 E._coli transformavimas šiais modifikuotais ekspresijos vektoriais ir iš rekombinantinių kamienų gautų baltymų ištyrimas parodo, kad mutagenezė yra efektyvi priemonė, eliminuojant nepageidaujamą vidinę iniciaciją. Šeimininko ląstelėse, nešančiose pAE31, IPTG-indukuoto produkto molekulinė masė yra 75 kD, tuo tarpu kai to paties produkto iš ląstelių, transformuotų pAE32, molekulinė masė - 87 kD.
Pareiškėjas rado, kad gamtoje paplitęs amidinimo fermentas iš B tipo kDNR posttransliaciniu būdu perdirbamas į baltymus, kurių molekulinė masė 43 kD, ir atliko eilę mutacijų AE B tipo kDNR, kurios leidžia ekspresuoti baltymus, pasibaigiančius toje padėtyje (arba arti jos), kurioje baigiasi ir natūraliu būdu perdirbtas baltymas. Dvi iš šių mutacijų gaunamos oligonukleotidinės mutagenezės būdu, tuo tarpu, kai trečiąją sukuria adapteriojungės mutacija, kaip parodyta aukščiau. Kada nešančios šias mutacijas kDNR panaudojamos pakeitimui atitinkamų pAE32 segmentų, aukščiau aprašytuose analogiškuose eksperimentuose transformuotų į JM105, tada analizuodami gautus baltymus, randame nukirstus alfa-amidinimo fermento galus. Kai mutacija įvyksta B tipo kDNR 396 amino rūgšties padėtyje, pakeisdama natūralų tirozino kodoną stop-kodonu (pAE36), aptinkamas fermentinis baltymas, kurio molekulės masė 39 kD, o tuo tarpu jungių (linkerinė) mutagenezė, užbaigianti transliaciją ties histidino kodonu 464 aminorūgšties padėtyje, rezultate duoda vektorių pAE51, kuris tuoj po transformacijos ir indukcijos JM105 E. coli gamina alfa-amidinimo fermento rekombinantinį baltymą, kurio molekulinė masė 46 kD.
Visi aukščiau aprašyti rekombinantiniai alfa-amidinimo fermento baltymai, pagaminti E. coli, pasiskirsto netirpioje ląstelės ekstraktų frakcijoje. Fermentus galima paversti tirpiais ir juos aktyvuoti, paveikiant 8 M urea ir po to greit praskiedžiant 50 mM Tris-HCl, pH 7. Kai JM105 E. coli, nešanti pAE12, išauginama ir indukuojama IPTG, kaip aukščiau aprašyta, alfaamidinimo fermento baltymai sintezuojami mažiausiai iki 30 mg/1 bakterinės kultūros.
Būdingi indukuoto netirpaus baltymo, produkuojamo E. coli, nešančioje ekspresijos plazmides AE, pavyzdžiai pateikiami Fig. 3 ir Fig. 4.
PAVYZDYS
Žinduolių ekspresijos vektoriaus pd BPV-MMTNEO-AEa75 generavimas
Norint generuoti žinduolių ekspresijos vektorių, ekspresuoj antį ir išskiriantį žymų kiekį A tipo alfaLT 4077 B amidinimo fermento, kurio molekulinė masė 75 kD, iš žinduolių ląstelių (žr. diagramą Fig. 1. atliekamos operacijos:
1) Tarpinis ekspresijos vektorius pd MMTNeo (komercinis tiekimas iš Amerikos Tipinių Kultūrų Kolekcijos) (kaip parodyta) skaldomas su Bgl II. Linijinė forma išskiriama ir išgryninama.
2) Rekombinantinė A tipo kDNR, turinti pilną pre-pro seką ir dirbtiną stop-kodoną TAA 2146-2148 padėtyje, išskiriama laipsniškai skaldant su Bgl I ir Xho I. Po to išskiriamas ir išgryninamas fragmentas, atitinkantis alfa-amidinimo fermentą.
3) Intarpas (A tipo alfa-amidinimo fermentas) ir vektorius (pd-MMTNeo) sumaišomi, ir atitinkami galai išlyginami, panaudojant Klenovo DNR-polimerazės I fragmentą. 5'-išsikišę segmentai užpildomi, pridedant dNTF, o 3' - išlindę segmentai, atvirkščiai, suskaldomi, tuo būdu išlyginami galai (alternatyviai, paeiliui: Sl-nukleazė ir Klenovas + dNTF gali būti panaudoti galų išlyginimui). Molekulės lygiais galais vėliau liguojamos 16 vai. 15° temperatūroje.
4) Liguoti produktai po to transformuojami j, RRI E. coli. Rekombinantiniai klonai atrenkami, pridėjus 50 ųg/ml ampicilino. Intarpo orientaciją rekombinantiniuose klonuose tikrina, panaudodami restrikcijos fermentų komplektą. Kaip nustatyta, vienas klonas, paminėtas kaip pdMMTNeo a-AEA75 (klonas II), turi A tipo kDNR teisingai orientuotą promotoriaus MMT atžvilgiu.
5) Plazmidinę DNR iš rekombinantinio pdMMTNeo a-AEA75 (klonas II) suskaldo pasinaudodami Bam HI. Linearizuotas vektorius išskiriamas ir išgryninamas, vėliau 2 valandas 37°C temperatūroje apdorojant bakterine šarmine fosfataze (B.A.P.), 5' fosfatams pašalinti. BPV-I genomas išskiriamas ir išgryninamas tuoj po vektoriaus pdBPV-MMTNeo skaldymo B ir Bam HI. Šitas BAmHI DNR BPV-I fragmentas, kurio dydis apie 8,0 kb, po to liguojamas į vektorių pdMMTNeo aAEA75, kuris linearizuotas, pasitelkiant BamHI ir apdorotas B.A.P., jungimas (ligavimas) trunka 3 valandas 14°C temperatūroje. Po jungimo mišinio transformacijos į RRI E. coli rekombinantiniai klonai atrenkami agarizuotose plokštelėse su LB buljonu ir 50 ųg/ml ampicilino. Rekombinantinės plazmidės analizuojamos, nustatant A tipo kDNR. Restrikciniai žemėlapiai parodo, kad klono 21 dydis yra apie 17 kb ir jis produkuoja laukiamą restrikcijos žemėlapį. Šią ekspresijos plazmidę vėliau panaudoja aAEA75 ekspresijai pelės CI27 ląstelėse.
6) Pelės CI27 ląstelės transfekuojamos 20 ųg pdBPVMMTNeo aAEA75 standartiniu precipitacijos metodu su
Ca3(PO4)2. Praėjus 2 savaitėms po transfekavimo, transformacijos židiniai kiekvienas atskirai perkeliami ir auginami mitybinėje terpėje, su antibiotiku G418. Kai ląstelės išauga iki pakankamo produkavimo lygio modifikuotoje Dulbeko terpėje, į kurią pridėta 10 % fetalinio veršelio serumo, tiriamas klonų sugebėjimas sekretuoti alfa-amidinimo fermentą, matuojant fermentinį aktyvumą kondicionuotose ląstelių kultūrų terpėse, o tap pat matuojant alfa-amidinimo fermento imunoreaktyvumą terpėje, standartiniais radioaktyvių izotopų žymių metodais ir imunoprecipitacij a. Klonus, sekretuojančius aktyvų, imunoreaktyvų alfa-amidinimo fermentą, kurio molekulinė masė 75 kD, padaugina dideliame ląstelių kiekyje (perkeldami į .kultūrinę terpę su sumažintu serumo kiekiu ir tuo pačiu sumažintu ekzogeninio baltymo kiekiu) ir panaudoja aktyvaus rekombinantinio fermento gamybai iš ląstelinių kondicionuotų terpių.
Terminai ir čia pateikti aprašymai - tai išradimo realizavimo variantai, pateikti tik iliustravimui, ir negali būti apribojimai daugeliui variantų, kurie, specialisto manymu, galimi praktiškai taikant šį išradimą.

Claims (12)

1. Šeimininkas, sugebantis ekspresuoti alfa-amidinimo fermento polipeptidų seką, besiskiriantis tuo, kad jis turi ekspresijos vektorių, kuriame yra transkripcijos promotorius su žemiau išsidėsčiusią DNR seka, svetima minėtam šeimininkui, kuris koduoja peptidilglicin- -amidinančią monooksigenazę (PAM), ir ši seka yra parinkta iš: A tipo sekos, pavaizduotos Fig.5, ir B tipo sekos, pavaizduotos Fig.6, o Fig.5 ir Fig. 6 yra šios apibrėžties dalis, kuri minėtą DNR seką Įeina stop-kodonas aukščiau sekos, kuri priešingu atveju koduotų domeną, perdengiantį membraną.
2. Šeiminikas, sugebantis ekspresuoti alfa-amidinimo fermento polipeptidų seką, besiskiriantis tuo, kad jis turi ekspresijos vektorių, kuriame yra transkripcijos promotorius su žemiau išsidėsčiusią DNR, svetima minėtam šeiminikui, kuris koduoja peptidilglicin-a-amidinančią monooksigenazę, ir griežtomis sąlygomis gali hibridizuotis su DNR seka, pasirinkta iš: A tipo sekos, pavaizduotos Fig.5, ir B tipo sekos, pavaizduotos Fig.6,kur Į minėtą DNR seką Įeina stop-kodonas aukščiau sekos, kuri priešingu atveju koduotų domeną, perdengiantį membraną, ir kurioje minėtas stop-kodonas A ir B tipo sekoms yra Įterptas atitinkamai tarp bazių 2025 ir 2275 arba bazių 2340 ir 2590.
3. Ekspresijos vektorius, sugebantis Įvykdyti alfaamidinančio fermento polipeptidinės sekos ekspresiją, besiskiriantis tuo, kad šį vektorių sudaro Įjungiant į ekspresijos vektorių pSV2 DNR seką, kuri koduoja peptidilglicin-a-amidinančią monooksigenazę ir griežtomis sąlygomis gali hibridizuotis su DNR seka, pasirinkta iš:
A tipo sekos, pavaizduotos Fig.5, ir B tipo sekos, pavaizduotos Fig.6, kur į minėtą įjungtą DNR seką įeina stop-kodonas aukščiau sekos, kuri priešingu atveju koduotų domeną, perdengiantį membraną.
4. Ekspresijos vektorius, sugebantis įvykdyti alfa amidinančio fermento polipeptidinės sekos ekspresiją, besiskiriantis tuo, kad į šį vektorių įeina transkripcijos promotorius su žemiau išsidėsčiusią DNR seka, turinčia amidinantį fermentą koduojančią sritį, ir ši pirmoji seka yra pakankamai homologinė gamtinės DNR, vykdančios gamtinio amidinančio fermento ekspresiją, sričiai, kad griežtomis sąlygomis ji gali hibridizuotis su DNR seka, pasirinkta iš: A tipo sekos, pavaizduotos Fig.5, ir B tipo sekos, pavaizduotos Fig.6, kurioje, norėdami apsaugoti nuo vidinės iniciacijos, modifikavo vidinės iniciacijos saitą, esantį gamtinės DNR kodavimo srityje, panaudojant charakteringą saitui mutagenezę.
5. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis yra toks, koks nusakytas 1 arba 2 punkte.
6. Ekspresijos vektorius pagal bet kurį iš 3-5 punktų, b e s i s k i DNR seka. r i a n t i s tuo, kad jame yra A tipo 7. Ekspresijos vektorius pagal bet kurį iš 3-5 punktų, b e s i s k i DNR seka. r i a n t i s tuo, kad jame yra B tipo 8. Ekspresijos vektorius pagal bet kurį iš 4-7 punktų, b e s i s k iria n t i s tuo, kad j į gauna,
įjungiant minėtą DNR seką, koduojančią peptidilglicinα-amidinančią monooksigenaze, į ekspresijos sistemą, pasirinktą iš grupės, kurią sudaro pdBPVMMTNeo, pSV2, pRSV, pMAMNeo, pueK-Cl, pCHUO ir jų dariniai.
9. Prokariotinis šeimininkas, besiskiriantis tuo, kad jame yra ekspresijos vektorius pagal bet kuri, iš 3-8 punktų.
10. Eukaritinis šeimininkas, besiskiriantis tuo, kad jame yra ekspresijos vektorius pagal bet kuri, iš 3-8 punktų.
11. Šeimininkas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jį pasirenka iš grupės, susidedančios iš IVI depozito 10029 (ATCC CRL 10919), Hela, CV, CHO (kinų žiurkėno kiaušidžių) ir COS.
12. Šeimininkas pagal 11 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra CHO, ekspresijos vektorius yra pSV2, DNR seka yra A tipo, o stopkodonas yra įterptas prie bazių 2146-2148.
13. Substrato amidinimo būdas, besiskiriantis tuo, kad minimam substratui leidžia kontaktuoti su rekombinantine peptidilglicin-a-amidinančia monooksigenaze (PAM), kurią gauna panaudojant ekspresijos vektorių pagal 3-8 punktus, arba iš PAM ekspresijos bet kuriame iš šeimininkų pagal 1, 2 arba 9-12 punktus.
14. Amidintas produktas, besiskiriantis tuo, kad jį gauna pagal 13 punktą.
15. Rekombinantine peptidilglicin-a-amidinanti monooksigenaze, besiskirianti tuo, kad ją gauna, panaudojant ekspresijos vektorių pagal bet kurį iš 3-8 punktų, arba ekspresuo j ant PAM bet kuriame iš šeimininkų pagal 1, 2 arba 9-12 punktus.
LTIP1829A 1989-02-06 1994-01-28 Expression systems for amidating enzyme LT4077B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/307,366 US5789234A (en) 1987-08-14 1989-02-06 Expression systems for amidating enzyme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1829A LTIP1829A (en) 1995-08-25
LT4077B true LT4077B (en) 1996-12-27

Family

ID=23189439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1829A LT4077B (en) 1989-02-06 1994-01-28 Expression systems for amidating enzyme

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5789234A (lt)
EP (1) EP0382403B1 (lt)
JP (1) JPH0771498B2 (lt)
KR (1) KR0157983B1 (lt)
AT (1) ATE283922T1 (lt)
CA (1) CA2009306C (lt)
DE (1) DE69034179T2 (lt)
DK (1) DK0382403T3 (lt)
ES (1) ES2235149T3 (lt)
FI (1) FI110517B (lt)
HU (1) HU220464B1 (lt)
LT (1) LT4077B (lt)
NO (1) NO900531L (lt)
RU (1) RU2129606C1 (lt)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789234A (en) * 1987-08-14 1998-08-04 Unigene Laboratories, Inc. Expression systems for amidating enzyme
US5912014A (en) * 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
DE69841939D1 (de) 1997-04-16 2010-11-25 Unigene Lab Inc Direkte expression von peptiden ins kulturmedium
US8088734B2 (en) 2003-01-21 2012-01-03 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides
US8603781B2 (en) * 2003-09-25 2013-12-10 Monsanto Technology Llc Prevention of incorporation of non-standard amino acids into protein
US7648965B2 (en) 2004-05-14 2010-01-19 Unigene Laboratories Inc. Method for fostering bone formation and preservation
US7531518B2 (en) * 2004-05-14 2009-05-12 Unigene Laboratories Inc. Method for fostering bone formation and preservation
US20060089723A1 (en) * 2004-10-25 2006-04-27 Murphy Kieran P Method for bone augmentation
US7445911B2 (en) 2004-11-24 2008-11-04 Unigene Laboratories Inc. Enzymatic reactions in the presence of keto acids
DE102004058306A1 (de) * 2004-12-01 2006-07-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
EP1861507A4 (en) * 2005-02-04 2008-06-25 Glaxo Group Ltd OPTIMIZATION OF THE EXPRESSION OF HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES
US20060293667A1 (en) * 2005-05-19 2006-12-28 Agnes Vignery Bone implant device and methods of using same
DK1907561T3 (da) * 2005-06-24 2013-12-02 Enteris Biopharma Inc Cellelinjer til ekspression af enzym, der er anvendeligt i fremstillingen af amiderede produkter
US8377863B2 (en) 2007-05-29 2013-02-19 Unigene Laboratories Inc. Peptide pharmaceutical for oral delivery
KR20110119707A (ko) 2009-01-22 2011-11-02 유니진 래보러토리즈 인코포레이티드 비만 치료
ES2583259T3 (es) 2009-12-01 2016-09-20 Novo Nordisk A/S Nuevas liasas alfa-amidantes de peptidil alfa-hidroxiglicina
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
US9102753B2 (en) 2011-06-15 2015-08-11 Ugp Therapeutics, Inc. Anti-inflammatory pharmaceutical products
TR201808456T4 (tr) 2011-11-02 2018-07-23 Keybioscience Ag Hastalıklar ve rahatsızlıkların tedavi edilmesine yönelik kalsitonin mimetikleri.
US9533022B2 (en) 2011-11-02 2017-01-03 KeyBioscience A/S Peptide analogs for treating diseases and disorders
KR102019911B1 (ko) 2011-11-02 2019-09-09 키바이오사이언스 아게 질병 및 장애 치료용 펩타이드 유사체
WO2014138241A1 (en) 2013-03-05 2014-09-12 Enteris Biopharma, Inc. Pharmaceuticals for oral delivery
NO3068796T3 (lt) 2013-11-14 2018-06-30
WO2015084875A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Stealth Peptides International, Inc. Compositions and methods for treating vitiligo
WO2015183988A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Stealth Peptides International, Inc. Therapeutic compositions including therapeutic small molecules and uses thereof
EP3148565A4 (en) 2014-05-28 2018-06-06 Stealth Biotherapeutics Corp Therapeutic compositions including frataxin, lactoferrin, and mitochondrial energy generating enzymes, and uses thereof
WO2015195737A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Stealth Peptides International, Inc. Methods of identifying and monitoring mitochondrial dysfunction using monocyte screening
GB201500263D0 (en) 2015-01-08 2015-02-25 Keybioscience Ag Calcitonin analogues for treating diseases and disorders
AU2016206950B2 (en) 2015-01-12 2021-05-06 Enteris Biopharma, Inc. Solid oral dosage forms
GB201704429D0 (en) 2017-03-21 2017-05-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201707955D0 (en) 2017-05-18 2017-07-05 Keybioscience Ag Dual amylin and calcitonin receptor agonists for treating diseases and disorders
GB201813677D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201813678D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Acylated calcitonin mimetics
WO2021026854A1 (zh) * 2019-08-15 2021-02-18 中国科学院微生物研究所 一种酶催化的蛋白质c-端选择性酰肼化修饰方法
GB202001024D0 (en) 2020-01-24 2020-03-11 Key Bioscience Ag Oxyntomodulin mimetics

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5374618A (en) * 1983-06-15 1994-12-20 Celltech Limited Calcitonin peptides, and gene related pharmaceutical compositions
DE3327007A1 (de) * 1983-07-27 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit einem saeureamid-carboxyterminus
US4708934A (en) * 1984-09-27 1987-11-24 Unigene Laboratories, Inc. α-amidation enzyme
US6319685B1 (en) * 1984-09-27 2001-11-20 Unigene Laboratories, Inc. Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use
JPS6229997A (ja) * 1985-04-08 1987-02-07 Sankyo Co Ltd Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法
JPS62177184A (ja) * 1986-01-29 1987-08-04 Toyota Motor Corp 鋳鉄製内燃機関用シリンダヘツドおよびその製造方法
JPH0775541B2 (ja) * 1986-06-07 1995-08-16 壽之 松尾 Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法
EP0249477A3 (en) * 1986-06-12 1988-01-20 Immunex Corporation Functional recombinant analog polypeptides devoid of hydrophobic amino acids
JP2598050B2 (ja) * 1987-07-17 1997-04-09 サントリー株式会社 Ｃ−末端α−アミド化酵素
US5789234A (en) * 1987-08-14 1998-08-04 Unigene Laboratories, Inc. Expression systems for amidating enzyme
US6255067B1 (en) * 1987-09-15 2001-07-03 The Johns Hopkins University cDNA encoding peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM)
JP2845468B2 (ja) * 1989-01-17 1999-01-13 サントリー株式会社 ヒト甲状腺由来Ｃ―末端α―アミド化酵素
JP2535398B2 (ja) * 1989-01-17 1996-09-18 サントリー株式会社 アミド化ペプチドの製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B A EIPPER, R E MAINS, AND C C GLEMBOTSKI: "Identification in pituitary tissue of a peptide alpha-amidation activity that acts on glycine-extended peptides and requires molecular oxygen, copper, and ascorbic acid", PNAS, 1983, pages 5144 - 5148
EIPPER B.A. ET AL.: "Peptidyl-Gly cine-Amidation Activity in Tissues and Serum of the Adult Rat", ENDOCRINOLOGY, 1985, pages 2497 - 2504

Also Published As

Publication number Publication date
KR900013078A (ko) 1990-09-03
EP0382403A3 (en) 1991-04-10
CA2009306A1 (en) 1990-08-06
HU900226D0 (en) 1990-03-28
US5789234A (en) 1998-08-04
JPH0771498B2 (ja) 1995-08-02
FI110517B (fi) 2003-02-14
ES2235149T3 (es) 2005-07-01
HU220464B1 (hu) 2002-02-28
DK0382403T3 (da) 2005-03-21
LTIP1829A (en) 1995-08-25
CA2009306C (en) 2002-04-09
DE69034179T2 (de) 2005-12-01
NO900531L (no) 1990-08-07
EP0382403B1 (en) 2004-12-01
KR0157983B1 (ko) 1998-11-16
JPH0541982A (ja) 1993-02-23
NO900531D0 (no) 1990-02-05
FI900554A0 (fi) 1990-02-05
DE69034179D1 (de) 2005-01-05
ATE283922T1 (de) 2004-12-15
HUT54414A (en) 1991-02-28
RU2129606C1 (ru) 1999-04-27
EP0382403A2 (en) 1990-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
LT4077B (en) Expression systems for amidating enzyme
CA2033176C (en) Growth hormone fusion proteins
US6103495A (en) Direct expression of peptides into culture media
Gray et al. Pseudomonas aeruginosa secretes and correctly processes human growth hormone
US6171823B1 (en) Process for producing extracellular proteins in bacteria
EP0510018A1 (en) Lipoprotein signal peptide fused to antigenic polypeptides
US4828988A (en) Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine
EP0422049A4 (en) Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium
HU216335B (hu) Eljárás peptidek előállítására
EP1597369B1 (en) Use of caspase enzymes for maturation of engineered recombinant polypeptide fusions
AU674741B2 (en) Methods and DNA expression systems for over-expression of proteins in host cells
US6165746A (en) Preventing endogenous aminopeptidase mediated n-terminal amino acid cleavage during expression of foreign genes in bacteria
EP0437544A4 (en) Recombinant pdgf and methods for production
CA1299119C (en) Dna encoding a grf precursor
EP0199018B1 (en) Expression in e.coli of hybrid polypeptides containing the growth hormone releasing factor sequence
EP0234592A1 (en) Plasmid containing DNA fragment coding for human immunoglobulin G Fc region protein and use thereof for production of said protein
EP0422217B1 (en) Human recombinant placental ribonuclease inhibitor and method of production
CA2369973C (en) Preparation of pancreatic procarboxypeptidase b, isoforms and muteins thereof and their use
PT98332B (pt) Metodo para a producao de uma proteina biologicamente activa por processamento in vitro de proteinas de fusao
WO1986005805A1 (en) A dna sequence
EP0361956A2 (en) Increased expression of small molecular weight recombinant proteins
CA2529282C (en) Recombinant igf expression systems
Hostomský et al. Cloning and expression in Escherichia coli of the synthetic proenkephalin analogue gene
AU633099B2 (en) Growth hormone fusion proteins
AU633099C (en) Growth hormone fusion proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20020128