HU220464B1

HU220464B1 - Amidáló enzimeket kifejező rendszerek és alkalmazásuk

Info

Publication number: HU220464B1
Application number: HU26/90A
Authority: HU
Inventors: Gary Agide Beaudry; Arthur H. Betelsen; Nozer M. Mehta
Original assignee: Unigene Laboratories Inc.
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 2002-02-28
Also published as: KR0157983B1; EP0382403A3; JPH0541982A; RU2129606C1; ATE283922T1; ES2235149T3; US5789234A; LT4077B; EP0382403A2; NO900531D0; CA2009306C; FI900554A0; JPH0771498B2; LTIP1829A; DE69034179T2; DK0382403T3; KR900013078A; EP0382403B1; FI110517B; CA2009306A1

Abstract

A találmány alfa-amidáló enzimekkel foglalkozik, amelyeket rekombinánsDNS-technika segítségével, nagy kitermeléssel és nagy tisztasággalállítanak elő. Mind eukarióta-, mind prokariótakifejező vektorokatállítanak elő, amelyek valamely transzkripciós promotort tartalmaznak,és ezt követi lefelé egy olyan DNS-szekvencia, amely amidáló enzimetkódol. A kiválasztott vektorok tehát olyan vektorok, amelyek képesek apolipeptid kifejezésének irányítására a kiválasztott gazdasejtben. Atalálmány leírja az előnyös gazdasejtek transzformálását is a fentebbismertetett vektorokkal. ŕ

Description

A leírás terjedelme 56 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 220 464 B1

HU 220 464 BI

A találmány alfa-amidáló enzimek előállításával foglalkozik rekombináns DNS-technikával és különösen alfaamidáló enzimek kifejezésére képes kifejezővektorokkal és gazdasejtekkel foglalkozik, amelyek segítségével az alfa-amidáló enzimek nagy kitermeléssel és kinyerhetően nagy tisztasággal állíthatók elő.

A natív fehérjék prekurzor formáinak sejten belüli feldolgozását (hasítás és/vagy funkciós csoport módosítás), amely a nukleinsav kódolószekvenciákból való transzlációt követi, világosan dokumentáljuk.

Az emlőssejtek és más eukarióták végre tudnak hajtani bizonyos transzláció utáni feldolgozási műveleteket, míg a prokarióták erre nem képesek. Bizonyos prokariótákat, mint az E. colit, széles körben alkalmazzák gazdaszervezetekként emlősfehérjék termelésére rekombináns DNS (rDNS)-technológiával, mivel ezeket könnyen lehet növeszteni fermentációs eljárásokkal nagy tételben, és mivel ezek genetikailag jól jellemzettek. Több emlősfehérje azonban igényel bizonyos transzláció utáni feldolgozást, és ha ezeket a fehéijéket E. coli genetikai manipulálásával állítjuk elő, akkor például a transzláció utáni feldolgozást gyakran kell komplex, in vitro kémiai eljárások alkalmazásával elvégezni, amely a nagy léptékű eljárások alkalmazásánál költségnövelő tényező.

A feldolgozási tevékenység egyik típusa a peptid vagy fehéije karboxi-terminális aminosavának fajlagos amidálása.

Sok természetben előforduló hormon és peptid tartalmaz ilyen módosítást, amely gyakran esszenciális, ha a fehérjének biológiailag aktívnak kell lennie. Erre egyik példa a kalcitonin, ahol egy natív formájú amidált prolingyök helyettesítése nem amidált prolinnal a biológiai aktivitás 3000-szeres csökkenését eredményezi. További biológiai peptidek, amelyek transzláció utáni amidálást igényelnek a teljes aktivitáshoz, például (anélkül, hogy csak ezekre korlátozódnának) a növekedésihormon-kibocsátó faktor, egyéb kalcitoninok és kalcitonin génrokon peptidek.

Valamely peptid karboxi-terminális aminosavának fajlagos amidálását az alfa-amidáló enzimek katalizálják. A polipeptidszekvenciák több fontos biológiai fehérjénél, amelyek amidálást igényelnek a maximális hatékonysághoz, előállíthatok például genetikai manipulációs technikákkal.

A fontos és néha elengedhetetlen karboxi-terminális-amidálást gyakran in vitro kell végrehajtani. Kívánatos elkerülni a költséges és fáradságos kémiai amidálási technikákat, ezért kívánatos valamely amidáló enzim alkalmazása a fajlagos amidálás elvégzésére. Alfa-amidáló enzimek azonban nem könnyen szerezhetők a természetből.

Az amidált peptidek jelenléte egy adott szövetben nem szükségszerűen párosul az alfa-amidáló enzimek magas szintjével. így például a patkány elülső hipofízisszövete magas alfa-amidáló aktivitást tartalmaz, de ennek szubsztrátuma nem ismeretes [Eipper és munkatársai: PNAS, 80, 5144-5148 (1983)]. A patkány hátsó hipofízisszövet tartalmaz amidált peptideket (oxitocin és vazopresszin), ugyanakkor nagyon alacsony alfaamidáló aktivitással bír [Eipper és munkatársai, Endo, 116, 2497-2504 (1985)]. Ennek megfelelően amíg az egyes szöveteket meg nem vizsgáljuk alfa-amidáló aktivitásra, az enzim jelenlétét vagy lehetséges szintjeit nem lehet előre megbecsülni.

A természetes fonásokból szerzett enzimek hozzáférhetőségének még nagyobb akadálya a tisztaság általában alacsony szintje. A természetes forrásokból szerezhető amidáló enzimek proteolitikus enzimeket és más szennyezéseket is tartalmaznak. Az amidált termékek hatékony kinyerését nagymértékben megnehezíti, ha ezeket a szennyezéseket is tartalmazó enzimeket egy L-aminosavakat tartalmazó szubsztrátum amidálására alkalmazzuk. Főleg a proteázok jelenléte bonthatja le a szubsztrátumot és/vagy az amidált terméket és/vagy az amidáló enzimet magát. A legtöbb biológiailag fontos aminosav tartalmaz L-aminosavakat, és ezek fogékonyak erre a proteolitikus lebomlásra és más amidáláskorlátozó gátakra, amelyeket az amidáló enzimekben levő szennyeződések okoznak.

Mivel a természet kevés forrást, kis mennyiséget és nem megfelelő tisztaságot szolgáltat, szükség van hatékony eljárásokra, amellyel alfa-amidáló enzimek tömegtermelését lehet elérni, nagy kitermeléssel és nagy tisztasággal.

Ahogyan itt használjuk, az „amidáló enzim” és „alfaamidáló enzim” bármely olyan ágensre vonatkozik, amely egy peptidilszubsztrátumnak egy olyan megfelelő peptidil-amiddá történő átalakítását képes katalizálni, amely az említett szubsztrátum C-terminális aminosavának helyén egy aminocsoportot tartalmaz.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmányt.

A találmány egyrészt rekombináns expressziós vektorokra vonatkozik, amelyek alfa-amidáló enzimet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.

A találmány másrészt eukarióta és prokarióta gazdasejtekre vonatkozik, amelyek az említett rekombináns expressziós vektort tartalmazzák.

A találmány tárgya ezenkívül eljárás rekombináns peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzim előállítására az említett gazdasejtek segítségével.

Az említett eljárásokat úgy hajtjuk végre, hogy egy alfa-amidáló enzim polipeptidszekvenciáját kifejezni képes gazdasejtet készítünk, ahol az említett gazdasejt egy olyan kifejezővektort tartalmaz, amely magában foglal egy transzkripciós promotort, amelyet lefelé egy, az említett gazdasejt szempontjából idegen DNS-szekvencia követ, amely az említett amidáló enzimet kódolja, és az említett vektor képes polipeptidek kifejeződésének irányítására az említett gazdasejtben.

Bizonyos kiviteli módokban olyan, alfa-amidáló enzim polipeptidszekvenciáját kifejezni képes gazdasejtet készítünk, ahol az említett gazdasejt egy olyan kifejezővektort tartalmaz, amely magában foglal egy transzkripciós promotort, amelyet egy, az említett gazdasejt szempontjából idegen DNS-szekvencia követ, amely szigorú körülmények között képes hibridizálni az alábbi DNS-szekvenciával:

HU 220 464 Β1

Ο Ο 1£> ι/1 -7 4φ xf WI ΓΊ — |

I I υ < < υ οοου HŰUÜ υοοΰ ÜOHÜ Η Η δ υου

Η υ

ο

Η

<	δ	<	δ	I
δ	<	δ	3	+
ο	υ		δ	1	00
<	δ	δ	Ö	1
<	δ	δ	δ	1
Η	Η	υ	Η	1
<	Η	ο	δ
δ	δ	3	Ο	1
δ	□	δ	Η	1	Ρ·4
δ	δ	δ	U	1
	δ	δ	δ	1
ο δ ο	Η	+
δ	<	υ	δ	1
δ	3	Ό	δ	1	_₍
Η	<	U	Η	1
Η	δ	Η	υ	1
<	υ	< <		Ρ—
υ	Η	δ Η	1
3	δ	3 3	1

. _ . δ < < δ -ί Οϋ<ϋ υ υ < ο

+ 6

Η δ - - < HUU ουυυ Η Η Ο Η < υοο OÜÜO Η δ Η Η < Ο < δ < δ ο δ οδού ΟΗΟΟ ÜUOH Η HÜO η ο οδ οο a κι -& κι η ' I §83 < δ Η U δ δ δ δ □ <ϋΗ <υδυ οοο< υουο ΟΗΟΟ HOCO οοοο < δ δ δ Ο HUU οοου ο Η<δ η υ ο ο οοδο οοου Η δ Ο < < δ u δ δ δ υ δοοο δ Η δ Η + —

ΚΙ

κι

KI

θ',

κι

KI

σι

κι

KI

»—1

κι

KI

ν>

κι

—<

ΓΊ

Γ*Ί

R-1

ττ

KI

CN

t-'

3

+

Η

+

t—

+

<

+

δ

+

<

+ 44

3

+

δ

1 οο

δ

1

δ

1

·<

I

3

1

δ

1 60

Η

1

δ

! ι-ι

u

1

δ

1

δ

1 Ό

<

1

δ

1

Ε->

1

δ

1

H

1

δ

1

3

1 σ

3

1

<

1 ·—

Η

U

1

δ

1 CL

<*

1

<

1

1 te

δ

<

• S

δ

•

3

δ

1

δ

1

δ

1

t-l

1

δ

1

δ

1 60

Η

1

<

1

δ

1

δ

te

δ

<

1

<

1

3

1 >

Η

1

Η

1 te

Η

3

1

δ

1 43

ο

1

δ

1

3

1

δ

1

<

1

δ

1

Η

1

δ

1 Cl

Ε-ι

1

δ

+ οο

Η

+

Η

+ te

δ

+ t-

<

+

3

+ >

Η

1

<

ι ε

<

1

δ

1

•ί

1 S3

δ

1

3

1

Η

1

δ

1

δ

1

Η

1

δ

1 ο-

<

1

υ

1 —'

δ

1

δ

1 CL

<

1

<

ι

1 44

υ

1

Η

1 ο

δ

1

δ

1

3

1 Τ3

Η

1

Ε-Ι

1

δ

Η

δ

<<

3

Η

1 u

Η

1

<

ι ε

υ

1 CL

δ

1

δ

1

3

1 60

<

1

Η

1 <4-

3

1

δ

1

δ

1 ι-ι

Η

1

<

1

δ

1

δ

1

υ

1

Η

1

δ

1 >

Η

1

δ

1 ω

<

1

Η

δ

1 CL

Η

1

Η

1

Η

+

Η

+ >4

Ε-

Μ-

Η

+

Η

+ L—

δ

+

Η

+

<

1

<

1

Η

Ι U

δ

1

Η

1

<

1

<

1

<

1 C

δ

1

δ

1 cc

δ

1

δ

1

δ

1 43

δ

1

<

1 ^w

Η

I

Η

1

δ

1 cc

1

δ

1

δ

1

δ

1

δ

1 00

1

Η

1

δ

1 Τ3

<

1

Η

• te

<

δ

<

• c

3

t-l

δ

• 43

Η

1

δ

1 Ό

Η

1

3

1

<

1 te

Η

1

Ε-·

1

Η

1

Η

1

υ

1

3

1

δ

1

δ

1 >

δ

1

Η

1 cu

δ

1

δ

1

1 L-

Η

1

Η

1

<

1 ***

<

1

Η

1 te

Η

1

<

1

<<

δ

1

δ

1

δ

+

3

+

<

+

Η

+

Η

+ c«

<£

4-

Η

1 te

<

1

Ε-

1

δ

1 CC

<

1

δ

1

δ

1 43

<

1

δ

1 <u

<

δ

1

δ

ι ·σ

Η

δ

1

3

1

δ

1

δ

1

δ

ι

<!

ι ε

Η

1

<

1 ι-

1

δ

1

Η

1 ?

3

ι

δ

1

3

1 >

δ

• 44

<

• ε

δ

• 60

Η

δ

1

Η

1

δ

1

Η

1

<

ι’ ε

3

1

<

1 *“*

δ

1

δ

1

δ

1 CC

<

1

Η

1

<

1 !-<

Η

1

δ

1 CL

Η

1 Λ

Η

1

Η

1 >>

Η

1

δ

1

δ

1

<

1

δ

1

δ

1

δ

<

1

+ 4—¹

δ

+

Η

+

Η

+

<

+

δ

+

Η

+ >1

1

<

1 ^w

δ

1 ~

<

1

υ

1 43

<c

1

δ

1

Η

1

<

1

Η

1

Η

1

Η

1 >>

δ

1

δ

1 ω

Η

1

Η

1

δ

t —

Η

1

δ

1

δ

1 ec

1

δ

1 >

<

I

Η

1

3

1 >

Η

t-

1

δ

3

Η

<

• ε

Η

<2

1 44

δ

1

δ

1 +-»

<

1 ·—

<

1

δ

1

t-

1 cu

Η

1

δ

1 CIO

Η

1

Η

1

δ

1 σ'

δ

1

δ

1

Η

1

Η

1

<

1

Η

1

3

1 60

Η

1

Η

1 <4-

δ

1

δ

1 Ό

•3

1 c

Η

1

25

1

δ

1 >

3

+

δ

+ CL

δ

+

υ

+

δ

+ —

υ

+

Η

+

δ

1

δ

1

δ

1

δ

1

δ

1 ec

<

1

1 ι-

Η

δ

ι ε

δ

1 cC

Η

1

t-l

1

δ

1 43

%

1

ι ε

δ

I

1

δ

1 >

t—

1

δ

1

δ

1

δ

te

1

δ

1

Η

1

• 44

δ

Η

-Lí

Η

<

• ε

Η

1

δ

1 L-

δ

1

Η

1

Η

1 Cu

Η

1

<

1

Η

1

Η

1

υ

! ^Λ

<

1

δ

1

Η

1 ’—¹

δ

1

Η

1 cu

Η

1

Ε-ι

3

1 Ό

1

Η

1

δ

1 CL

δ

1

<

1 —

δ

I

<

1

Η

1 >4

δ

1

Η

1

Η

+

Η

+

δ

+ U

δ

+

δ

+ CL

<

+

δ

1 >

<

1

δ

1

<

!

1

3

1

Η

1 >4

Η

1

3

1 Ό

<

1

Η

1

<;

1 44

<

1

δ

1

δ

1

δ

1

<

1 CL

δ

1

δ

1

δ

ι σ

Η

1

Η

1 te

Η

1

δ

1

Η

1 ej

3

1

δ

ι

ι ε

Η

δ

• —

Η

δ

• te

υ

<Γ

Η

1

δ

1

Η

1 ⁴⁴

δ

1

<2

1

δ

1 CL

<?

1

δ

1 —'

υ

1

δ

1

1 ί**'

3

1

δ

1

1 44

<

1

δ

1 ec

<

1

δ

1 60

Η

1

δ

1

δ

1

Η

1

δ

3

1

Η

1

δ

1 >

<

1

δ

+ ο.

Η

+

Η

+

3

+ 60

δ

+

Η

+

Η

+ >.

δ

1

Η

1 L-.

Η

ι Ό

<

1

<Γ

δ

1

<

1

Η

1

<!

<

1

<Γ

1

υ

1 1-

<

1

1 ό

<

1

δ

1

δ

1 <υ

3

1

δ

1 σ*

<

1

δ

1 Ό

Η

1 —

Η

1

1 σ

δ

1

δ

1

3

<

δ

<

- —

δ

<

1 t-

υ

1

δ

1

δ

1 Ό

3

1

δ

1

Η

1 σ

υ

1

Η

I te

Η

| >

Η

1

3

1 60

Η

1

δ

1

Η

1

<

1

Η

1

δ

1

<

1

δ

I «·Ρ>4

δ

1

Η

1 cu

δ

1

δ

t-l

1 u

3

1

Η

1

Η

1 te

δ

+

δ

+ «

δ

+

Η

+

δ

+ 60

<

+

Η

+

δ

1

Η

1

3

1

Η

1

Η

1

δ

1 43

Η

1

3

1 ec

<

1

<

!

Η

1 c*-·

Η

1

<

1

<

1 ·—

δ

1

δ

1 T3

<

3

1

3

1 >

Η

1

δ

1

Η

1

Η

1

3

I

δ

1

<

1

δ

1 >

<

1

δ

- —

Η

3

te

Η

• ?

3

υ

δ

• Ά

δ

1

δ

1 '—¹

<!

1

δ

1

1 ι-ι

δ

1

Η

1

δ

1

Η

1

δ

1

<

1

υ

1

Η

1 ce

δ

1

Η

1 σ

δ

1

Η

1 ο

Η

1 >4

Η

1

δ

1

δ

1 CC

δ

1

δ

1 CL

1

Η

1

Η

1 L—

Η

1

Η

1

δ

+

δ

+

δ

+ _

+

<

+

δ

+ >

<

+

<

1 te

δ

1

δ

1

1 te

3

1

δ

1

<

1 C

δ

1

<

Η

1

<2

1

δ

1 60

3

1

δ

1

δ

1

δ

1

δ

I

3

1

Η

1

δ

I 60

Η

1

<

1 te

Η

1

Η

1 ·*

δ

1 60

Η

1

Η

1

δ

1 >

3

δ

• >

υ

Η

δ

• >

υ

<

1

<

1

υ

I CX

δ

1

Η

1

Η

1 te

Η

1

δ

1 σ'

δ

1

δ

1

<

1 —*

3

1

δ

1

3

1 >

δ

1

δ

1 CL

Η

1

δ

1

3

1 60

δ

1

<

1

Η

1

<

1

υ

1 —

δ

1

<

1

Η

1 σ

<

1

ΚΙ κι οο

ATACAGAGTAAGAAACGGACAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTT

HU 220 464 Bl v>

VT

Os

VT

VT ©

VT

VT OS

VT

CS ’d·

VT

SO

VT

OS

GGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGGTGAAGGGAGGACAGAGGCCACCCATATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACA

+

H

+

<

+

E-

+

co

E-

+

E— +

< +

ε

1

<

1

• -H

1

H

1

<

1

·—1

<3 1

© 1

1

E-

1

q

1

00

«3

1

<

1

© 1

Ό

© 1

1

>>

<

1

©

1

T3

©

1

<3 1

< ¹

V3

1

<

1

c

1

©

1

©

1

CX

4 ¹

© 1

©

ω

CT

H

<3

—

Ό

1

©

1

<

1

©

1

Ö

1

© 1

< ¹

U

1

©

1

c3

1

υ

1

©

1

00

© 1

tí ¹

1

©

I

]

©

1

E-

1

<3 1

CZT

1

tí

1

©

1

Λ

E-

1

© 1

Ö 1

00

+

©

+

O

υ

+

©

+

©

+

—

E- +

φ +

1

u

1

ex

E-

1

E-

1

Ε- 1

—

P 1

I w

I

I + *I

I

I oo

I 00

I — +

I

I 45

I Λ I +

I o

I *I

I >I + 00

I

I o

I

I oo

©

H

Es

H H ©

E- + © í

H ©

E->

«3 P + P !

<: υ E© + Eu Ευ υ H ©

ES ⁺ υ

EE% ©

1

©

1

a*

H

1

Ε- 1

©

1 >

©

1

©

1

H

1

U 1

©

1

©

1

ex

1 CT

<

1

E-

1

© 1

ex

E-

1

©

1

E-

c

© ·

E-

• 6-

©

1

E-

1

E-

1

<2 ¹

©

1

<

1

1 60

E-

1

E—

1

© 1

oo

E—

1

H

1

©

1

>

H

1

< ¹

O

1 >

©

1

H

1

H

1

< 1

E-

1

©

1

ex

+ a.

E-

+

©

+

© +

<υ

U

+

E-

+

H §

□ + -a

EEE- + © g «3

Ό <L>

H <

© ©

l

P

EQ <3 + μ © ' ©

• T3 <

H ©

E- + ü

S

H □

§ ©

□ ©

©

1

E-

1

<

1

ε

H

|

H

1

1 C

©

1

u

1

E-

i

1

w

E-

1

Ü

1

©

1

>

©

1

©

1 n!

©

1

©

1

E-

1

+

©

+

»—

H

+

H

+

©

+

00

©

+

o

+

H

+ u

<c

+

©

+

1

<3

1

<

1

ε

<

1

©

1 ft

E-

1

©

1

<

1

©

1

H

1

©

1

4=

©

1

y

1

Ü

1 >

H

1

<3

1

©

1

O“

1

©

1

CS

H

1

©

1

<

1

L-.

·<

1

H

1

H

1 6^

©

1

y

1

E-

1

©

1

>

H

1

y

1

©

1 Ό

<

1

E-

1

©

1 60

<3

1

>

<3

©

H

<

H

©

• Ό

<C

©

1

H

1

H

1

H

1

©

1

45

E-

1

<

1

©

1 -S

©

1

©

1

<

1

ε

<c

1

©

1

<c

1 ·—

y

1

y

1

<

1

E-

1

o

<

1

©

1

©

1

'O

H

1

©

1

<3

1

<

1

E-

1

—

1

<3

1

5*

<

1

©

1

H

1

<*-

E-

1

©

1

<3

1 c

©

1

H

1

+

©

+

©

+

Ό

<c

+

H

+

©

+ >

H

+

<3

+

y

+ Q.

<3

+

1

u

©

1

©

1

©

1

σ

H

1

©

1

©

1 >

<3

1

<3

1

©

1

45

1

©

1

cú

©

1

©

1

<

1

· —

H

1

©

1

©

1 σ'

©

1

H

1

<

1

y

1

ex

<!

1

©

1

©

1 —

©

1

y

1

E-

1 ^w

©

1

ctí

1

©

1

o

H

1

©

1

H

<3

1

H

1

©

1

ex

©

<υ

<3

<

©

>

E-

©

• T3

E-

©

1

©

1

<3

1

H

1

<

1 ·—

<3

1

H

1

H

1 6-

H

1

C3

E—

1

©

1

H

1

—

Ε-

1

©

1

E-

1

Ü

1

©

1

©

1

>

1

<3

1

s

H

1

<

1

υ

1

—

y

1

H

1

<3

1

H

1

U

1

©

1

H

1

y

1

<

1 —'

1

©

1

©

1 σ·

H

1

+

—

<

+

H

+

©

+

>

<

+

©

+

<3

+ c

3

+

©

+

©

+

1

H

1

©

1

<

1

tí

<c

1

<3

1

©

1 60

H

1

©

1

H

1

©

1

ex

<

1

H

1

©

1 Ό

©

1

H

1

©

1 >

©

1

<

1

H

1

©

1

<υ

<

1

<

1

©

1 60

©

1

H

1

©

1

cö

1

H

1

H

1

<C

1

<3

1

c

<3

1

H

1

©

1 ο-

E-

1

©

1

ü

<

· —

<!

©

• ω

<

<3

H

1

Ό

E-

1

<

1

©

1

<u

<

1

©

1 Ό

<

ι

©

1

E-

1

<

1

ε

©

1

©

1

<

1

5aí

<3

1

<

1

©

1 σ·

©

1

E-

1

©

1

©

1

ex

<

1

H

1

©

1 υ

y

1

©

1

©

1

©

1

00

E-

1

©

1

©

1

o

©

1

H

1

<

H

1

H

1

<3

1

CZ5

HU 220 464 Bl

V“>	<n		Oh	v>	v->
	v->	v->			V“>
Oh	©	»—1	r-		m
	(N	CN		<N	<M
<! +	H +	o +	00	< +	H
Q	O 1	Η 1		U 1	H
< 1	O 1	O 1		< l	<

in o\ w> —i

Tt OO

ΓΊ

U + T3 H <n tn in m

E□

EE<

H <! + U I Ε— I < I U I EU I - I

U +

H EU g

Ευ

U +

I u

U i cl

U 1 Ι-

1

u

1

03

Ε- 1

Ε-

1

CL

E- ¹

Ε- 1

u

1

Ε-

1

U 1

υ

1

< +

y

+

υ

+

y +

u

+

CL

y i ε

U 1 45

E-

1

σ*

u

1

—

U 1 60

u

1

< 1

y i

E—

1

Ε-

1

u

1

y i

< 1

<

1

υ

1

u

1

U i -o

U i «

<

1

—

u

1

—

< 1 44

u

1

CL

H ·

y ·

y

H

<r

y

H 1

Η 1

<

1

y

1

u i

o

1

oo

U 1 <-

< i ε

u

1

u

1

>

U 1 >-

u

1

03

< 1

H

1

E-

1

Η 1

1

+ 4= +

u

U + « u

+ tn u .

< + to

U I 44 □ I y · < I IE- I

Ü I < I > u +

U I U I cl

I

U · 44 Ε- I Ε- I U l <Ε— I u + y ¹ > U i

Q.

C

U u + f— u

Ευ U f—

E<

E(- + g

EU

EEU

U u

V)	V)		V->	VI
v>	ΜΊ	«η	«η	o-l
r*	00	Oh	©	F-l
ÍM	cq	04		cn
<	Q	u		H
O		H	O	O
H	O	H	u <
H	< u	E-	u
Ü u	Ε-	E-	<
<	E-	υ	<c	H
u	E-	u	E-	H
y	<	E-	<	y
<	y	E-	E-	u
u	<	H	H	H
u	u	U
u	E-	y	u u
H	E-	ű		<
H		Ε-	<	E-
U	U	υ	E-	E-

> u	1 Λ	<	1	U 1	u	U	E-	E-
H	1	y	1	U 1	E-	Ε-	<	E-
H		y		u ·	H	υ	U	U
CL E-	1 <*-	<	1 u	Ε— 1		U	u	H

u

U ΕΠΗ + u +

Ευ

H y

H g

u

Ευ u

E— +

I u

u g

«: + g

m

- < 1 Ό

U l

>

U 1

Η 1

< 1

00

U 1

Ε-

E-

<

E- ·

u ·

H

u ·

y ·

υ

u u

< 1

y ¹

·< 1

<

1

y ¹

< 1

·<

u

y

>. f- 1 —

< 1

CL

U

( ·—

U 1

00

O

Η 1

H

y

<

Ε— 1

y i

U 1

H

t

U 1

y ¹

Η 1

H

U

<c

y

<* 1

Ε- 1

U

1

y ¹

y i

Ε- 1

E-

u

<

w + —

+

E- +

<L>

E-

+ —

ű +

00

í +

Ό

y +

<

y

u

<< 1

<! i

U l

E-

1

U 1

U i

H

<

u

E—

E«?

U

E- I 60 y ¹ < I

U I to u +

EEEEC3 + u g

Ευ u u

EU E- +

H

Ε< Ε- Η H E- U Ευ u u

1 to	y	1 Ό	U 1 ω	< 1	>	Q	1 60		1 <u
1	<	1	y ¹	y i		<	1	u	1
1	y	1	¹	y '		y	1	y	1
<—1	u	• 00	< · CtJ	u	oo	u	• co		• σ·
1	H	1	y i	U 1		E-	l	y	1
1	E-	1		Ε- 1		H	1	E-	1
1 c	<		< 1 o	U 1	(Λ	Ε-	1 <-	y	1 Ό
1	y	1	1	y ¹		υ	1	<	1
+	<	+	u +	y +			+		+
i ε	H	1 >->	Ε- 1 44	U 1	00		1 tts		1 to

U

Ε— I U I E—

EE□

EU

H

U

w

<C i t-

á

1

4-»

<

1

<u

<

1

o

S- 1

w

y

1

<u

<

1

y ¹

1

u

1

y

1

<

1

u

1

y ¹

y

1

u

1

<

1

<? 1

u

1

u

1

03

< + 60

u

+

oo

H

+

σ'

u

+

4—

+

y

+

4-»

H

+

m

< 1

E-

1

y

1

y

1

<r |

<c

1

u

1

VI

U 1

1

<

1

<· 1

u

1

y

1

(50

4=!

Ο i σ'

u

1

<

1

>

u

1

V3

<f |

E-

1

CA

1

Ε- 1

<

1

y

1

Ε-

1

y ¹

y

1

y

1

u ·

<!

H

υ

u ·

<

Ε-

U 1 >

y

1

<u

H

1

4>

<r

1

Ε- 1

£

y

1

>

υ

1

U 1

Ε-

1

<

1

<f

1

y ¹

u

1

u

1

y ¹

υ

1

y

1

O 1

y

1

Ε-

1

(Λ

—·

U i o.

E-

1

(Λ

u

1

u

1

Λί

U 1

<d

1

i-t

υ

1

< H U y u h .

< u u u < < u u η u < h <C < u < < u Ε- Ε— Η < Η H U Η H Ü H < H U < < H < U <í H U < U < < U <ζ Η H OOU4UU Ű E- U U Ε- H o < y ε- Η H < U H <

U U Η H h h u u

U U E- H

U H < U e— e— u u y < u y h u u u < <

u u y ε- < y

E- E- E- u u <

y y η h < <

< < y ε- y y <UE-yUEH Η H U Η H u u u < < u

HU 220 464 Β1

I I á

c'^a5 &

Is >» <L> C .^i

5? .

n ti

Ό > N ^:Q cd ^4 °e « e '3 u c 33 ω ε -δ ^ϋ 8

S ” ^ö 00

O S •s ^Q “ c oö

Ί2 ’+ZT^>(ü c .t± o 3? cl w e cd S T3 g N N cd ⁷³öö.t± 8 3 3 — 00

\0	Ό	<Ο	χι
+	+	μ-	χι
C4 1	1	ι
υ	<	<	υ
υ		υ	υ
Η	Q	υ	υ
U	ζ5	ο	ο
δ	υ	Η	CJ
Η	Η	υ	Η
ο	Ο	υ	υ
υ	υ	υ	□
δ	ο	δ	Η
<	υ	<	υ

Η	Η	υ	ί—
<	Η	υ	U
δ	U	δ	Ο
υ	□	δ	Η
δ	υ	υ	υ
<	ο	υ	ο
ο	α	δ	Η
δ	<:	υ	Ο
δ	δ	ο	δ
Η	<	ο	Η
Η	υ	Η	υ

< < O < o u < o u u < δ

CL <u .& Έ

CL

-cd

Ό

5s in

-S’

QQ υ υ v o O < 3 H < u ű y ÜÜU < ÖÜUU Füi-S

SS s s u e- u u ocoo Ο H <c Ö H U O Ö UUÖU ο o u u Η Ο < O < < Q U δ υ δ u δ o u u Ο Η O H

XI		>η		XI	σ\	X)		χ>		χ>	<31
χ>		XI		ΧΊ		XI		XI		XI	—
		ΓΊ		m	4—1	U-		χ>		ο	<Ν
											^4-
Q	+	Η	+	Η	+ «		+	δ	+	<	+ 34
δ	1 00	Ο	1	δ	1	<2	1 34	<	I	δ	1
Η	1	υ	1 *-	υ	1	δ	1	δ	1 13	<:	1
Η	1	ο	1	Η	1 ^1/1	CJ	1		1	δ	1 ω
<	1 —	Η		CJ	1	υ	1 Β		1	<	1
Ο		<	ε	Ο		υ		<;	- 34	δ
υ	1	υ	1	υ	1 Β	Η	1	υ	1	δ	I 00
<	1 ***	ο	1	δ	1	υ	1	<	1	<	1
Η	1	Η	1	Η	1	δ	1	Ό	1 33	U	1
δ	1	Ο	1	<	1 β	δ	1	Η	1	δ	1 Β
δ	+ Μ	Η	+	Η	+	CJ	+ 1-4	<	+	<	+
Η	1	<	ι ε	<	1	υ	1		1 S3	υ	1
Η	1	U	1	<	1 C	δ	1	Η	1	δ	1 Β
υ	1	δ	1	υ	1	<		<	1	<	1
δ	1	Η	1 ο	δ	1	υ	1	δ	1 13	Η	1
δ		υ		Η	• ο	υ		<:		<	. —
Η	1 ο	Η	1	<	1	υ	1 Β	δ	1	ο	1
<	1	Η	1 Β	δ	1	υ	1	υ	1 —	Ε-	1
<	1	U	1	δ	1 ΟΧ)	ο	1	Ε-	1	δ	1 >
ο	1 ω	<	1	Η	1	ο	1 Β	Η	1	Η	1
Η	+	Η	+	Η	+	Η	+	Η	+ β	δ	+
<	1	C	1	Η	1 ^4-1	δ	1	Ε-	1
	1 C	υ	1	δ	1	δ	1 Ο	υ	1	δ	1
υ	1	<	1 **	Η	1	Η	1	δ	1 <β	<	1
υ	1	υ	1	Ο	] —	<	1	Η	1	δ	1 13
Η	• ΙΛ			δ		<2	• β	δ		Η
Η	1	υ	1 13	Η	1	δ	1		1 ^Μ	Η	1
Η	1	Η	1	υ	1 -=	δ	1	U	1	δ	1 >
Η	1 β	υ	1	δ	1	<	1 ^U	Η	1	Η	1
<	1	Η	1	Η			1	<	1 --4	U	1
U	+	ο	+	<	+ ε		+	Η	+	Η	+ <Λ
Η	1 x	<	1	Η	1	δ	1 ο	<	1	δ	1
<	1	ο	1 <3	<	1	δ	1	δ	1 13	Η	1
□	1		1	U	1 33	δ	1	U	1	C	ι ε
<	1 4-	<*	1	δ	1	Η	1 *	δ	1	δ	1
U			• 34	<		υ		δ	• 00	Η
υ	1	Η	1	υ	1 33	ο	1	Η	1	<	ι’ ε
<	1 **	U	1	υ	1	δ	1 ο	<	1	Η	1
Η	1	CJ	1 Β	Η	1	Η	1	Η	1 >4	Η	1
υ	1	<	1	δ	1 >	<	1	δ	1	ο
	+ Β	υ	+	Η	+	Η	+ >.	<	+	δ	+
	1	<		δ	1	<	1	U	1 33	<	1
<Γ	1	Η	1	<		Η	1	Η	1	Η	1 >4
Ο	1 ω	Η	1	Η	1	U	ί —¹	Η	1	δ	1
	1	δ	1 >	<	1	Η	1	δ	1 >	Η	1
		δ		δ	• 13	Η		<		<	• ε
<;	1 34	δ	1	δ	1	<	1 -44		1	υ	1
Η	1	δ	1 6β	Η		Η	1	υ	1 σ-	δ	1
Η	1	Η	1	<	ι ε	<	1	Η	ι	δ	1 00
Η	1 Β	U	1	U	1	<	ι c	Η	1	δ	1
<2	+	υ	+ Β	Ο	+	Ο	+	U	+ —	υ	+
δ	1	ο	1	<	1 4Λ	υ	1	U	1	δ	1 ο
<	1 >-	Η	1	ο	1	ο	1 <β	Η	1	Ε—	1
δ	1	<	ι ε	ο	1		1	δ	1 >	Η	1
<	1	U	1	ο	1 ο	<Γ	1	υ	1	<	1 —
<	• 34	δ		Η			• 34	Η		<
Η	1	υ	! =	δ	1	Η	1	Η	1 Β	Η	1
Η	1	Η	1	υ	1 1-4	<	1	δ	1	Ε-ι	I —
Ε—	1 Β	Η	1	Η	1	δ	1 13	<	1	Η	1
υ	1		1 --	CJ	1	<	1	Η	1 >4	U	1
Η	+	Η	+	δ	+ Β	υ	+		+	CJ	+ Β
ϋ	1 >		1	δ	1	<		•«ί	1	δ	1
Η	1	δ	1 Ό		1	Η	1		1 34	<	1
U	1	δ	1	<	1 34	δ	1	<_>	1	U	1 σ'
Η	[ 4Λ	Η	1	υ	1	Η	1 ο	δ	1	U	1
Η		υ	—	Η		Ο		<	- ΙΛ	Ο
Η	1	δ	1	Η	1 Β	δ	1	<2	1	U	1 Β
U	1 —	ο	1	U	1			δ	1	δ	1
<	1	ο	1 (β	<	1	<	1	δ	1 0Α	Η	1
Ο	1	Η	1	δ	1 Ό	υ	1	Η	1	Ο	1 >
υ	+ Β	Η	+	Η	+	δ	+ Μ	δ	+	Η	+
υ	1	Η	1 Β.	Η	1	<	1			δ	1
δ	1	Η	1	<		<	1	<*	1	υ	1 <4
<	1	<	1	δ	1	δ	1 <3	<ζ	1	<	1
<	1	δ	1 13	Η	1	Η	1	δ	1 <3	U	1
δ		<		δ	• >	<C		<		<	« -4-J
<	1 4-	υ	1	υ	1	δ	1 13	δ	1	υ	1
υ	1	Η	1 3)	Η	1	Η	1	δ	1 00	Η	1
Η	1	<	1	Η	1 Β	δ	1	<	1	U	1 —-
Η	1 Β	υ	1	Ο	1	Η	1 u	δ	1	Η	1
υ	+	δ	+ «	υ	+	Η	+	δ	+ 00	<	+
υ	1	Η	1	δ	1 <3	Η	1	Η	1	δ	1 33
□	1 Μ	<:	1		1	Η	1 Β	Η	1	<	1
δ	1	δ	1 13	<	1	δ	1	δ	1 >	Η	1
Η	1	Η	1	δ	1 Ο	δ	1	<	1	δ	1 >
υ	- -Η	Η		δ		Η	•	δ		ο
ο	1	Ο	1 —	<	1	δ	1	<	[ 4-	ο	1
δ	1	Η	1	δ	1 ω	<	1	υ	1	Η	1 ^Λ
Η	1 u	υ	1	Η	1	Η	1 >4	Η	1	δ	1
υ	1	υ	1 Β	<	1	Η	1	Η	1 Β	Η	1
ο	+	υ	+	δ	+ 13	δ	+	<	+	δ	+ >
<	1	υ	1	δ	1	<	1 4Λ	δ	1	U	1
ο	1	<		Η	1	<2	1	δ	1 00	δ	1
<3	1	υ	1	δ	1 >	δ	1	Η	1	δ	1 οο
<	1 ^1/3	Η	1	Η	1	δ	1 60	Η	1	Η	1
δ		δ	• >	υ		Η		δ	• >	υ
<	1	<	1	υ	1 Β	δ	1	Η	1	Η	1 33
ο	1 ο·	υ	1	δ	1	<		δ	1	υ	1
ο	1	Ο	1 Β	Η	1	U	1	δ	1 00	ο	1
Η	1	<	1	U	1 -=	υ	1	<	1	Η	1 ο

HU 220 464 Bl

V) in IQ •n m r- oo O'' o*\ V) in m ©

Ά <n •n in

O\ ir>

m

Tfr m m

•n

M•n •n »n n

in \o

© +		í-	+	< +
© 1		E-	1	© 1
© 1		E-	1 +l	< 1
© 1	bű	Ε-	1	Ε- 1
< 1		υ	1	O 1
© ·		<	- —	E— ·
Ε- 1	Vi	E-	1	© 1
© 1		E—	1	<2 ¹
0 1		©	1 >	¹
Ε- 1	>	E—	1	< 1	tí
© +		<1	+	E- +
q ¹		©	1 Ό	© 1
< ¹	>	f—	1	ί— 1	ü
< 1		E-	1	© 1
Η 1		©	1 >	ί- 1
q ·	44	©		<	ε
© 1		©	1	<r \|
< l		©	1 Cl	< l
Ε- 1	bű	©	1	© 1	<υ
f- 1		<	1	<2 ¹
t- +		©	+ 43	< +
< 1		<	1	© 1	σ
© 1		<	1	E- 1
q ¹		©	1 <L>	© 1
< 1	43	©	1	< 1	Vi
©		ί-		E- ·
Ε- 1		Ο	1 >	© 1
© 1	43	E-	1	Ε- 1	Vi
< 1		©	1	Ε- 1
q ¹		©	1 CL	<2 ¹
< +	w	©	+	<c +	w
© 1		<	1
© 1		H	1 >.	© 1
Ε- 1	43	©	1	© ί
© 1		E-	1	© i
<		E—	- tw	©
© 1	>	H	1	© 1	öű
·< 1		©	1	© 1
© 1		<2	1 «3	Ε- 1
< 1	J-H	<2	1	< 1	♦—
E- +		<	+	<2 +
© 1		©	1 CT	< 1
© 1	>>	<	1	© 1	43
© 1		©	1	© 1
Ε— 1		©	1 CL	© ¹
E- ·	cd	©		< ·	4-*
ί- 1		E-	1	© 1
© 1		©	1 —	<2 ’
Ε- 1	<4-1	©	1	Ö 1	ed
© 1		<	1	δ t
H +		©	+ σ-	+
< 1	>	©	ι	© 1	o
<2 ¹		©	1	<í 1
© 1		©	1 CL	<2 ¹
Η 1			1	$ '·	4-»
< 1			ι a	O 1
© 1	ε	©	1	< I	L-.
© 1		<	1	© !
Ε- 1		©	1 σ'	© 1
< +	ex	©	+	© +	bű
Ε- 1		©	1	< ¹
© 1		©	1 —	< 1
ί- 1	X	<!	1	© 1
< 1		<2	1	Ε- 1
<*		o	• 60	© '
<j 1	ε	E-	1	© 1	bű
l		H	1	ί— 1
© 1		<		© 1
< 1		©	1	< 1	4-»
h +		H	+	© +
		U	1 —>	Ε- 1
<2 ι	>%	<	1	ί- 1	u-
© 1		©	1	Ü 1
© ¹		<	1 ***	Ε- 1
© ·	σ’	ü		© ·	>
Ε- 1		©	1	Ε- 1
© 1		E-	1 z	O l
U 1	υ	©	1	Ε- 1	o
Ε- 1		<	1	< l
E- +		©	+ σ·	© +
Ε— 1	Vi	<	1	< 1	u
< 1		u	1	U 1
q ¹		©	1 60	U 1
<C 1	—	©	1	© ¹	cd
© ·				<c ·
Ε- 1			1 c	© 1
© 1	T3		1	© t	cd
Ü 1		<2	1	© í
t- ¹		<	1 —	Η 1
<c +	cd	<	+	© +
< 1		E—	1	< 1
© 1		<2	1 >	Ö ¹
Ε- 1	tí	<c	1	< 1	· —
© 1		©	1	Η 1
< ·		<	• L.	<
Ε- 1	>	©	1	© 1
Ό ¹		<	1	Ε- 1
< 1		E—	1 >.	© ¹
< 1	>		1	© 1	bű

<

&

EE—

E—

H © o H © + ©

E— o

«: ⁺

		+ +4	<	+	©	+	© + 60	©	+
	<r	1	©	1 u	<	1	Ε- 1	<Γ	1	L-
bű	<ζ	1	Ο	1	υ	1 σ·	υ ι	<Γ	1
	©	1 u	<	1	©	ι	Η 1 «		1
	<	1	©	1 υ	<	ι	Ε- 1	υ	1	σ*
σ	©		Ε-		υ	• σ'	Ε—	©
	<	1		1	υ	1	© 1 >		1
		1	©	1 +3	Ε-	1	© ¹	©	1	σ’
44	©	1	©	1	Η	1 L.	< 1	©	1
	©	1 CL	<	1	ο	1	© 1 σ'	<	1
	H	+	©	+ ο	υ	+	υ +	Ε-	+
CL		1	<	1	Ε-	1 ^Μ	© ¹	Η	1
		1 c	©	1	υ	1	Ο 1 60	Η	1
	H	1	©	1 Λ	Η	1	< 1	©	1	>
σ’	<	1	Ε-	1	Ε-	1 +-	© 1	Ε-	1
	H	• >>	©		Ε-		Ο · Ο.	Η
	©	1	©	1 60	©	1	< 1	Ε—	1	<Μ
σ’	<	1		1	©	1 (6	Η 1	©	1
	<	1 +4	<	1	<	1	Η 1 -	<	1
	©	1	©	1 υ	©	1	© I	<	1	44
ε	<c	+	<	+	<	+ -	Η +	υ	+
	©	1 Λ	©	1	υ	1	Η 1 -	©	1
	o	1	<	1 —	©	1	© ¹	<	1	Vi
	H	1	©	1	<	1 Μ	< 1	©	1
	Ü	1 >	©	1	©	1	Η 1 >>	<	1
	H		©	• C6	<		© ·	©		Ό
cd	<	1	©	1	©	1 u	ί— 1	Ε-	1
	©	1 43	<C	1	Ε-	1	Ο 1 >	Η	1
	E-	1	©	1 Ό	υ	1	< ι	Η	1	<4-.
Vi	H	1	Η	1	©	1 C6	© ¹	ί-	1
	©	+ >	©	+	<	+	Ο + 60	Ο	+
	E-	1	Η	1 3	©	1	Ε- 1	Ε-	1	Vi
44	<	1	©	1	ο	1 CL	υ ι	υ	1
	©	1 T3	©	1	Ö	1	© 1 CL	<Γ	1
		1	©	1 —	Ö	1	© ¹	<	1	£
<υ			Η		<	• L.	<5 ·	·<;
		I υ	©	1	©	1	Ε- 1 %	©	1
	Q	1	Ο	1 60	Ε-	1	© 1	©	1	bű
44	δ	1	Η	1	υ	1 —	< 1	ί-	1
	<*	1 —	Ε-	1	Ε-	1	© 1 Ό		1
	<*	+	υ	+ —	υ	+	© -Ι-	©	+	Ό
t3	<·	1	©	1		1 ^w	Ε- 1	©	1
	©	1 υ		1		1	© 1 -	©	1
	<	1	©	1 Ό	υ	1	¹	Ε-	1	£
u	©	1	©	1	Η	1 ^Μ	< 1	Ε-	1
	©	• 60			©		ο · ω	Ε-
	<	1	<*	1 L4	<	1	¹	©	1	>
cd	Ε-	1	<Γ	1	©	1 ω	< 1	Ε—	1
	υ	1 —		1	<	1	Ο ι ω	<C	1
	©	1		1 34	Ε-	1	«5 ¹	©	1	43
<0	H	+	©	+	υ	+ —		©	+
	©	1 —	<	1	©	1	© 1 U	<:	1
	©	1	©	ι σ·	<	1	Ο 1	Ο	1	Ό
44	<d	1	©	1	υ	1 σ'	Ε- 1	ί-	1
		1 +4	Η	1	©	1	© 1 >	©	1
	©		©	• >	<		Ε- ·	©		bű
43	©	1	©	1	υ	1 +3	< 1	<	1
	H	1 ^M	Η	1	υ	1	υ ι 43	©	1
	H	1	©	1 >	Η	1	© ι	<	1	ι-*
43	Ε-	1	©	1	Ε-	1	Ε- 1	©	1
	υ	+ —		+	<:	+	Ε- + <=	<	+
	o	1		1 C	©	1	Ε— 1	υ	1	43
bű	H	1		1	<	1 —	< 1	υ	1
	U	1 —	©	1	©	1	Ο 1 -σ	Ε-	1
	<	1	Ο	1 Λ	<	1	< ι	Η	1	<+-.
43	©		Η		©	• 43	© ·	Ε—
	H	1 ^M	Ε-	1	©	1	© I t>0	Η	1
		1	<d		ε—	1	<C ι	<d	1
ε	<	1	©	1	<	1 —	© I	Ο	1
	Ε-	1 >.		1	©	1	Ε- 1 «	ί-	1
	υ	+	©	+ Ο	©	+	υ +	Ο	+
ε	H	1	Η	1	<	1 —	υ ι	<	1
	H	1 6-	©	1	©	1	© ι &	Ε-	1
	E-	1	©	1 σ!	-<	1	¹	υ	1	—
>	<C	1	<	1	©	1 Ό	< ι	υ	1
	©	• Ό	ί-		<		ο · ο
	H	1	©	1 >	©	1	< 1	<	1	Ű
ε		1	Ο	1	<	1 —	υ ι	Η	1
	©	1 60	Η	1	υ	1	© 1 CL	<	1
	©	1	©	1 ’—¹	Ε—	1	«5 ¹	<3	1	C
Ό	<	+	©	+	©	+ >	< +	©	+
	©	1 σ'	<	1	<	1	© 1 ω	<	1
	©	1	©	1 Ό	Ε-	1	© 1	<	1	44
CL	<C	1	<	1	υ	1 —	Ο ί	Ε-	1
	©	1 ω	©	1	©	1	Ε- 1 ί	υ	1
	<		Η	• (Λ	Ε-		Ε- ·	Ε-		VI
44	H	1	©	1	<		© 1	Η	1
	H	1 —'	©	1	Η	1	υ ι &	<	1
	<	1	Ο	1 60	υ	1	© ι	©	1	σ
>	E-	1	Ε-	1	©	1 «β	© ¹	Ο	1
	©	+ >	υ	+	Ε-	+	© + 60	Ε-	+
	<	1	Ε-	1	<	1	¹	υ	1	—
ex	<	1	<	1		1 C3	< I	©	1
	©	1 ο	<	1	Η	1	© 1 Ο	υ	1
	<	1	©	1 ω	©	1	© 1	©	1	cd
•-M	·<		<		Ο	• 60	© ·	Ο
	©	1 υ	©	1	©	1	© 1 60	Ε-	1
	O	1	<	1 —*	ο	1	Η 1	©	1	>
CL	<	1	©	1	Η	1 ϊ	© 1	©	1
	©	1 ω	<	1		1	© 1 CL	Ο	1

ros ι—· ι/Ί ι/Ί

Os

HU 220 464 B1

AGGTCTTGGGCCAATTGAAGAAGACACCATCCTGGTCATTGACCCAAATAATGCTGAAATCCTCCAGTCCAGTGGCAAGAACCTGTTTTATTTACCACAC

44	Η 1	<
	Hl— U
	U 1	H
O.	H ·	y
	U 1 — H
	Η 1	y
—	U l	y
	U 1	X H
	u +	H

m

Γ4

rq

<N

cq

y

+

<3

+

44

<3 +

H

+

H

+

Vi

H

+ .

<3

1

y

1

Η 1 >.

y

1

y

1

<3

ι ε

U

1

cr

y

1

Η 1

u

1 c+

u

1

y

1

y

1

<3

1

4->

y ι

y

1

y

1

«Μ

1

y

1

y

1

y ι o.

H

1

<3

1 44

y

ÖŰ

<3

y ·

<3

'· ε

<3

y

<3

1

y

1

< 1

y

1

U

1

44

<3

1

y

1

H

1

<3 1 44

<3

1

y

1

y

1 σ'

y

1

Cl

y

1

y ι

y

1 Ό

1

y

1

H H + + &£>

y l

y

1

<

1

< ι

y

1

H

1

<4-+

Η 1

<

1

Ö l

öű

H

1

H

1

<3 1 44

1

y

1

<J 1

ε

<

1

< ¹

□

1

>

u

1

y ι

<r

ι c

<

1

<J Ϊ

y

1 o

¢+-

< 1

H

1

y

1

Cl

H 1

1

Ό

1

43

<r |

1

y ·

o

U

H

H · <*-

H

<3

44

y

1

y ι

O

1 >

1

<r 1

H

1 «

—1

<[ 1

<3

1

<

1

tZJ

y I

y

1

<

1

44

|

u

1

|

44

y

1

y

1

Η 1 o

y

1

y

1

y ι

O

y

1

U 1

O

1

ÖO

y

1

< ¹

y

1 ce

y

1

Η 1

H

1 «,

C

y +

H

+

Vi

< +

H

+

y

+

u

y +

y

+

< 1

Vi

O

1

<

1

y 1 CT

H

1

<

1

<3 1

+»*

y

1

Η l

<

1

·++

y

1

y ι

H

1 6-,

H

1

y ι

<

1 —

44

< 1

H

1

y

1

öű

Η 1

u

1

y

1

>

H 1

y

1

U 1

43

y

1

H

1

< ι -

H

1

<

1

y ι

—

y

1

y

<

(Λ

u

< ·

U

• —<

u

y ·

y

• Q.

ÖŰ

U 1

u

1

H

1

(Z5

O l

y

1

y

1

CL

y ¹

<r

1

U 1

o.

y

1

y

1

U 1 H

H

1

< 1

4-<

1

y 1

y

1

CL

y

1

U 1

H

1 ««

<

1

U 1

1 44

M

c ι

3

1

H

1

Vi

y ι

H

1

<

1

44

Η 1

y

1

Ö +

<

+

Ö + 00

3

+

y

+

H +

«++

+

υ ι

3

1

<U

<

1

H 1

y

1 60

H

1

y ι

<

1 c

i

H

O

H

U δ

<3

H

1

H

1

<

1

i-l

<

1

<

1

y

1 >

•s 1

y +

y

+

y

+

H

+ >.

H

+

u

+

<3 + 44

·—

H

1

H

1

H

1 £

<3

1

<

1

<

1 —

y

1

y ι

3

1 >

<

1

Ό

y

1

H

1

y ι

y

1

y

1 Ό

<

1

<3

1

H

1 ™

H

1

y

1

y ι o.

<υ

c

1

y

1

y

1 σ'

o

1

H

1

<:

1 —

1

5 ¹

y

σ'

y

aj

H

-<

• c

<

y

1

<3

y

l

£5

1

<

1 —

<3

1

<3

1

y ι «

«j

<C

1

y

1

<3

1

y

1

y

1 <υ

y

1

Η 1

y

1 43

y

1

y

1

ü

1

>

y

1

y

1

1 —

Η 1

y

1

y

1 O.

H

1

H

1

y

1 a

y

1

y

1

y ι >

c

H

+

y + >

y +

H

+

y

+ 60

< +

H +

y

1 —

<C

1

y

1

H

1

O

H

1

H

1

y

1 43

Η 1

H

1

u

1 σ'

H

1

y

1

H

1 ‘ti

1

<

1

y ι >

ö

y

1

y

1

H

1 <41

H

1

y

1

<

1 ΪΛ

y

1

< 1

3

1 ee

y

1

y

1

H

1

H

1

y

1

y

1 C6

U 1

y

H

• Q

y

• >

y

U · tü

a.

H

1

y

1

<3

1 44

1

H

1

H

1 ^M

<

1

y ¹

y

1 >

H

1

<3

1

y

1

cr

<

1

H

1

y

1 Ό

£ ¹

H

1

H

1

y

1

y

1

<

1 <3

H

1

<

1

y 1 ω

Ό

<

1

H

1

y

1 60

<3

1

y

1

H

1 «Μ

y

1

υ ι

y

+ -α

<

+

y

+

y

+

Ό

Q

+

y

+

y

+ 60

y +

ι

y

1 43

1

y

1

<

1

<

1

H

1

y ι <s

·—

y

ι

H

1

<

1 m

H

1

<3

1

<3

1 c

H

1

|

c

1 ^w

1

H

1

y

1

<

<7 |

y

1

<r

1 c

y

1

H

1

y

1 60

H

y

1

< 1 44

>

H

y

• e.

<

H

<c

• ε

<

u ·

y

1 >

1

<

1

y

1

43

H

1

y

1

H

1 >>

Η 1

y

1

u

ι σ'

y

1

H

1

H

1 ‘t-i

H

1

y

1

1 ·-<

—

y

1

y

1

H

1 <λ

y

1

<

1

y

1 >

H

1

ι

H

1 5

<

1

H

1

y

1

Cl

y

1

H

1

y

1 >

<, 1

+ ω

<

1

H

1

H

1 '4—1

H

1

<3

1

H

1

y

1

y

1

H

1 >>

y

1

y

1

y

1 >

y

1

<3

1

<3

1

<

1

H

1

Vi

<c

1

H

1

y

1 C3

y

1

y

ι σ'

w

1

y

ι σ

H

1

y

1

y

1 60

f5

1

y

1

• β

y

•

<

- 00

H

1

y

1

Öű

H

1

y

1

u

1 43

<

1

H

1

y

l >

T3

Q

1

H

1

y

1 >

y

1

y

1

y

1 σ'

<3

1

<

1

ű

1 60

u

1

H

1

y

1 te

<

1

y

1

y

1 Ό

<3

1

H

1

y

1

a.

H

1

y

1

<

1 44

H

1

<

1

y

1 o

υ

<c +

<

+

<3

+ —

H

+

H

+

y

+ >

<

+

H

+

y

1 Ό

<

1

y

1

H

1 —

H

1

u

1

y

1 u

H

1

y

1

O“

y

1

H

1

<3

1 ·—

u

1

H

1

<

1 —

o

y

1

y

1

y

1

y

1

y

1

u

I ο-

y

1

y

1

<

H

1

H

1

<3

1

<3

1

y

ι

H

1

y

1

H

ε

y

• ω

<3

H

y

• 00

-,-

<3

1

y

1

<3

1

<3

1

<3

1

y

1 u

y

1

H

1

y

1 Ό

y

1

y

1

y

1 43

y

1

<

1

y

1 aj

o

1

<

1

<3

1

Vi

<

1

H

1

<3

1 ^u

1

y

1

ö

1 <3

H

1

y

1

<

1 c

y

1

y

1

y

l σ·

H

1

<

+ —

y

+

H

+

y

+ CX

H

+

y

+

y

+ >

+

y

1

<

1

l—

y

1

H

1

y

1 >

<3

ι

H

1

<c

1 44

öű

y

1

<

1

H

1 σ

H

1

H

1

y

ι ·σ

H

1

<c

1

<

1 ^w

1

y

1

y

1 >

H

1

<:

1

<3

1 ·—

1

y

1

y

1

ÖŰ

<;

1

H

1

H

1 'i

y

ι

H

1

1 44

—

H

y

H

• >>

y

<

y

• 00

<3

u

H

1 ’—¹

H

1

H

1

<3

1

<3

1

H

1

y

1 Ό

1

y

1

u

1

—

y

1

y

1

y

1 ω

H

1

H

1

1 >

ÖŰ

y

1

H

1

y

1 60

H

1

<

1

H

1 <*-

<3

1

<

1

y

1 60

H

1

y

1

H

1

<

1

y

1

y

1 43

U

1

GCAAGAGAAACAGAAACTGAGCACAGAGCCCGGCTCGGGAGTGTCCGTGGTTCTCATTACAACCCTTCTGGTTATTCCTGTGCTGGTCCTGCTGGCCATT 26 5 5

HU 220 464 Bl (S

Ü + ÖJO <

H U υ E- + bű bű

Ευ

E- + “ EU ES ₊

Ε<n

M·

Oi n

E- +

H

O

E— +

E— ' §

H U

EEΕυ υ E<? υ + εο Ευ O U υ

«: υ

E□

U + λ bO bO υ Ε- + § υ

c +	< +		υ
< 1	υ ι
0 1	υ ι	ÖŰ	Η
ο i	< ¹		0
E- l £	< 1		<
<3 ·	υ ·	ο
O l	< 1		Η
υ i -	υ ι		<
H 1	< ¹	(μ
Ε- 1	< 1		ο
< + —	υ +		<
Ε- 1	< ¹	«Μ	υ
Ε- 1	< ¹		Ε-
Ε- 1	υ ι		υ
υ i	υ ι	&0	Η
r-¹ ·	< ·		υ
< ι ε	υ ι		υ
υ ι	υ ι		υ
H I	< 1		υ
υ ι >	υ ι		<

Ahogyan itt alkalmazzuk, a „szigorú körülmények” 2xSSC-t (0,3 mol/1 nátrium-klorid és 0,03 mol/1 nátrium-citrát) jelentenek 62 °C hőmérsékleten.

A jelen találmány továbbá kifejezővektorokat nyújt 5 alfa-amidáló enzim kifejezésének irányítására mind prokarióta, mind eukarióta rendszerekben. így például olyan kifejező vektort állítunk elő, amely egy prokarióta gazdasejtben képes egy alfa-amidáló enzim polipeptidszekvenciája kifejezésének irányítására, ahol az említett vektor egy transzkripciós promotort tartalmaz, amelyet lefelé egy amidáló enzimet kódoló területtel bíró első DNS-szekvencia követ, ahol az említett első szekvencia megfelelően homológ a természetes amidáló enzimet kifejező természetes DNS-szekvenciával az említett természetes szekvenciával szigorú körülmények közt végzett hibridizálás alapján, és ahol az említett első szekvencia egy beindító metionin kodont is foglal magában az említett enzimet kódoló tartomány rajtjától számítva mintegy 50 nukleotidon belül.

A jelen találmány egy még további kiviteli módjában olyan kifejezővektort állítunk elő, amely egy alfaamidáló enzim polipeptidszekvenciája kifejezésének irányítására képes valamely eukarióta gazdasejtben, ahol az említett vektor egy transzkripciós promotort tartal25 máz, amelyet lefelé egy amidáló enzimet kódoló területtel bíró első DNS-szekvencia követ, ahol az említett első szekvencia megfelelően homológ a természetes amidáló enzimet kifejező természetes DNS-szekvenciával az említett természetes szekvenciával szigorú körülmények közt végzett hibridizálás alapján, és ahol az említett első szekvencia egy stopkodont is tartalmaz egy olyan szekvenciától lefelé, amely egyébként egy membránon átívelő tartományt kódolna.

Ezt az első szekvenciát egy olyan szekvenciának kell követnie, amely megszabja a poli-A hozzáadását az említett promotorból való transzkripcióval kialakított hírvivő RNS-hez.

Ahogyan itt használjuk, a,,membránon átívelő tartomány” kifejezés egy olyan DNS-szekvencia, amely, amint ezt Kyte és Doolittle vizsgálatával meghatározzuk [J. Mól. Bioi., 157, 105-132 (1982), ennek teljes leírása referenciaként beépül a jelen bejelentésbe], egy, a membránhoz való rögzítésre megfelelő hidrofobicitású, hosszúságú, szerkezeti jellegű stb. aminosavszek45 venciát kódol. így ez történhet például úgy, hogy egy fehérje szintetizálódik egy membránhoz kötött riboszómán, vagy egy másik eljárás szerint egy, a membránon átívelő tartomány által kódolt aminosavszekvencia társul a fehérje más területeivel, és annak részévé válik, így az ilyen szekvencia transzláció után beiktathatóvá válik a membrán hidrofób környezetébe. A membránon átívelő tartományokat részletesen tárgyalja az alábbi szakkönyv: Von Heijne: Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Szek55 venciaelemzés a molekuláris biológiában: talált kincs vagy köznapi tevékenység) 81-121. oldal (Academic Press, 1987); ennek kitanítását referenciaként építjük be a jelen bejelentésbe.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt áb60 rákat.

HU 220 464 BI

Az 1. ábra az alfa-amidáló enzimet kódoló emlős kifejezővektor megalkotásának folyamatábrája.

A 2. ábra az alfa-amidáló enzimet kódoló prokarióta kifejezővektor megalkotásának folyamatábrája.

A 3. ábra a jelölt plazmidokat (amelyek az 1. példában ismertetett jellemzőkkel bírnak) hordozó E. coli JM 105-ből származó oldhatatlan fehérje Coomassie Blue-val festett SDS-PAGE elektroforetogramja, ahol a nevezett törzset IPTG-nek a növesztő tápközeghez való hozzáadásával (+) vagy a nélkül (-) tenyésztjük (C=a pKK233-2-t hordozó E. coli JM105 oldhatatlan fehérjéje).

A 4. ábra a 3. ábrán bemutatott gél Westem-folt elemzése, miután a fehérjét átvittük nitrocellulózra. A nitrocellulóz szűrőt nyúl anti-AE antiszérummal és alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl Ig-vel kezeljük, majd valamely kromogén szubsztrátummal kezeljük, amely az alkalikus foszfatázra fajlagos.

Az 5. ábra a pSU₂-dhfr, valamint a pAE68 plazmid térképét mutatja, amely utóbb az α-amidáló enzim oldható formáját kódolja.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány előnyös kiviteli módjait.

A jelen találmány szerinti prokarióta rendszerekhez alkalmas kifejezővektorokat és eukarióta rendszerekhez alkalmas kifejezővektorokat állítunk elő. Az ezekben a vektorokban alkalmas, amidáló enzimet kódoló DNS-t az alább ismertetett módon izolálhatjuk. Alfa-amidáló enzimeket izolálunk patkányvelő tiroid karcinómaszövetből vagy egy patkánysejtvonalból származó kondicionált szövetből vagy egy patkánysejtvonalból származó kondicionált tápközegben és homogenitásig tisztítjuk, amint ez a 655,366 számon 1984. szeptember 27-én benyújtott bejelentsében (ez később 4,708,934 számon kapott USA-szabadalmat) le van írva. Az aminosavszekvenciákat meghatározzuk a tisztított alfa-amidáló enzimnél, és ezeket a szekvenciákat alkalmazzuk egy sor oligonukleotidvizsgáló minta tervezéséhez, amelyeket radioaktívan jelzünk és felhasználjuk cDNS-ek izolálására amidáló enzimekhez.

Az izolált cDNS-eket azután olyan könyvtárak átvizsgálására alkalmazzuk, amelyeket például patkányvelő tiroid karcinómaszövetek, az ezekből származó sejtvonalak vagy olyan sejtvonalak teljes RNS-éből állítunk elő, amelyekről ismeretes, hogy termelnek amidáló enzimet; ilyen például az IVI10028 számon deponált sejtvonal (In Vitro International, Linthicum, Maryland) (patkány MTC szövet) vagy ennek származéka, az IVI 10029 sejtvonal. A teljes RNS-t poli-A RNSként állítjuk elő, és a poli-A RNS-t oligo-dT cellulózzal szelektáljuk.

Jól ismert eljárásokkal cDNS-eket állítunk elő, először reverz transzkriptázt alkalmazva, majd DNS-polimerázt. A cDNS-t cDNS-könyvtárak kialakítására használjuk fel a Xgt 11 vektorban, és a rekombináns DNSeket in vitro „becsomagoljuk”, hogy fertőző bakteriofág-részecskéket képezzenek.

A „becsomagolás”-hoz alkalmas kivonatok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők a Promega Biotechtől vagy a Clontech Laboratories-től, vagy a szakterületen jól ismert eljárásokkal állíthatók elő. A fágot radioaktívan jelzett oligonukleotidvizsgáló mintákkal vizsgáljuk át, amint fentebb ismertettük. Az alfa-amidáló enzim cDNS-t („AE cDNS”) tartalmazó bakteriofág átvizsgálását a bakteriofág mintáinak szélesztésével és a fágnak nitro-cellulóz-lemezekre való átvitelével hajtjuk végre. A hibridizálás két vagy több, radioaktívan jelzett AE-fajlagos oligonukleotidvizsgáló mintával fajlagosságot biztosít.

A fentebb azonosított IVI 10029 számon deponált biológiai törzsből készített könyvtárak átvizsgálására különösen előnyösek az alábbi táblázatban megadott AE4, AE5, AE8 és AE9 számú oligonukleotidpróbák. A táblázat az összes olyan lehetséges génszekvenciát tartalmazza, amelyek egy alfa-amidáló enzim megfelelő kiválasztott régiójának megfelelnek. A tervezett szekvenciák alatt vannak megadva a génnel komplementer oligonukleotidpróbák, amelyek a cDNS azonosítására és izolálására alkalmazhatók.

Aminosav-

szám 1 2

3

4

5

6 7

8

9 10

11 12

13

14

15

16

17

18

Szekvencia Ser Phe

Ser

As n

Glu

Cys Leu

Gly

Thr Ile

Gly Pro

Va 1

Thr

Pro

Leu

Asp

Al a

5 ’ Tervezett TCC TTC génszek-

TCC

AAT

GAG

TGC CTG

GGC

ACC ATT

GGC CCT

GTG

ACC

CCC

CTG

GAT

GCC

vencia AGT T

AGT

C

A

TTT

A

T C

A A

C

T

T T

C

T

A

G

A A

G C

T

A

G

C

T

G

T G

A

G

C

G

3 ’

5

Oligonukleotidpróba

TTA

CTC

ACG GAC

CCG

TGG TAA

CCG GGA

CAC

TGG

GGG

GAC

CTA

CG

AE1

3 ’

T

G

5

Oligonukleotidpróba

AC

CCG

TGG TAA

CCG GGA

CAC

TG

AE8

I

I I

I

Aminosavszám 19

20

21

22

23 24

25

26 27

28

Szekvencia Ser Asp Phe Alá Leu Asp Ile Arg Met Pro

HU 220 464 Bl

Tervezett génszekvencia AGC G

TCT GAC TTT GCC CTG GAC ATC CGG ATG CCT

TTT A A

TAA A C

T

Aminosavszám 123456789 Szekvencia Asn Gly Gin Trp Thr Leu I le Gly Arg

Tervezett génszekvencia

AAT GGC CAG TGG ACC CTG ATT GGC CGG

TTC A T G G

AAA G C T T

Oligonukleotid- 3 ’ 5 ’ próba TTA CCG GTC ACC TG

AE4 GTT

Oligonukleotid- 3 ’ 5 próba TTA CCG GTC ACC TG

AE5 GAT

Aminosavszám Szekvencia

1 Ser

2 Me t

3 Gin

4 Pro

5 Gly

6 Se r

7 As p

8 Gin

9 Asn

10 Hi s

11 Phe

12 Ser

13 Gin

14 Pro

15 Thr

5

*

3’

Tervezett

TCC

ATG

CAG

CCT

GGC

TCT

GAC

CAG

AAC

CAC

TTC

TCC

CAG

CCC

ACT

génszekvencia

AGT

A

AGC

T

A

T

AGT

A

T

A

C

G

A

C

G

T

G

Oligonukleotid-

3 ’

5

próba

TAC

GTC

GGI

CCI

ÁGI

CTG

GTC

TT

AE6

T

A

T

Oligonukleotid-

3 ’

5 ’

próba

TAC

GTC

GGI

CCI

TCA

CTG

GTC

TT

AE7

T

G

A

T

Oligonukleotid-

3

»

5

próba

CTG

GTC

TTG

GTG

AA

AE10

A

Oligonukleotid-

3’

5 ’

pr óba

CTG

GTT

TTG

GTG

AA

ΑΕΙ 1

A

Aminosavszám

1

2

3

4

5

6

7

Szekvencia

Phe

Val

Thr

Gin

Trp

» Gly

Glu

Tervezett génszekvencia

5’ 3'

TTT GTG ACC CAG TGG GGA GAG

Oligonukleotid- 3 ’ 5 ’ próba AAA CAC TGC GTC ACC CCC CT

AE9 G I I Τ I

A több bakteriofágból izolált AE cDNS-ek elemzése a fenti oligonukleotid-hibridizálásos átvizsgálási eljárásokkal azt jelzi, hogy a cDNS-ek sokféle elkülönült típussá választhatók szét. Az egyik típusnak a szerkezetét az alábbiakban úgy adjuk meg, mint „A” típust, ahol a nukleotidok számozása az 1. bázissal kezdődik, amely a kezdő metionin kodonjának első bázisa. Az alábbiakban megadjuk ennek nukleotidszekvenciáját, valamint az egybetűs aminosavkódot azokra az aminosavakra, amelyek a gén transzlációja után fehérjeként megjelennek. A zárójelben levő számok a sorok végén az amino60 savak számát jelzik.

HU 220 464 Bl

GGGATGCTGCCAGTGGGACCAGGTTCCGAATGATGACTGCGCGGGTCTGCGCGATAGCCCTCACAGCCCCTGGCATTGCGAGCGATAAGGACCCTGCTCC - 2 4 6 TCCAGCCCTGTGGCTGCCACCGGCTCTGGCCGCTCTGGAGGGCGGGCGGCTCCAGCGGGCGGGCGGAGCGGACTCCAGAGCCGCTTCCCACGCGTCGGGA -14 6 GCGGACGGAGCGGACCCGGCTGGCCGCGCATCGCCCTCGCCCGGGGCCATGAAGTAGCTGCCGCCAGCCCTGCCATCCCGCCGGCCCGCCAGCCCTGCCA - 4 6 TCCCGCCGGCCCGGCCACTGCCCGCTGCCCTGGTCCTGCGCGGACATGGCCGGACGCGCCCGCAGCGGTCTGCTACTGCTGCTGCTGGGGCTGCTCGCCC 5 5

	Ch	in		«ΖΊ			«1		σ\	in		in			<n	σι	>n		in
	,—t	in		in			m			<n		<n			m	<—*	in		>n
				Γ4			m		1—			in				ΓΊ	r-~		oo

+	—	O +		0	+		0	+	05	<	+	q	+		<	+	q +		0	+
1		0 1	bű	0	1		0	1		<	1	-<	1		q	1	0 1	bű	0	1
1		Η 1		0	1	k-	0	1		0	1	0	1	T3		1	0 1		0	1 6-
1		0 1		0	1		0	1	05	0	1		1		q	1 ω	q ¹		0	1
1		< 1		0	1		0	1		0	1 0	<	1		<!	1	< 1	05	0	1
		0 ·		<		B	0			0				X	q		0 ·		<	. —
1		0 1		0	1		0	1	CL	0	1	q	1		q	1 60	0 1		0	1
1		< 1		0	1		0	1		0	1	<	1		<	1	q ¹	>	0	1
1		0 1		0	1	05	0	\|		q	1	0	1	X	0	1	0 1		0	1 >
1		0 1		0	1		<c	1	ε	o	1	0	1		q	1 o-	0 1		0	1
+		0 +	bű	0	+		0	+		u	+ >-	<	+			+	q +	>		+
1		Η 1			1	ε	<	\|		0	1		1	c	0	1	q ¹		o	1 Ό
1	bű	0 1		0	1			\|	C	0	1	0	1		q	1 Ο-	¹		0	1
1		υ i		0	1		0	1					1		<	Ι	< 1	X	0	1
1		0 1		0	1	CJ	0	1		0	1	q	1	Ό	0	1	0 1		0	1 >
		0 ·		0			0		G>	0		<í			c	- -w	q ·		0
1		Η 1	4-»	0	1			1		0	1 0	0	1		0	1	q ¹	bű	0	1
1		< ¹		0	1	G—	q	1		0	1	0	1	k-	0	1	< 1		0	1 o.
1		< 1		0	1		0	1	bű	0	1	0	1		0	1 >	0 1		0	1
1		0 1	<υ	<	1		0	1		0	1 0	0	1		0	1	0 1		<	1
+		0 +		0	+		0	+		0	+	0	+	<+-.	q	+	0 +		0	+ 45
1		<(. 1		<c	1		0	1		0	1	0	I				< 1			1
1		< 1	c	0	\|		0	1		0	1 «	0	1		q	1	0 1	X		1
1		0 1		<	\|		0	1		0	1	0	1	rt	-<	1	q ¹		q	1 o
1		0 1		0	\|		0	1	—		1	0	1		0	1 T3	< 1		0	1
		0 ·	05				0				• c	q			0		0 ·	X	0
1		0 1		0	\|	Ό	0	1			1		1	05	0	1	0 1		0	1 >
1		0 1		0	1		0	1	—	ö	1	0	1		0	1 >	q ¹		0	1
1		0 1	G-.	0	1		0	1		<	I	0	1		0	1		-4—>	0	1
1		< 1		0	1	05	0	1			1	<	1		0	1	q ¹		0	1 o.
+		0 +		q	+		<	+	ε	0	+	0	+		0	+ «	< +		0	+
1		0 1	05		1		0	1		0	1 te	·<	1		0	1	0 1	X	<	1
1		< 1		0	1	O	<	1		0	1	o	1	Ό	0	1	0 1		0	1 >>
1	bű	□ 1			1		0	1	X!	0	1	0	1			1 B	0 1		0	1
1		< 1	k-		1		q	1		0	1 &	q	1		0	1	q ¹	>	0	1
		0 ·				X	<			0		0		bű	0		< ·		0	• «4—1
1		0 1		0	1		0	]	X	0	1	0	1		<c	l' B	q ¹		0	1
1		< 1	*-	0	1		0	1		0	1 te	<	1		0	1		k-	0	1
1		0 1		0	1	ex	0	1		0	1	0	1	>>	0	1	q ¹		q	1 te
1	k-,	0 1			1		0	1	>	<	1	q	1		0	1	< 1		q	1
+			-w	0	+		0	+		0	+	<	+		q	+	0 +	X		+
1		•rf I			1		0	\|		<	1	0	1	X	<	1	0 1		0	1 CT
1	Λ	<j 1		0	1		<	\|	-4-»	0	1	0	1		0	1 >>	0 1		<	1
1		q i	<U	0	1		0	1		0	1 —“	0	1		0	1	0 1	«3	0	1
1					1	>	<	\|		0	1	q	1	>	0		0 1		0	1 0
	k.	<!		0			q		XJ	0						• B	0 ·		0
1		l	X	0	1		0	1			1 ··		1		0	1	0 1	G-.	0	1
1		0 1		0	1	bű	0	\|		0	1	0	1	er	q	1	0 1		0	1
1	bű	0 1		0	1		<	1	ε	<	1	0	1		q	1 60	0 1		q	1
1		0 1	G—·	0	1		0	\|			I a	0	1		0	1	0 1	>	<	1
+		q +		0	+	ex	0	+		0	+	0	+	—	0	+	0 +		0	+ σ-
1	o3	0 1		0	1		<	1	05	q	1	0	1		0	1 te	< 1		0	ι
1		< 1	I_	0	1		0	1		0	1 ra	0	1		0	1	0 1	X	0	1
1		0 l		<	1	ε	0	1			1	0	1	>	0	1	0 1		0	1 0
1	s	< 1		0	1		0	1	03	<r	1	0	1		<	1 ·—	0 1		0	1
		< ·	X	0			0				•	0						ε
1		0 1		0	1	k-l	0	1		0	1	0	1	<+-	0	1	< 1		<3	1 o
1		0 1		0	1		0	1	u	<	1	q	1		0	1 -—¹	0 1		q	1
1		0 1		0	1		0	1		q	1 Ό	<	1		0	1	0 1	Ct		1
1		0 1		<	1	· —	0	1			1	0	1	>*	0	1	0 1		0	1 σ·
+		0 +		0	+		0	+	ex	0	+		+		q	+ O.	< +		0	+
1		0 1	>		1		0	1		<			1		q	1	0 1	X	0	1
1		Η 1		q	\|	T3	<	1		0	1	<ζ	1	X		1	0 1		q	1 *—
1		0 1		0	1			1	X	0	1	0	1		0	1 0	0 1		<	1
1		Η 1	05	0	1		0	1		0	1 u	q	1		0	1	1	ε	0	1
		0 ·		0		—	0			0		<		05	0		·«£		0	60
1		0 1		0	\|		0	1	q-	0	1	<!	1		0	1 Ο-	□ '		0	1
1		Ό 1		0	\|		0	1				q	I		0	Ι	<ξ \|	X	0	1
1		< 1		0	\|	Λ	<	1			1	0	I	bű	0	1	q ¹		<	1 ·—
1		0 1		0	\|		0	1	tj	0	1	0	1		0	1 >	< 1		0	1
+		0 +	a	0	+		0	+		q	+ 60	q	+		0	+	0 +	>4	0	+
1		0 1		0	1		0	1			1		1	+-»	0	1	<S ¹		q	1 υ
1		□ 1		0	1		<	1		<	1		1		q	1 o	< 1			1
1		< i	oa		1		0	1		0	1 u		1		<	1	0 1	cr	q	1
1		< 1		0	1	Ό	0	\|		0	1	q	1	o	q	1	q ¹		<1	j
		□ ·					0		>	<		*í			<	* *»t	0 ·		q
1		< 1	l_	0	1		0	1		0	1 O	q	1		u	1	0 1	Q	q	1
1		0 1		0	1	05	0	\|		0	1	q	1	bű	0	1	0 1		0	1
1		Η 1			1		0	]	<40	0	1	<!	1		0	j ---	0 1		q	1
1		0 1		0	1		0	1		0	1 o	q	1		0	1	0 1	05	<c	1
+		0 +		0	+	0}	0	+		0	+	0	+	bű	<	+	0 +		q	+ σ
1		0 1		0	1		0	\|		0	1	0	1		q	1 45	0 1		<	1
1		q i	03		1		<	\|		0	1 0	0	1			1	< 1	—	q	1
1		0 i		0	1	Ό	<	1		q	1	0	1	>	0	1	q ¹		ο	1 60
1		0 1		0	1		q	1	ü	0	1	<	1		0	1 >	< 1		q	1
		u ·	—	0			0			0	• £	q			0		0 ·
1		0 1		0	1		<	1		q	1	<	1	u	0	1	0 1		<u	1 o
1		□ 1		0	1		0	1	e>	<	1	0	1		0	1 ^Μ	0 1			1
1		0 1	O	0	1		0	1		0	1 0	0	1		0	1	0 1	rt	q	1
1		0 1		0	1	a	<c	1		0	1	0	1		0	1	¹			1 o
+		q +		0	+		q	+	Ό	q	+	<	+		0	+ >	í +		<	+
1		< 1	C/2	0	1		0	1			1 ^w	q	1		0	1	«! i	c	0	1
1		0 1		<	1	4-»	0	1		<!	1	0	1	bű	q	1	0 1		q	1 >
1		0 1		0	1		0	1	>	q	1	0	1		o	1 60	0 1			1
1		< 1	05	0	1		0	1		0	1 60	0	1		0	1	q ¹	>	q	1
		0 ·		0		>	0			0		0		>	0		<		<	- v-
1		<C 1		<	1		0	1	ex	0	1	0	1		0	1	0 1		0	1
1		0 i	O“	0	\|		0	1		<		q	1		0	1	q ¹	>	<c	1
1		0 l		0	1	o.	0	1		0	1	q	1	bű	0	1	•í ¹		0	1 >,
1		0 1		<C	1		0	1	—	0	1	<	1		0	1 o	< 1		<	1

HU 220 464 Bl

ΟΊ Oh m ·—*

Oh

Oh i/Ί

ΓΊ Tf in

V“>

«η «η </Ί

ΓΜΊ

1/Ί

Oh \o

GGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGGTGAAGGGAGGACAGAGGCCACCCATATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACA σ'

Cl σ' σ' + ε

Η υ Η Η Η + οο £ ⁺§ § ο

Η + Η ό^{+ 8}

Η Η

Η Η Ο Η + υ

Η υ

Η

Q +

	U 1	σ’	<3 1	Η 1	ο	1	ο«
	ο		Η · X	<3 ·	ο
03	Ö 1		Η 1	Η 1 >>	ö	1
	Ö 1	00	Η 1	Η 1	γ5	1	οο
	< 1		Ο 1 >	Η 1	<	1
V)	υ ι		Η 1	Η 1 <«	<	1
	υ +	α	Η +	Ο +	ο	+	<υ

Η <

Ο + -σ «:

ο υ

I

Η

Η + 00

Q + ω υ υ η Η Η <

.

⁺

Η Η <

Η

Ο + >

ΐ οο

Ό % ⁺

Η Ο Η

Η + >* Η 8 §

Η

Ο +

Η '

Η Η υ Η Ο Η

Γ

I οο Η · < + Μ ο υ ο

Η Ο

Η + υ

Η <

Ο + ω ο

Η Ο Η Η Η

Ϊ

	ej		ο
		1

	υ	1
σ’	υ	1
	<	1	4-»
	υ	1
00	< +
	ο	1	Ό
	Η	1
CX	Ο	1
	<!	1	4»»
J-I		1
	<3	1	4-ί
	ο	1
π.	Η	1

Η + οοο οο

C

Η

1

□

1 ω

<

I

υ

1

υ

I

σ'

υ

1

ο

Η

+

Η

+

υ

+

σ*

υ

+

υ

+

<3

+

Λ

Ο

1

>

Ο

1

ο

1

<

ο

1

δ

1

Η

1

Ο

1 rt

<

1

υ

1

<c

1

+-·

Η

1

<U

<

1

Η

1

ο

1

45

υ

1

υ

1

ο

1

>

υ

1

45

<

1

υ

1

υ

1 Ο-

Η

1

Η

1

υ

<

• (3

Η

ο

Ο

>

ο

<υ

<

1

Η

1

U

1

r—

<

ι

Ο

1

Η

1

Ο

ο

1

Ό

1

Η

1

υ

1 σ'

Η

1

C3

1

Η

1

<]

1 13

U

1

υ

1

Η

1

«+-

Η

1

>

Ο

1

ο

1

C3

ο

1

Ο

1

Η

1

—-

δ

+

00

υ

+

δ

+

Η

+ ο

+

Ο +

<

1

υ

1 ο.

Η

1

υ

1

<Γ

1

<

1

43

ϋ

1

υ

1

□

1

>

Η

1

<Γ

1

υ

1

σ'

<

1

J-

<3

1

Η

1

Η

1 0-1

δ

1

ο

1

υ

1

ο

1 Ό

<

1

Η

1

δ

1

00

<3

1

<+-

<

Η

Q

<

ο

δ

υ

1

45

Η

1

<

1

U

1 43

ο

1

δ

1

υ

1

<

1 ·

υ

1

υ

1

(Λ

Η

1

Ό

Η

1

υ

1

<

1

4-»

1

<

1

Η

1

—

Η

1

Η

1

υ

1

1 C

υ

1

Η

1

+ >

Η +

Ο+ο.

< + Ο

Η + Η

Η

Η U

Η

U

Η U υ Η <

U «3 ⁺

Ο Η

	1		υ	1 σ·	υ ι	Η
	1		ο	1	ΗΙ« η
Η	1	£	<1	1	Η 1	υ
Η			ο	• ·σ	Η ·	ο
<	1		Η	I	Η 1 Η
Η	1	>>		I	Ο 1	ο
Η	1		<	1 rt	< 1	Η

+ C

ο.

Ο Ο + Η Ο Η Η

Ο Η

HU 220 464 B1

AGATTAAGCACGCATCATTTGGAAGGAATGTCTTTGCCATTTCATATATACCAGGTTTCCTCTTTGCCGTAAACGGGAAGCCTTACTTTCGAGACCAAGA 195 5

X)

χι

σ\

Χι

χ>

X)

»Τ) νη

V“>

X) X)

χ>

Χΐ

XI

X)

χ>

«η ν>

v>

xi xi

Ο

I

Γ-

Γ4

m

+

00

XI

\©

Γ- 00

Oá

Ο —1

Γ4

<Ν

η

tN

C4

<Ν

ίΝ <Ν

<N

m cn

Η +

U +

00

<2 +

Ε-

+

υ

+

Ό

U +

Ε- +

< y

u

<C H

α>

U 1

Η 1

U 1 σ-

Ε—

1

Η

I

Ε- 1 “

Η 1

υ <

H

y y

Ο 1 Λ

U 1

<

1

Η

ι

Ε- 1

< 1

Η Ο

H

y <

δ ι

(β

<2 I

Ε—

1

Η

I

U-

U 1

Ε- < U

h y

σ

Η 1

δ ¹

< 1 44

Ε-

1

υ

1

U 1 Ο.

Η 1

υ υ

E-

H <

Ο · >

Ο ·

Ε-

ti

δ

<

Η ·

<: ε—

y

<C E—

Η 1

<£ |

< I

υ

1

δ

1

bű

υ ι

Η 1

υ Ε-

y

Ε- H

τ3

Η 1

|

Ο I ω *5 ¹

Ε—

1

υ 1 Λ

< 1

υ <

E-

< y

< 1 —

<j |

«2

ι ε

1

Ε— 1

υ 1

<2 y

E-

η δ

Ε- ¹

<2 ι

< I

υ

I

<2

1

υ 1

υ <

E-

Η E-

bű

<2 +

Η +

y + σ-

Ε-

+

<Γ

+

U + α.

ί— +

υ υ

y

<1 <!

U 1 Τ3

Η 1

υ 1

υ

1 >

1

U ι

υ 1

y e-

y

y y

Ε- ¹

υ ι

>

Η ¹ «

Η

1

<

1

Η

-ί ¹

Ε- 1

E— E-

δ

< <

<4-<

< 1

<2 1

< ι ε

Η

1

υ

1

< 1 44

υ ι

E- <2

E-

< H

Ο 1 43

y ι

υ ι

<2

1 —

1

υ I

Η 1

y u

Η H

Η ·

CZ3

υ

<2

C/3

υ

Ε- ·

<2 E^-1

δ

y h

>>

U 1 y ι ο.

8 !

< 1 44 y ι

υ <5

1 1 σ

1 1

υ I Ο. U ι

U 1

3 8

EH

<d Ευ H

δ ι

υ 1

U

< 1

δ

1

Ε-

1

Ε— 1

<2 |

< <

H

E- E-i

CL

Ε- 1

Η 1

y 1 σ-

Ε-

1

υ

1

U 1 -

<ζ |

y e-

y

<2 + ε

<2 +

υ +

υ

+ —

υ

+

υ +

Η +

Ε- E-

H

<ς <

Η Η bű c

>

<4+ —

CL y EE8 +

E— y + y υ

EH y

H y + y □

Ο ο

E-

i —-

Ε-

1

y ι

Cl

Η

1

y

y ^H

< E- <

<

1

υ

1

y ι

y

1

<

e— y <

υ

<

1

y

1

<r

1

υ 1

y

1

Ε-

ί- E- <

y

• ω

E-

<2

Q ·

σ3

y

υ

0 y

h y -í

<

1

<2

1

>

y

1

δ ι

y

1

E-

δ h

Ε- H <

ε

y

1

δ

1

y

1

J-

y ι

y

1

E-

< y

E— <C <

H

1 tA

Ε-

1

E-

1

E- 1

ίΛ

<

1

E-

y <

h y <

y

1

υ

1

—4

y

1

y ¹

E-

1

E-

y y

ε- δ <

-ki

y

+

y

+

<

+

ΚΛ

< +

H

+

E-

^u y

<: δ <

Ε-

1 tA

H

1

<

1

Η 1

>»

Ε-

1

y

y δ

ε- y <

υ

1

y

1

>

u

1

y ι

υ

1

H

< u

y y <

<υ

y

1

Ε-

1

y

1

Λ

< 1

y

1

y

y E-

Ε- E- <

<

υ

1

E-

1

y ι

<u

y

1

E-

E- <:

HE--Í

y

Q-

E-

y ·

y

H

y y

y h <

-w

y

1

H

1

H

1

< 1

í—

1

u

y u

h y y

y

1 CL

H

1

y

1

y ι

<υ

Ε-

1

y

δ y

UHU

1

<

1

—

E-

1

¹

υ

1

δ

y <

E- y <

—

1

H

1

E-

1

< 1

y

1

H

< y

< E- H

<

+ 44

E-

+

H

+

y +

ο

E-

+

E-

3 y h

(Ν

Γ*Ί

H y

EH

U y

ω

Η y

Η

Ό

Η ι

ο y υ ο

Η .

«2 + 8

8υξ y υ y d η y ο η y υ ^j

y

1 T3

í— 1

y

1

i —

Η 1

y ι

<d

1

H

h < y

<

1

y ι

>

y

1

H

1

Η 1

< 1

y

1

H

Η E- <

E-

u

y

CL

f-

y ·

u

y

u y y

1 ·—

y ¹

1

<

!

y ι

y ¹

<

1

<

y < y

H

1

< 1

<

1

y

1

δ ι

bű

< 1

H

1

H

y y <d

C/5

H

1

y ι

y

1

O

H

1

y ι

H

1

f-

δ <c y

E—

1

u

1

δ ϊ

y ¹

í—

1

E-

y y <

<2

+

<1 +

c

H

+

E-

+

δ +

bű

<J +

y

+

<

y <ς o

—

<2

1

<ϊ 1

y

1

>

H

1

y ι

O

y

1

E-

< < y

E—

H %

Η Ο υ y Η □

Η +

τΛ	<	1	y ι	y ¹	>	y	1	<	1
	y	1 Ό	y ι			y	1 M	<	1
		1	υ 1 σ			<	1	y	1 σ-
Uu	y	1	«ί ¹	δ i	bű	y	1	y	Ι
	δ	- 60	<2	δ		ö	00	<!
	H	1	y 1 ω	y ι		H	1	y	1 -σ
c	H	1	1	Ε- 1	CZ3	E-	1	H	1
	<	1 *—	<2 ι	u 1		E-	1 <1	y	I
	y	1	< 1 44	y ι		y	1	<	1 to
ε		+	y +	δ +	bű	y	+		+

ί-ΟΟΟ. .

Η < Η Η Η Ο UÜH U,-l· Ü <UUU

H y

E□

EO

U bű

<

1

*-»

<

1

h ¹

K

y

1

<c

1

y

1

y

1

σ’

y

1

<r |

<

1

4-»

y

1

y

1

00

ζ5

1

y

1

<

1

*-»

<£ 1

y

1

u

1

z-~\

<

+

o

+

bű

Ε-

+

y

+

*2 +

44

y

+

H

+

cn

1

E-

1

υ

1

>

y

1

<T |

<

1

<Λ

u

1

v-j

y

1

σ’

1

<

1

<2

1

C*2

o ι

y

1

y

1

00

y

1

y

1

<

1

y

1

<C 1

44

Ε-

1

«2

1

z

Ε-

1

y

1

H

1

y ¹

υ

1

>

y

1

υ

>

<2

H

y

ő ·

<

H

y

1

y

1

<u

H

1

Ε- 1

y

1

y

1

y

1

H

1

<

1

·—

1

y ¹

y

1

U>

y

1

y

1

CL

y

1

y

1

<2

1

δ ι

y

1

Ε-

1

1/3

y

1

H

1

C/5

y

1

y

1

y ι

1

<

1

υ

1

. Ο < Ο Ο<Η Η ου<υυ Η U U Η Η <ÜHU< U Η < <οο

υ υ

Η <2 C . _ Η Ο Ο U <2 < <2 <2 UE-UUEί- Η Η U Η ΕΟ Ο Ο < < Ο

HU 220 464 Β1 \© so so in tt tj- tj- in <N —< l o>

*n in in m

(N in os in m —< »n m »—ι Tt in »n «η »n Os <n »n -μ ·η sO (N Γ

N

Ο

I

N

Ο

N

-C3 a

s

I u < < u U Q U U HÖy u U 0 o o O U H U Η H U H UÜUÜ u y u o υ

>?

1)

TT

CU

CQ

UÖÜU uy uh y qy □

< < o < o u < □ y u < c © h o u

g .§) s

υ £ 75 tí Ό <ü N

S '

X>

υ c

,υ © © © © Η H © H < © © ' © © © < © «:

□ 8 & _ υ η υ © UUOH H H © © E- © © Ü OÜŐU ŰÖÖU < © E— © © © υ © © «3 © f<uűy öuuc öouu u e— υ υ © O © © © E- <£ E- '·

H υ

© u

in »n

Γ*Ί

I

+

—

ü

+

E-

+

E-

+ Μ

<

+

©

+

<3 +

9

+

1

©

1 Ml

o

1

©

1

<3

1 44

I

9 ¹

©

ι

00

1

E—

1

©

1 u

©

1

©

1

©

1 Ό

<3 ι

υ

I

1

<Ú

E—

1

©

1

H

1 tt

©

1

9 ¹

ο

9

1

<

1

E-

©

1

©

1 Ο.

1

¹

<3

1

75

©

<3

• S

©

44

9 ·

©

1

υ

1

©

1

©

1 Ο-

Ε-

1

©

1

9 ¹

bű

Ε-

1

<

1 —

©

1

©

ι

υ

1 —

<

1

< 1

9

1

>

1

e-

1

E-

1 ^M

E-

9

1

©

1 43

υ ι

©

1

©

1

©

1

<

1 8

©

1

9 ¹

Ρ-

Η

1

+

u

+ 60

H

+

E-

+

©

+ -

<

+

<3 +

9

+

1

H

1

<3

ι ε

<

1

©

1

1 β

© 1

9

1

00

Ε-

1

©

1

<

1 s

©

1

H

1

9 ¹

Q.

1

υ

| —

©

1

©

1

<

1 *·

<

1

< 1

<

1

4χί

1

©

1

E-

1 u

©

1

υ

1

9

1 Ό

¹

Ε-

1

©

E-

• u

υ

·<

<3

·-*

9

1

H

1 o

E—

1

©

1 Ο-

©

1

© 1

9

1

οο

1

<

1

Ε-

1 +-

©

1

υ

ι

©

1 —

Ε- 1

<

1

*“

<

1

υ

1

©

1 M)

©

1

E-

1

© I

>

Ε-

1

□

1 ω

<

1

E—

1

υ

1 ο.

H

1

ί- 1

Η

1

—

+

H

+

H

+

E-

+

Ε-

+

H

+ ««

9 +

Ε-

+

1

<

1

<

1

H

1 L-

υ

1

E-

1

<3 1

4-»

<

1

<

1 c

©

1

©

1

©

1 tt

©

1

9 ¹

©

1

43

1

©

1

<

H

1

Ε-

1

©

1 tt

< I

©

1

υ

1

©

1

©

1 —¹

<ς

1

Ο 1

Τ3

<

1

e-

- W5

<

©

<2

• 13

9

Η ·

©

43

1

E-

1

©

1 Ό

H

1

9

1

<

1 tt

Ε- 1

Ε-

1

*·

E-

1

ε-

1

©

1 —

9

1

©

1

© I

>

υ

1

H

1 <*-

υ

1

©

1

<

ι —

H

1

Ε— 1

<3

1

>-»

1

<

1

E-

1 tt

E—

1

<

1 ·—

© 1

υ

1

+

*“*

υ

+

©

+

<

+ ε

©

+

E-

+

Ε- +

75

<3

+

1

E-

1 ^M

<3

1

H

1

9

1 tt

<

1

© I

©

1

Λ

1

<

1

©

1 U

<

1

9

1

©

1 Τ3

Η 1

υ

1

ÖŰ

□

1

©

1 43

©

1

©

1

<3 ι

ε

Η

1

<

1 —

<3

1

©

1

ί-

1 »

9

1

© 1

9

1

>

©

-

<

υ

©

• 60

Ε-

<3

1

75

©

1

Ε-

1

©

1 43

©

1

H

1

< 1

ε

9

1

<

1 +^-

υ

1

©

1

©

1 tt

<

1

Η 1

<3

1

U

1

Ε-

1

©

1 Q.

H

1

Ε—

1

Ε-

1 >>

Ε- 1

©

1

Ui

Ο

1

<c

1

©

1 >

<

1

υ

1

© 1

—

<3

1

+

+ -

©

+

Ε-

+

Ε-

+ χ

<

+

9 +

Ε-

+

X

1

<3

1

<

υ

1

<

1

©

1 43

<3 ι

υ

1

03

1

E-

1

<

Ε-

1

H

1

Ε— 1

>>

©

1

©

1 ω

E-

1

E-

1

υ

1 '—'

H

1

© I

©

1

«β

1

©

1 >

1

Η

1

9

1 >

Η 1

Ε—

1

u

<3

©

• T3

Ε-

<3 ·

ε

Η

1

1 44

©

1

©

1

<

1 ·—

<

1

© 1

Ε-

1

tu

1

E-

1

©

1 M)

E-

1

Ε-

1

©

1 σ'

9 '

ϋ

1

00

H

1

E-

1

<d

ι ε

1

H

1

© ί

00

Ε-

1

E-

1 <—

©

1

©

I

<

1 13

Ε-

1

© I

©

1

>

+

ü

+

©

+ Q.

©

+

©

+

υ

+ —

υ +

Η

+

1

Λ

O

1

©

1

1 tt

υ

1

©

1

© I

CÚ

<3

1

<

1 *-

E—

©

1

©

1 tt

H

1

Η 1

©

1

43

1

ü

1

<3

ι ε

©

1

Ü

1 >

Η 1

©

1

ε

1

©

1

Ü

1 tt

1

©

1

¹

• Μ

Η

1

<

- 44

©

E-

• 44

E-

< ·

ε

1

H

1

©

1 —

©

1

Ε-

1

E-

1 <+>

Ε- 1

<

1

E-

1

E-

1

©

1 —

1

©

1

Ε- 1

©

1

H

1 ‘H

E-

1

H

1

9

1 Ό

<

1

Η 1

©

1

ο.

1

©

1

<

1 ¹

©

1

<

1

H

I

υ ι

Η

1

+

H

+

E—

+

©

+ a.

©

+

υ +

Ο-

<

+

I

©

1 >

<

1

9

1

<

1 ^w

•c

1

9 ¹

ί-

1

>>

1

E-

1

©

1 T3

1

Ε-

1

•«ξ

1 44

<3 1

υ

1

υ

1

©

1

<

1 4«í

ϋ

1

©

1

υ ι

σ-

Η

1

E-

| ΕΛ

Ε-

1

©

1

Η

1 u

9

1

© 1

1

ε

E—

υ

• -—1

©

<

• cn

© ·

<Γ

1

H

1

©

1

Ε-

1 t—

©

1

© 1

ο-

<3

1

©

1 —·

©

1

υ

1

1 —

δ

1

© 1

1

Λί

1

<

1

©

1 tt

<

1

<3

1

©

1 60

Η 1

©

1

©

1

E-

1

o

ι -σ

9

1

Η

1

© I

>

<

1

+

©

+ o.

E-

+

H

+

9

+ 60

©

+

Η +

Ε-

+

1

©

1

H

1

<

1

<r

© 1

I

1

©

1

E—

1

<

1 ·—

<

1

·<Γ

1

9 ¹

U

<

I

1

1 ^M

<

1

©

1

©

1 <u

<*

1

<3 1

©

1

σ-

1

<

1

Ü

1 Ό

E-

1

Η

1

©

1 ω

© 1

©

1

Ü

<

©

>

<

< ·

©

1

<

1 u

©

1

©

1

©

1 Ό

9

1

© 1

Η

1

υ

1

υ

1

H

1 tt

1

(-

1

9

1 60

Η 1

©

1

E—

1

<

1

Ε-

1 «—

©

1

<3

1

© 1

—

©

1

Ε-

1 L.

©

1

υ

1

Η

1 u

9

1

ί- 1

Η

1

75

+

υ

+

©

+ tt

©

+

Η

+

Ο

+ 60

< +

Η

+

1

©

1

f-

1

©

1 tt

Η

1

Η

1

9 ¹

Ε-

1

<5

1 tt

<3

1

Η

1 t—

Η

1

<3 ι

<3

1

·—

1

©

1

o

1 T3

1

9

1

9

1 >

Ε- 1

©

1

E—

1

E—

1

9

1 u

©

1

© 1

>

<3

1

©

• —

E-

9

Η

•

9

© ·

©

Ό

1

U

1

©

1 ¹—¹

<

1

©

1

<

1 —

© 1

ί-

1

©

1

H

1

©

1 <u

<

1

©

1

Η 1

75

υ

1

E—

1 o

©

1

E-

1

Ε-

1 >.

Ε-

1

Ο 1

©

1

©

1

©

1 O.

·<

1

Η

1

Η

1

Ε— 1

Ε-

1

+

©

+

©

+

9

+ T3

9

+

<

+

© +

>

<

+

1

<

i tt

©

1

©

1

<

1 tt

9

1

υ ι

<

1

ϋ

1

u

1

<

1

H

1

<

1

Ο

1 60

9 ¹

©

1

©

1

©

1

©

1 >

9

1

Ε-

1

Ο I

00

Ε-

1

«3

1 ^M

E-

1

Ε-

1

ο

1 60

Η

1

Η 1

9

1

©

ü

• >

υ

Ε—

©

- >

© ·

<

1

<

1

<

1

©

1 Ο-

©

1

Η

1

Η 1

75

Η

1

©

1 σ-

©

1

©

Ι

<

9

1

© 1

9

1

>

1

©

ι

©

1 ο-

Ε-

1

©

1

9

1 60

© 1

<

1

E-

1

<C

ι

υ

1 —

©

1

<

1

Ε- 1

Ο

<2

1

HU 220 464 B1

ATACAGAGTAAGAAACGGACAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTT vi

VI

		V)		vi			VI
		VI	i—l	Vl			VI
		a	m	o			a

+		rf +			+		rf	+
1		y ¹		rf	1	·—		1
1	Q-.	rf 1		H	1		y	1	Öfi
1		Η 1		rf	1		0	1
1		O l		rf	1	tí	rf	1
	•w	t—¹		U			y		cr
1		υ i	—	υ	1		rf	1
1		y ¹		y	1	tí	rf	1
1	>	rf i		3	1		rf	1	4^
1		rf 1	tí	rf	1		rf	1
+		H +		y	+	<u	y	+
1	Ό	□ 1		rf	1		y	1	CL
1		Η 1	o	y	1		3	1
1		Ü 1		y	1	«ί	rf	1
1	>	Η i		·<	1		y	1	cr
		rf	ε	y			y
1		rf '		y	1	CL	rf	j
1	CL	rf ί		y	1		y	1	tx
1		y i	¢)	H	1		3	\|
1		y ¹		rf	1	—		1
+	43	c +			+		rf	+	ε
1		y i		y	1		rf	1
1		Η 1		rf	1	•w	H	1
1	O	y ¹		rf	1		H	1	-Μ
1		rf 1	ΐΛ	y	1		t-	1
		H ·		rf		U	y
j	>	U 1		y	1		□	1	tí
1		Η 1	(Λ	H	1			1

1		1		H	1 a
ι a	y	1		y	1
+	<	+		H	+
I		1		rf	ι ε
1 >.		1		H	1
1	δ	1	öű	rf	1
1	y	1		y	1 T3
• a	y			rf
1	3	1	öO	y	1
1	y	1		y	ι a
1 eo	H	1		H	1
1	rf	1	—	y	1
+	y	+		y	+ BS
1 Ο-	rf	1		3	1
Ι	υ	\|	4=	H	1
1	y	1		y	1 >
i a	y	1		y	1
	rf		+-»	rf
1	y	1		rf	1 c
1 a	y	I		y	1
1	y	1	tí		1
1	3	1		<r	1 44
+ σ-	c	+			+
ι	y	1	υ	y	1
1	<:	1		c	1 ***
i a	y	1		H	1
1	rf	1	*-	y	1
	y			H	• o
1 13	3	1		u	1
1	<;	1	ι.	y	1
1		1		rf	1 Ί
1 CT	δ	1		y	1
+	ö	+	ÖD	H	+
1	rf	1		rf	ι ε
1 1	rf	1		y	1
1	□	1	<υ	H	1
1	H	1		H	1 a
• 00	y			y
1	3	1	ÖŰ	u	1
1	H	1		H	1 cn
[ ·	y	1		H	1
1	rf	1	--	H	1
+	y	+		y	+ ~
1 ω	H	1		rf	1
1	H	1		y	1
\|	y	1		y	1 C0
1	H	1		H	1
	y		>	rf

I

I +

I

I +

I

I +

I

I +

I

M ω

c o

CO ω

JS

JS ε

ε >

1		Η 1		H	1 >>	Η 1
1	*	y ι			1	rf 1	ε
1		H 1	ü	rf	1	y ¹
1		rf 1		rf	1 44	rf ¹
+	cr	y +		y	+	y +	Ό
1		rf 1	la	y	1	3 ι
1		y ι		y	1 CO	u ι
1	CJ)	y ι		rf	1	y ¹	CL
1		y ι	tí	rf	1	rf '
		rf ·		y	• <D	rf
1	c	y ι		3	1	rf 1	-tó
1		y ι	tí	H	1	y ι
1		3 ι		rf	ι ε	H 1
1	u	Η 1		y	1	y ι	>
+		y +	—	rf	+	H +
1		rf 1		H	1 >>	y ι
1	>	H 1		H	1	y ι	CL
1		rf 1	·—	rf	1	Η 1
1		Η 1		H	1 >>	Η 1
	la	rf ·		y		rf '	•H
1		y ι	Ό	H		rf 1
1		Η 1		rf	ι ε	y ι
1	>1	y ¹		y	1	y ι	CL
1		3 ι	CJ)	H	1	y ι

V) O\ V)

VI — VI

T Cl <:

u

H

H <

υ

H

H y>

a s3 >

>

Ό

1» <U

ΙΛ

ΪΛ •o

CT

1» >

ω <L>

<U

VI

V) vi

Vi O Vl

VI —' VI

VI VI Ό

rf	+	y	+	y	+ 00	y	+		y	+
y	1 u	c	1	H	1		1	ko	rf	1
3	1	y	1 σ-	y	1	rf	1		y	1 4C
<	1	y	ι	H	1 cn	rf	1		rf	1
y	1 u	·<	1	H	1	y	1	o-	y	1
H		y	• σ-	H		y			y	• a
rf	1	y	Ι	y	1 >	rf	1		rf	1
y	1 43	H	1	y	1	y	1	σ·	H	1
3	1	H	1 a	rf	1	y	1		H	1 44
rf	1	y	1	y	1 CT	rf	1		H	1
y	+ <u	y	+	y	+	H	+		rf	Ί
<	1	H	1 cn	y	1	H	1		H	1 >.
y	1	u	1	y	l oo	H	1		H	1
y	1 co	H	1	<<	1	y	1	>	H	1
H	1	H	1 a	y	1	H	1		H	1 a
y		H		y	a				y
3	1 00	y	1	rf	1	H	1		H	1
<c	1	y	1 CO	H	1	y	1		U	1 44
<	1	rf	1	H	1 44	rf	I		y	1
y	1 <u	y	1	y	1	rf	1		rf	1
rf	+	-<	+	H	+	y	+		rf	+ 13
y	1	y	1	H	1 —	y	1		y	1
<	1 *-	y	1	y	1		1	cn	rf	1
y	1	rf	1 cn	rf	1	y	1		rf	1 44
y	1	y	1	H	1 >.	rf	1		y	1
y	eü	<-		y		y		Ό	y
y	1	y	1 u	H	1	H	1		3	l eo
<	1		1	y	1 >	H	1		H	1
y	1 Ό	y	1	<c	1	H	1	L-.	y	1
H	1	y	1 co	y	1	H	1			1 cn
y	+	rf	+	3	+ 00	U	+		y	+
H	1 co	u	1		1	H	1	V3	y	1
y	1	y	ι a	y	1	y	1		H	1 co
3	1	3	1		ι a		1		y	1
y	1 *4	3	1	δ	1	rf	1	tí	rf	1
H		rf	- i—	δ		rf			y	• CT
y	1	y	1	Η	1 *	y	1		y	1
3	I eo		1	y	1	3	1	00	H	1
H	1	y	1 —	rf	1	H	1		y
H	1	H	1	y	1 Ό	rf	1		y	1
u	+ —	y	+	3	+		+			+
y	1	rf		H	1	δ	1		<*	1 *4-
rf	1	rf	1	y	1 4-	δ	1		c	1
y	1 Ό	y	1	rf	1	Η	1	£		1
3	1	H	1 cn	rf	1	f—	1		y	1 ω
		y		y	ω	Η			H
rf	1 44	rf	1	rf	1	y	1		y	1
rf	1	y	1 <U	rf	1	H	1		y	1 CO
rf	1	<:	1	y	1 υ	rf	1		H	1
rf	1 44	H	1	rf	1	y	1	43	rf	1
y	+	y	+ —	rf	+	y	+		rf	+ c
rf	1	y	1	y	1 ο	rf	1		H	1
y	l σ-	rf	1	3	1	y	1	Ό		1
y	ι	y	1 CT		1		1		<r	1 13
	1	y	1	y	1 >	y	1			1
y	• ο-	rf		H		3		ao	u
3	ι	y	1 43	rf	1	<;	1		y	ι a
H	1	y	1	u	1 43	y	1		y	1
y	1 ο-	H	1	y	1	<;	1	u	rf	1
y	ι	H	1 a	H	1	y	1		y	1 13
	+	rf	+	H	+ a	rf	+		H	+
<*	1 Ö	y	1	H	1	u	1	43	H	1
	1	rf	1 c-	rf	1	y	1		rf	1 ·-·
u	1	y	1	y	ι ·α	H	1		y	1
y	1 CO	rf	1	rf	1	H	1	L-.	H	1
H		y	• 43	y		H			y	>
H	1	y	1	y	1 00	H	1		3	1
rf		H	1	rf	1	rf	1	—	H	1
y	1	rf	1 · —	y	1	y	j		y	1 —
rf	1	y	1	H	1 cn	H	I		y	1
y	+ w	3	+	υ	+	y	+		H	+
H	1	rf	1 c-	y	1	rf	1		rf
y	1	y	1	y	ι a	H	1		y	1
y	1 co	rf	1	rf	1	y	1	—	y	1
rf	1	y	1 Ό	rf	1	y	1		rf	1 **
		<c		y	• u	rf			y
y	1 >	y	1	·<	1	rf	1	tí	rf	1
3	1	<;	i ι	y	1	H	1		y	1 13
	1	y	1	y	ι a	rf	1		rf	1
y	1 —	H	1	rf	1	rf	1	tí	<	1
y	+	y	+ >	rf	+	y	+		y	+ <u
rf	1	<c	1		1 ω	rf	1		rf	1
y	1 Ό	H	1	y	1	rf	1	44	rf	1
<c	1	y	j —	3	1	H	1		y	1 Cj
y	1	y	1	H	1 S	y	1		f—	1
H	• cn	H		H		H		cn	H
	1	rf	1 ·—	y	1	H	1		rf	1 ‘4*
y	1	H	1	u	ι a	rf	1		rf	1
3	1 00	y	1	υ	1	y	1	Xí	y	1
H	1	y	1 CO	y	1	3	1		u	ι a
y	+	H	+	y	+ 00	H	+		y	+
H	1 cn	rf	1	rf	1	y	1	—	y	1
rf	1	rf	1 c	rf	1	y	1		3	1 00
rf	1	H	1	y	1 u	y	1		H	1
y	1 u	o	1	y	1	y	1	tí	H	1
<;		δ	• 00	y		3			y	• —4
y	1	δ	1	3	l oo	H	1		H	1
rf	1 Ί	δ	1	H	1	y	1	>	y	1
y	1	Η	1	y	1	3	1		y	1 00
rf	1	<	1	y	ι a	3	1		<c	1

HU 220 464 Bl

GGCTTGAGCATAGATACAGATGGAAATTATTGGGTCACAGATGTGGCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCTCTCTTAA 1855

O\

<n

>n

©

m

η

in

©

>η

m

<n

σ>

»—t

in

«η

m

»—t

ΙΖΊ

in

>n

1—t

>η

m

>n

©

o\

©

r.

CN

cn

tT

00

m

<©

t—

n

CN

s—✓

CN

'—'

<

+

□ +

<

+

34

< +

E-

+

E-

+

ví

Ε- +

E-

+

q

+ OO

q

1 Ό

< 1

υ

1

Ε- 1

υ

1

O

1

¹

ε

1

<

1

υ ι

cr

υ

1

Η 1

υ

1

a

q

1

q ι

<

1

· —

q

1

—

q

1

<

1

—»

υ ι

q

1

υ

1

u

¹

υ

1

q

1 00

E-

i cd

Ö 1

υ

1

υ ι ο.

E-

1

E-

1

< I

υ

1

<

1

q

δ

Ö0

<

q ·

ε

<

<3

q

cü

q

—

E-

1

< 1

q

1

T3

·< ¹

υ

1

q

1

35

< ι

q

1

q

1 00

q

1 >

υ ι

Ε-

1

< 1 +4

<J

1

q

1

q ¹

σ·

Ε-

1

υ

1

CX

υ

1

q ι

q

1

Ό

<

1

q ι

υ

1

—

q

1

ex

E-

1

q ί

1

—»

q Ϊ

υ

1

q

1

Ο

ί- I

q

1

1 —

Ε-

+ 0-

q +

<3

+

q + oo

E-

+

q

+

—

H

+

<!

+

υ

1

< 1

u>

<3

1

υ ι

E-

1

<—

E—

1

¹

υ

1

—

q

1

b0

E-

1

Ε- 1

<j

1

34

υ

1

<r

1

ε

¹

υ

1

t —

q

1 >

υ ι

υ

1

<? 1 fi

<

1

*5 ¹

ο

E-

1

<

1

Ε-

1

υ ι

CX

e-

1

<; 1

υ

1

-C

<r

1

< 1

q

1

>

q

1

<υ

υ

Ε— ·

E—

G-.

E-

υ

<3

υ ·

q

bO

q

1 CO

q ι

υ

1

q ι >

1

<c

1

Η I

Vi

H

1

q

1

<

1

< ι

Vi

q

1

υ ι

<

1

34

1

υ ι

υ

1

H

1

34

q

1

υ ι

E-

1

O

υ ι

υ

|

q

1

ο

υ ι

q

1

υ

1 —

q

I oo

q ι

<

1

q ι co

q

I

Ε-

1

Ε- 1

Vi

E-

1

υ

1

Ε-

+

< +

VI

+

E- +

υ

+

u

υ

+

υ +

q

+

>

E-

+

Vi

υ

1

< I

q

1

σ'

ί— 1

<

1

<

1

-W

q ¹

H

1

q

1 >

<

q ι

υ

|

ί- 1 o-

Η

1

q

1

4-J

υ

1

·<

1

E-

1

q ι

Ö0

E-

1

υ ι

q

1

>

E-

1

υ ι

υ

1

C4

q

1

rG

q

1

E- 1

<d

1

·—

E- 1

<

1

υ

1

--

υ ι

E-

1

<

1 —

• co

υ

*?

υ · -

q

υ

q

ex

H

<

υ

1

Ε- 1

V3

q

1

υ ι

υ

1

ex

υ

1

|

<

1

•r-

q

1

ex

υ

1

υ ι

υ

1

u

Ε- 1

a

1

<

1

Ν-»

<Γ |

H

1

q

1 00

υ

1 fi.

υ ι

υ

1

Ε- 1 ο-

<

1

υ

1

34

H

1

Ε-

1

q

1

H I

Vi

<3

1

Ε- 1

<

1

34

Ε—

1

q ¹

q

1

>

υ

1

T3

<

+

q +

q

+

Ö0

q +

υ

+

Η

+

(4-1

+

q

+

H

+ 1«

q

1 fi

< I

t—

1

q ι oo

Ε-

1

q

1

•5 1

a

E-

1

E-

1

□ I <C υ

q

I fi

	Ö í	q ι	q	1		<	1	.-
	δ ι	q ι oo	q	1		E-	1
q-i	Η 1	q ι	<	1	t-4	<	1
	q + >	q +	υ	+			+	>>
	Ε- 1	H 1	<	1		<	1
>	< 1	q ¹	q	1	Ό	υ	1
	q ι -a	< 1	<	1		Η	1	Vi
	υ ι	q ι σ-	q	1		Η	1
er	υ ·	υ ·	q		cö	Η
	< 1 -	q ¹	q	1			1	·—
	υ ι	< 1 ~	E-	1		υ	1
35	υ ι	υ ι	q	1	>	υ	1
	υ ι ο.	E- 1	E-	1		q	1
	q +	q + >	q	+		Η	+
—	< ι	υ ι	H	1	o	Η	1
	υ 1 σ·	H 1	q	1		Ε-	1
	q ¹	f- 1 1-	E-	1		υ	1
Λ	Ο I	q ¹	E-	1	—	Η	1
	Ε- ο		q			q
	υ ι	< 1	<	1		Ε—	1
>	Ε- 1	-< \|	υ	1	cr		1
	ί- 1 ι-	q ¹	υ	1		<	1	cs
	Ε- 1	q ι oo	<c	1		q	1
	< +	υ +	q	+	’σ	q	+

υ υ E—

H E- +

Ε— I Ε- I Ε- I < q l -fi Ε— I U I O I fi. □ + oo EE—

E— <

O

E— + ^M ί- I ου I I

H q υ ¹ < I q I -fi <C I

E- + ι fi

Q I δ + Ε- I Ü I < I U I υ

E—

EEEI

H Cl δ

EH +

I cn

1	<	1		q ι ω	Η 1
1 o-	q	1		q ι	q ¹	>
+	q	+	00	υ +	á ⁺
1	t-	1		q ι co
1 fi	H	1			δ í	00
1		1	—	·< t	δ i
1	υ	1		< 1 34	υ ι
- ε	<			o ·	E- ·	Vi
	E-	1		Η 1	υ ι
1	q	1		<r 1 ·—	q ¹
1 >	H	1		1	q ι	ö0
1	q	1	>	< 1	υ ι

E- + + fi (J + $

υ E<?

□ υ +

Ευ υ a υ q E<

υ í

υ q + « oo

E-

I

Ε-

1 ο-

Η 1

<

I

¹

υ

ι

δ ι

υ

I

ex

>>

q

1

q

ι

q ι >

υ

1

< 1

1

q

1

<

1

Vi

<

1

Η 1

q

1

cö

q ¹

I

υ ι σ-

<

1

q

1

υ

1 σ-

Η 1

υ

1

q ι

ÖO

δ

1

υ ι

q

1

ο

c

q

υ · —

<

·

δ

• 00

Ε-

<

q

1

ÖO

Ε-

ι

υ ι

υ

1

35

< 1

Η

1

υ ι >

υ

1

Ε-

1

q

1 >

υ ι

q

1

υ ι

σ

<

1

¹

<

1

Η-»

Öű

υ

1

Ε-

1

δ ι σ

1

q ι

q

1 Ό

< 1

υ

1

υ

1

ex

Η

1

q ι

<

1

34

H 1

1

q ι ω

q

1

+

<

+ —

Ε— +

Η

+

q +

>

<

+

Ε- +

<

+

Vi

T3

-ί

1

q

1

Ε- 1 —

Ε-

1

υ ι

q

1 fi

Ε- 1

q

1

υ

1

σ·

ο

1

Ε- 1

<c

1

υ ι

Ε-

1

< 1 -

Η

1

q

1

υ

1 —

q ¹

q

1

υ ι

CL

υ

1

υ ι

υ

1

-*-*

Η

1

Η

1

< 1 co

<

1

q ¹

Ε-

1 co

q ¹

<ς

1

<

ε

q

q ·

q

ŰJ

< ·

Ε-

q · oo

υ

1

<

1

< 1

1

q ι

<υ

υ

1

Ε- ι

1

34

q

1

υ

1

υ ι λ

q

1

•3 ¹

q

1 CO

υ ι

q

1

<

1

(Λ

1

Η ι

1

u

< 1

ο

1

q ι co

<

1

I +

s

E- +

U I υ + □

E- +

Ό I υ +

E□ +

<

1

u

q

1

H

q

1 >

<

H

1

+4

ι

1

H

1

o

H

1

q

•σ

H

1

I

Vi

1

υ

1

q

>

H

1

<

1

· —

<

q

1

q

1

00

<

1

E-

1 Ο-

q

E-

1

<3

<

1

q

H

q

<

q

• 00

<

υ

q

• ω

—

H

1

E-

1

<

cn

<!

ι

H

q

1

-σ

Η

<,

1

υ

1

—

q

1

υ

q

1 fi

E-

1

q

>

<

1

H

1

q

1

ÖO

H

1

H

c«

1

<

υ

1 σ-

ÖO

E-

1

υ

1

E-

Cw

1

υ

1

35

υ

q

ι

υ Eδ +

E—

EH

O

E<

U

E— q

HU 220 464 Bl

GAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAAGAGAAGGAGGAAGAAAAGCAGAAGGAGGAAGAAGAGGAGAAGGAGGAAGATGAAGGCAGCATTAGCCATGGGC 2 8 5 5

I Μ»

I +

I 00

I

I ω

I

I 00

I

I + u

I 60

I

I M +

I

I ω

I

I • U3

I

I +

I fcfl

I

I Ö0

I

I + w

I

I *-<

I

I 60

I

I »+

I

I M

I

I • <0 v>

M· σ» <N

H H H O O H «: υ +

A fentebbi módon izolált cDNS-eket alkalmazzuk mind prokarióta, mind eukarióta kifejezővektorok megalkotására, és több gazdaszervezetet fertőzünk át ezekkel a vektorokkal az alfa-amidáló enzimek hatékony ki5 fejezéséhez.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában új módosítást végzünk az előbbi cDNS-eken abból a célból, hogy ne csupán a kifejeződést, hanem az amidáló enzim kinyerését is optimalizáljuk. A módosítás termé10 szete és mértéke változik a kiválasztott gazdaszervezettel és/vagy vektorral. így például beiktatunk az egyik előnyös kiviteli módban egy stopkodont egy olyan szekvenciától lefelé („downstream”), amely egyébként egy membránon átívelő tartományt kódol. Ezeknek a memb15 ránon átívelő tartományoknak a jelenléte esetleg nemkívánatos egy rekombináns DNS-kifejező rendszerhez, mivel ezek azt idéhezetik elő, hogy a kifejezett fehérje a membránhoz kötődik és bizonyára inaktív lesz a gazdaszervezetben vagy a sejtvonalban. A membránon átívelő tartományra példák találhatók a fenti két cDNS-mintában, amelyet ,Λ” és ,3” típusként mutattunk be (a mintegy 2275-2355. bázisok közti szekvencia az „A” típusban és mintegy 2587-2667. bázisok közti szekvencia a ,3” típusban). Az „A” és ,3” típusok cDNS-ei lé25 nyegében azonosak ezeknek a transzmembrán tartományoknak az aminooldalán azzal a különbséggel, amely egy introntartományként tűnik fel a ,3” típusú cDNS 1178-1492. bázisai között.

A fenti „A” és „B” típusok cDNS-ei mintegy 95, il30 letve 105 kD-s fehérjetermékeket kódolnak. Ezek közül a fehérjék közül mindkettő nagyobb, mint az érett, aktív enzimek, amelyeket állati szövetkivonatokból vagy sejtvonalszekrétumokból tisztítunk. Ezeknek a primer transzlációs termékeknek mindegyike pre-pro-enzim, amely membránon átívelő tartományokat tartalmaz a kódolószekvencia C-terminális harmadában. Előnyös, hogy a stopkodon úgy helyezkedik el, hogy a kifejezett fehérje molekulatömege mintegy 75 kD, amikor az „A” típusú cDNS fejeződik ki (azaz a stop a 2025. és 2275.

bázisok között helyezkedik el), és mintegy 87 kD, amikor a ,3” típusú cDNS fejeződik ki (azaz a stop a 2340. és 2590. bázisok között helyezkedik el). Az egyik érett természetes amidáló enzim bizonyos tömegét mi tisztítottuk először.

Az érett alfa-amidáló enzim citoplazmás kifejezésénél E. coliban például előnyös, hogy azok a génszekvenciák, amelyek a természetes kiválasztó szekvenciát kódolják, el vannak távolítva, és egy iniciációs kodon van helyezve az alfa-amidáló enzimnek megfelelő érett fehérje rajtját kódoló génszekvenciától mintegy 50 nukleotidon belül, és a membránon átívelő tartományt kódoló génszekvenciák a C-terminális területben nincsenek transzlatálva. A beindító (iniciációs) kodon természetesen keretben van azzal a szekvenciá55 val, amely az enzimet kódolja, és néhány előnyös kiviteli módban ez fölfelé van a területtől, néha közvetlenül fölfelé.

Amikor az AE cDNS-t E. coliban fejezzük ki, rájövünk, hogy a természetes génszekvencia tartalmaz egy rejtett E. coli riboszóma kötőhelyet („RBS”) és egy

HU 220 464 Bl iniciációs kodont a természetes iniciációs szekvenciákon belül. Ez egy N-terminálison megcsonkított amidáló enzimfehérje termelését eredményezi. Bár ez nem akadályozza a kívánt termék kifejeződését E. coliban, a korrekt módon beindított és egy ezen belül beindított termék együttes létezése bonyolítja a rekombináns termék feldolgozását és tisztítását hasznos formává, ennek megfelelően nemkívánatos. Abból a célból, hogy eltüntessük ezt a nem várt, nem kívánt terméket, el kell tüntetni vagy a riboszóma kötőhelyet vagy a belső iniciációs kodont, vagy mindkettőt.

így például a jelen találmány bizonyos előnyös kiviteli módjaiban egy valin kodont, amely prokarióta rendszerekben egy beindító metionint kódol, pontmutációval egy egyenértékű, nem beindító valin kodonra változtatjuk a 661-663. bázisoknál (azokra a cDNS-ekre értve, amelyeket az „A” vagy „B” típus ábrázolásánál mutattunk be).

E helyett a pontmutáció helyett vagy ezen kívül egy másik előnyös kiviteli módban kiiktatunk vagy jelentősen módosítunk minden riboszóma kötőhelyet kódoló területet, amely egy belső iniciációs helytől éppen felfelé fordul elő és előnyösen minden riboszóma kötőhelyet, bárhol, ahol csak előfordul. Ezeket a módosításokat azért végezzük, hogy lényegében megszüntessük a belső beindítást úgy, hogy ne legyen megfigyelhető egy külön csík elektroforézis elvégzése után, amely a belső beindítás miatt kifejezett fehérjének felel meg.

Abból a célból, hogy kiválasztott, aktív alfa-amidáló enzimfehéijét kapjunk egy rekombináns eukarióta gazdasejtvonalból, el kell távolítani azokat a génszekvenciákat, amelyek a természetes génszekvenciák Cterminális területében található transzmembrán tartományt kódolják. Az „A” típusú cDNS-nél ezt úgy végezzük el, hogy a fehérjekódoló területet megcsonkítjuk egy stopkodon beiktatásával ott vagy annak közelében, ahol a természetes amidáló enzim transzláció után feldolgozódik bizonyos természetes rendszerekben, amint ezt később részletesen elmagyarázzuk. A „B” típusú cDNS-nél ezt szintén úgy végezzük el, hogy új stopkodont vezetünk be az enzimfehérje területébe, ahol a természetes „B” típusú amidáló enzim transzláció után feldolgozódik (lásd a későbbiekben). Nem szabad kizárni azt a lehetőséget sem, hogy bizonyos gazdasejtrendszerekben előnyös lehet a teljes, természetben előforduló génszekvenciák kifejezése. Mivel a B típusú cDNS tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyek egy fel nem dolgozott intron jellemzőivel bírnak, nehézség léphet fel ennek a cDNS-nek a kifejezésében bizonyos eukarióta gazdasejtekben. Ezek a sejtek esetleg nem termelnek hatékonyan mRNS-t a „B” típusú génből a párosán összekapcsolt donor- és akceptorhelyek jelenléte miatt. Az akceptorhely eltávolítása ezért szükséges lehet, hogy lehetővé váljék a „B” típusú AE cDNS hatékony kifejezése.

Rájöttünk arra, hogy a természetben előforduló 75 kD-s alfa-amidáló enzimfehérjének karboxivége a 709. aminosavhelyen túl (a „B” típusnál a 814. aminosavhelyen túl) van. Abból a célból, hogy a 75 kD-s fehérjét (a „B” típusnál 87 kD-s fehérjét) előállítsuk egy rekombináns DNS-gazdasejtben, egy stopkodont vezetünk be a cDNS-be a 716. aminosavhelynél (a „B” típusnál a 821. aminosavhelynél) levő lizinkodonjának mutálásával. Ezt a módosítást úgy végezzük el, hogy helyspecifikus mutagenezisre irányító oligonukleotidot alkalmazunk. Az ilyen mutagenezist sokféle úton végezhetjük el. Ezek az eljárások számos összefoglaló munkában megtalálhatók a molekuláris biológia irodalmában. Az az általános módszer, amelyet alkalmazunk, az alábbi irodalmi helyeken található meg: Taylor J. W. és munkatársai: Nucl. Acids Rés., 13, 8749-8764 (1985); Taylor J. W. és munkatársai: Nucl. Acids Rés., 13, 8764-8765 (1985); Nakamaye K. és Eckstein F.: Nucl. Acids Rés., 14, 9679-9698 (1986). Az ennek a módszernek a gyakorlati kivitelezéséhez szükséges reagensek egy „mutageneziskészlet” formájában az Amersham Corporationtól szerezhetők be.

A szekvencia mutációja, amelyet elvégzünk, az AAA lizinkodon átváltoztatása TAA stopkodonná. A mutagenezishez alkalmazott oligonukleotid beépíti ezt a változást, de egyébként a szekvencia azonos a természetben előforduló cDNS szekvenciájával annál a megfelelő enzimnél („A” vagy ,3 típusú), amelyet mutálunk.

Arra is rájöttünk, hogy az alfa-amidáló enzimfehérje egy természetben előforduló rövidített formája termelődik a „B” típusú fehérje feldolgozásával a fehéije belső területénél, amely egyedi a „B” típusú enzimfehérjére nézve. Ez egy olyan enzimterméket eredményez, amely mintegy 43 kD molekulatömegű. Anélkül, hogy valamely elmélethez kötnénk magunkat, úgy véljük, hogy az intronterülettől „fölfelé” levő DNS-szekvencia elegendő egy olyan polipeptid kódolására, amely jelentős alfa-amidáló aktivitást képes mutatni. Következésképpen azokat a polipeptideket, amelyeket könnyű kinyerni, és amelyek képesek alfa-amidáló aktivitást kifejezni, olyan cDNS-ek kódolhatják, amelyek jelentősen meg vannak csonkítva egy stopkodon behelyezésével valahol a „B” típusú cDNS intronterületében, közvetlenül az annak megfelelő hely előtt vagy után, ahol ez az intron hiányzik az „A” típusú cDNS-ből. Előnyös csonkítást eredményez egy stopkodon behelyezése az intronterület kezdetétől számítva 30 bázison belül, előnyösen közvetlenül attól lefelé. Abból a célból, hogy az alfa-amidáló enzimfehéqe egy előnyös rövid formájának termelése lehetővé váljék rekombináns gazdasejtekben, módosított cDNS-t alakítunk ki, amely a lizinkodon helyett stopkodonnal bír „B” típusú cDNS 436. aminosavhelyénél. Ezt a mutációt a „B” típusú AE cDNS oligonukleotid-irányított helyspecifikus mutagenezisével hajtjuk végre.

Míg az amidáló enzimfehérje rövidítése a stopkodon bevezetésével a „B” típusú cDNS 436. aminosavhelyénél olyan fehérjét ad, amely igen közel áll ahhoz, amely a primer transzlációs termék proteolitikus hasításával keletkezik (vagy más hasítási intermedierekhez a bioszintetikus útban), az amidáló enzimfehéije további rövidítése szintén aktív termék keletkezéséhez vezet19

HU 220 464 Bl hét rekombináns DNS-gazdasejtekben. Módosítjuk az AE cDNS-t több más úton, hogy a fehérje rövidebb formáit alkossuk meg. Az egyik példában oligonukleotidirányított helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk, hogy egy tirozinkodont, amely a „B” típusú cDNS 396. aminosavhelyénél található, átalakítsunk stopkodonná. Ez a változás - a cDNS transzlációja, majd feldolgozás után - olyan fehérjét eredményez, amely mintegy 39 kD hosszúságú. Egy másik esetben a „B” típusú cDNS természetesen előforduló BamHI enzimfelismerő helyét hasznosítjuk egy stopkodon bevezetésére kapcsoló (linker) mutagenezissel. Ez az eljárás jól ismert a molekuláris biológiában és egyszerűen a cDNS hasítását foglalja magában, amelyet ligálás követ egy kettős szálú szintetikus kapcsolófragmentumhoz; ez a fragmentum komplementer az elhasított cDNS egyik végéhez és egy megfelelő keretben levő stopkodont vezet be éppen a hasítási hely után. Olyan oligonukleotid-fragmentumot alkalmazunk ennek a módosításnak a végrehajtására, amely az alábbi szekvenciával bír:

5’ 3’

GATCCACTAATGATCA

GTGATTACTAGTTCGA 3’ 5’

Ez a kapcsoló egy stopkodont vezet be a 469. aminosavnál levő hisztidinkodont követően. Az így módosított cDNS transzlációja és feldolgozása egy olyan fehérje szintézisét eredményezi, amelynek molekulatömege mintegy 46 kD.

A megcsonkító stopkodon előnyös elhelyezése mintegy 15 bázispáron belül van egy olyan DNS-szekvenciához képest, amely egymást követő bázisos gyököket (általában Lys-Lys) kódol és általában közetlenül ettől fölfelé van. Anélkül, hogy valamilyen elmélethez ragaszkodnánk, úgy véljük, hogy a „B” típusú cDNS által kódolt természetes polipeptid dolgozódik fel olyan transzláció utáni módosítások során, amely az amidáló enzim természetes kifejeződése során történik egymást követő bázisos gyököknél vagy azokhoz közel, például azoknál a lizineknél (vagy azokhoz közel), amelyek a „B” típusú cDNS-intronterületen belül kódolódnak. Még akkor is, amikor a beiktatott stopkodonokat nem arra szánjuk, hogy megcsonkítsák a kifejezett polipeptidet a fentebb leírt módon, előnyös, ha a beiktatott stopkodon mintegy 20 bázison belül helyezkedik el olyan DNS-szekvenciáktól, amelyek egymást követő bázisos aminosavgyököket kódolnak, még előnyösebben közvetlenül azoktól fölfelé helyezkedik el. Stopkodonok beiktatása ezeknél a helyzeteknél a transzláció utáni feldolgozás után valószínűleg olyan polipeptid kifejeződését eredményezi, amely hasonlít bizonyos természetes amidáló enzimekre.

A prokarióta rendszerekben történő citoplazmás kifejezésnél előnyösen eltüntetünk minden szignálszekvencia-kódoló területet (például a korábban bemutatott mind „A”, mind „B” típusú cDNS első bázisait) és egy metionin beindító kodont iktatunk be mintegy 50 nukleotidon belül annak a területnek a kezdetétől számítva, amely az amidáló enzimet kódolja.

A prokarióta kifejezés egy másik kiviteli módja szerint eltüntettünk minden szignálszekvenciát vagy proenzimszekvenciát kódoló szekvenciát, és egy metionin beindító kodont iktattunk be mintegy 50 nukleotidon belül annak a területnek a kezdetétől számítva, amely az amidáló enzimet kódolja. Több természetes AE cDNSben ez annak a területnek a kezdetét jelenti, amely ser-X-ser-t kódol (X jelentése phe vagy leu). Lásd például a 124-132. bázisokat az „A” típusú vagy „B” típusú cDNS-ben. Bizonyos kiviteli módokban kívánatos lehet az alfa-amidáló enzim kiválasztása. Ebben az esetben előnyös megtartani a szignálszekvencia-kódoló területeket, vagy egy másik eljárás esetében olyan heterológ szekvenciákkal helyettesíteni ezeket, amelyek azonos funkciót szolgálnak, például a bakteriális OMP A fehérje szignálszekvenciáival.

Amint nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak, hogy az itt bemutatott és amidáló enzimeket kódoló DNS-szekvenciáknak számos mutációja és megcsonkítása lehetséges a találmány oltalmi körén belül, és az ilyen módosított szekvenciák is kódolhatnak olyan polipeptideket, amelyek amidáló enzimekként működnek. Következésképpen igénypontjainkat úgy szerkesztettük meg, hogy magukban foglalják a pontosan ismertetett DNS-szekvenciák, kifejezővektorok és gazdasejtek minden funkcionális ekvivalensét.

Azokra a prokarióta vektorokra, amelyek a célnak megfelelnek módosíthatók amidáló enzimeket kódoló DNS-szekvenciák befogadására, a találmányunk szerint, példák lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a pKK233; pKK322-2; pROK-1; pkT279,280,287; pPl lambda, pYEJOOl, pKC30, pROK-C vektorok, amelyek mind kaphatók kereskedelmi forgalomban. Azok között a prokarióta gazdaszervezetek között, amelyeket a jelen találmány szerinti kifejezővektorokkal átfertőzhetünk, találjuk (de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik) a C600, LE392, RR1, DH1 és SF8 törzseket, amelyek mind beszerezhetők kereskedelmi forgalomból.

Azokra az eukarióta vektorokra, amelyek a célnak megfelelően módosíthatók amidáló enzimeket kódoló DNS-szekvenciák befogadására a találmányunk szerint, példák lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a pMAMNeo; pdBPVMMTNeo; pRSV; peuK-Cl; pCHllO vektorok, amelyek mind kaphatók kereskedelmi forgalomban. Alkalmazhatunk megfelelő élesztővektorokat is. Azok között az előnyös eukarióta gazdaszervezetek közt, amelyeket a jelen találmány szerinti kifejezővektorokkal átfertőzhetünk, találjuk (de eljárásunk nemcsak ezekre korlátozódik) az IVI 10029 számon deponált vonalat, továbbá a Hela, CV1, C127, CHO- (kínaihörcsög-petefészek) és COS-sejteket.

1. példa

Alfa-amidáló enzimfehérjék kifejezése E. coliban

Abból a célból, hogy alfa-amidáló enzimet fejezzünk ki E. coliban (lásd a 2. ábra folyamatábráját), egy „A” típusú szekvenciával bíró cDNS-fragmentumot KpnI-gyel és HindlII-mal emésztünk, és izoláljuk a

HU 220 464 Β1 mintegy 2,1 kb-s fragmentumot. Abból a célból, hogy egy természetes érett enzimnek megfelelő aminoterminálist építsünk vissza, egy alábbi szekvenciájú oligonukleotid-kapcsolót ligálunk ehhez a DNS-fragmentumhoz:

5’ 3’

CATGTCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTAC

AGTAAAAGGTTACTTACGGAAC

3’ 5’

Az így létrejövő fragmentum egy Ncol-gyel összeférhető tapadós véget és egy HindlII tapadós véget tartalmaz. A pKK233-2 E. coli kifejezővektort a Pharmaciától vásároljuk, ezt Ncol és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük. A nagy lineáris fragmentumot izoláljuk és a linkerrel adaptált cDNS-fragmentumba Egáljuk. A ligálási keveréket kompetens E. coli JM105 transzformálására használjuk. Ampicillinrezisztencia alapján transzformánsokat szelektálunk, és az izolált kiónokat a rekombináns plazmidra elemezzük restrikciós enzimes elemzéssel és DNS-szekvencia-elemzéssel, hogy igazoljuk a kifejezővektor (a továbbiakban „pAE12”) szerkezetét, amelyet ezek a transzformánsok tartalmaznak. A kifejezővektor tartalmazza a hibrid trp-lac promotort, amely a lac represszorral van represszálva és indukálható a sejtek kezelésével izopropiltiogalaktoziddal (IPTG). A beindító metionintól fölfelé a vektor tartalmazza egy erős riboszóma kötőhely szekvenciáit.

Abból a célból, hogy az alfa-amidáló enzimet E. coliban kifejezzük, a rekombináns sejteket LB-tápközegben növesztjük rázatás közben 37 °C hőmérsékleten 0,4 OD₆₀₀ értékig. A tenyészethez IPTG-1 adunk 1 mmol/1 végső koncentrációig és a növesztést folytatjuk 37 °C hőmérsékleten rázatás közben 3 és X órán át. A sejteket a tenyészet centrifugálásával összegyűjtjük, és a felülúszót eldobjuk. A sejteket újra szuszpendáljuk olyan pufferban, amely proteázinhibitorok keverékét tartalmazza, lizozimmal kezeljük, majd ultrahangos kezelésnek vetjük alá, hogy a sejtmembránokat lizáljuk. A lizátumokat 12 000xg-nél centrifugáljuk, hogy elkülönítsük a sejtek oldható és oldhatatlan frakcióit. Az egyes frakciókat SDS-PAGE-val és a fehérje festésével elemezzük. Az alfa-amidáló enzimfehérje könnyen azonosítható, mint IPTG-vel indukálható termék az oldhatatlan fehérjefrakcióban. Mivel a kiindulási kifejezőplazmid nem tartalmaz az alfa-amidáló enzim génszekvenciák által meghatározott stopkodont, a keletkezett indukálható termék olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyeket egy lefelé levő vektor DNS határoz meg, az alfa-amidáló enzimfehérje-szekvenciák C-terminálisához fuzionálva. Ezenkívül az indukált oldhatatlan fehérje tartalmaz egy kisebb, amidáló enzimfajlagos fehérjét; ez olyan terméket képvisel, amely egy fehérjeszintézis belső beindításával keletkezik, ahol a belső beindítás egy rejtett RBS-nél és beindító kodonnál történik (221. aminosavhely az alfa-amidáló enzimszekvenciában).

Abból a célból, hogy eltávolítsuk a nem várt szekvenciákat a kifejezett termék C-terminális részéről, mutációt végzünk az „A” típusú szekvencia 716. helyénél levő lizinkodonnál, hogy kialakítsunk egy TAA stopkodont ennél a helyzetnél. A mutált cDNS-t ezután KpnI-gyel és EcoRI-gyel emésztjük, és ezt alkalmazzuk az eredeti KpnI-EcoRI fragmentum helyettesítésére a pAE12 kiindulási kifejezővektorban. Hasonló módon mutáljuk a „B” típusú cDNS-szekvenciákat az ennek megfelelő helyzetnél (821. aminosav), így alkotunk meg egy stopkodont, és a mutált „B” típusú cDNS-ból való KpnI-EcoRI fragmentumot alkalmazzuk a megfelelő fragmentum helyettesítésére a pAE12ben. Az így kialakított két kifejezóplazmidot, a pAE24et („A” típus) és pAE25-öt („B” típus) ezután JM105 transzformálására használjuk. Az így létrejövő törzset kifejeződés céljából tenyésztjük, amint ezt korábban a pAE12-tartalmú törzseknél tettük. A pAE24-ről úgy találjuk, hogy két IPTG-indukálható, oldhatatlan fehérjét tartalmaz mintegy 75 kD, illetve 55 kD molekulatömeggel, míg a pAE25-ről úgy találjuk, hogy két IPTG-indukálható, oldhatatlan fehérjét termel mintegy 87 kD és 67 dK molekulatömeggel. Ezen párok mindegyikében a kis fehérje képviseli a nem várt, aminoterminálisán megcsonkított terméket mind az „A” típusú, mind a „B” típusú termékből.

Abból a célból, hogy eltüntessük a fehérjeszintézis beindulását a rejtett belső riboszóma kötőhelynél és iniciációs kodonnál (221. aminosavhelyzet), a GTG startkodont (a GTG a met beindító ködönként szolgál baktériumokban) GTT kodonná alakítjuk, amely nem képes fehérjeszintézis beindítására, de amely valint kódol, amelyet normálisan ennél a helyzetnél találunk a természetes gének által kódolt alfa-amidáló enzimfehérjékben. Amikor a cDNS mutált területével helyettesítjük a természetes szekvenciát a pAE24 és pAE25 kifejezővektorokban, két új vektort alkotunk meg, a pAE31-et és pAE32-t. Az E. coli JM105 transzformálása ezekkel a módosított kifejezővektorokkal és a fehérjetermelés vizsgálata az így létrejövő rekombináns törzsekből azt jelzi, hogy a mutagenezis hatékony a nem várt belső beindítás kiküszöbölésében. Az IPTG-indukált termékről, amely a pAE31-et hordozó gazdasejtekből való, úgy találjuk, hogy 75 kD méretű, míg azokból a gazdasejtekből való termékről, amely pAE32-vel van transzformálva, úgy találjuk, hogy 87 kD molekulatömegű.

Mivel úgy találjuk, hogy a természetben előforduló, „B” típusú cDNS-ból származó amidáló enzim transzláció után feldolgozódik, hogy mintegy 43 kD méretű fehérjéket adjon, elkészítünk egy sor mutációt a „B” típusú AE cDNS-ben, amely lehetővé teszi azoknak a fehérjéknek a kifejezését, amelyek befejeződnek annál a helyzetnél vagy annak közelében, ahol a természetesen feldolgozott enzim befejeződik. Ezek közül a mutációk közül kettőt elkészítünk oligonukleotid-mutagenezissel, míg egy harmadikat egy adapterkapcsolós mutációval alakítunk ki, amint ezt fentebb jeleztük. Amikor az ezeket a mutációkat hordozó cDNSeket alkalmazzuk a pAE32 megfelelő szegmenseinek helyettesítésére, transzformáljuk JM105 törzsbe és elemezzük fehérjetermelésre olyan kísérletekben, amelyek a fentebb leírt kísérletekhez hasonlók, megcsonkí21

HU 220 464 Bl tott alfa-amidáló enzimfehéijéket mutatunk ki. Egy mutációval a „B” típusú cDNS 396. aminosavhelyzeténél, ahol a természetes tirozinkodont stopkodonra változtatunk (pAE36), egy 39 kD méretű enzimfehéijét találunk, míg egy kapcsoló-mutagenezis, amely a 464. aminosav hisztidinkodonjánál fejezi be a transzlációt, a pAE51 vektort eredményezi, amely egy 46 kD-s rekombináns alfa-amidáló enzimfehéijét termel az E. coli JM105 transzformálása és indukciója után.

Az összes fentebb leírt, E. coliban termelt rekombináns alfa-amidáló enzimről úgy találjuk, hogy a sejtextraktum oldhatatlan frakciójával különül el. Az enzimet 8 mol/1 karbamiddal végzett kezeléssel, majd 50 mmol/1 trisz.HCl-lel (pH 7) végzett hígítással tehetjük oldhatóvá. Amikor pAE12-t hordozó E. coli JM105-öt növesztünk és IPTG-vei indukálunk, amint fentebb leírtuk, az alfa-amidáló enzimfehérjék legalább 30 mg/liter baktériumtenyészet szinten vannak jelen.

Az AE kifejezőplazmidot hordozó E. coliban termelt indukált oldhatatlan fehétje reprezentatív mintáit a 3. és 4. ábrán mutatjuk be.

2. példa

A pdBPV-MMTNEOa-AE_A75 emlős-kifejezővektor kialakítása

Abból a célból, hogy olyan emlős-kifejezővektort alakítsunk ki, amely emlőssejtekből 75 kD méretű, „A” típusú amidáló enzimet fejez ki és választ ki konstitutíven (lásd az 1. ábra folyamatábráját), a következő lépéseket hajtjuk végre:

1. A pdMMTNeo köztes kifejező vektort (amely az

American Type Culture Collectionnél szerezhető be) (amint bemutatjuk) BglII-vel emésztjük. A lineáris formát izoláljuk és tisztítjuk.

2. A rekombináns „A” típusú cDNS-t, amely a teljes pre-pro-szekvenciát tartalmazza és tartalmaz egy mesterséges TAA stopkodont a 2146-2148. helynél, izoláljuk BglI-gyel és Xhol-gyel egymás után végzett emésztéssel. Az alfa-amidáló enzimnek megfelelő fragmentumot azután izoláljuk és tisztítjuk.

3. A beiktatást („A” típusú alfa-amidáló enzim) és a vektort (pdMMTNeo) összekeverjük, és a megfelelő végeket tompa végűvé tesszük, DNS-polimeráz I KJenow-fragmentumot alkalmazva. Az 5’ túlnyúló szegmenseket visszaemésztjük, hogy tompa vég alakuljon ki (egy másik eljárás szerint egymás után SÍ nukleázos és Klenow+dNTP-s kezelést alkalmazva a tompa végek kialakítására). A tompa végű molekulákat azután 16 órán át ligáljuk 15 °C hőmérsékleten.

4. A ligáit anyagot azután E. coli RRl-be transzformáljuk. Rekombináns kiónokat választunk ki 50 pg/ml ampicillin jelenlétében. A beiktatás orientációját a rekombináns kiónokban egy sor restrikciós enzim alkalmazásával igazoljuk. Az egyik klónról, amelyet pdMMTNeoa-AE_A75-nek nevezünk (11. klón) meghatározzuk, hogy „A” típusú cDNS-sel bír az MMT-re nézve korrekt orientációban.

5. A rekombináns pdMMTNeoa-AE_A75 plazmidot (11. klón) BamHI-gyel emésztjük. A linearizált vektort izoláljuk és tisztítjuk, majd bakteriális alkalikus foszfatázzal (B.A.P) kezeljük 2 órán át, hogy eltávolítsuk az 5’-foszfátokat. A BPV-1 genomot izoláljuk és tisztítjuk a pdBPVMMTNeo vektor BamHI emésztését követően. A BPV-1 DNS-nek ezt a BamHI fragmentumát, amely mintegy 8,0 kb méretű, azután a BamHI-gyel linearizált és B.A.P.-vel kezelt pdMMTNeoa-AE_A75 vektorba ligáljuk 3 órán át 14 °C hőmérsékleten. Miután a ligálási keveréket E. coli RRl-be transzformáltuk, a rekombináns kiónokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agar lemezeken választjuk ki. A rekombináns plazmidokat PBV DNS-re elemezzük, és elemezzük „A” típusú AE cDNS-re is. A restrikciós térképezés feltáqa, hogy a 21. klón mintegy 17 kb méretű és olyan restrikciós térképet produkál, amelyet várunk. Ezt a kifejezőplazmidot alkalmazzuk azután az a-AE_A75kifejezésére egér C127 sejtekben.

6. Egér C127 sejteket fertőzünk át 20 pg pdBPVMMTNeoa-AE_A75-tel a standard kalcium-foszfátos kicsapási technikával. Az átfertőzés után mintegy 2 héttel a transzformált fókuszokat egyenként felvesszük és átvisszük G418 antibiotikumot tartalmazó növesztő tápközegben és ebben növesztjük. Amikor a sejteket megfelelő kapacitásra növesztettük Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben (DMEM), amely még 10% borjúembrió szérumot is tartalmaz, a kiónoknak megvizsgáljuk azt a képességét, hogy alfa-amidáló enzimet választanak ki; ezt az enzimatikus aktivitás mérésével végezzük a kondicionált sejttenyésztő tápközegben, valamint az alfa-amidáló enzim immunreaktivitásával mérjük a tápközegben, standard radioaktív jelzési és immunkicsapási technikákat alkalmazva. Az aktív, immunreaktív, 75 kD méretű alfa-amidáló enzimet kiválasztó kiónokat felszaporítjuk nagyszámú sejtté (a sejttenyésztő tápközeget átváltva csökkentett szérumtartalmú és ezáltal csökkentett exogén fehétje szintű tápközegre) és felhasználjuk nagy mennyiségű aktív rekombináns enzim előállítására a sejttel kondicionált tápközegből.

Az itt használt meghatározások és leírások az előnyös kiviteli módokat világították meg és csak illusztrációként szolgáltak; ezek azonban nem azt a célt szolgálják, hogy korlátozzák a találmány oltalmi körét. Számos olyan változat létezhet, amelyet a szakterületen járatos szakember a jelen találmány ismeretében megvalósíthat, ezek is az alábbi igénypontok által behatárolt oltalmi körön belül vannak.

3. példa a-Amidáló enzim expressziója pAE68 vektor segítségével

Kínaihörcsögpetefészek (CHO)-sejteket transzformálunk pSV_2neo és pAE68 plazmiddal. A pAE68 plazmid úgy állítható elő, hogy az α-amidáló enzimgén 2,8 kb méretű fragmensét a pSV₂-dhfr szülőplazmid Hindii! helyére toldjuk be. Az α-amidáló enzimfrag22

HU 220 464 BI mens tartalmazza a génhez tartozó endogén szignálszekvenciát és úgy van módosítva, hogy az enzim 75 kD oldható formáját expresszálja. A pAE68 plazmid a következő primer elemeket tartalmazza: ampicillinrezisztencia-gén a plazmiddal transzformált baktériumok szelektálásához, amit a CHO-sejtek transzfektálásához felhasználandó plazmid-DNS előállítása érdekében végzünk; valamint a dicisztronikus gének, α-amidáló enzim és dihidrofolát reduktáz, az SV40 promoterről átírva (lásd az 5. ábrát).

A CHO DG44 gazdasejtek transzfektálása után a transzformált sejtek tiszta tenyészetét állítjuk elő, metotrexát emelkedő koncentrációival szembeni rezisztencia alapján szelektálva. A végső sejtizolátum, a B3/A1-7 az α-amidáló enzimet a tenyésztőközegbe 15 expresszálja. Adaptált sejtek szuszpenzióit tenyésztjük 250 ml-es forgó lombikokban, 50 ml-es tenyészetekben 25 napig. A tenyészközeget kéthetente frissítjük. A kivett, kondicionált mintában megszámláljuk a látható sejteket, és meghatározzuk az α-amidáló enzim aktivitá- 20 sát. Az egyes mérések eredményeit a következő táblázatban foglaljuk össze:

Tenyésztés ideje (nap)	Sejtszám (10⁶ sejt/ml)	Aktivitás (cgység/10⁶ sejt/nap)
1.	0,68	4 589
4.	0,50	17 336
8.	0,40	5 365

Tenyésztés ideje (nap)	Sejtszám (10⁶ sejt/ml)	Aktivitás (egység/10⁶ sejt/nap)
11.	0,75	3 305
15.	0,53	4 353
18.	0,40	6 425
22.	0,40	7 453
25.	0,60	3 786
1-25. nap átlaga	0,53	6 576,5

A kondicionált tápközeg amidáló enzimaktivitását a fluoreszcens jellel jelölt modellpeptid, danszil Tyr-Val-Gly (YVG) amidált termékké, danszil YV-NH₂-vé alakítása alapján határozzuk meg. A danszil YVG enzimatikus úton amidált termékké történő alakításához különböző kulcsfontosságú komponensek szükségesek, így réz, aszkorbinsav, káliumjodid és kataláz az enzimreakcióhoz. Az α-amidáló enzim aktivitásának mérését a következő össeztételű oldatban végezzük: 30 mM kálium-jodid, 10 mM aszkorbinsav, 0,67 μΜ réz(II)-szulfát, 20 μΜ danszil YVG és 198 egység/ml kataláz. Az egyes vizsgálati időpontokban HPLC útján értékeljük ki a danszil YVG danszil YV-NH₂-vé alakulását.

Az átlagos α-amidáló enzimaktivitás mintegy 6577 egység/10⁶ sejt/nap volt a kísérletben. Az 50 ml tenyészetből 8 kinyeréssel összesen 1,3 xlO⁶ egységet gyűjtöttünk össze.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK ként a membránon átívelő régiótól felfelé és attól olyan távolságban lefelé, ami lehetővé teszi egy legalább

-------- ---- -1-. - - , , , - . t---- . . ___. . a_____. . *____ ‘_a_____I_.----1 -____- . -_1_

HU 220 464 Bl

AGATTAAŰCACGCATCATTTGGAAGGAATeTCTTTGCCATTTCATATATACCAGGTTrCCTCTTTGCCCTAAACGGGAAGCCTTACTTTGGAGACCAAGA

---« - - - - —* -- - —>------ . _ - - . t _ .______í____________ ...4 . . . . . <____......

HU 220 464 BI

3214

GTTAGAACACTATTTTTCAGAATCTGAATGTAATTTGTCTAATAAAGTGTTTCACAGCATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

HU 220 464 BI

ATACAGAGTAAGAAACGOÁCAGTGGACACTGATTCGACGCCACAACCCCCACCTCCCACAGCCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTT

......- . I . ------ . - I ... .-------..... · - - i .

HU 220 464 Bl u>

m α» <D u*» trt <o

Irt Γ*

< o < > u· < í- — < Ί <9 V9 <9 < 1 < < UJ < H C9 V9 ί- < X O C9 < ο < < O < C9 Ι- O VJ ⁴ VJ < VJ ·— Η» · Ο o < < < < o <9 < w O < X <9 < VJ o. C9 < < LU < VJ < ►— - C9 < VJ ’ a. ♦— - <9 * O o < VJ < z < ί- VI < <9 < VJ ο O < o ►»· €9 X < VJ < >- < VJ x O ⁴ h- < u < σ (9 <9 UJ VJ VJ < w o í— ·—· O < < o < ►— X VJ C9 < - o ί-« < · < « X < - O o *- VJ C9 ί- < ί- -Λ (9 < Ο <o < h- ί- > VJ < C9 X ί- α VJ ί- < O < <9 Ο co O C9 < X. CJ I— ί- u ί- VJ ·< ί— W α <n c- C9 O ί- O < fr· H· < - ·— « X C9 - V9 · U ' o < < w H· H· O Ο >- < o C9 C9 < o < <9 C3 O <9 < UJ < VJ <9 1 O < 4 C9 4 < · UJ H· ‘ O CJ X < <9 C9 o VJ < <9 C9 ί- «4· ί- <9 X >- < ο < VJ < o - O << < Ί X < - CJ ’ < X <9 -< UJ CJ o ί— < €9 < o a < UJ < €9 VJ ί o <9 «9 C9 <9 < < < * X €9 < ’ o VJ < < << o <9 (9 fr- <9 < X < VJ V9 < «< UJ <9 < < - UJ < « O- H- · Cg . €9 <J ί- < VJ < < < < M €9 VJ O ί- ί- < < i£ <J < α <J VJ < C9 ·— - < X VJ ' C9 ’ O X VJ O VJ CO O < VJ ►- ·— ·— ♦— <9 < X <9 O <9 <9 o »- VJ <9- X <9· VJ · < · < < <9 C9 C9 < UJ CJ <9 «J < <9 I- u. VJ <J VJ 1—» < X < C9 <9 ' C9 VJ ’ VJ ‘ VJ · co »- · <9 VJ <0 <9 fr- ►- ί- ·— ►- X < Ο ί— í- < < >- C9 < ί- -i <9 ►— < O- VJ ’ »— - X VJ ’ C9 · »— U. < < u_ ►- ·— a < ►» H- <J C9 <9 C9 ί— »- <9 < o < O ' < « >· <9 ‘ C9 · ί* X »- O <9 o < -< <9 V9 V9 VJ C9 ►- < < a C9 O O · x <J ’ <9- < « O VJ - < VJ < C9 VJ < O C9 VJ a. C9 C9 o X < VJ UJ < <9 < UJ < <9 VJ < - a - < « < - ►- · O < C9 << . H· _i <9 C9 ►· X VJ ►- V9 €9 < H- > < C9 ♦— •J VJ <9 H- ►- O - < ’ >- ♦— * <9 * CJ · < 9— VJ CL < *- ί- ·>« ί— VJ < UJ < < < > H- <9 < »— fr— < C9 < - o (9 < · < UJ < < <9 ►- X <9 CJ ί- < VJ CL a < Ο O VJ VJ < UJ <9 C9 ί— — VJ <9 <

UJ <9 H < VJ O · ►VJ <o <9 2 < < X VJ < o X UJ C9 fr- < σ < a *- o o X VJ · I— · >- <g o X VJ <9 < o < ». u. V9 VJ ί- -4 >— < o o í- UJ tg VJ < >- H- VJ - <o VJ b- « «< - >- h- C9 <9 >- ί- VJ C9 »— · >- í— t— u. < C9 1— U. V*· VJ X W · <9 »_ . VJ »- 4 U- Cg VJ < ί- ί- _ι <g *- -J ο Ο UJ < << o V9 X <9 < < X < - t- -< -J o · « ú* VJ <9 <0 C9 C9 co VJ < < W «t < >- O < C9 *- < o o < < UJ <9 O 1 €9 C9 <3 J- > ί- <9 o h- <9 H- u. ί- VJ < < ί- Ο «η €9 <9 C9 ►— < co < - C9<« O - CO CJ - VJ X »- Ι- o (Ο VJ VJ X Ο ί— Q* <9 VJ < X ej cg X <9 < ο V9 X < ' o <g V9 1“ <9 tg o »— VJ <9 ί- -J VJ a H- Ο 1* V9 < a o VJ* »- <9 · O - ί- - —— ί- . -j C9 o ο O X < VJ <o ί- ω >- < UJ í- C9 cg C9 ⁴ < > ί- 4 < UJ >< <9 o < C9 < Ul ί- C9 < V9 < X ί- H· _J < . VJ < χ VJ - << * UJ O » < · CJ <9 C9 < a ί- < a V9 <9 X VJ H· ί- VJ <9 <9 <9 < ' X ·— C9 O · X VJ < X < O VJ O O X o t- Lu CJ < < ο >- u. o C9 χ < - >- · < - X ί- - Cfl X t- o ί- — < < Q o X CJ <9 »~ X ο < X ί- ί- > VJ ' €9 ’ <9 ►— · Ο ‘ o <9 ί- — €9 < < b· < O CO C9 Ο UJ <9 > Ο C9 X VJ · O ’ ί- * •m ·< o X < << ·< VJ VJ ί- hJ Ο < a < Ο ο Ι- C9 < UJ o < >> < C9 ' < · X Ο ’ €9 X < < Ο VJ X <9 VJ VJ X ►- > < < < ω Cg - < < UJ <9 « Ο - a < V9 < X < *— <9 < UJ VJ C9 X ί- C9 co CJ »- Ο co »— « *>· ί- »— · ί— · •Μ C9 < Ο o X AT o 2 VJ < o V9 Ο X tí C9 V9 C9 ο CO - Cg - »— - _J C9 ' < X «< O <9 <9 < < ω o C9 UJ ♦- CJ o < ί- C9 o o <9 ί- . -J €9 ¹ <9 C9 O ⁴ Ο t— C9 <9 > ί- <9 J- C9 Ο C9 ♦— o X V9 ο X < VJ O C9 <

CCCrTCAGCATACATACACATCGAAATTATTGGGTCACAGATGTGGCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCTCTCTTAA

HU 220 464 Bl

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy A típusú DNSszekvenciát tartalmaz.

6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy B típusú DNS- 5 szekvenciát tartalmaz.

7. Az 1., 2. vagy 4. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy pdBPVMMTNeo, pRSV, pMAMNeo, peK-Cl, pCHllO vagy ezek származékait tartalmazza.

8. Prokarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektort tartalmaz.

9. Eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti exp- 15 ressziós vektort tartalmaz.

10. A 9. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a következők valamelyike: ATCC CRL 10919, Hela, CV1, C127, CHO, COS.

11. Eljárás rekombináns peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy az enzimet valamely, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vektor expresszáltatásával állítjuk elő.

12. Eljárás rekombináns peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzim előállítására, azzal jellemezve, hogy az enzimet valamely, a 8-10. igénypontok bármelyike szerinti gazdasejt expressziójának indukálásá10 val állítjuk elő.

13. Eljárás amidált termék előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő szubsztrátot valamely, all. vagy 12. igénypont szerinti eljárással előállított peptidilglicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzimmel hozunk érintkezésbe.

HU 220 464 BI Int. Cl.⁷: C 12 N 15/53

B«m

BamHI

ATG

TAA

BglI

A típusú flíAE ,SI nukleáz

Xhol

Klenow+dNTP

HU 220 464 Bl Int. Cl.⁷: C 12 N 15/53

EcoRI

Emésztés

KpnI+HindlII

PvuII _ Ncol Piti HindlII |AQQA|AACAQAtCATQ CfcT QCA Qbc'AAQ OTT¹ m»t «ι« «ι· ala ly* lau

Emésztés

NcoI+HindlII

A 2,1 kb-s KpnI/HindlII Ncol fragmens izolálása _KpnI

I

A 4,6 kb-s linearizált vektor izolálása

HU 220 464 BI Int. Cl.⁷: C 12 N 15/53

---- ..-1-.1....1.. - I.....I . . . - A . I ~ . . Λ - . . 1....... . ... . . . . . _ . ,

fr— . ·— < ή < < - Ul C3 - < O O < ο < >- fr- O < U1 ο Cl < z €9 Ο < Ul o < < σ ο < Cl 1 Cl · CI ►- ·- Cl * u < < < X Cl <9 < X fr— Cl fr— z <9 < CI α. ο fr— < Ul < CI Ul o <9 1 Cl ' Q. fr— . ο - Cl ’ <j < Cl < ζ < fr- <J O < CI << Cl C9 < O fr— ο fr— ε < Cl < >- fr- Cl ' Q. O ·— - ο o fr— CJ < σ <3 ο Cl Ul Cl Cl X < o fr— <9 < Ul < < fr— ε Ο ο <9 O fr~ 4 <- <- X < - < · CJ fr— < ο ο oz Cl < fr— _ι Ο < o CO < *- Ι- > CJ < o CC fr- Ο Ο ·< o < · Cl · < fr— < Ο ‘ < CO u <9 X Cl o fr- U_ fr— Ο < a fr- O co Ι- C9 CJ Ι- <9 < Ι- > Η· o fr- - ε O- Ο - Cl - CO < · < < χ fr— Ι- Cl Ο ►- < < ο Ο Cl < Q < ο ο az o <9 < Ul < Cl <5 <3 < 1 O < <4 U1 ►· Cl eu < ο ο <3 o <j < x ο ο ί- M fr- < ο <4 ►- ο ej < Cl fr·· _l fr- C9 < z «< - ο η Cl- X <9 < U1 CI < fr— > < ο < o < O Ul < ο CJ fr— Cl O ο ο ο fr— < z < J €9 < X o Cl < < < < €9 <9 Ι- -I < o < x < Ο < X < < < Ul ο < fr- Ul < - O- fr-« -1 ο · Cl· CJ Ι- < CI < o o < < X ο ο < fr— fr— < X ο Cl <9 Ο Cl < fr·· > <J fr- < < X ο ο - OZ Cl CJ CI <ο ο CJ Cl fr— fr- ►- Ι- > Cl < X 1— Ο <3 <9 Cl ί- —1 CI fr- fr- * ε O· ο · < X <- < O C9 ο < o bl Cl O -J < < fr- u. Cl C1 ο -< CJ fr— < X C ο < <3 Cl ⁴ CJ . ο «ο I— · <-> 1 u <0 <9 ►- fr— M· <J fr- fr- ε I- · < fr. fr- fr— < >· ο fr- <9 Ι- < Ul o Cl’ fr- . ε Ο « ο« O ” U. < < κ U. fr* < ci < fr— 1— ο ·< Cl C9 fr- 1- ο < >> fr- O ο < C9 < « >- O ο ·— < « fr- H- ε Η» C9 <9 o < < ο C3 ο <. < x CJ ο fr- Cl < < ο ο Cl Ι- <k£ o« <9- <« ο Cl ’ Ο · o < o ο < Q < €9 Cl Ο- ο ο fr- < < Cl < U1 < Cl < Ul < ο ο co Cl C9 ' < Χ < · fr- · fr- < O < 1— ο < w ε Cl κ· €9 C9 fr— < - ►— 5* ο Cl Cl O Ι- . >· fr- o < * >· Ο · Cl ’ co fr- - ·- <J Ο. < fr- < fr- Cl < Ul < < X >- fr- ο Ul fr- ί- fr- — < ο o o α < < < · Ul < - o >- ε < ο Cl fr- o < Cl 0. <9 o <3 Cl Cl < Ul (9 »— ♦— — o ο < X <

GGCTTGAGCATACATACACATGGAAATTATTGGGTCACAGATGTGGCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCTCTCTTAA

HU 220 464 BI

........-1. . - ------...---......---.... . . , ,..... - .... .... . . . ... . .......

AGCATTCTCAGCCTGTGGCAQTGAAGAGAACCAACCTGCCACACGACGAAAAGCTGCTAAATCTCTTCTATTTTTTTAAAATCACTAACATTATATTGCA

- ------- - ......I .....I l·. ... . ........ .... ... . . . . ... . .... .

ATGACAGAAATTTTAAAAAGTCTCTATTTAAATTCTTTTTTTAAATTTCTCCTCAttTTGGTGTCTTTCCGGGATGTCTTATTTTTTTAGATGGTTACACT

- _ ‘ ‘ ‘ ‘ .....¹.........»___ . - - .___¹..... -_' ..... *_._._. .

HU 220 464 BI

3214

GT TAGAACAC T AT T T T TCAGAATCTGAATGTAATTTGTGTAATAAAGTGTTTCAGAGCATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

HU 220 464 Bl

ATACAGAGTAAGAAACGGÁCAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCACCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTT TT

- ---.--- . * _ — - A — .. .» - - «-----»>· . - » ---· - - - ⁴ - - - - - - *---- ....... _

HU 220 464 B1 «Λ <Λ

0» <·> § «Α co

GGTGA7ATACTGGCAGCCACATGTGTGTTCACTGCTGAAGCGAGGACACACCCCACCCACATCCGCCCCACTTCTAGTCACCAAATGTCTAACCTGTACA

-----1 -----A - - . . t----. t______ _____I . .... 1___ . . <___.x___ ____.

a

►— o o X O ίΟ X X ' o < σ 1- . 1— < <9 Η 11— U. Ο ’ 11- <ο »— « 1X o O < X 1— ι- ο ο_ ο > CJ < 1— U. Ο ο o X 1 X C9 1 »- . Ο C9 1- 1— X Ul <9 ο ο X 1- «Μ < C9 w X < ο X X X < < < X Ι- ο 1- X σ Ul < Ο (L ο X - Q W· J O « »— J >· <-) ο ^J I— ’ O Ι- <9 (9 ο Ο£ ο ο 1— Ο 1- X 1— < X ►— X X X < »— —· ο X ο o o «3 <9 < ο </> ο ί- i- X Ul < ' ο - ŰL 1— · ο a. O < Ul < ο ο ο o O Z C9 C9 < >- ο o O σ C9 Ι- Ι- —J Μ I- χ H- O -J Ο Ο X - X « X <9 «J o · ο · ο ο I— o O 1— C9 ο ο α. ο X o €9 H- Ι- -1 < ο ί- <9 • X Ul < Ο < X ο ο u> O < Ul Ul < ο < ο Ι- te C9 Cfl ⁴ 1— ' > < ' ο ο ί- I— X < (9 ο Ο£ ο ο ο X o <o (9 ο ο </> ο X X X K· Ι- -J Ι- ►— X o X X o Ο Ο CO ο 1- O « X - o - vt C9 H < < - >- ►- ’ 5 w 5 Ul H· o ΙΟ > < ο ·< ΙΟ ΙΟ o O o Ι- ο UI ο <9 Z Ι- < Ο α. Η» €9 ο o Ο Π* Ul j ο < I- J U. Q Ο ’ X X o α- I— ί- UJ π- Ι- €9 o 1- Μ ο ο ι- Ο Ι- < < Η» U- ο X Ο χ 1- 1- X UI ο O · tt. o < «1 1- « > ι-« ο · • 1— · O o 1- o €9 W ο O X z €9 < ο <π X X X o Ι- < ί- ο X te <9 Ο ο ο ο X O 1- < Ί Ul I— · Ί · UI ο ' I— Ll <9 <9 h- ο ο ο ο ί- X X C9 ο 1- Ι- ο ο X >> Ul 1- Ο (Ο <9 í— <9 C9 ο 1- 1— < 1- O <9 · z < ’ ζ < - X « o Π- < X < < ο <9 ο X a <9 < ο 1- < ο ο <9 >» U < I- -J ο X X C9 Ul a. 1- 1- < Ο ο í— O · Ul 1- —· ο < ο · ο X o 1— < < ο <9 ο X 1— X < Ul ο ο << ' ο 1— t— ui <9 -J ο ο X X z 1- ο ο Ο ο X · X ’ I— ’ 1- « ο* < · UI ο X Ul X C9 Ι- >► ο C9 ο O u* 1— ♦- Ο ο <ο 1— X O X C9 < < ' ο ο C9 O o C9 Ι- < <9 W C9 X ’ z < ' Ο · ο < <9 < « Ο ' i- u> Ul < ο Ο ' < X X O CO X <9 ο β) ο ο X <J X C9 Ι- < X ο ο o <9 < Ul Ο < UI Ι- o · <n Ul ‘ <9 - · <- <9 Ο · ►» X o Ul €9 ο ο << ' ο O < < ο ο X ι- te C9 €9 €9 < Ο ι- <9 <9 <9 ο C9 UI ο ο · <9 ‘ < · Ul (9 ’ ο < < · ο ο - X z b C9 Ο «0 1— C9 ο X ·— Ι- Ι- U- ο <9 x < X Ο Ι- Ο <13 ο ♦— X ui < <9 C9 Ο ο X · X « >- O « C9 ’ ο - < ο · ο · <9 Π- — Ο ο <9 ο ο 1- > O < Ο 0- ο €9 1— C9 I— < Ο ο Ο Ι- I- C9 < Ul €9 < < UI Ο te C9 < · UI < Ο ' Ο ' o Ι- €9 C9 ο «ο < ο X X < σ < I- Ο W X O C9 <9 Ul Ο Ι- < < ο C9 <9 Ο Ul << X ο ο X « <9 ' I— * > Ο * <· ο «ο π- · X O 1— C9 ο Ο) < << ο Ul X o < < < X ο ο (9 €9 < Ul C9 < Ι- > X Ι- 9» X C9 ί- -J ο Ο ο Ο X Ul I- ' ο ο · < · Η· ' o <9 »— < Ι- ο ζ ο o Ól Ι- < < X Ο ο ο o Ο «Ο o < ο ο Ι- (9 1- <9 o C9 ο ο Ο

<Λ <n

ΙΛ tn l/Y «Λ

GTTAGTTGGTGGATGTAAATAGCCCTATTCTCTCCTTGAACACAGTATTCTCCCAGTCCACACCCATCGCCAGTGTCTTTCTTTGGTGCCTTTCCTGTTC

1. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemez- 43 kD méretű enzim expresszióját, tartalmaz egy stopve, hogy tartalmaz egy transzkripciós promotert, ame- kodont, és az említett DNS-szekvencia a következők valyet lefelé egy peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxige- lamelyike:

názt kódoló DNS-szekvencia követ, amely egy, egyéb23

HU 220 464 Bl

ATACACAGTAAGAAACGGACAGÍGGACACTCATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTCCCACACGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTTTT

HU 220 464 Bl

3214

GTTAGAACACTATTTTTCAGAATCTGAATGTAATTTGTGTAA7AAAGTGTTTCAGAGCATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA sa

HU 220 464 Bl

B típusú szekvencia

145

GGGATGCTGCCAGTŰQGACCAGGTTCCQAATGATGACTGCCCGGCTCTGCCCGATAGCCCTCACAGCCCCTGGCATTGCGAGCGATAAGGACCCTGCTCC | - · - - ---- - — ¹----------- ----------- » -----i - - - ......· - - - . ...

TCCAGCCCTGTGGCTGCCACCGGCTCTGGCCGCTCTGGAGGGCGGGCGGCTCCAGCGGGCGGGCGCAGCCGACTCCAGAGCCGCTTCCCACGCGTCGGGA

ATACAGAGTAAGAAACGQÁCAGTGGACACTGATTCGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAeeCTTTCTACCCTGTGGAACACCCCGTTGATGTTACTITT

HU 220 464 Bl

CO U7 « $

1Λ «Λ tO

C* u>

Ul

U>

W)

GGC77GAGCA7AGA7ACAGA7GGAAA7TATTG6GTCACAGA7GTGGCTCTCCACCAGGTG77CAAA77GGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCC7C7C77AA

GGTGATATACTGGCAGCCAGATGTCTGTTCACTGGTGAAGGGAGGACAGAGGCCACCCACATCGCCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACA

HU 220 464 BI

HU 220 464 Bl

2. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy egy transzkripciós promotert tartalmaz, amelyet lefelé egy peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenázt kódoló DNS-szekvencia követ, amely egy, egyébként a membránon átívelő régiótól felfelé tartalmaz 5 egy stopkodont, amely az A típusú szekvencia esetén a

2025. és 2265. bázis között vagy pedig a 2268. és 2275. bázis között, míg a B típusú szekvencia esetén a 2340. és 2477. bázis között vagy pedig a 2480. és 2587. bázis között helyezkedik el, és az említett DNSszekvencia a következők valamelyike :

HU 220 464 Bl

< X o < >- »— < ♦— — < Ί 49 O L9 »— - a < Z 49 e 49 < < O C9 »- · _í cu < LU H- - -J lu o < < LU lu <9 < U < Z 49 < LU < UJ < C9 h - 49 - LU · CL· C9 » 49 o ·< LU ►- >> LU <9 C9 49 <9 < Q C9 >- x < LU C9 49 < · LU ‘ CL <9 C9 < lu < a k- < LU lu LU U <9 ►- MM 49 »- LU < ►- £ < · O H- - <« H· « >* <9 lu ►“ < C9 *- < ►- C9 €9 <0 < t— < o < C9 as LU W · < LU < <U LU <Zr LU <9 C9 49 ►» ·— u ♦- €9 Ι- Ι- <9 <o Ο ►- Ο < LU a. < - 1- 4 x L9 « LU « o < <9 <9 ♦- < >- 49 < a << h· LU <9 -< uu «9 49 « 49 < < <9 - €9 LU a. << ►· 4U LU w LU ·— MM »- ‘ < < >- (U LU W « 49η <« z <9 · X <9 -< fr- >> LU > < <9 u <9 < UJ '< LU »- LU C9 C9 49 < ’ < ⁴ Z -< C9 lu < LU < H· lu €9 <9 <U a. 49 < w << LU a < ·< UJ €9 < J UJ < J C9’ <9 ’ □t 49 LU < < < < LU O I— < < Q < <9 LU LU €9 a < « << - X 49 < 49 LU LU K -J < LU ►- H- . LU €9 < < X < 49 <9 €9 LU < UJ 49- 1— - X C9’ 49 χ < < <9 «9 < < LU LU <9 UJ 49 ►- u. LU <9 »- Ι- < X < 49 C9 Ο LU < UJ 49 LU OT L9 <9 W X <9 u < K > < tel C9 49 cu * LU « μ. , X *- ►— U. < ·< X LU < LU 49 <9 LU Η» > 1- €9 »- u. <9 ’ < · >* <9 ♦- »- »— ►· X ►- 49 tu < << < o H- < LU €9 < < < a C9 (9 · K LU ’ <9 ' <- o < LU < <9 LU- LU €9 LU a. 49 lu < < LU < Ul <9 UJ -< 49 < · 49 < · w < < LU < 49 < »- tej 49 >- X LU »- 49 < ·* > < fr- _J (U ⁵ L9 > 4U * < - >- H- - 49 - < LU a. < fr— te. ·— LU < UJ < >- »- 49 >— 1- k* mi < < · a <9 · < · < · UJ (9 ►- X < 49 w < LU CL 49 <9 <9 LU LU < ' LU 49 —· LU 49

<

lu lu o

<9 <9 <

<

U €9 <

<9 <

LU

LU <

49LU h<J <9 €9

LU

LU <

<

LU >49 ‘

LU

LU <49 u>

AGTTTGGCCCTTGTGCCTCATTTGGACCAGTTGTeTQTCGCAGACAGGeAAAATGGCCCAATCCAATGCTTCAAAACTGACACCAAAGAATTTGTGAGAG

HU 220 464 BI

32Η

GTTAGAACACTATTTTTCAGAATCTGAATGTAATTTGTGTAAIAAAGTGTTTCAGAGCATTACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

HU 220 464 Bl

ATACAGAGTAA6AAACGGÁCAGTGGACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCC6TTGATGTTACTTTT

HU 220 464 Bl irt irt

0» <0 n

W) s

irt irt irt β

<*>

trt w>

Cv irt <n to sr u>

®

X «η o *Λ — irt w>

irt irt <0

Cm irt irt irt <o r*

GGCTTGAGCATAGATACAGATGGAAATTATTGGGTCACAGATGTGCCTCTCCACCAGGTGTTCAAATTGGACCCGCATAGCAAAGAAGGCCCTCTCTTAA

GGTGATATACTGGCAGCCACATGTGTGTTCACTGCTGAACCCAGGACAGACCCCACCCACATCGGCCGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACA ,1.. —-ι _t .---.______-I . . . . . . a . a

HU 220 464 Bl

3. ábra 4. ábra

IS 3V^d

9E avd

VC 3V<* fzavd

Zl 3V^d tS 3V^d

9ε avd te 3Vd

W 3V^d

ZL3Vd ?! I + $ I o> + 00 | I** + <0 I U) + M I <0 + CM | T- + £J|

O| ®+ CO I r**+ <o i io +

I « + CM | r- +

A

A («;

V i|i n

I

I »

A <0 ί

»

I >1«»

I i I I

I t

« *

I i

0>

CM

HU 220 464 Bl Int. Cl.⁷: C 12 N 15/53 ceoLr

3. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy pSV₂ expressziós vektort és egy peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzimet kódoló DNS-szekvenciát, amelynek komplementer szék venciája szigorú körülmények között a következő DNS szekvenciák valamelyikével hibridizál:

ro

Ό c

<D £

<ü

N

CO

O

CO

CL

CM <O « o 40 <n 40 m «0 40 *Λ IO 40 β 40 40 40 ÍM 40 CM 40 CM V m 40 Γ- α X · w Cl X «í O - C9 1- · X X o <9 <9 I- U. <9 O X UJ O 1- <_» CL X O O <n 1- ci X iC X X o I- Cl X · C9 · ta <9 X ' Ι- Cl O Ι- Ι- ο X I X Ο Ι- > <9 Cl Cl <l o Ο <9 CC 1— Cl Ι- >· I- O X - z X · Ο · X « ο o X CJ o. o <9 Cl I- i- Cl X X Ι- X X o X X Ι- > o O I— ^- Ο o <l X · x · o o ο o O OC Cl o ο 0. <J Cl Ι- > X ο CJ ft. I— Ο 1— -1 ο cu I- u. 1- 1— X ζ 1— · 1— « Cl Ι- 1— · Ο ' X I- X X X X C9 Cl X o o < ω |- O X Ο o ο X Z Ι- ta X X ο X · Ο H v> 1- . o Ι- o X Ι- Ι- Ο <9 OC Cl Ο Ο 1- Ι- χ »— — Ι- X Ο α. X X Ο VJ o ο · X I- · Η· · X - X ο C9 X o ta Cl X >- d O ι- X o Ι- <9 □c o χ Ι- > Ο Ι- O C9 Ο Ο . I- ÜL ο · O ι- · X X J 1- ' <J X 1— X o CC ►- d X >- I- X ο < K ί- _J o ο X >- o ο X > ο J- . X - X ο- 1- « X · cr X O χ >- o ο _l 1- I— o X X CJ Ι- > <9 o ο α. 1— Ο Η» X I— ο 1— < M· X 1 X · 1— u. ο X X σ Ο I- -J Cl Ο ta o ο X z I— Ο Ι- > ο χ 1- _j Ο Ο X & O ’ Cl « Ο - X I- - ο · cj X o Ο X X ο <9 I— > 1— o ο ft. X €9 1— — o ο X w O X X ο χ 1— · u. X · X 1 χ · ζ 1- Ι- 1- -Λ X . X χ o Ο Ι- o ft. ο 3 X >· Ι- o < ο χ i- Ο <L 1- ο <J · 1— X . ο · X « >· ο« X X id ta Ι- ο CC Ι- X χ α Ο ο Ο Cl o ο I- X X ί- <9 M ο X ο ο ο · X · Ο ' CL X ο ‘ o ί- X ο 3 M 1- χ O ta <9 X 1— ' — X <9 1“ o X 3 α Ι- €9 X Ι- ο €9 * Ο · 1— « - 1- ‘ χ X C9 OC X ο χ UJ X Ο X Ο - X d X UJ X o ο I- 1- <9 ο 1— o X X o X ' X o o <9 <9 <9 19 ο ί- ο I- <9 Ι- _J ο Ι- <9 O X Ο o VJ Ο I- C9 ta 1- 1- <· ο i- · O X ’ X 1— ♦ ο · Ι- ·— ο ·— X Ι- >· X X ο ο α <9 1— > o ο C9 z X €9 . X Q ο Ι- O oc Ο - o χ · ζ Ο X Ο VJ Ι- X X >- o Ι- Ο X X 1- 1— u. Ο o ο CC 1- 1- Ι- > μ- X <9 * VJ X Ο ‘ X · z X * X (9 <9 ο X Ι- > X <9 Ο O C9 Ο <9 C9 Ι- Ο 9» X O Ι- > Ι- ta ο CC i- · Ο Ο · VJ X ' X · o t— Ι- ί- > ο X Ο O ο o - X >- Cl <9 ta O X 1- Cl «Λ X X X

HU 220 464 BI

HU 220 464 Bl

Aft

W) m

*o «ο «η ® — to

W>

agattaagcacgcatcatttggaaggaatqtctttqccatttcatatataccagctttcctctttcccctaaacgggaagccttactttggagaccaaca

4. Rekombináns expressziós vektor, amely patkány peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzim polipeptidszekvenciája kifejezésének irányítására képes, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy transzkripciós promotert, amelyet lefelé egy első, peptidil-glicin- 5 alfa-amidáló monooxigenázt kódoló DNS-szekvencia követ, amely a prokarióta rendszerek által felismerhető kódolórégiójában nem tartalmaz második iniciációs fonást, és amelynek komplementer szekvenciája egy, a természetes, peptidil-glicin-alfa-amidáló monooxigenáz enzimet kódoló természetes DNS-szekvenciával olyan mértékben homológ, hogy szigorú körülmények között a következő DNS-szekvenciák valamelyikével hibridizálódik:

HU 220 464 Bl

GGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGeTGAAGGeAeeACAGAGGCCACCCATATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACA

AGTTTGCCCCTTGTGCCTCATTTCGACCAGTTGT6TQTGCCAGACAGG6AAAATGBCCGAATCCAATeCTTCAAAACTGACACCAAAGAATTTCTGAGAG
5. ábra

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna főosztályvezető-helyettes Windor Bt., Budapest