JPH0541982A - アミド酵素発現のための宿主および発現ベクタ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電子出願以前の出願であるので 要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は組替えＤＮＡ技術を介するα−アミ ド化酵素の生成に関し、かつ特定的には高い収率 でかつ高い純度で回収可能なα−アミド化酵素を 発現することができる発現ベクタおよび宿主に関 する。

核酸コード配列からの翻訳に続く天然蛋白質の 前駆物体の細胞内処理（切断および／または官能 基修飾）が明確にされてきている。

一般的に、哺乳類細胞および他の真核生物は或 る翻訳後の処理を行ない得るが、一方で原核生物 はこれを行なうことができない。Ｅ． ｃｏｌｉ 等の、或る原核生物は、組替えＤＮＡ（ｒＤＮＡ） 技術を用いる哺乳動物蛋白質の生成のための宿主 として広く用いられる。なぜならばそれらは回分 発酵法で容易に増殖され得て、かつそれらが遺伝 的な特徴づけを容易に行えるからである。しかし ながら、多くの哺乳動物蛋白質がいくつかの型の 翻訳後の処理を必要とする。もしこれらの蛋白質 をたとえばＥ． ｃｏｌｉの遺伝子工学によって 生成しようとすれば、翻訳後の処理をしばしば生 体外で複雑な化学的工程を用いることによって達 成しなければならず、それらを大規模生産に適用 すると法外に費用がかかる。

このような翻訳後の処理の１つとして、ペプチ ドまたは蛋白質のカルボキシル末端アミノ酸の特 異的アミド化がある。多くの天然由来のホルモン およびペプチドはそのような修飾を受けており、 蛋白質が生物的に活性であるためには、修飾はし ばしば必要である。１つの例はカルシトニンであ り、カルシトニンにおいて、通常のアミド化され たプロリンがアミド化されていないプロリン残基 に置換されると、生物活性が３０００分の１にな る。十分な活性のために翻訳後のアミド化を必要 とする他の生体ペプチドには成長ホルモン放出因 子、他のカルシトニン、およびカルシトニン遺伝 子関連ペプチドがあるが、それらだけではない。

蛋白質のカルボキシル末端アミノ酸の特異的ア ミド化はα−アミド化酵素によって触媒される。

最大活性のためにアミド化を必要とする多くの重 要な生体蛋白質に必要なポリペプチド配列は、た とえば遺伝子工学の手法によって製造することが できる。しかしながら、重要でかつ時に本質的な カルボキシル末端のアミド化はしばしば生体外で 行なわれなければならない。この点で費用がかか りかつ厄介な化学的アミド化法を避けることが望 ましく、一方、特異的アミド化を行なうためにア ミド化酵素を用いることが望ましい。しかしなが ら、α−アミド化酵素は自然界において容易に入 手できない。

特定の組織内でのアミド化されたペプチドの存 在はα−アミド化酵素の高いレベルとは必ずしも 相関しない。たとえば、ラットの下垂体前葉組織 は高いα−アミド化活性を有するが基質となるも のが知られていない。［エイッパー（Eipper）等、ＰＮＡＳ ８０、５１４４−５１４８（１９８３） ］。またラットの下垂体後葉組織はアミド化され たペプチド（オシキトシンおよびバソプレシン） を含むが、α−アミド化活性がほとんどない。

［エイッパー等、Ｅｎｄｏ １１６、２４９７− ２５０４（１９８５）］。それゆえ、個々の組織 がα−アミド化活性をテストされるまで、酵素の 存在または潜在的レベルは予測できない。

天然物から得られるアミド化酵素の利用可能性 に対するさらに大きな障害は、純度が通常は低い レベルにあることである。天然物から得ることが できるアミド化酵素は蛋白質分解酵素および他の 夾雑物質で汚染されている。アミド化された生成 物の効果的な回収は、これらの夾雑物につきまと われる酵素でＬ−アミノ酸を含む基質をアミド化 しようとすると、大きく妨げられる。特に、蛋白 質分解酵素が基質および／またはアミド化された 生成物および／またはアミド化酵素それ自体を破 壊するおそれがある。大抵の生物学的に重要なポ リペプチドはＬ−アミノ酸を含むので、この蛋白 質分解による損傷やアミド化酵素試薬内の夾雑物 によって引き起こされるアミド化の妨害を受けや すい。

自然界には、α−アミド化酵素の供給源がわず かしかなく、その発生量も低くかつ純度も不十分 であるため、高い収率でかつ高い純度で回収可能 なα−アミド化酵素を大量生産する効率的な方法 が必要である。

なお、ここで用いられる「アミド化酵素」およ び「α−アミド化酵素」という用語は、ペプチド を基質として、上記基質のＣ末端アミノ酸にアミ ノ基がついたペプチドアミドの形成を触媒するこ とができるものを指す。

発明の簡単な説明 この発明の目的は、高い収率でかつ高い純度で 回収可能なα−アミド化酵素を提供することであ る。

この発明の別の目的は、高い収率でかつ高い純 度で回収可能なα−アミド化酵素を発現できる宿 主生物を提供することである。

この発明の別の目的はα−アミド化酵素のため のＤＮＡ配列コードを備える発現ベクタを提供す ることである。

この発明の別の目的は、Ｌ−アミノ酸を含むペ プチドの基質、たとえば天然物から精製されるも の、化学的に合成されるもの、または組替えＤＮ Ａ技術によって生成されるもののアミド化のため に、効果的なレベルまで、発現された酵素が容易 に回収されかつ精製されることができるように、 α−アミド化酵素を発現することができる発現ベ クタを提供することである。

この発明の別の目的は、真核宿主内でのα−ア ミド化酵素の発現を誘導するのに特に適する発現 ベクタを提供することである。

この発明の別の目的は、原核宿主内でのα−ア ミド化酵素の発現を誘導するために特に適する発 現ベクタを提供することである。

この発明の別の目的は、α−アミド化酵素の効 率的で費用効率の良い大量生産のための手段を提 供することである。

これらおよび他の目的は、α−アミド化酵素の ポリペプチド配列を発現できる宿主を提供するこ とによって達成され、前記宿主は、転写プロモー タとその下流にある前記アミド化酵素をコードす る前記宿主に対して外来性であるＤＮＡ配列とを 有する発現ベクタを備え、前記ベクタは前記宿主 内でのポリペプチドの発現を誘導することができ る。

１つの実施例においては、α−アミド化酵素の ポリペプチド配列を発現することができる宿主が 示され、前記宿主は、転写プロモータとその下流 にある前記宿主に対し外来であるＤＮＡ配列とを 有する発現ベクタを備え、そのＤＮＡ配列はスト リンジェントな状態の下で次に示すＤＮＡ配列と ハイブリダイズすることができる。

別の実施例において、α−アミド化酵素のポリ ペプチド配列を発現することができる宿主が示さ れ、前記宿主は転写プロモータとその下流にある 前記宿主に対し外来であるＤＮＡ配列とを有する 発現ベクタを備え、そのＤＮＡ配列はストリンジ ェントな状態下で次に示すＤＮＡ配列とハイブリ ダイズすることができる。

ここにおいて用いられる「ストリンジェントな 状態」という用語は、６２℃での２ ｘ ＳＳＣ （０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエ ン酸ナトリウム）を意味する。

この発明はまた、原核および真核細胞系の両方 においてα−アミド化酵素の発現を誘導するため の発現ベクタをも提供する。例として、原核宿主 内でα−アミド化酵素のポリペプチド配列の発現 を誘導することができる発現ベクタが示され、前 記ベクタは転写プロモータとその下流にあるアミ ド化酵素コード領域を有する第１のＤＮＡ配列と を備え、前記第１の配列は、アミド化酵素を発現 するための本来のＤＮＡ配列に対して十分に相同 であり、ストリンジェントな状態の下で本来の配 列とハイブリダイゼーションを受け、かつ前記第 １の配列は前記酵素コード領域の開始部分のおお よそ５０ヌクレオチド内に開始メチオニンコドン を含む。

同様に、この発明の別の実施例において、真核 宿主内でα−アミド化酵素のポリペプチド配列の 発現を誘導することができる発現ベクタが示され、 前記ベクタは、転写プロモータとその下流に続く アミド化酵素コード領域を有する第１のＤＮＡ配 列とを備え、前記第１の配列は、アミド化酵素を 発現するための本来のＤＮＡ配列と十分に相同で あり、ストリンジェントな状態の下で本来の配列 とのハイブリダイゼーションを受け、かつ前記第 １の配列は、他の態様ではmembrane spanning do mainをコードするであろう配列から上流に停止コ ドンを含む。

この第１の配列には、前記プロモータからの転 写によって発生されるメッセンジャーＲＮＡへの ポリＡの付加を特定する配列が続くべきである。

ここで用いられる「membrane spanning domain」 という用語はＤＮＡ配列であり、それは、カイト およびドーリットル（Kyte & Doolittle）のテキ スト、Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．、Ｖｏｌ．１５７、 ｐｐ．１０５−１３２（１９８２）によって規定 されるように、（この開示の全体にわたり、これ を引用している）十分な疎水性、長さ、構造的特 性などの膜内に固定されるための性質を備えるア ミノ酸配列をコードする。たとえば、膜結合リボ ソーム上で蛋白質が合成される際、これが存在す るであろうし、またその代わりに、membrane s panning domainによってコード化されるアミノ酸 配列がそれが一部分である蛋白質の他の領域と結 合するようになるかもしれない。それゆえにその 配列が翻訳後に膜の疎水性環境内に挿入されるよ うになる。フォン・ハイン（Von. Heijne）、 Sequence Analysis in Molecular Biology:Trea sure Trove or Trivial Pursuit、ｐｐ．８１− １２１（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ １９８７）に おいてmembrane spanning domainがより詳細に論 じられ、その教示はここに援用される。

ここで用いられる塩基番号は、塩基番号を参照 して明白に述べられるいかなるＤＮＡ配列に対し ても特定的に定められる番号である。塩基番号が この文書内で明白に割当てられないすべての配列 に対しては、論じられている配列によって発現さ れる第１のコドンの第１の塩基を塩基番号１とし て塩基が連続的に番号づけられ、またアミノ酸の 番号は塩基１から３によって発現されるアミノ酸 を１として連続的に番号づけられる。

好ましい実施例の詳細な説明 この発明に従って、原核細胞系のための適切な 発現ベクタおよび真核細胞系のための適切な発現 ベクタが調製される。これらのベクタ内に用いる アミド化酵素をコードするＤＮＡは、ＥＰＣ出願 第８８３０７５３３．５号において教示されるよ うに分離されてもよく、かつその出願は公告番号 第０３０８０６７号として公告され、それの全体 の開示がここに引用により援用される。α−アミ ド化酵素はラットの延髄甲状腺カルチノーマ組織 またはラットの細胞系からの馴らし培地から分離 され、かつ均質なものに精製されてきた。それは 上述した親出願および現在は米国特許第４、７０ ８，９３４号として発行されている、１９８４年 ９月２７日出願の親の親出願連続番号第６５５， ３６６号において教示されており、その優先権が 請求されている。それら全体の開示がここに引用 により援用される。精製されたα−アミド化酵素 に対してアミノ酸配列が決定され、これらの配列 は、様々な放射性ラベルをつけられたオリゴヌク レオチドプローブを形成するために用いられてき た。また、アミド化酵素に対するｃＤＮＡを分離 するためにも用いられてきた。

分離されたｃＤＮＡは、調製されるライブラリ をスクリーニングするために用いられてきた。ラ イブラリはたとえばラットの延髄甲状腺カルチノ ーマ組織または、それらより派生された細胞系の 全ＲＮＡ、もしくはアミド化酵素を生成すること が周知の細胞系、たとえば、biological deposit ＩＶＩ １００２８（メリーランド、リンチカム、 イン・ビトロ・インターナショナル(In Vitro In ternational, Linthicum,Maryland)）（ラット のＭＴＣ組織）またはそれより派生された細胞系 ＩＶＩ １００２９から調製される。全ＲＮＡの 調製およびポリ−Ａ ＲＮＡの選別はオリゴＤＴ セルロースを用いてなされた。ｃＤＮＡは第１に 逆転写酵素、次にＤＮＡポリメラーゼを用いる周 知の方法によって調製された。ｃＤＮＡがベクタ ｈｇｔ １１内のｃＤＮＡライブラリを形成する ために用いられ、かつ組替えＤＮＡは生体外でパ ッケージングされて感染性バクテリオファージ粒 子を形成する。

パッケージングのための抽出物はたとえばプロ メガ・バイオテック（Promega Biotech）ま たはクロンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）から商業的に入手可能であり、 または当該技術において周知の方法に従って調製 することができる。ファージは上記で述べられた ように調製される放射性ラベルをつけられたオリ ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされる。

α−アミド化酵素ｃＤＮＡ（“ＡＥ ｃＤＮＡ” と示す）を有するバクテリオファージのスクリー ニングは、バクテリオファージのサンプルを培養 し、さらにファージをニトロセルロースフィルタ ディスク上に移すことによって達成された。２つ またはそれ以上の放射性ラベルをつけられたＡＥ 特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリ ダイゼーションにより特定を行なった。 ＥＰＣ 出願第８８３０７５３３．５号および公告番号第 ０３０８０６７号として公告されたものの６１な いし６４頁においてＡＥ４、ＡＥ５、ＡＥ８およ びＡＥ９と示されるオリゴヌクレオチドプローブ は、上記biological deposit ＩＶＩ１００２９ から調製されたライブラリをスクリーニングする ときに特に好ましい。

上記のオリゴヌクレオチドによるハイブリダイ ゼーションスクリーニングによって分離された多 くのバクテリオフォージからのＡＥ ｃＤＮＡの 分析は、ｃＤＮＡが複数個の別の型に分離され得 ることを示した。１つの型の構造が下記にＡ型と して示され、そこにおいて開始メチオニンのため のコドンの第１塩基を塩基１としてヌクレオチド が番号づけされている。また、ヌクレオチド配列 には、遺伝子配列の蛋白質への翻訳のための一文 字のアミノ酸コードが付与されている。線の端部 での丸括弧内の数字はアミノ酸番号を示す。

上述されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ ーションスクリーニングによって分離された別の 型のｃＤＮＡ配列を以下にＢ型として示す。番号 づけおよび他の申し合わせは上記のＡ型と同じで ある。

原核細胞および真核細胞の発現ベクタの両方を 構成するために、出願者は上記態様で分離された ｃＤＮＡを用い、多くの宿主がα−アミド化酵素 の効果的な発現のためにこれらのベクタでトラン スフェクションされた。

この発明の好ましい実施例において、発現だけ でなくアミド化酵素の回収をも最適化するために、 前述のｃＤＮＡに対して出願者は新規の修飾をし た。修飾の性質および程度は選択される宿主およ び／またはベクタによって様々であってもよい。

たとえば出願者は、好ましい実施例において、他 の態様ではmembrane spanning domainのためにコ ードするであろう配列の上流に停止コドンを挿入 する。これらのmembrane spanning domainの存在 は組替えＤＮＡ発現系に対してあまり望ましくな い。なぜならばそれらは宿主生体または細胞系に おいて、発現された蛋白質が膜と結合したり、非 活性になったりするおそれがあるからである。me brane spanning domainの例が、上記のＡ型およ びＢ型において述べられた２つのｃＤＮＡに現わ れている。（Ａ型に示される配列の塩基２２７５ −２３５５について、およびＢ型において示され る配列の塩基２５８７−２６６７について）。Ａ 型およびＢ型のｃＤＮＡはこれらのトランスメン ブレンドメインのコードするアミノ酸は実質上同 一であるが、Ｂ型のｃＤＮＡの塩基１１７８から 塩基１４９２までにはイントロン領域が存在して いる。

上記のＡ型およびＢ型のｃＤＮＡはそれぞれ約 ９４および１０５ｋＤの蛋白質生成物をコードす る。これらの蛋白質の両方が、動物組織抽出物ま たは細胞系分泌物から精製されたマチユアな活性 のある酵素よりも大きい。これらの第１次翻訳生 成物の各々は、コード配列の３分の１のＣ末端内 にmembrane spanning domainを含むプレプロ酵素 である。Ａ型のｃＤＮＡによって発現される場合 は、発現された蛋白質が約７５ｋＤの分子量を有 するように（すなわち、停止コドンが塩基２０２ ５および２２７５の間に置かれる）、またＢ型の ｃＤＮＡによって発現されるときは８７ｋＤの分 子量を有するように（すなわち停止がおおよそ塩 基２３４０および２６９０の間に置かれる）停止 コドンが挿入されることが好ましい。この分子量 は、出願人によって精製された１つの天然由来の アミド化酵素の分子量である。

Ｅ． ｃｏｌｉ内のマチユアなα−アミド化酵 素の細胞質発現に対して、たとえば、隠れたシグ ナル配列をコードする遺伝子配列が除去されるこ と、α−アミド化酵素に相当するマチユアな蛋白 質の開始をコードする遺伝子配列のおおよそ５０ のヌクレオチド内に開始コドンが挿入されること、 およびｃ末端領域内のmembrane spanning domain をコードする遺伝子配列が翻訳されないことが望 ましい。開始コドンはもちろん、酵素をコードす る配列とｉｎ−ｆｒａｍｅであり、かついくつか の好ましい実施例においては、酵素のコード領域 から上流、時にはすぐ上流とする。

ＡＥ ｃＤＮＡがＥ． ｃｏｌｉにおいて発現 されるとき、本来の遺伝子配列が、陰か性Ｅ． ｃｏｌｉ のリボソーム結合部位（“ＲＢＳ”）お よび開始コドンを本来の開始配列の内側に含むこ とが見い出された。これは、Ｎ末端を切取ったア ミド化酵素蛋白質の生成をもたらした。これはＥ． ｃｏｌｉ内での所望する生成物の生成を妨げな い一方で、正しく開始された生成物に内部から開 始された生成物が混じるため、組替え生成物の有 用な形への処理および精製が複雑になり、かつそ れゆえに好ましくない。予期されず好ましくない 生成物を除くために、リボソーム結合部位および 内部開始コドンのいずれかまたは両方を除くこと が必要であった。

たとえば、この発明の１つの好ましい実施例に おいて、原核細胞系において、開始メチオニンを コードするバリンコドンは、点変異によって（Ａ 型またはＢ型のｃＤＮＡの）塩基６６１−６６３ で、相当する非開始バリンコドンに変更される。

この点変異の代わりに、またはそれに加えて、他 の好ましい実施例において、出願者は内部開始部 位のすぐ上流で起こるリボソーム結合部位をコー ドする領域、さらにより好ましくは、起こり得る すべてのリボソーム結合部位をコードする領域を、 消すかまたは実質的に修飾する。これらの手法は 実質的に内部開始を排除するためになされ、それ ゆえ内部開始によって発現された蛋白質は電気泳 動に従う別個のバンドとして観察されなくなる。

組替え真核宿主細胞系から、分泌される活性α −アミド化酵素蛋白質の発現を得るために、本来 の遺伝子配列のＣ末端領域内に見い出されるトラ ンスメンブレンドメインをコードする遺伝子配列 を除去することが必要であった。そこでＡ型のｃ ＤＮＡに対しては、下記に詳細に説明されるよう に、本来の系内で本来のアミド化酵素の翻訳が終 了される所か、またはその近くに、停止コドンを 導入することによって、蛋白質コード領域の切り 詰めを行なった。またＢ型ｃＤＮＡに対しては、 酵素蛋白質の領域内で、本来のＢ型アミド化酵素 の翻訳が終了されるところに、新しい停止コドン を導入した（下記参照）。何らかの宿主細胞系に おいて本来の遺伝子配列全体を発現することが好 ましいかもしれないという場合、この方法はとら れるべきではない。Ｂ型ｃＤＮＡは翻訳されない イントロンの特性を有する配列を含むので、ある 真核宿主細胞においてはこのｃＤＮＡを発現する ことは困難であるかもしれない。これらの細胞は、 対にされたスプライス供与体と受容部位の存在の ために、Ｂ型遺伝子から効率的にｍＲＮＡを生成 しないかもしれない。受容部位の除去はそれゆえ Ｂ型ＡＥ ｃＤＮＡの効率的発現を可能とするた めに必要であろう。

天然由来の７５ｋＤα−アミド化酵素蛋白質の カルボキシル末端は、アミノ酸位置７０９（Ｂ型 は８１４）を越えていることを我々は見い出した。

組替えＤＮＡ宿主細胞内で７５ｋＤ蛋白質（Ｂ型 は８７ｋＤ）を生成するために、アミノ酸位置７ １６（Ｂ型は８２１）のリジンに対するコドンの 変異によって停止コドンがｃＤＮＡ内に導入され た。このような修飾はオリゴヌクレオチドの誘導 部位特異的突然変異誘発を用いてなされた。その ような突然変異誘発は様々な方法で達成され得る。

その方法は分子生物学の文献において広く論評さ れてきた。我々が用いた一般的方法は、テイラー ・ジェイ・ダブリュ（Taylor,J.W.）等（１９８ ５）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３： ８７４９−８７６４；テイラー・ジェイ・ダブリ ュ等（１９８５），Ｍｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ，１３：８７６４−８７８５；ナカマエ・ケイ （Nakamaye,K）およびエクステイン・エフ（Ec kstein,F.）（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ ｓ，Ｒｅｓ．，１４：９６７９−９６９８によっ て示されるものである。この方法を実現するため に必要とされる試薬は、アマシャム・コーポレー ション（Amersham Corporation）から突然変異誘 発キットの形で入手可能である。

我々が生成した配列の変異はＡＡＡリジンコド ンをＴＡＡ停止コドンに変える。突然変異誘発の ために用いられるオリゴヌクレオチドはこの変異 を組入れたが、他の態様では、それぞれの酵素 （Ａ型またはＢ型）のための変異されるべき天然 由来のｃＤＮＡ配列と配列が同一であった。

我々はまた、α−アミド化酵素蛋白質の天然由 来の短縮形が、Ｂ型酵素蛋白質に特有である蛋白 質の内部領域で、生成されることを見い出した。

これは、分子質量が約４３ｋＤである酵素生成物 をもたらす。理論に制限されることをしないなら ば、イントロン領域から上流であるＤＮＡ配列が、 この著しいα−アミド化活性を示すことができる ポリペプチドをコードするのに十分であると考え られる。したがって、回収することが容易であり かつα−アミド化活性を発現することができるポ リペプチドは、Ｂ型ｃＤＮＡのイントロン領域内 のどこかに位置する停止コドンによって顕著に切 り詰められたｃＤＮＡでコードされることができ る。切り詰められる位置は、イントロンのないＡ 型のｃＤＮＡの相当する位置の前後であろう。好 ましい切り詰めは、イントロン領域の初めからお およそ３０の塩基内に、好ましくはそこからすぐ 下流に、停止コドンを置くことからもたらされる。

組替え宿主細胞内でα−アミド化酵素蛋白質の１ つの好ましい短縮形の生成を可能とするために、 Ｂ型ｃＤＮＡについて、アミノ酸位置４３６にお いてリジンコドンの代わりに停止コドンを有する 修飾されたｃＤＮＡが作られる。この変異は、Ｂ 型ＡＥｃＤＮＡのオリゴヌクレオチドの誘導部位 特異的突然変異誘発によって達成された。

Ｂ型ｃＤＮＡのアミノ酸位置４３６に停止コド ンを導入することによるアミド化酵素蛋白質の短 縮が、１次翻訳産物の加水分解による切断（また は生合成経路内の何らかの他の切断）によって自 然に生成されるものに最も近い蛋白質を与える一 方で、アミド化酵素蛋白質のさらなる短縮によっ ても、組替えＤＮＡ宿主細胞内に活性物の生成を もたらすことができる。我々はいくつかの他の方 法でＡＥ ｃＤＮＡを修飾して蛋白質のそのよう なより短い形を作った。１つの例において、我々 はオリゴヌクレオチドの誘導部位特異的突然変異 誘発を用いて、Ｂ型ｃＤＮＡのアミノ酸位置３９ ６でのチロシンコドンを停止コドンに変換した。

この変化は、ｃＤＮＡが翻訳されかつ蛋白質が合 成されるとき、約３９ｋＤの蛋白質をもたらすで あろう。第２の場合において、我々はＢ型ｃＤＮ Ａの天然由来Ｂａｍ Ｈ１酵素の認識部位を利用 して、リンカー突然変異誘発によって停止コドン を導入した。この方法は分子生物学において周知 であり、ｃＤＮＡの切断に続いて２本鎖合成リン カーフラグメントを結合させるものである。この フラグメントは切断されたｃＤＮＡの一方の端部 に対して相補的でありかつ切断部位のすぐ向こう にin frame停止コドンを導入する。我々はこの修 飾を達成するために以下の配列のオリゴヌクレオ チドフラグメントを用いた。

^５′ＧＡＴＣＣＡＣＴＡＡＴＧＡＴＣＡ^３′ _３′ＧＴＧＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＧＡ_５′ このリンカーはアミノ酸４６９でのヒスチヂンコ ドンに続く停止コドンを導入する。ｃＤＮＡの翻 訳および蛋白合成は、それが一旦この態様で修飾 されてしまうと、約４６ｋＤの蛋白質の合成をも たらす。

切り詰め用停止コドンの配置は、連続する塩基 性残基（通常はＬｙｓ−Ｌｙｓ）をコードするＤ ＮＡ配列の約１５塩基内が好ましく、特にそこか らすぐ上流が好ましい。理論に縛られることを意 図しないならば、Ｂ型のｃＤＮＡによってコード される本来のポリペプチドは、連続する塩基性残 基上またはその近くで、アミド化酵素が通常通り 発現されている間に、翻訳後の修飾が起こって、 形成されると考えられる。このような連続する塩 基性残基は、たとえば、Ｂ型ｃＤＮＡのイントロ ン領域内にリジンの連続として見られる。また、 停止コドンを挿入して上述したように発現された ポリペプチドを切り詰めるすることを意図しない ときでも、連続する塩基性アミノ酸残基をコード するＤＮＡ配列から好ましくはすぐ上流に、通常 は約２０塩基内に、停止コドンを挿入した方がよ い。これらの位置への停止コドンの挿入によって、 それらが翻訳後の蛋白合成の後に、本来のアミド 化酵素に類似するポリペプチドの発現をおそらく もたらすであろう。

原核細胞系での細胞質発現のために、いかなる シグナル配列コード領域でも（たとえば、前に示 されたＡ型およびＢ型ｃＤＮＡの第１の塩基）除 去するのが好ましく、またメチオニンイニシエー タコドンを、アミド化酵素をコードする領域の始 まりのおおよそ５０ヌクレオチド内に挿入する。

原核細胞の発現のための他の実施例は、シグナ ル配列またはプロ酵素配列のためのいかなるコー ド配列をも除去し、かつアミド化酵素をコードす る領域の初めの約５０ヌクレオチド内にイニシエ ータメチオニンコドンを挿入する。多くの天然の ＡＥ ｃＤＮＡにおいて、これは、ｓｅｒ−ｘ− ｓｅｒ（Ｘはｐｈｅまたはｌｅｕ）をコードする 領域の初めに対応する。たとえば、Ａ型またはＢ 型ｃＤＮＡに対する配列の塩基１２４ないし１３ ２を参照されたい。いくつかの実施例において、 α−アミド化酵素のセクレチオンが所望するもの かもしれない。この場合、シグナル配列コード領 域を保つこと、またはその代わりには同じ機能を 有するヘテロジニアスな配列とそれを置換えるこ こが好ましく、それはたとえば細菌性ＯＭＰ Ａ 蛋白質のシグナル配列である。

アミド化酵素をコードするための、ここで述べ られた多くの変異およびＤＮＡ配列の切り詰めが この発明の範囲内で可能であること、およびその ような修飾された配列はアミド化酵素として機能 することができるポリペプチドをコードするであ ろうことは、当業者には容易に明らかとなるであ ろう。したがって、出願者の特許請求の範囲は、 特定的に述べられたＤＮＡ配列、発現ベクタおよ び宿主細胞のすべての機能的均等物を含むように 解釈されるべきである。

この発明に従うアミド化酵素をコードするＤＮ Ａ配列を有するように好ましい形に変えることが できる原核細胞の発現ベクタの例には、ｐＫＫ２ ３３−，ｐＫＫ３２２−２，ｐＰＲＯＫ−１，ｐ ｋＴ２７９，２８０，２８７，ｐＰＬ ｌａｍｂ ｄａ，ｐＹＥＪ００１，ｐＫＣ３０，およびｐＰ ＲＯＫ−Ｃがあるがそれらに限定されず、これら はすべて商業的に入手可能である。この発明に従 う発現ベクタでトランスフェクションされてもよ い原核宿主には、商業的に入手可能であるＣ６０ ０、ＬＥ３９２、ＲＲ１、ＤＨ１、およびＳＦ８ があるがそれらに限定されない。

この発明に従うアミド化酵素をコードするＤＮ Ａ配列を有するように好ましい形に変えることが できる真核細胞発現ベクタには、すべて商業的に 入手可能であるｐＭＡＭＮｅｏ，ｐｄＢＰＶＭＭ ＴＮｅｏ，ｐＲＳＶ，ｐｅｕＫ−Ｃｌ，およびｐ ＣＨ１１０があるがそれらに限定されない。適切 な酵母ベクタもまた用いられてもよい。好ましい 真核宿主はこの発明に従う発現ベクタでトランス フェクションされることができ、それらにはＩＶ Ｉdeposit１００２９、Ｈｅｌａ、ＣＶ１、Ｃ１ ２７、ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター・オー バリー）（Chinese Hamster Ovary）およびＣＯ Ｓがあるがそれらに限定されない。例１ Ｅ．ｃｏｌｉ内でのα−アミド化酵素蛋白質の発 現 Ｅ． ｃｏｌｉ内でα−アミド化酵素を発現 するために（第２図のフローチャート参照）、上 記Ａ型の配列を有するｃＤＮＡフラグメントがＫ ｐｎＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで切断され、約２． １ｋｂのフラグメントが分離された。天然由来の 酵素に対応するアミノ末端を形成し直すために、 以下の配列のオリゴヌクレオチドリンカーがこの ＤＮＡフラグメントに結合された。

^５′ＣＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＡＴ
ＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣ^３′ _３′ＡＧＴＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＴＡＣＧ
ＧＡＡＣ_５′ 結果としてのフラグメントは１つのＮｃｏ Ｉに 適合する接着末端および１つのＨｉｎｄ ＩＩＩ 接着末端を有した。Ｅ． ｃｏｌｉ発現ベクタｐ ＫＫ２３３−２はファーマシア（Pharmacia）か ら商業的に得られ、かつ制限酵素Ｎｃｏ Ｉおよ びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断された。大きな線状フ ラグメントが分離され、かつリンカーが取付けら れたｃＤＮＡフラグメントに結合された。結合し た物はＥ． ｃｏｌｉＪＭ１０５を形質転換する ために用いられた。形質転換体はアンピシリン耐 性によって選択され、分離されたクローンについ て、制限酵素およびＤＮＡ配列の解析により組替 えプラスミドを解析し、発現ベクタの構造（以後 “ｐＡＥ１２”と示す）を確かめた。発現ベクタ はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモータを含み、 プロモータはｌａｃリプレッサによって抑制され、 またイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ） によって誘導される。またイミニシエータメチオ ニンから上流に、ベクタはリボソームに強く結合 する部位の配列を含む。

Ｅ． ｃｏｌｉ内でα−アミド化酵素の発現を 得るために、組替え細胞は、ＬＢ−培地で、３７ ℃で、ＯＤ_６００が０．４まで振とう培養された。

ＩＰＴＧは最終濃度１ｍＭまで培養液に加えられ、 ３ないし５時間の間、３７℃で振とう培養された。

細胞は遠心分離によって回収され、上清は捨てら れた。細胞は、プロテアーゼ阻害剤を含む緩液内 に再度懸濁され、リゾチームで処理された後、超 音波処理され、細胞膜が溶解された。その後、細 胞の可溶性および不溶性のフラクションを分離す るために、１２，０００ｘ ｇで遠心分離された。

各フラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛋白染 色によって分析された。α−アミド化酵素蛋白質 は不溶性蛋白質フラクション内のＩＰＴＧ誘導可 能な生成物として容易に識別された。最初の発現 プラスミドはα−アミド化酵素遺伝子配列を特定 する停止コドンを含まないので、形成された誘導 可能な生成物は、α−アミド化酵素蛋白質配列の Ｃ末端にベクタＤＮＡの下流によって特定される 配列を含んでいる。加えて、誘導された不溶性蛋 白質はまた、本来のアミド化酵素が小さくなった ものに相当する蛋白質を含み、それは隠れたＲＢ Ｓおよび開始コドンで蛋白質合成が内部より開始 されて形成された生成物であった（開始コドンは α−アミド化酵素配列のアミノ酸位置２２１）。

発現された生成物のＣ末端部分から必要でない 配列を除去するために、Ａ型配列の位置７１６で のリジンコドンを変異し、この位置にＴＡＡ停止 コドンを発生させた。変異されたｃＤＮＡはｋｐ ｎ ＩおよびＥｃｏ Ｒ１で切断され、最初の発 現ベクタｐＡＥ１２内の元のＫｐｎ Ｉ−Ｅｃｏ Ｒ１フラグメントと置換えられた。類似の態様 で、Ｂ型ｃＤＮＡ配列は相当する位置で変異され て（アミノ酸８２１）、停止コドンが形成され、 変異されたＢ型ｃＤＮＡからのＫｐｎ Ｉ−Ｅｃ ｏ Ｒ１フラグメントがｐＡＥ１２内で対応する フラグメントに置換えられた。そのようにして形 成された２つの発現プラスミドｐＡＥ２４（Ａ型） およびｐＡＥ２５（Ｂ型）はＪＭ１０５を形質転 換するために用いられた。得られた株は、ｐＡＥ １２株で上述したと同様に発現のため培養された。

ｐＡＥ２４は約７５ｋＤおよび５５ｋＤの２つの ＩＰＴＧ誘導可能な不溶性蛋白質を生成すること が見い出され、一方ｐＡＥ２５は約８７ｋＤおよ び６７ｋＤの２つのＩＰＴＧ誘導可能な付加溶性 蛋白質を生成することが見い出された。再び、こ れらの各々に小さくなった蛋白質が認められ、こ の蛋白質はＡ型またはＢ型のｃＤＮＡのそれぞれ から、不必要にアミノ末端が切り取られてできた ものであった。

隠れた内部リボソーム結合部位および開始コド ン（アミノ酸位置２２１）で蛋白質合成が開始さ れるのを排除するために、ＧＴＧ開始コドンが （ＧＴＧは細菌内でイニシエータｍｅｔコドンと して働く）、蛋白質合成を開始できないＧＴＴコ ドンに変換された。ＧＴＴコドンはその代わりに、 本来の遺伝子によってコードされるα−アミド化 酵素蛋白質内のこの位置で通常見い出されるバリ ンをコードする。発現ベクタｐＡＥ２４およびｐ ＡＥ２５内で本来の配列が、変異されたｃＤＮＡ の配列に置換されて、２つの新しいベクタ、ｐＡ Ｅ３１およびｐＡＥ３２が形成された。Ｅ． ｃ ｏｌｉ ＪＭ１０５をこれらの修飾された発現ベ クタで形質転換し、得られた組替え株からの蛋白 質生成物をテストした結果、このように突然変異 を起こすことによって必要でない内部開始を効果 的に除去することが示された。ｐＡＥ３１を保持 する宿主細胞からのＩＰＴＧ誘導生成物は７５ｋ Ｄであることが見い出され、一方でｐＡＥ３２で 形質転換された細胞からのそれは８７ｋＤである ことが見い出された。

我々は、Ｂ型ｃＤＮＡからの天然由来のアミド 化酵素が翻訳完了後のプロセスで約４３ｋＤの蛋 白質を与えることを見い出したので、本来、合成 される酵素が終わる位置またはその近くで終端と なる蛋白質の発現を可能とするＢ型 ＡＥ ｃＤ ＮＡ内の一連の変異を我々は調製した。これらの 変異のうちの２つはオリゴヌクレオチド突然変異 誘発によって調整され、一方第３のものは上述さ れたようなアダプタ−リンカー変異によって作ら れた。これらの変異を保持するｃＤＮＡがｐＡＥ ３２の対応するセグメントと置換えられ、ＪＭ１ ０５内に形質転換され、かつ上述したと同様の実 験において蛋白質の生成を分析した結果、切り詰 められたα−アミド化酵素蛋白質が検出された。

本来のチロシンコドンを停止コドンに変えるＢ型 ｃＤＮＡのアミノ酸位置３９６での変異によって （ｐＡＥ３６）、３９ｋＤ酵素蛋白質が見い出さ れ、一方、翻訳をアミノ酸４６４のヒスチジンコ ドンで終わらせるリンカー突然変異誘発が施され たベクタｐＡＥ５１についてはＥ． ｃｏｌｉＪ Ｍ１０５の形質転換および誘導を行なった結果、 ４６ｋＤの組替えα−アミド化酵素蛋白質が生成 された。

上述されたＥ． ｃｏｌｉ内で生成されたすべ ての組替えα−アミド化酵素蛋白質は、細胞抽出 物の不溶性フラクションで分離することができた。

得られた酵素は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１ ｐＨ７で速やかに希釈された後、８Ｍ尿素の処理 によって、可溶性かつ活性にされた。ｐＡＥ１２ を保持するＥ． ｃｏｌｉＪＭ１０５が培養され かつ上述したようにＩＰＴＧで誘導されたとき、 α−アミド化酵素蛋白質は培養液１リットルあた り少なくとも３０ｍｇｓのレベルにあった。

ＡＥ発現プラスミドを保持するＥ． ｃｏｌｉ より生成される誘導された不溶性蛋白質の代表的 なサンプルは第３図および第４図において示され る。例２ 哺乳類発現ベクタｐｄ ＢＰＶ−ＭＭＴＮＥＯ− ＡＥ_Ａ７５の形成 哺乳動物細胞から、７５ ｋＤＡ型αアミド化 酵素を発現しかつ連続的に分泌する、哺乳動物発 現ベクタを形成するために（第１図のフローチャ ート参照）、以下のことが行なわれた。

１） 中間発現ベクタｐｄＭＭＴＮｅｏ（アメ リカン・タイプ・カルチャー・コクレクション （American Type Culture Collection）から商業 的に入手可能である）（図示されるように）がＢ ｇ１ ＩＩで切断された。線状のＤＮＡが分離さ れかつ精製された。

２） 完全プレプロ配列および位置２１４６− ２１４８で人為的に形成された停止コドンＴＡＡ を含む組替えＡ型ｃＤＮＡがＢｇ１ ＩおよびＸ ｈｏ Ｉによるシーケンシャルな切断によって分 離された。α−アミド化酵素に対応するフラグメ ントが、その後、分離されかつ精製された。

３） 挿入部位（Ａ型α−アミド化酵素に対応 する）およびベクタ（ｐｄＭＭＴＮｅｏ）が混合 され、また対応する端部がＤＮＡポリメラーゼＩ のクレノウフラグメントを用いて平滑にされた。

５’が突出したセグメントは、ｄＮＴＰが添加さ れて埋められ、３’が突出したセグメントは戻し 切断されて、それぞれ平滑末端が形成された（そ の代わりとしてシーケンシャルなＳ１ヌクレアー ゼおよびクレノウ＋ｄＮＴＰを平滑末端を形成す るために用いることができる）。平滑末端分子は、 その後１５℃、１６時間で結合された。

４） 結合されたものは次にＥ． ｃｏｌｉＲ ＲＩ内に形質転換された。組替えクローンが、５ ０ｕｇ／ｍｌアンピシリン下で選択された。組替 えクローン内の挿入の配向は１組の制限酵素を用 いて検証された。ｐｄＭＭＴＮｅｏ α−ＡＥ_{Ａ ７５} で示される１つのクローン（クローン１１） が、ＭＭＴプロモータに関して正しい配向のＡ型 ｃＤＮＡを有すると判断された。

５） 組替えｐｄＭＭＴＮｅｏ α−ＡＥ_{Ａ７ ５} （クローン１１）からのプラスミドＤＮＡがＢ ａｍＨＩで切断された。線状にされたベクタが分 離され、かつ精製され、それから５’リン酸塩を 除去するために３７℃で２時間、細菌性アルカリ 性ホスファターゼ（Ｂ．Ａ．Ｐ．）で処理された。

ＢＰＶ−１ゲノムが、ベクタｐｄＢＰＶＭＭＴＮ ｅｏのＢおよびＢａｍＨＩによる切断の後、分離 されかつ精製された。約８．０ｋｂである、ＢＰ Ｖ−１ ＤＮＡのＢａｍＨＩフラグメントは、そ の後、ＢａｍＨＩで線状にされかつＢ．Ａ．Ｐ． 処理されたｐｄＭＭＴＮｅｏ α ＡＥ_Ａ７５ベ クタに、１４℃において３時間で結合された。結 合物は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＲ１内に形質転換さ れた後、組替えクローンは５０ｕｇ／ｍｌアンピ シリンＬＢ寒天接地上で選択された。組替えプラ スミドがＢＰＶ ＤＮＡのために分析され、また Ａ型ＡＥ ｃＤＮＡのためにも分析された。制限 酵素によるマッピングは、クローン２１が約１７ ｋｂであることを示し、かつ予期されたように制 限酵素地図がもたらされた。この発現プラスミド は次にマウスＣ１２７細胞内のαＡＥ_Ａ７５の発 現のために用いられた。

６） マウスＣ１２７細胞は標準ＣａＰＯ_４沈 降法によってｐｄＢＰＶ−ＭＭＴＮｅｏ αＡＥ_Ａ７５ ２０ｕｇでトランスフェクションされた。

トランスフェクションの後約２週間、形質転換さ れたｆｏｃｉが個々に採取され、かつ抗生物質Ｇ ４１８を含む増殖培地で培養された。ダルベコ変 更型イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ ｓ Ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄ Ｅ agle Meium）に１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ） を添加したものの中で十分な活性を示すまで培養 した後、標準放射性ラベルおよび免疫沈降法を用 いて培地内のα−アミド化酵素の免疫反応性を測 定するとともに、調整された細胞培地内の酵素活 性を測定することによって、クローンはα−アミ ド化酵素を分泌する能力が評価された。活性があ り免疫反応性を有する７５ｋＤα−アミド化酵素 を分泌するクローンは大量培養され（血清を減じ したがって外因性蛋白質のレベルを減じた細胞培 養培地に切換えられた）、細胞用に調製された培 地から大量の活性組替え酵素を生成するために用 いられた。

なお、ここで用いられた用語および説明は例示 としてのみ述べられた実施例であり、かつ前掲の 特許請求の範囲によって規定されるこの発明を実 施するとき、当業者が可能であると理解するであ ろう多くの変更に対する制限であるとは意図され ない。

【図面の簡単な説明】

第１図はα−アミド化酵素のための哺乳類発現 ベクタ形成のためのフローチャートである。 第２図はα−アミド化酵素のための原核細胞発 現ベクタ形成のためのフローチャートである。 第３図は、上述したプラスミド（例１で述べら れた性質を有するもの）を保持するＥ． ｃｏｌ ｉ ＪＭ１０５を、培地にＩＰＴＧを添加して （＋）培養した場合、およびＩＰＴＧを添加せず （−）培養した場合、得られる不溶性蛋白質フラ クションのクマーシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ電気泳動クロマトグラムを示す図である。（図 中Ｃは、ｐＫＫ２３３−２を保持するＥ． ｃｏ ｌｉ ＪＭ１０５の不溶性蛋白質を示す。） 第 ４図は第３図に示されるゲルのウェスタンブロッ トを示す図であり、蛋白質がニトロセルロースへ 移され、そのフィルタがウサギの抗ＡＥ抗血清お おびアルカリ性ホスファターゼ複合抗ウサギＩｇ で処理され、アルカリ性ホスファターゼのための 色素染色が行なわれたものである。

【手続補正書】

【提出日】平４．１．１４ （１） 明細書の特許請求の範囲を別紙のとおりに補
正する。 （２） 明細書第１９−２頁を別紙（第４０、４１お
よび４２頁）のとおりに補正する。 （３） 明細書第２０−２頁を別紙（第４３、４４お
よび４５頁）のとおりに補正する。 （４） 明細書第２７−２頁を別紙（第４６、４７、
および４８頁）のとおりに補正する。 （５） 明細書第２８−２頁を別紙（第４９、５０お
よび５１頁）のとおりに補正する。 （６） 図面を別紙の通りに補正する。 なお、（１）から（６）の補正の内容に変更はありま
せん。

【特許請求の範囲】

【請求項３３】 停止コドンが塩基２３４０と２６９０
の間に位置づけられる、請求項２１に記載の発現ベク
タ。

【手続補正書】

【提出日】平２．４．１９ （１） 明細書の特許請求の範囲を別紙のとおりに補
正する。 （２） 明細書第２２頁第８〜第９行、第２２頁第１
４行、第２３頁第４〜第５行、第２３頁第１３行、第２
９頁第１２行、第２９頁第１４行、第２９頁第１８〜第
１９行、第３０頁第１５行および第３１頁第１２行の
「membrane spanning domain」を「メンブレンスパニン
グドイン（membrane spanning domain）」に補正する。

【特許請求の範囲】

【請求項５】 原核細胞においてα−アミド化酵素のポ
リペプチド配列の発現を誘導することができる発現ベク
タであって、前記ベクタは、転写プロモータとその下流
にあるアミド化酵素コード領域を有する第１のＤＮＡ配
列とを備え、前記第１の配列は、天然のアミド化酵素を
発現するための天然のＤＮＡ配列と十分に相同であり、
ストリンジェントな状態の下で前記天然の配列とのハイ
ブリダイゼーションを受け、かつ前記第１の配列は前記
酵素コード領域の開始部分のおおよそ５０ヌクレオチド
内に開始メチオニンコドンを含む、発現ベクタ。

【請求項６】 前記酵素の発現配列が、他の態様ではメ
ンブレンスパニングドメイン（membrane spanning doma
in）をコードするような配列から上流に停止コドンを含
む、請求項５に記載の発現ベクタ。

【請求項７】 内部開始部位が前記開始メチオニンコド
ンおよび前記停止コドンの間に存在しない、請求項５に
記載の発現ベクタ。

【請求項８】 真核細胞内のα−アミド化酵素のポリペ
プチド配列の発現を誘導することができる発現ベクタで
あって、前記ベクタは、転写プロモータとその下流にあ
るアミド化酵素コード領域を有する第１のＤＮＡ配列を
備え、前記第１の配列は、天然のアミド化酵素を発現す
るための天然のＤＮＡ配列に十分相同であり、ストリン
ジェントな状態の下で前記天然の配列とのハイブリダイ
ゼーションを受け、かつ前記第１の配列が、他の態様で
はメンブレンスパニングドメイン（membrane spanning
domain）をコードするような配列から上流に停止コドン
を含む、発現ベクタ。

【請求項９】 請求項５の発現ベクタを備える原核細胞
宿主。

【請求項１０】 前記宿主がＣＨＯであり、請求項８に
記載のベクタを備える、真核細胞宿主。

【請求項１１】 請求項８に記載の発現ベクタを備え
る、真核細胞宿主。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/53 ＺＮＡ 15/72 15/85 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ノーザー・エム・メイター アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー州、 ロカウエイ アパチ・トレイル、８ (72)発明者 ゲアリ・アージデイ・ボードリー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー州モ ントクレアー インウツド・アベニユー、 81

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α−アミド化酵素のポリペプチド配列 を発現することができる宿主であって、前記宿主 は、転写プロモータと、その下流にある前記アミ ド化酵素をコードする前記宿主に対して外来性で あるＤＮＡ配列とを有する発現ベクタを備え、前 記ベクタは前記宿主内でポリペプチドの発現を誘 導することができる、宿主。
2. 【請求項２】 α−アミド化酵素のポリペプチド配列 を発現することができる宿主であって、前記宿主 は、転写プロモータと、その下流にあるストリジ ェントな状態下で下記に示すＤＮＡ配列とハイブ リッド形成することができる前記宿主に対して外 来性であるＤＮＡ配列とを有する発現ベクタを備 える、宿主。
3. 【請求項３】 α−アミド化酵素のポリペプチド配列 を発現することができる宿主であって、前記宿主 が、転写プロモータとその下流にあるストリンジ ェントな状態の下で下図に示すＤＮＡ配列とハイ ブリッド形成することができる前記宿主に対して 外来性のＤＮＡ配列とを有する発現ベクタを備え る、宿主。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ配列が、他の態様ではmemb rane spanning domainをコードするような配列か ら上流に停止コドンを含む、請求項１、２または ３に記載の宿主。
5. 【請求項５】 前記停止コドンが、他の態様では連続 するリジン残基をコードするような配列から上流 にある、請求項４に記載の宿主。
6. 【請求項６】 原核細胞においてα−アミド化酵素の ポリペプチド配列の発現を誘導することができる 発現ベクタであって、前記ベクタは、転写プロモ ータとその下流にあるアミド化酵素コード領域を 有する第１のＤＮＡ配列とを備え、前記第１の配 列は、天然のアミド化酵素を発現するための天然 のＤＮＡ配列と十分に相同であり、ストリンジェ ントな状態の下で前記天然の配列とのハイブリダ イゼーションを受け、かつ前記第１の配列は前記 酵素コード領域の開始部分のおおよそ５０ヌクレ オチド内に開始メチオニンコドンを含む、発現ベ クタ。
7. 【請求項７】 前記酵素コード領域の第１の３つのコ ドンがアミノ酸配列ｓｅｒ−ｘ−ｓｅｒをコード し、そこにおいてｘはｐｈｅまたはｌｅｕである、 請求項６に記載の発現ベクタ。
8. 【請求項８】 前記開始メチオニンコドンが前記酵素 コード領域の開始から上流の約５０ヌクレオチド 内にある、請求項６に記載の発現ベクタ。
9. 【請求項９】 前記酵素の発現配列が、他の態様では membrane spanning domainをコードするような配 列から上流に停止コドンを含む、請求項６に記載 の発現ベクタ。
10. 【請求項１０】 内部開始部位が前記開始メチオニン コドンおよび前記停止コドンの間に存在しない、 請求項６に記載の発現ベクタ。
11. 【請求項１１】 前記開始メチオニンコドンおよび前 記停止コドンの間に位置づけられるリボソーム結 合部位をコードするすべてのＤＮＡ配列が、ＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後の 単独のバンドとして観察可能な量のポリペプチド の内部開始および翻訳を防ぐように、開始コドン から十分遠くに位置づけられる、請求項１０記載 の発現ベクタ。
12. 【請求項１２】 前記天然のＤＮＡ配列が次のような ものである、請求項６に記載の発現ベクタ。
13. 【請求項１３】 前記天然のＤＮＡ配列が次のような ものである、請求項６に記載の発現ベクタ。
14. 【請求項１４】 前記停止コドンが塩基１１４８と１ ４９２の間に位置づけられる、請求項１３に記載 の発現ベクタ。
15. 【請求項１５】 前記停止コドンが塩基１１４８と１ ２０８の間に位置づけられる、請求項１３に記載 の発現ベクタ。
16. 【請求項１６】 前記停止コドンが塩基２０２５と２ ２７５の間に位置づけられる、請求項１２に記載 の発現ベクタ。
17. 【請求項１７】 前記停止コドンが連続する塩基性ア ミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列の５つのコド ン内にある、請求項６に記載の発現ベクタ。
18. 【請求項１８】 前記開始メチオニンコドンが前記Ｄ ＮＡ配列コードｓｅｒ−ｘ−ｓｅｒのすぐ前にあ り、ｘがｐｈｅまたはｌｅｕである、請求項７に 記載の発現ベクタ。
19. 【請求項１９】 真核細胞内のα−アミド化酵素のポ リペプチド配列の発現を誘導することができる発 現ベクタであって、前記ベクタは、転写プロモー タとその下流にあるアミド化酵素コード領域を有 する第１のＤＮＡ配列を備え、前記第１の配列は、 天然のアミド化酵素を発現するための天然のＤＮ Ａ配列に十分相同であり、ストリンジェントな状 態の下で前記天然の配列とのハイブリダイゼーシ ョンを受け、かつ前記第１の配列が、他の態様で はmembrane spanning domainをコードするような 配列から上流に停止コドンを含む、発現ベクタ。
20. 【請求項２０】 前記天然のＤＮＡ配列が次のような ものである、請求項１９に記載の発現ベクタ。
21. 【請求項２１】 前記天然のＤＮＡ配列が次のような ものである、請求項１９に記載の発現ベクタ。
22. 【請求項２２】 前記停止コドンが塩基１１４８と１ ４９２の間に位置づけられる、請求項２１に記載 の発現ベクタ。
23. 【請求項２３】 前記停止コドンが塩基１１４８と１ ２０８の間に位置づけられる、請求項２１に記載 の発現ベクタ。
24. 【請求項２４】 前記停止コドンが連続する塩基性残 基をコードするＤＮＡ配列の５つのコドン内に位 置づけられる、請求項１９に記載の発現ベクタ。
25. 【請求項２５】 前記停止コドンが塩基２０２５と２ ０７５の間に位置づけられる、請求項２０に記載 の発現ベクタ。
26. 【請求項２６】 前記ベクタが、前記第１のＤＮＡ配 列を、ｐｄＢＰＶＭＭＴＮｅｏ，ｐＳＶ_２，ｐＲ ＳＶ，ｐＭＡＭＮｅｏ，ｐｅｕＫ−Ｃｌ，ｐＣＨ １１０およびこれらの誘導体からなる群から選択 された発現系内に結合することによって形成され る、請求項２１に記載の真核細胞用発現ベクタ。
27. 【請求項２７】 請求項６の発現ベクタを備える原核 細胞宿主。
28. 【請求項２８】 前記宿主が、ＩＶＩ ｄｅｐｏｓｉ ｔ １０２９，Ｈｅｌａ，ＣＶ１，Ｃ１２７，Ｃ ＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａ ｒｙ）およびＣＯＳからなる群から選択され、請 求項１９に記載のベクタを備える、真核細胞宿主。
29. 【請求項２９】 請求項１９に記載の発現ベクタを備 える、真核細胞宿主。
30. 【請求項３０】 α−アミド化酵素のポリペプチド配 列を発現することができる宿主であって、前記宿 主は転写プロモータとその下流にある下記のＤＮ Ａ配列とを有する発現ベクタを備える、宿主。
31. 【請求項３１】 α−アミド化酵素のポリペプチド配 列を発現することができる宿主であって、前記宿 主は転写プロモータとその下流にある下記に示す ＤＮＡ配列とを有する発現ベクタを備える、宿主。
32. 【請求項３２】 停止コドンが塩基２３４０と２６９ ０の間に置かれる、請求項１３に記載の発現ベク タ。
33. 【請求項３３】 停止コドンが塩基２３４０と２６９ ０の間に位置づけられる、請求項２１に記載の発 現ベクタ。