CN101863983B - 基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。该组用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白，为如下1)和2)：1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成；2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成；所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。本发明方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统。
背景技术
研究蛋白质-蛋白质间的相互作用(PPI)是研究细胞中信号通道和传导的基础。细胞内部的动态和平衡态、内部变化和细胞生理功能都很大程度上依赖于蛋白质-蛋白质相互作用的信号网络进行调节。检测他们之间的相互作用，揭示生物学功能是目前生物医药领域的热点之一。
通过分子生物学的方法，调节特定的蛋白质与蛋白质相互作用为一些疑难杂症也提供了一种新的治疗方法的可能性。因此，无论是学术科研机构还是制药公司对这一领域都表现出浓厚的兴趣，希望通过发现和调节蛋白质与蛋白质的相互作用作，为临床治疗找到一种新的治疗手段。
在生物体外有很多种研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。其中大多需要首先将这些蛋白从其生理环境中纯化出来才可以使用。因为只有将所研究的蛋白还原到自然细胞生理状态下进行研究，我们才能得到准确空间信息，因此能够用于活细胞中生理水平PPI的分析技术显得尤为重要。
类似的技术包括：荧光共振能量转移技术(FRET)、双分子荧光互补技术(BiFC)、荧光互相关谱(FCCS)等。在这些方法中，双色荧光共定位技术是较为普遍的研究蛋白质相互作用的技术之一，并且广泛用于研究各类细胞和生物中。另外，亚细胞定位、多蛋白质分析同样也能够被双色荧光共定位技术检测出来。
绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP蛋白，是自发荧光蛋白中最重要的成员。它们分别是从水母victoria和珊瑚Discosma中分离得到的自发荧光蛋白。它们的光谱范围分别是359nm-509nm和558nm-702nm。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白组。
本发明所提供的用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白组，为如下1)和2)：
1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成的融合蛋白；
2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成的融合蛋白；
所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；
所述1)所示融合蛋白片段与2)所示融合蛋白片段分别独立包装；
所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白。
上述融合蛋白组中，所述1)所示融合蛋白中，荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号顺次连接；
所述2)所示融合蛋白中，待测蛋白B、核定位信号和荧光蛋白B顺次连接。
上述融合蛋白组中，所述荧光蛋白A为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白；所述荧光蛋白B为红色荧光蛋白或绿色荧光蛋白。
上述融合蛋白组中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述核输出信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围；上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
如下Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围：
Ⅰ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；
Ⅱ、含有上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；
Ⅲ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的编码基因和上述任一所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
上述重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒中，所述Ⅰ中所述重组表达载体为如下a所示；所述Ⅱ中所述重组表达载体为如下b所示；所述Ⅲ中所述转基因细胞系是将a所示重组表达载体和b所示重组表达载体转入细胞得到的；
a、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pmWasabi-C的多克隆位点间插入所述核输出信号的编码基因和待测蛋白A的编码基因，使绿色荧光蛋白的编码基因、待测蛋白A的编码基因和核输出信号的编码基因顺次连接为融合基因；
b、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pDsRed1-N1的多克隆位点间插入所述核定位信号的编码基因和待测蛋白B的编码基因，使待测蛋白B的编码基因、核定位信号的编码基因和红色荧光蛋白的编码基因顺次连接为融合基因。
上述转基因细胞系中，所述宿主细胞为Hela细胞系。
如下物质中的至少一种在检测蛋白是否相互作用中的应用也属于本发明的保护范围：1)上述任一所述的融合蛋白，2)上述编码基因，3)上述Ⅲ所述重组表达载体，4)上述Ⅲ所述重组菌，5)上述Ⅲ所述转基因细胞系。
本发明的最后一个目的是提供一种检测蛋白是否相互作用的方法。
本发明所提供的检测蛋白是否相互作用的方法，包括如下步骤：检测上述Ⅲ所述转基因细胞系的荧光发光情况，根据检测结果判别所述待测蛋白是否相互作用；
所述根据检测结果判别所述待测蛋白是否相互作用的方法如下：
若所述转基因细胞系中细胞核中同时具有两种颜色荧光，则所述待测蛋白相互作用；若所述转基因细胞系中细胞核中具有一种颜色荧光，而细胞质中具有另一个种颜色荧光，则所述待测蛋白不能相互作用。
或者，若所述转基因细胞系中细胞核中同时具有绿色荧光和红色荧光，则所述待测蛋白相互作用；若所述转基因细胞系中细胞核中具有红色荧光，而细胞质中具有绿色荧光，则所述待测蛋白不能相互作用。
所述检测转基因细胞系的荧光发光情况，是在得到所述转基因细胞系后的24h时进行的。
本发明的检测系统，赋予待检测蛋白对在细胞核内和核外分区表达的能力，从而产生空间位移变化的特点，并且使两种蛋白分别带有不同颜色的标记，便于区别。所用的核定位信号是NES数据库中核定位效果最突出的。出核信号的效果也非常明显。当两蛋白相互作用时，两蛋白全部出现在细胞核内，核内同时呈现绿色和红色两种颜色；当两蛋白不存在相互作用时，一个蛋白位于核内呈现红色，另一个蛋白位于核外呈现绿色。通过核内核外的两种颜色的荧光定位变化，就可判断两蛋白是否相互作用(原理示意如图1所示)。此方法检测结果可靠，操作简单，一目了然地看到共定位现象，易于判别，方便快捷。
附图说明
图1为本发明的原理示意图。
图2为pmWasabi-C载体的多克隆位点示意图。
图3为各转染处理组的荧光检测图。
图4为各转染处理组的细胞统计结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
GFP是绿色荧光蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：2，氨基酸序列SEQ ID NO：1；
RFP是红色荧光蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：4，氨基酸序列SEQ ID NO：3；
核输出信号(ABL)，其核苷酸序列SEQ ID NO：6，氨基酸序列SEQ ID NO：5；该多肽的作用是帮助核内的某些分子通过核孔进入细胞质。
核定位信号(NoL)，其核苷酸序列SEQ ID NO：8，氨基酸序列SEQ ID NO：7；该多肽的作用是帮助亲核蛋白进入细胞核；
Bcl2蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：14，氨基酸序列SEQ ID NO：13；
Bak(+)蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：10，氨基酸序列SEQ ID NO：9；
TIG3蛋白，其核苷酸序列SEQ ID NO：12，氨基酸序列SEQ ID NO：11；
已知：Bcl2蛋白与Bak(+)蛋白能够相互作用而结合；Bcl2蛋白与TIG3蛋白能够相互作用而结合；
下述实施例中所用的引物如表1所示。
表1、合成中需要的引物
| Zhou_08c | AGCTTAGGTAGCTGGGCAGATT | 22 |
实施例1、
一、GFP系列表达载体的构建
(一)表达融合蛋白GFP-ABL的表达载体的构建
ABL和Bcl2在pmWasabi-C载体中的插入位点如图2所述。
首先，从allelebiotech公司购买pmWasabi-C载体；
其次，退火合成ABL：退火合成的基本过程：
(1)片段处理：50ul：Zhou_05n 10ul，Zhou_06c 10ul，Zhou_07n 10ul，Zhou_08c 10ul(引物浓度0.1nmol/ul)，Ligase buffer(10×)5ul，H2O 5ul。煮沸5min，冷却至室温。
(2)连接(20ul)：去上述体系10ul，Ligase Buffer 2ul，Ligase 1.5ul，H2O6.5ul。室温连接2h。
(3)酶切载体pmWasabi-C：载体1ug，EcoRI 0.5ul，HindIII 0.5ul，Buffer2 2ul，H2O 16ul。37度酶切4h。
(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
(5)连接：将(2)步中连接的片段2ul，酶切后的载体1ul，Ligase Buffer2ul，Ligase 1.5ul，H2O 13.5ul。室温连接2h。
(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。
(7)挑克隆PCR鉴定
(8)取阳性克隆DNA测序
测序结果：载体pmWasabi-C中在EcoRI和HindIII酶切位点间插入的ABL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pmWasabi-ABL；该重组载体pmWasabi-ABL表达GFP-ABL融合蛋白(pmWasabi-C载体中含有GFP蛋白的编码基因，本实验将ABL的编码基因插在GFP的下游，构成了编码GFP-ABL融合蛋白的融合基因)。
(二)表达融合蛋白GFP-Bcl2-ABL的表达载体的构建
PCR扩增得到Bcl2并用XhoI+EcoRI插入到GFP-ABL上面得到GFP-Bcl2-ABL。
如下表达载体GFP-Bcl2-ABL构建步骤：
首先，从allelebiotech公司购买pmWasabi-C载体
其次，(1)PCR扩增Bcl2
模板pmWasabi-C载体1ul
引物09ZJ17n 5’-cgac ctcgagtc atggcgcacgctgggaga-3’ 1ul
引物09ZJ18c 5’-caat gaattc tcacttgtggctcagatagg-3’ 1ul
Pfu mixture(天根公司) 25ul
H2O 22ul
50ul
反应条件：94度 5min
94度 40sec
30cycles 60度 40sec
72度 1min
4度 10min
(2)酶切(1)PCR产物
PCR扩增产物 40ul
EcoRI 1ul
XhoI 1ul
Buffer 2 5ul
H2O 3ul
50ul
37度酶切4h
(3)酶切载体pmWasabi-ABL
载体 1ulg
EcoRI 0.5ul
Xho I 0.5ul
Buffer 2 2ul
H2O 16ul
20ul
37度酶切4h
(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
(5)连接
将(2)步中连接的片段 2ul
酶切后的载体 1ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 13.5ul
20ul
室温连接2h
(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。
(7)挑克隆PCR鉴定
(8)取阳性克隆DNA测序
结果：载体pmWasabi-ABL中在EcoRI和Xho I酶切位点间插入的Bcl2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pmWasabi-Bcl2-ABL；该重组载体pmWasabi-Bcl2-ABL表达GFP-Bcl2-ABL融合蛋白(本实验将Bcl2的编码基因插在GFP和ABL之间，构成了编码GFP-Bcl2-ABL融合蛋白的融合基因)。
二、RFP系列表达载体的构建
(一)表达融合蛋白NOL-RFP的表达载体的构建
载体pDsRed1-N1购自Clontech laboratories，产品目录号为Catalog #6921-1；载体pDsRed1-N1中含有RFP的编码基因(DsRed1)。
退火链接NOL
退火合成的基本过程：
(1)片段处理：引物浓度0.1nmol/ul
Zhou_11n 10ul
Zhou_12c 10ul
Zhou_13n 10ul
Zhou_14c 10ul
Zhou_15n 10
Zhou_16c 10ul
Zhou_17n 10ul
Zhou_18c 10ul
Zhou_19n 10ul
Zhou_20c 10
Zhou_21n 10ul
Zhou_22c 10ul
Zhou_23n 10ul
Zhou_24c 10ul
Zhou_25n 10ul
Zhou_26n 10ul
Zhou_27c 10ul
Ligase buffer(10×)20ul
H2O 10ul
200ul
煮沸5min，冷却至室温
(2)连接：
去上述体系 10ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 6.5ul
20ul
室温连接2h
(3)酶切载体pDsRed1-N1
载体 1ulg
EcoRI 0.5ul
BamHI 0.5ul
Buffer 2 2ul
H2O 16ul
20ul
37度酶切4h
(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
(5)连接
将(2)步中连接的片段 2ul
酶切后的载体 1ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 13.5ul
20ul
室温连接2h
(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。
(7)挑克隆PCR鉴定
(8)取阳性克隆DNA测序；
结果：载体pDsRed1-N1中在EcoRI和BamHI酶切位点间插入的NOL编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pDsRed1-NOL；该重组载体pDsRed1-NOL表达NOL-RFP融合蛋白(pDsRed1-N1载体中含有RFP蛋白的编码基因，本实验将NOL的编码基因插在RFP的上游，构成了编码NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。
(二)表达融合蛋白Bak-NOL-RFP的表达载体的构建
Bak+由引物Venus01n，Venus0退火合成，并用XhoI+HindIII连接到NOL-DsRed的N端。
退火合成的基本过程：
(1)片段处理：引物浓度 0.1nmol/ul
Venus01n 10ul
Venus02c 10ul
Ligase buffer(10×) 3ul
H2O 7ul
30ul
| Venus01n | 5’-TCGAGGGGCAGGTGGGACGGCAGCTCGCCATCATCGGGGACGACATCAACCGAT-3’ |
| Venus02c | 5’-AGCTTTCGGTTGATGTCGTCCCCGATGATGGCGAGCTGCCGTCCCACCTGCCC-3’ |
煮沸5min，冷却至室温
(2)连接：
去上述体系10ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 6.5ul
20ul
室温连接2h
(3)酶切载体pDsRed1-NOL
载体 1ulg
XhoI 0.5ul
HindIII 0.5ul
Buffer 2 2ul
H2O 16ul
20ul
37度酶切4h
(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
(5)连接
将(2)步中连接的片段 2ul
酶切后的载体 1ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 13.5ul
20ul
室温连接2h
(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Amp+平板。
(7)挑克隆PCR鉴定
(8)取阳性克隆DNA测序
结果：载体pDsRed1-NOL中在XhoI和HindIII酶切位点间插入的Bak+编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pBak-NOLs-DsRed；该重组载体pBak-NOLs-DsRed表达Bak-NOL-RFP融合蛋白(本实验在pDsRed1-NOL中NOL-RFP的N端插入了Bak的编码基因，构成了编码Bak-NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。
(三)表达融合蛋白NOL-RFP-TIG3的表达载体的构建
人工合成得到SEQ ID NO：12所示的TIG3基因。
(1)PCR扩增TIG3
模板SEQ ID NO：12所示的TIG3基因1ul
引物tig3-n-primer 5′-CAAGCTCGAGATGGCTTCGCCACACCAAGA-3′ 1ul
引物tig3-125c-primer5′-CTAGAAGCTTTTAGGACTTGCCATATCTCAGCTGGG-3′ 1ul
Pfu mixture(天根公司) 25ul
H2O 22ul
50ul
反应条件：94度 5min
94度 40sec
30cycles 60度 40sec
72度 1min
4度 10min
(2)酶切(1)PCR产物
PCR扩增产物 40ul
XhoI 1ul
HindIII 1ul
Buffer 2 5ul
H2O 3ul
50ul
37度酶切4h
(3)酶切载体pDsRed1-NOL
载体 1ulg
XhoI 0.5ul
HindIII 0.5ul
Buffer 2 2ul
H2O 16ul
20ul
37度酶切4h
(4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
(5)连接
将(2)步中连接的片段 2ul
酶切后的载体 1ul
Ligase Buffer 2ul
Ligase 1.5ul
H2O 13.5ul
20ul
室温连接2h
(6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Kan+平板。
(7)挑克隆PCR鉴定
(8)取阳性克隆DNA测序
结果：载体pDsRed1-NOL中在XhoI和HindIII酶切位点间插入的TIG3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12中第1-375位核苷酸所示，表明得到的基因序列正确及构建的载体正确，将该重组载体记作pTIG3-NOL-DsRed；该重组载体pTIG3-NOL-DsRed表达TIG3-NOL-RFP融合蛋白(本实验在pDsRed1-NOL中NOL-RFP的N端插入了TIG3的编码基因，构成了编码TIG3-NOL-RFP融合蛋白的融合基因)。
实施例2、共定位检测
HeLa细胞购自美国模式培养物研究所(简称ATCC)。转染试剂购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司(Vigofect)。
将HeLa细胞于37℃，5％的二氧化碳的加湿孵化器中培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’s medium)。然后将细胞移至24孔组织培养板，当细胞密度达到70％，迅速将各处理组的重组表达载体转染细胞，使用PEI转染试剂。得到转染细胞后，再过24小时检测荧光量。转染量：处理组的重组表达载体分别为300ng。
数据分析方法：使用DMIL荧光显微镜(蔡司，德国)为所有转染细胞进行荧光图像拍摄，每个共转染组分别随机选取300组照片，然后由ImageJ1.42软件进行分析，得出各处理组的共定位细胞数占样本集合的百分比和非共定位细胞数的百分比。然后用orginpro7.5进行显著性差异分析。
各处理组如下：
a、GFP-ABL+NOL-RFP；b、GFP-Bcl2-ABL+NOL-RFP
c、GFP-ABL+Bak-NOL-RFP Peptide
d、GFP-Bcl2-ABL+Bak-NOL-RFP Peptide
e、GFP-ABL+TIG3-NOL-RFP
f、GFP-Bcl2-ABL+TIG3-NOL-RFP。
结果如图3和4所示。
a、b、c、e组均是细胞核内呈现红色，细胞质中呈现绿色，即没有出现细胞核内共定位的现象。d和f组全部为细胞核内同时出现红色和绿色且绿色会在核内核仁处聚集，即细胞核内共定位。表明，本发明的检测方法检测结果准确可靠。
序列表
<110>北京大学
<120>基于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的双荧光共定位系统
<160>14
<210>1
<211>230
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Thr Thr Met Gly Val Ile Lys Pro Asp
1 5 10 15
Met Lys Ile Lys Leu Lys Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe
20 25 30
Val Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Asp Gly Thr Asn Thr
35 40 45
Ile Asn Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ser Tyr Asp
50 55 60
Ile Leu Thr Thr Ala Phe Ser Tyr Gly Asn Arg Ala Phe Thr Lys Tyr
65 70 75 80
Pro Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr
85 90 95
Ser Trp Glu Arg Thr Met Thr Phe Glu Asp Lys Gly Ile Val Lys Val
100 105 110
Lys Ser Asp Ile Ser Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Tyr Glu Ile His
115 120 125
Leu Lys Gly Glu Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Glu
130 135 140
Thr Thr Gly Trp Asp Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Val Arg Asp Gly
145 150 155 160
Val Leu Lys Gly Asp Val Lys Met Lys Leu Leu Leu Glu Gly Gly Gly
165 170 175
His His Arg Val Asp Phe Lys Thr Ile Tyr Arg Ala Lys Lys Ala Val
180 185 190
Lys Leu Pro Asp Tyr His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Asn
195 200 205
His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Thr Val Tyr Glu Ile Ala Val Ala
210 215 220
Arg Asn Ser Thr Asp Gly
225 230
<210>2
<211>690
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atggtgagca agggcgagga gaccacaatg ggcgtaatca agcccgacat gaagatcaag 60
ctgaagatgg agggcaacgt gaatggccac gccttcgtga tcgagggcga gggcgagggc 120
aagccctacg acggcaccaa caccatcaac ctggaggtga aggagggagc ccccctgccc 180
ttctcctacg acattctgac caccgcgttc agttacggca acagggcctt caccaagtac 240
cccgacgaca tccccaacta cttcaagcag tccttccccg agggctactc ttgggagcgc 300
accatgacct tcgaggacaa gggcatcgtg aaggtgaagt ccgacatctc catggaggag 360
gactccttca tctacgagat acacctcaag ggcgagaact tcccccccaa cggccccgtg 420
atgcagaagg agaccaccgg ctgggacgcc tccaccgaga ggatgtacgt gcgcgacggc 480
gtgctgaagg gcgacgtcaa gatgaagctg ctgctggagg gcggcggcca ccaccgcgtt 540
gacttcaaga ccatctacag ggccaagaag gcggtgaagc tgcccgacta tcactttgtg 600
gaccaccgca tcgagatcct gaaccacgac aaggactaca acaaggtgac cgtttacgag 660
atcgccgtgg cccgcaactc caccgacggc 690
<210>3
<211>226
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Met Val Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys
1 5 10 15
Val Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys
35 40 45
Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro
50 55 60
Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile
65 70 75 80
Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg
85 90 95
Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser
100 105 110
Ser Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val
115 120 125
Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp
130 135 140
Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly
145 150 155 160
Glu Ile His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val
165 170 175
Glu Phe Lys Ser Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly
180 185 190
Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp
195 200 205
Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu
210 215 220
Phe Leu
225
<210>4
<211>681
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
atggtgcgct cctccaagaa cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60
ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120
ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180
atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240
cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300
gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc 360
tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420
accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480
gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc 540
atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact actacgtgga ctccaagctg 600
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc 660
cgccaccacc tgttcctgta g 681
<210>5
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
Ala Ile Asn Lys Leu Glu Asn Asn Leu Arg Glu Leu Gln Ile Cys Pro
1 5 10 15
Ala Thr
<210>6
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gcaatcaaca agctggaaaa caatctccga gaactccaaa tctgcccagc gact 54
<210>7
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
Ser Lys Arg Pro Arg Arg Leu Arg Arg Leu Gly Lys Glu Thr Met Gly
1 5 10 15
Arg Ala Cys Arg Ala His Leu Gly Ser His Arg Trp Pro Thr Thr Cys
20 25 30
Thr Thr Lys Thr Thr Thr Thr Arg Ala Arg Arg Arg Lys Arg Arg Arg
35 40 45
Arg Arg Arg Leu Gly Thr Glu Ile Thr Phe Cys Ser Val Met Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Met Val Phe Ile Pro Val Lys Val Met Arg Arg Ile Glu Pro
65 70 75 80
His Met Gln Ala Leu Val Thr Gly Leu Gln Gly His Gly
85 90
<210>8
<211>279
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
agcaaacgcc cgcgccgtct gcgccgactg ggcaaagaaa ccatgggccg cgcatgccgc 60
gcgcatctgg gcagccatcg ctggccgacc acatgcacca ccaaaaccac gaccactcgc 120
gcgcgccgcc gaaaacgccg acgtcgccgc cggctgggca ccgaaattac cttttgcagc 180
gtgatgaaac tgagcctgat ggtgtttatt ccggtgaaag tgatgcgccg gattgaaccg 240
catatgcagg cgctggtgac cggcctgcag ggccatggc 279
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
Gly Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg
1 5 10 15
<210>10
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
gggcaggtgg gacggcagct cgccatcatc ggggacgaca tcaaccga 48
<210>11
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>11
Met Ala Ser Pro His Gln Glu Pro Lys Pro Gly Asp Leu Ile Glu Ile
1 5 10 15
Phe Arg Leu Gly Tyr Glu His Trp Ala Leu Tyr Ile Gly Asp Gly Tyr
20 25 30
Val Ile His Leu Ala Pro Pro Ser Glu Tyr Pro Gly Ala Gly Ser Ser
35 40 45
Ser Val Phe Ser Val Leu Ser Asn Ser Ala Glu Val Lys Arg Glu Arg
50 55 60
Leu Glu Asp Val Val Gly Gly Cys Cys Tyr Arg Val Asn Asn Ser Leu
65 70 75 80
Asp His Glu Tyr Gln Pro Arg Pro Val Glu Val Ile Ile Ser Ser Ala
85 90 95
Lys Glu Met Val Gly Gln Lys Met Lys Tyr Ser Ile Val Ser Arg Asn
100 105 110
Cys Glu His Phe Val Thr Gln Leu Arg Tyr Gly Lys Ser
115 120 125
<210>12
<211>495
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>12
atggcttcgc cacaccaaga gcccaaacct ggagacctga ttgagatttt ccgccttggc 60
tatgagcact gggccctgta tataggagat ggctacgtga tccatctggc tcctccaagt 120
gagtaccccg gggctggctc ctccagtgtc ttctcagtcc tgagcaacag tgcagaggtg 180
aaacgggagc gcctggaaga tgtggtggga ggctgttgct atcgggtcaa caacagcttg 240
gaccatgagt accaaccacg gcccgtggag gtgatcatca gttctgcgaa ggagatggtt 300
ggtcagaaga tgaagtacag tattgtgagc aggaactgtg agcactttgt cacccagctg 360
agatatggca agtcccgctg taaacaggtg gaaaaggcca aggttgaagt cggtgtggcc 420
acggcgcttg gaatcctggt tgttgctgga tgctcttttg cgattaggag ataccaaaaa 480
aaagcgacag cctaa 495
<210>13
<211>239
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>13
Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met
1 5 10 15
Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala
20 25 30
Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro G1y Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile
35 40 45
Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp
50 55 60
Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr
85 90 95
Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe
100 105 110
Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly
115 120 125
Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp
130 135 140
Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu
145 150 155 160
Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp
165 170 175
Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn
180 185 190
Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala
210 215 220
Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Ser His Lys
225 230 235
<210>14
<211>717
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>14
atggcgcacg ctgggagaac ggggtacgat aaccgggaga tagtgatgaa gtacatccat 60
tataagctgt cgcagagggg ctacgagtgg gatgcgggag atgtgggcgc cgcgcccccg 120
ggggccgccc ccgcaccggg catcttctcc tcccagcccg ggcacacgcc ccatccagcc 180
gcatcccgcg acccggtcgc caggacctcg ccgctgcaga ccccggctgc ccccggcgcc 240
gccgcggggc ctgcgctcag cccggtgcca cctgtggtcc acctgaccct ccgccaggcc 300
ggcgacgact tctcccgccg ctaccgccgc gacttcgccg agatgtccag ccagctgcac 360
ctgacgccct tcaccgcgcg gggacgcttt gccacggtgg tggaggagct cttcagggac 420
ggggtgaact gggggaggat tgtggccttc tttgagttcg gtggggtcat gtgtgtggag 480
agcgtcaacc gggagatgtc gcccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gactgagtac 540
ctgaaccggc acctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggatgc ctttgtggaa 600
ctgtacggcc ccagcatgcg gcctctgttt gatttctcct ggctgtctct gaagactctg 660
ctcagtttgg ccctggtggg agcttgcatc accctgggtg cctatctgag ccacaag 717
Claims (9)
1.一种用于检测待测蛋白是否相互作用的融合蛋白组，为如下1)和2)：
1)由荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号组成的融合蛋白；
2)由荧光蛋白B、待测蛋白B和核定位信号组成的融合蛋白；
所述荧光蛋白A与所述荧光蛋白B为发不同颜色荧光的荧光蛋白；
所述荧光蛋白A为红色荧光蛋白，所述荧光蛋白B为绿色荧光蛋白或所述荧光蛋白A为绿色荧光蛋白，所述荧光蛋白B为红色荧光蛋白；
所述1)所示融合蛋白与2)所示融合蛋白分别独立包装；
所述待测蛋白A和待测蛋白B是待检测是否相互作用的两个蛋白；
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述核输出信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白组，其特征在于：所述1)所示融合蛋白中，荧光蛋白A、待测蛋白A和核输出信号顺次连接；
所述2)所示融合蛋白中，待测蛋白B、核定位信号和荧光蛋白B顺次连接。
3.权利要求1或2所述1)所示融合蛋白的编码基因。
4.权利要求1或2所述2)所示融合蛋白的编码基因。
5.如下I、II或III任一所示的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒：
I、含有权利要求1或2所述1)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；
II、含有权利要求1或2所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒；
III、含有权利要求1或2所述1)所示融合蛋白的编码基因和权利要求1或2所述2)所示融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒，其特征在于：
所述I中所述重组表达载体为如下a所示；
所述II中所述重组表达载体为如下b所示；
所述III中所述转基因细胞系是将a所示重组表达载体和b所示重组表达载体转入宿主细胞得到的；
a、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pmWasabi-C的多克隆位点间插入所述核输出信号的编码基因和待测蛋白A的编码基因，使绿色荧光蛋白的编码基因、待测蛋白A的编码基因和核输出信号的编码基因顺次连接为融合基因；
b、按照如下方法得到的重组表达载体：在载体pDsRed1-N1的多克隆位点间插入所述核定位信号的编码基因和待测蛋白B的编码基因，使待测蛋白B的编码基因、核定位信号的编码基因和红色荧光蛋白的编码基因顺次连接为融合基因。
7.根据权利要求6所述的转基因细胞系，其特征在于：所述宿主细胞为Hela细胞系。
8.如下物质中的至少一种在检测蛋白是否相互作用中的应用：1)权利要求1或2所述的融合蛋白组，2)权利要求3和4所述编码基因，3)权利要求5或6中III所述重组表达载体，4)权利要求5或6中III所述重组菌，5)权利要求5-7中任一III所述转基因细胞系。
9.一种检测蛋白是否相互作用的方法，包括如下步骤：检测权利要求5-7中任一III所述转基因细胞系的荧光发光情况，根据检测结果判别待测蛋白是否相互作用；
所述根据检测结果判别待测蛋白是否相互作用的方法如下：
若所述转基因细胞系中细胞核中同时具有两种颜色荧光，则所述待测蛋白相互作用，
若所述转基因细胞系中细胞核中具有一种颜色荧光，而细胞质中具有另一个种颜色荧光，则所述待测蛋白不能相互作用。
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| Jakobs S, et al.EGFP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy.《FEBS Letters》.2000,第479卷第131-135页. * |
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