JP6716108B2 - 血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法に関する。特に本発明は、新生児の黄疸管理を適切に行うため、新生児由来血液試料中のアンバウンドビリルビンを正確に測定する方法に関する。中でも本発明は、早産児の核黄疸を確実に予見するため、早産児由来血液試料中のアンバウンドビリルビンを正確に測定する方法に関する。

従来、核黄疸は新生児脳障害の原因の１つであったが、周産期医療の進歩によって早期発見早期治療がなされ、正期産児（成熟児）ではほぼ予防可能となった。しかし、近年、超早産児の生存例の増加等に伴って早産児に核黄疸症例が発生している現状が明らかになり、小児新生児医療領域において、緊急に解決すべき大きな課題となっている。

核黄疸の原因が、新生児期の黄疸、すなわち血清ビリルビンにあることは良く知られている。血清ビリルビン、いわゆる総ビリルビン（TB）は、それ自体が黄色色素であり、非抱合型ビリルビン（間接ビリルビン；iDB）および抱合型ビリルビン（直接ビリルビン；DB）を含む。神経毒性を有する成分は非抱合型ビリルビンであるが、その中でも、アルブミン非結合型のアンバウンドビリルビン（UB）は、低分子量であることから容易に血液脳関門を通過し脳に沈着するため、神経毒性を発揮する重大要因となる。

アンバウンドビリルビンの測定技術の開発は１９６０年代から試みられてきた中で、本発明者は、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ（ＧＯＤ−ＰＯＤ）法を報告した（非特許文献１：Clin Chim Acta. 1977 Sep 1; 79(2): 411-7参照）。さらに、ＧＯＤ−ＰＯＤ法を適用した自動測定装置（（株）アローズ製UB-Analyzer）を開発した（非特許文献２：Kobe J Med Sci. 1982 Apr; 28(2): 91-104参照）。この自動測定装置は、アンバウンドビリルビン測定装置として臨床応用されている唯一の装置であり、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）および日本国厚生労働省に認可されている。

ＧＯＤ−ＰＯＤ法では、グルコースとグルコースオキシダーゼとにより発生させた過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させ、ビリルビン酸化分解を起こさせる。アルブミン非結合型のアンバウンドビリルビンが無色成分へ容易に酸化分解される一方、アルブミン結合型ビリルビンが酸化分解されにくいため、アンバウンドビリルビンの濃度はその酸化分解の初速度から計測される。具体的には、比色法によりビリルビン色素の減少速度をモニタリングすることで計測される。

神戸大学医学部小児科から発表された黄疸治療基準では、血清総ビリルビン濃度とアンバウンドビリルビン濃度との両方について、光線療法および交換輸血の適応基準が示されている（非特許文献３：神戸大学医学部小児科，編，未熟児新生児の管理．東京、日本小児医事出版社，1991参照）。この基準の普及により、成熟児の核黄疸は大きく減少した。しかし、この基準を早産児にあてはめることについて過剰治療の指摘もあり、現状として、遵守率は下がっている。

また、黄疸治療基準の他の例として、血清総ビリルビン濃度のみに基づいて光線療法および交換輸血の適応基準が示されているものもある（非特許文献４：川瀬康浩.新生児高ビリルビン血症.山口徹、北原光夫、福井次矢 総編集、今日の治療指針2006年版、医学書院、東京、2006 pp 941-942）。

一方、ニホンウナギの筋肉において緑色蛍光を示すタンパク質をコードする遺伝子が単離された。その遺伝子産物ＵｎａＧは非抱合型ビリルビンと特異的に結合することで強い緑色蛍光を発し、結合したビリルビン自体が蛍光性発色団として働くことが発見された（非特許文献５：Cell. 2013 Jun 20; 153(7): 1602-11および特許文献１：国際公開第２０１４／１３３１５８号参照）。

国際公開第２０１４／１３３１５８号

Clinica Chimica Acta, 1977 Sep 1; 79(2): 411-7. Kobe Journal of Medical Sciences, 1982 Apr; 28(2): 91-104. 神戸大学医学部小児科，編，未熟児新生児の管理．東京、日本小児医事出版社，1991 川瀬康浩.新生児高ビリルビン血症.山口徹、北原光夫、福井次矢 総編集、今日の治療指針2006年版、医学書院、東京、2006 pp 941-942 Cell. 2013 Jun 20; 153(7): 1602-11.

本発明者らによって行われた早産児の核黄疸の発生頻度に関する全国調査によると、核黄疸の年間発生数は、在胎３０週未満の早産児で８〜９人/年と推察されるところ、実際には在胎３０週以上３７週未満の早産児にも発症しうることを考慮すると、さらに多い可能性が十分ある。

また、通常では血中のアンバウンドビリルビン量は総ビリルビン量に相関するが、新生児のうち特に早産児においては、そのような相関を示さない場合がある。本発明者らによる調査では、３０週未満の早産児では、総ビリルビンが１５未満の低値であるにも関わらずアンバウンドビリルビンが０．８以上の高値を示す例が３９％もみられ、低ＴＢ核黄疸児８例中７例も占めていたことが判っている。総ビリルビンに比してアンバウンドビリルビンが相対的に高い症例が少なからず存在することを示したこの結果は、黄疸管理を総ビリルビンのみで管理することが、核黄疸発生の危険状態を見逃すことを警告している。

アンバウンドビリルビンによる黄疸管理の重要性の再認識により、アンバウンドビリルビンの正確な測定系が必要となる。しかしながら、唯一の自動測定装置UB-Analyzerでさえも、検体中の抱合型ビリルビンが高い場合には正確な測定ができない問題がある。ＧＯＤ−ＰＯＤ法では、抱合型ビリルビンが高い場合に、アンバウンドビリルビンとともに抱合型ビリルビンも酸化分解されることで、アンバウンドビリルビン測定値が真のアンバウンドビリルビン量からかけ離れた、見かけ上パニック値を示すことがある。このような測定値に直面した場合の臨床的判断の困難性は非常に大きい。新生児、特に早産児では、この抱合型ビリルビンが高い症例が多いため問題は大きい。

国際公開第２０１４／１３３１５８号（特許文献１）に記載されたポリペプチドＵｎａＧが非抱合型ビリルビンに特異的に結合することから、本発明者らは、このポリペプチドをＧＯＤ−ＰＯＤ測定系に適用することを着想した。しかしながら、このポリペプチドはアルブミン結合ビリルビンと接触した瞬間にアルブミンの結合を解いてビリルビンに結合するため、アンバウンドビリルビンとアルブミン結合ビリルビンとの区別が無くなる。そのため、アンバウンドビリルビンの酸化分解の初速度からその濃度を導出するＧＯＤ−ＰＯＤ測定系へ単純に適用することができない。

以上に鑑み、本発明の目的は、抱合型ビリルビン量が高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビンを正確に反映することができる測定方法を提供することにある。

本発明者らは、ＧＯＤ−ＰＯＤ測定系において、アンバウンドビリルビンの濃度測定に必須であったアンバウンドビリルビン酸化分解の初速度測定の手法を敢えて捨象し、代わりに当該酸化分解を停止させる手法を採用した。そして、酸化分解反応前後におけるＵｎａＧ結合量の差分をアンバウンドビリルビンの量として導出することで、ＵｎａＧを、従来のように検出対象成分のみを標識する形態で使用するのではなく、検出対象成分のみを変化させ標識されない形態で使用することで、ＧＯＤ−ＰＯＤ測定系への適用を可能にした。本発明は、以下の発明を包含する。

（１）
本発明のアンバウンドビリルビンの測定方法は、分解工程（i）と、分解停止工程（ii）と、接触工程（iii）と、検出工程（iv）とを含む。
分解工程（i）では、非抱合型ビリルビンおよび抱合型ビリルビンを含む血液試料を、非抱合型ビリルビンのうちのアンバウンドビリルビン、および抱合型ビリルビンの酸化分解反応に供する。
分解停止工程（ii）では、酸化分解反応を停止して試料分解物を得る。
接触工程（iii）では、試料分解物を、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる。別途、血液試料が分解工程（i）に供されなかった未反応試料も、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる。
検出工程（iv）では、試料分解物と未反応試料とのそれぞれについて、ポリペプチドに起因する蛍光を検出する。さらに、試料分解物における蛍光と未反応試料における蛍光との差から、アンバウンドビリルビンの量を導出する。

上記の構成では、血液試料が、分解工程（i）を経た系統と、分解工程（i）を経ない系統とに分けられ、前者のみで、アンバウンドビリルビンが、ポリペプチドへの特異的結合能を持たない成分へ分解される。これにより、血液試料中に含まれていた非抱合型ビリルビン（アンバウンドビリルビンおよびアルブミン結合ビリルビン）および抱合型ビリルビンのうち、分解工程（i）を経た系統ではアルブミン結合ビリルビンのみが特異的結合および蛍光を生じ、分解工程（i）を経ない系統ではアンバウンドビリルビンおよびアルブミン結合ビリルビンが特異的結合および蛍光を生じるように調製される。

したがって、非抱合型ビリルビンと抱合型ビリルビンとが区別されるとともに、非抱合型ビリルビンのアンバウンドビリルビンとアルブミン結合ビリルビンとも区別されるため、抱合型ビリルビンが高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビンを正確に測定することが可能になる。これにより、新生児からの採血試料を血液試料として測定すれば、新生児の黄疸管理を的確に行うことができる。

さらに、蛍光法であることから高い測定感度が達成されるため、微量血液試料での測定が可能になる。したがって、血液試料が、新生児、特に早産児に由来するものである場合に、採血時の負荷を軽減することができる。

（２）
上記（１）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は、早産児由来の血液試料であってよい。

早産児では、総ビリルビンに対しアンバウンドビリルビンが高い症例が特に多いため、より有効性の高い黄疸管理が可能となる。

（３）
上記（１）または（２）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は、血清総ビリルビン濃度が８ｍｇ／ｄＬ以上である血液に由来するものであってよい。

このように血清総ビリルビン濃度が高い場合、抱合型ビリルビン量が高い症例が特に多い。本発明では抱合型ビリルビンを検出しないため、このように抱合型ビリルビン量が高い症例が特に多い場合に特に有用である。具体的には、新生児黄疸の管理を効果的に行うことができる。

（４）
上記（１）から（３）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料の抱合型ビリルビン濃度は１ｍｇ／ｄＬ以上であってよい。

本発明では抱合型ビリルビンを検出しないため、このように抱合型ビリルビン濃度が高い試料の場合に特に有用である。

（５）
上記（１）から（４）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、酸化分解反応の停止は抗酸化物質によって行ってよい。

この場合、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。

（６）
上記（５）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質はアスコルビン酸であってよい。

この場合、酸化分解反応の停止をより簡易かつ効果的に行うことができる。

（７）
上記（１）から（６）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、酸化分解反応の停止は、分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下の時点で行うことができる。

この場合、血液試料中のアンバウンドビリルビンを十分に分解することができるとともに、アンバウンドビリルビンの迅速な測定を行うことができる。

（８）
上記（５）から（７）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質は、分解停止工程（ii）の反応系において０．１重量％以上となるように添加されてよい。

この場合、酸化分解反応の停止をより確実に行うための抗酸化作用を発揮することができる。

（９）
上記（８）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、抗酸化物質がアスコルビン酸である場合、アルコルビン酸は、分解停止工程（ii）の反応系において３２重量％以下となるように添加されてよい。

この場合、接触工程（iii）において、ポリペプチドの結合反応が起こりやすいｐＨへの調整が容易である。

（１０）
上記（６）から（９）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、アスコルビン酸は、接触工程（iii）の反応系において０．８重量％以下となるように希釈されてよい。

この場合、接触工程（iii）の反応系を、ポリペプチドの結合反応が起こりやすいｐＨとすることができる。

（１１）
上記（１）から（１０）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、分解工程（i）の反応系における血液試料の希釈率は、血清換算値で５倍以上１２０倍以下であってよい。

この場合、血液試料が比較的濃い濃度で反応に供されるため、ビリルビンの自然消費（たとえば、光曝露および／または血清中の未知の代謝物質による分解）を好ましく抑制するとともに、アンバウンドビリルビンの分解反応の進行への悪影響も回避しやすい。したがって、より正確にアンバウンドビリルビンを測定することができる。

（１２）
上記（１１）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、分解工程（i）の酸化分解反応が、グルコースオキシダーゼの存在下でグルコースから生じさせた過酸化水素とペルオキシダーゼとにより進行させるものであり、酸化分解反応の反応系において、グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼそれぞれの量が、血清１μＬ当たりの換算値で０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下であってよい。
なお、本明細書において、酵素の量を表す単位Ｕは、国際単位（International Unit）である。

この場合、血液試料の濃度に対する酵素量が適切であるため、分解工程（i）の反応速度を適切にコントロールすることができる。

（１３）
上記（１）から（１２）のいずれかのアンバウンドビリルビンの測定方法において、血液試料は全血試料であってよい。

この場合、さらに、血清の調製を行う必要が無いため測定効率が良好である。したがって、緊急疾患である新生児黄疸の迅速な検査が可能となる。さらに、採血量が少なくて済むため、新生児、特に早産児の採血時の負荷を軽減することができる。

（１４）
上記（１３）のアンバウンドビリルビンの測定方法において、検出工程（iv）で、ヘマトクリット値による補正を行ってアンバウンドビリルビンの量を導出してよい。

通常ビリルビンは血球成分中に存在せず血漿成分中に存在するために、全血でのアンバウンドビリルビン測定値は、血清または血漿で測定した場合に比べて低く検出される。これをヘマトクリット値で補正することで、全血であっても正確な測定が可能となる。

（１５）
本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、インキュベータと、試薬液添加部と、試薬ブランク液添加部と、タイマーと、停止剤添加部と、混和部と、を含む。
インキュベータは、反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含む。
試薬液添加部は、反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液を添加する。
試薬ブランク液添加部は、対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液を添加する。
タイマーは、試薬液添加部および試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動する。
停止剤添加部は、タイマーの計測時間に基づいて制御されかつ、反応用容器および対照用容器それぞれに酸化分解停止剤を添加する。
混和部は、反応用容器の内容物および対照用容器の内容物それぞれを混和する。

この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法の分解工程（i）および分解停止工程（ii）をルーチン化し、接触工程（iii）に供するためのアンバウンドビリルビン測定用試料を容易にかつ正確に調製することができる。

（１６）
本発明のアンバウンドビリルビン測定装置は、（１５）に記載のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置と、蛍光測定部と、演算処理部と、出力部とを含む。
蛍光測定部は、酸化分解停止剤が添加された反応用容器の内容物および対照用容器の内容物それぞれに蛍光特性を示すポリペプチドが添加された蛍光測定用試料について蛍光測定を行う。
演算処理部は、少なくとも反応用容器の内容物の蛍光値と対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する。
出力部は、導出された前記アンバウンドビリルビン値を表示する。

この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法を容易にかつ正確に行うことができる。

（１７）
上記（１６）に記載のアンバウンドビリルビン測定装置は、分取部と添加部とをさらに含んでよい。
分取部は、酸化分解停止剤の添加後に反応用容器および対照用容器それぞれから内容物を測定用容器に分取する。
添加部は、測定用容器に蛍光特性を示すポリペプチド液を添加する。

この構成によって、蛍光測定用試料の調製もルーチン化されるため、（１）から（１４）に記載アンバウンドビリルビンの測定方法をより容易にかつ正確に行うことができる。

（１８）
本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、を少なくとも含む。

この構成によって、（１）から（１４）に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法を実施することができる。

（１９）
上記（１８）のアンバウンドビリルビン測定キットは、グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含んでよい。

これによって、アンバウンドビリルビンの分解開始のタイミングおよび分解速度のコントロールが容易となる。

（２０）
上記（１８）または（１９）のアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、酸化還元酵素はペルオキシダーゼであってよい。
これによって、アンバウンドビリルビンの酸化分解を効果的に行うことができる。

（２１）
上記（１８）から（２０）のいずれかのアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、酸化分解停止剤は抗酸化物質であってよい。
これによって、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。

（２２）
上記（２１）のアンバウンドビリルビン測定キットにおいて、抗酸化物質はアスコルビン酸であってよい。
これによって、酸化分解反応の停止を簡易かつ効果的に行うことができる。

本発明によって、抱合型ビリルビンが高い検体か否かにかかわらず、アンバウンドビリルビン量を正確に反映した測定を行うことができる。このため、たとえば新生児の黄疸管理を的確に行うことが可能となる。

本発明の一実施形態における測定原理を模式的に示す。 本発明の測定方法のプロトコルの一例を示す。 本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置および本発明のアンバウンドビリルビン測定装置の一例のブロック図を示す。 参考例１で行ったＵｎａＧ法のプロトコルを模式的に示す。 参考例１で得られた検量線を示す。 参考例３で得られた、ＵｎａＧ法（ＵｎａＧ使用およびＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ使用）による非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法による非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 図６の相関図について、ＵｎａＧを使用したＵｎａＧ法の場合（７２検体、×ドット）とＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを使用したＵｎａＧ法の場合（６８検体、○ドット）とで区別して示す。 図６の相関図について、光線治療中の新生児の検体（３５検体、三角ドット）と、光線治療を行っていない新生児の検体（１０５検体、丸ドット）とを区別可能にプロットしたものである。 参考例６で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中のヘモグロビン濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例７で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中の乳び濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例８で得られた、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度が新生児血清中のアスコルビン酸濃度に影響されないことを示したグラフである。 参考例１０で得られた、ＵｎａＧ法による全血中の非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法による血清中の非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 参考例１０で得られた、ＵｎａＧ法による全血中の非抱合型ビリルビン濃度と、ＵｎａＧ法による血清中の非抱合型ビリルビン濃度との相関を示す。 参考例１１で得られた、ＵＢアナライザによるアンバウンドビリルビン濃度と総ビリルビン濃度との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＴＢ値を基にしたＵＢ値（UB analyzer−0-20s）との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（UB analyzer−0-20s）との相関を示す。 従来の測定方法によるＵＢ値の算出方法（ａ）と、本発明によるＵＢ値の算出方法（ｂ）とを説明する図である。 従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。 実施例３で得られた、ＤＢ低値血清検体についての、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。 実施例４で得られた、ＤＢ高値血清検体についての、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を、図１９に重ねて示す。 実施例３での低ＤＢ値の検体と実施例４での高ＤＢ値の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値との関係を示す。 実施例３での低ＤＢ値の検体と実施例４での高ＤＢ値の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるＵＢ値との関係を示す。

［１．測定原理］
図１に、本発明の実施形態の一例を挙げて測定原理を模式的に示す。
図１において、Ｄ−Ｂｉｌは抱合型ビリルビンを、ｉＤ−Ｂｉｌは非抱合型ビリルビンを示す。Ａｌｂはアルブミンを示し、アルブミンＡｌｂから遊離しているｉＤ−ＢｉｌはアンバウンドビリルビンＵＢを示す。Ｄ−ＢＸは抱合型ビリルビンの分解物を示し、ｉＤ−ＢＸはアンバウンドビリルビンの分解物を示す。ＵｎａＧは抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌに特異的に結合する蛍光性ポリペプチドの一例を示す。

［１−１．測定対象］
図１の（ａ１）は、血液試料（未反応試料）を示す。血液試料としては、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌおよび非抱合型ビリルビンｉＤ−ＢｉｌのアンバウンドビリルビンＵＢが含まれていれば、ヒトまたは非ヒト生物由来の採血試料であってもよいし、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌおよび／またはアンバウンドビリルビンＵＢを既知濃度で調製した人工血液試料であってもよい。

血液試料（ａ１）は、臨床上の意義が大きい点から、ヒト乳児、特に新生児に由来する血液試料であることが好ましい。血液試料（ａ１）には、総ビリルビン、つまり抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌおよび非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌが含まれる。非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌの多くはアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとして存在する一方、一部はアルブミンＡｌｂから遊離して神経毒のアンバウンドビリルビンＵＢとして存在する。血液試料（ａ１）は、具体的には、全血、血漿および血清のいずれであってもよく、当業者によって適宜血液試料が入手および調製される。調製においては、血漿化処理、血清化処理、希釈処理などが行われる。

新生児は、通常、生日を０日と数えた場合に、生後０日以上２８日未満の乳児である。新生児は、総ビリルビンとアンバウンドビリルビンＵＢとの間に通常みられる相関から乖離してアンバウンドビリルビンＵＢが相対的に高いことが多く、アンバウンドビリルビンＵＢ測定を正確に行わなければならない要請が高い。したがって、新生児がアンバウンドビリルビンＵＢ濃度を上昇させる要因を持っている場合、たとえば低アルブミン血症、薬剤治療中、感染症罹患などに該当していることが好ましい。中でも、新生児が、当該要因に該当する可能性が極めて高い早産児であることが好ましい。早産児は、在胎３７週未満で生まれた新生児をいうが、在胎３０週未満の新生児であることがより好ましい。
一方、生後２８日以上の乳児でも当該要因に該当する可能性があるため、本発明は、生後２８日以上の乳児にも適用され得る。

本発明は、血液試料中の抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌの濃度に影響を受けない測定方法である。したがって本発明は、血液試料が、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌを高濃度で含んでいる可能性がある場合、たとえば総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬ以上、好ましくは８ｍｇ／ｄＬ以上、特に２０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度で含む場合に一層有用である。本発明で測定可能な場合の総ビリルビン濃度の上限は特に限定されないが、たとえば４０ｍｇ／ｄＬ、好ましくは３０ｍｇ／ｄＬまでを測定対象とすることができる。
具体的には、本発明は、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌ濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬ以上である場合に一層有用である。あるいは、総ビリルビン濃度に対する抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌ濃度（抱合型ビリルビン／総ビリルビン比）で表した場合、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上である場合に一層有用である。本発明者らは、従来のＧＯＤ−ＰＯＤ法によるアンバウンドビリルビンＵＢ測定法において、検体の抱合型ビリルビン／総ビリルビン比が上記の範囲である場合に、アンバウンドビリルビンＵＢが総ビリルビン値から通常想定される値よりも高値で出やすいことを確認している。

また、本発明は、血液試料の由来元となる被験者が光線療法を受けたか否かに影響を受けない測定方法である。従って、本発明では、血液試料中のビリルビンが脂溶性であってもよいし、光線により水溶性の構造異性体（シクロビリルビン）に変化させられていてもよい。

［１−２．分解工程］
図１に示すように、血液試料（ａ１）は分解工程（i）に供される。分解工程（i）では、血液試料（ａ１）中の抱合型ビリルビンＤ−ＢｉｌとアンバウンドビリルビンＵＢとが酸化分解される。当該工程で生じる分解反応は、少なくともアンバウンドビリルビンＵＢが後述工程（iii）で用いられる蛍光性ポリペプチドとの結合特性を有しない物質に変換し、かつ、アルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンの当該蛍光性ポリペプチドとの結合特性を変化させない限り、特に限定されるものではない。

酸化分解は、酸化還元酵素を用いてビリルビンの水素を水素受容体である過酸化物に転移させることにより進行させればよい。好ましくは、図１に示すように酸化還元酵素としてペルオキシダーゼ、過酸化物として過酸化水素を用いる。

過酸化水素は、分解工程（i）の反応系中で発生させることができる。より好ましくは、図１に示すように、過酸化水素を、ＧＯＤ（グルコースオキシダーゼ）の存在下、グルコース（Glucose）、水および酸素からグルコネート（Gluconate）とともに生じさせる。生じさせた過酸化水素にペルオキシダーゼを作用させることで、ビリルビンを酸化分解する。この場合、分解速度がペルオキシダーゼに依存するため、ペルオキシダーゼの添加タイミングおよび濃度によってアンバウンドビリルビンＵＢの分解開始のタイミングおよび分解速度をコントロールしやすい点で好ましい。なお、本実施形態では過酸化水素を分解工程（i）の反応系中で発生させている例を示しているが、本発明では、グルコースおよびグルコースオキシダーゼを用いることなく、過酸化水素を試薬として系外から添加することも許容する。

図１においては、分解工程（i）によって、血液試料（ａ１）中のアンバウンドビリルビンＵＢとともに、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌも酸化分解される。アンバウンドビリルビンＵＢおよび抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌは、酸化分解によって、それぞれ無色のアンバウンドビリルビン分解物ｉＤ−ＢＸおよび無色の抱合型ビリルビン分解物Ｄ−ＢＸに変換される。

［１−３．分解停止工程］
血液試料（ａ１）では、アンバウンドビリルビンＵＢとアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとが平衡状態の関係にあるため、アンバウンドビリルビンＵＢが遊離し続けることによるアンバウンドビリルビンＵＢの分解反応が後述の接触工程（iii）にまで冗長しないよう、分解停止工程（ii）を行う。これによって、試料分解物（ｂ１）を得る。

分解停止工程（ii）では、分解工程（i）の反応の停止が可能な方法を特に限定されることなく用いることができる。具体的には、分解工程（i）を構築している反応系に、酸化分解停止剤を添加すればよい。

たとえば、分解反応の停止を簡易かつ効果的に行う観点から、酸化分解停止剤として抗酸化物質を用いることができる。抗酸化物質としては、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、ブチルヒドロキシアニソール、カテキン、クエルセチン、尿酸、フラボノイドなどが挙げられる。図１に示すようなアスコルビン酸を用いる場合、コスト性、入手容易性、操作性（高い水溶性）、高い分解停止効果などにより、分解反応の停止をより簡易かつ効果的に行うことができる。

上記の他にも、酸化分解停止剤としては、フェロシアン化物イオン；ＥＤＴＡ鉄錯体；フェロシアン化物およびアルブミン；カチオン性界面活性剤および／または両性界面活性剤；両性界面活性剤およびフェロシアン化物；ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびフェロシアン化イオン；鉄錯体およびステロイド化合物；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル縮合物などを用いてもよいし、炭素数８以上２４以下の飽和又は不飽和脂肪酸（具体的には、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、イコサン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラドコサン酸、およびテトラコサペンタエン酸）を用いてもよい。

なお、血液試料の由来元となる被験者が点滴などによるビタミンＣ処置を受けている場合は、上記の分解工程（i）に先立って、血液試料をアスコルビン酸オキシダーゼ処理することで、もともと含まれていたアスコルビン酸の分解工程への悪影響を排除し、正確な測定が可能となる。この場合、アスコルビン酸以外の酸化分解停止剤を用いることによって、効果的に分解停止を行うことができる。

［１−４．接触工程］
接触工程（iii）では、分解工程（i）を経ていない未反応試料（ａ１）、および分解工程（i）を経た試料分解物（ｂ１）それぞれに対し、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌに特異的に結合することで蛍光特性を示すポリペプチド（蛍光性ポリペプチド）を接触させる。図１においては、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを用いている。これによって、未反応試料（ａ１）からは蛍光化未反応試料（ａ２）が、試料分解物（ｂ１）からは蛍光化試料分解物（ｂ２）が得られる。

接触工程（iii）で用いる蛍光性ポリペプチドは、少なくとも以下の２つの特性を示す。１つめの特性として、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌに対する特異的結合性を有し、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌおよびその分解物Ｄ−ＢＸと、アンバウンドビリルビンＵＢの分解物ｉＤ−ＢＸとに対する結合性は有しない。２つめの特性として、ホロ体つまり非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌと特異的結合した場合に励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発する一方、アポ体つまり非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌが存在しない場合には同じ励起光の照射を受けても蛍光を発しない。当該蛍光の強度は、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌ濃度に依存する。

さらに、蛍光性ポリペプチドの３つめの特性として、アルブミンＡｌｂ結合性ビリルビンと接触した場合、アルブミンＡｌｂと非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌとの結合を切断して非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌと結合してよい。

図１に示す実施形態で例示されている蛍光性ポリペプチドＵｎａＧは、上記の３つの特性を全て有する。したがって、蛍光化未反応試料（ａ２）中では、アルブミンＡｌｂに結合しているか否かを問わず、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌに結合する。つまり、アンバウンドビリルビンＵＢとアルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンとに結合し、結合量相当の蛍光を発する。一方、蛍光化試料分解物（ｂ２）中では、アルブミンＡｌｂ結合型ビリルビンのみに結合する。

接触工程（iii）で用いられる蛍光性ポリペプチドは、上記の３つの特性を満たす限り特に限定されない。蛍光性ポリペプチドの具体例は、ＵｎａＧを基本構造とするポリペプチドであってよく、たとえば、以下の（Ａ）から（Ｄ）に挙げられる。

（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）。
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個以上７個以下のアミノ酸が置換、 欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸の個数は、上記の特性を好ましく満たす点で、１個以上５個以下または１個以上６個以下であることが特に好ましい。
（Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する蛍光性ポリペプチド。なお、配列同一性は、上記の特性を好ましく満たす点で、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、或いは９９％以上であることが特に好ましい。
（Ｄ）上述の（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド。

上記蛍光ポリペプチドは、ペプチド結合されたアミノ酸残基で構成されるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ポリペプチド以外の構造としては、糖鎖、イソプレノイド基などが挙げられるが、特に限定されるものではない。上記の特性を満たすことが前提であるため、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌとの結合部位となる構造を有していることは言うまでもない。

蛍光性ポリペプチドは、天然供給源より単離してもよいし、人為的に得てもよい。より具体的には、当該蛍光性ポリペプチドには、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された翻訳産物が含まれる。人為的に得られる蛍光性ポリペプチドには、たとえば上記の（Ａ）から（Ｄ）に挙げられるタンパク質構造に、その精製などの目的でアフィニティタグが付加された態様のものが含まれてよい。蛍光性ポリペプチドの一例として、ウナギ由来のものが挙げられ、より具体的にはニホンウナギ由来のものが挙げられる。

蛍光性ポリペプチドの蛍光特性は、最大励起波長が４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下、または４９０ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、または４９４ｎｍ以上５０４ｎｍ以下であってよく、最大蛍光波長が緑色光の５０７ｎｍ以上５４７ｎｍ以下、または５１７ｎｍ以上５３７ｎｍ以下、または５２２ｎｍ以上５３２ｎｍ以下であってよい。特にＵｎａＧの主な蛍光特性は、最大励起波長が４９８ｎｍ以上４９９ｎｍ以下、最大蛍光波長が５２５ｎｍ以上５３０ｎｍ以下、モル吸光係数が５０，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1以上７８，０００Ｍ^-1ｃｍ^-1以下、量子収率が５０％以上５４％以下、蛍光寿命が２．２ナノ秒である。

上述に具体的に挙げた蛍光性ポリペプチド、特にＵｎａＧは、非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌと接触すると即座に結合するとともに、少量の非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌであっても強い蛍光活性を確保することができるため、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）の量が微量であっても高感度且つ正確な測定が可能となる。すなわち、最初に用意する血液試料（ａ１）の量が微量であっても支障なく、また、１回の測定で蛍光化未反応試料（ａ２）と蛍光化試料分解物（ｂ２）との二系統を並列して調製する必要性に対しても支障がない。このような利点は、新生児黄疸のルーチン検査としての有用性に大きく寄与する。

［１−５．検出工程］
検出工程（iv）においては、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対して励起光を照射し、発せられた所定波長の蛍光を検出する。蛍光化未反応試料（ａ２）中ではアンバウンドビリルビンＵＢと蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）との結合による蛍光が発せられ、蛍光化試料分解物（ｂ２）中ではアンバウンドビリルビン分解物ｉＤ−ＢＸが蛍光性ポリペプチド（ＵｎａＧ）に結合していないためそこからは蛍光が発せられない。

当該蛍光性ポリペプチドのホロ体から発せられる蛍光強度は、蛍光性ポリペプチドの結合量に相関する。したがって、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）から発せられる蛍光強度を計測し、その差を算出することによってアンバウンドビリルビンＵＢの量が導出される。

［１−６．診断］
測定されたアンバウンドビリルビンＵＢの測定値に基づいて、血液試料の由来元（被験者）の黄疸管理を行うことができる。この場合、たとえば、核黄疸発症の予知を行い、光線療法、交換輸血、血漿交換、γ−グロブリン点滴療法などの治療法の適応を決定することができる。さらに、治療後のフォローアップ時に、治療効果を確認することもできる。診断の基準となるカットオフ値は、症例の蓄積に基づいて決定することができる。この場合、カットオフ値としては、在胎週数３０週未満と３０週以上との間、出生体重１５００ｇ未満と１５００ｇ以上との間で異なる値を設定することができる。

本発明は上記の測定原理でアンバウンドビリルビン量を測定するものであるが、適宜、総ビリルビン量の測定法、抱合型ビリルビンの測定法、および他のアンバウンドビリルビンの測定法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法、つまりアンバウンドビリルビン分解による総ビリルビン量の減少速度からアンバウンドビリルビン量を求める方法）の少なくともいずれかによる測定結果と組み合わせてもよい。

［２．プロトコルおよび諸条件］
図２に、本発明の測定方法のプロトコルの一例を示す。以下において、このプロトコルに準じ、それぞれの工程における諸条件等についてさらに詳細に説明する。

図２の例では、血清（Serum）を血液試料（ａ１）として用意する。最初に用意する血液試料量は、図２の例のような血清の場合で（血液試料が全血など血清でない場合は血清換算値で）たとえば０．５μｌ以上２５μｌ以下であってよい。本発明の方法は、接触工程（iii）での希釈率が高くても測定可能であるため、血液試料の微量測定が可能である。したがって、血液試料量（血清換算値）は、たとえば１μｍ未満の微量であってもよい。一方、各工程での希釈操作性を考慮すると、必要な血液試料量（血清換算値）は、たとえば０．８μｌ以上２μｌ以下、特に１μｌを確保することが好ましい。

［２−１．分解工程（i）諸条件］
血液試料（ａ１）は、まず、緩衝液（Buffer）と混和されることで最初の希釈を受ける。本実施形態では、反応系中で過酸化水素を発生させるため、この緩衝液（Buffer）の中にグルコース（Glucose）を含ませる。緩衝液としては、ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などを使用することができる。

緩衝液による希釈により、血液試料（ａ１）は血清換算値（血液試料中の血清量を基準とした希釈率）でたとえば１．５倍以上、または１．８倍以上（体積基準）に希釈される。希釈率が上記下限値以上であることは、調製容易性の点で好ましい。希釈率の範囲内の上限値は特に限定されないが、希釈倍率の上昇に伴うビリルビンとアルブミンとの平衡関係の変化を考慮する観点、ならびに、光曝露および／または血清中の未知の代謝物質による分解によるビリルビンの自然消費を回避する観点から、血液試料（ａ１）は薄め過ぎないことが好ましい。この観点から、血液試料（ａ１）の希釈率は、血清換算値でたとえば５５倍以下であってもよいし、２．５倍以下または２．２倍以下（いずれも体積基準）であってもよい。

当該緩衝液（Buffer）中のグルコースの濃度は、上述の希釈率と、分解工程（i）の反応系におけるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）基質としての適切量と、を勘案して適宜決定される。たとえば、分解工程（i）の反応系を構築した場合にグルコースオキシダーゼ１Ｕあたりの量が０．３ｍｇ以上１ｍｇ以下、好ましくは０．３ｍｇ以上０．５ｍｇ以下、一例として０．３１２ｍｇとなるように勘案して決定することができる。したがって、緩衝液中のグルコースの濃度は１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下、一例として１ｍｇ／ｍＬであってよい。

希釈された血液試料（血液試料希釈物）の一部はＡ系統用に使用され、別の一部はＢ系統用に使用される。

本実施形態のＢ系統の血液試料希釈物には、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む緩衝液（ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液）が加えられ、適切な温度条件を満たすことで、分解工程（i）の反応系が構築される。ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液に用いられる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。

分解工程（i）の反応系では、ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液により血液試料（ａ１）はさらなる希釈を受ける。分解工程（i）の反応系中における血液試料（ａ１）の希釈率は、血清換算値でたとえば１２０倍以下、好ましくは７０倍以下、一例として５２．５倍であってよい。希釈率が上記上限値以下であることは、ビリルビンの自然消費回避の点で好ましい。当該希釈率の範囲内の下限は特に限定されないが、希釈操作性などを考慮すると、たとえば５倍であってよい。

ＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液中のＧＯＤおよびＰＯＤの量は、上述の希釈率と、分解工程（i）の反応系における酵素としての適切量と、を勘案して適宜決定される。ＧＯＤの量は、血液試料（ａ１）１μｌ（血清換算値）に対してたとえば０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下、好ましくは０．０５Ｕ以上０．２Ｕ以下、一例として０．１６Ｕとなるように調製される。ＰＯＤの量も、血液試料（ａ１）１μｌ（血清換算値）に対してたとえば０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下、好ましくは０．０５Ｕ以上０．２Ｕ以下、一例として０．１６Ｕとなるように調製される。ＧＯＤおよびＰＯＤの量を上記範囲内で設定することにより、適切な速度、つまり遅すぎず早すぎない速度でアンバウンドビリルビンを分解させることができる。ＧＯＤの量とＰＯＤの量とは、同量であってよい。

分解工程（i）における反応温度は、例えば２８℃以上３８℃以下、一例として３７℃である。分解工程（i）の反応は速やかに終了させられるため、当該反応系を構築する直前の段階で、血液試料希釈物とＧＯＤ／ＰＯＤ緩衝液との両方が加温等により上記の温度に調整されていることが好ましい。

なお、Ａ系統の血液試料希釈物には、ＧＯＤおよびＰＯＤを加えないことを除いて同じ操作を行う。すなわち、ＧＯＤおよびＰＯＤのいずれも含まない緩衝液が加えられ、かつ、同じ温度条件下に置かれる。

［２−２．分解停止工程（ii）諸条件］
分解工程（i）の反応は、アスコルビン酸を含む緩衝液の添加により停止される。アスコルビン酸を含ませる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。Ａ系統とＢ系統とでは、分解反応（i）を経たか否かという点を除いて互いに同じ条件とするため、アスコルビン酸を含む緩衝液は、Ａ系統およびＢ系統の両方に同様に添加される。Ａ系統では上記の分解反応（i）を受けていないため、試料中のビリルビンの構成としては当初の血液試料（ａ１）と変わらない（図１参照）。すなわちこの試料は未反応のままであるので、未反応試料（ａ１）と記載する。一方、Ｂ系統では上記の分解反応（i）を受けたため、試料中のビリルビンの構成が変化しており試料分解物（ｂ１）となっている（図１参照）。

分解停止工程（ii）を行うタイミングは、分解工程（i）の反応開始前から既に血液試料（ａ１）中で遊離していた分のアンバウンドビリルビンＵＢの分解が完了したタイミングであることが望ましい。分解工程（i）の反応開始後から分解停止工程（ii）までに確保する時間は、分解工程（i）の反応系における血液試料の希釈率などを考慮して選択してよい。

たとえば、当該時間は、抱合型ビリルビンＤ−Ｂｉｌが通常量であることで総ビリルビン量の減少度合いと非抱合型ビリルビン量の減少度合いとが同視可能な系を想定した場合に、当該系において、総ビリルビン量がその初期濃度から約２０％減少（具体的には１８％以上２５％以下減少）するのにかかる時間相当であってよい。完全混和により分解工程（i）の反応系が均一となるまでに総ビリルビン濃度が５％程度減少することを考慮すると、具体的には、総ビリルビンの初期濃度を１００％とした場合に、９５％から７６％まで低下するのにかかる時間相当であってよい。さらに具体的には、たとえば分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下、好ましくは１５秒以上３５秒以下、より好ましくは１５秒以上２５秒以下、一例として２０秒であってよい。分解停止を行うタイミングの範囲が上記下限値以上であることは、分解すべきアンバウンドビリルビンを確実に分解する点で好ましく、上記上限値以下であることは、測定値の再現性が良好である点で好ましい。

分解停止工程（ii）における反応温度は、たとえば２０℃以上３８℃以下、一例として３７℃であってよい。アスコルビン酸は、分解工程（i）で使用したＰＯＤ１Ｕあたり０．００１５ｍｇ以上となる量であれば分解停止可能である。分解停止を迅速かつ確実に行うことを目的としてより多量に用いてもよく、たとえばＰＯＤ１Ｕあたり０．０１５ｍｇ以上１２０ｍｇ以下、好ましくは１．５ｍｇ以上５０ｍｇ以下、一例として１．７３ｍｇとなる量で用いてもよい。より具体的には、アスコルビン酸を含む緩衝液のアスコルビン酸濃度および添加量は、分解工程（i）の反応液中に添加された後のアスコルビン酸の終濃度がたとえば０．１重量％以上３２重量％以下、好ましくは０．２重量％以上１０重量％以下、一例として０．３５重量％となるように決定することができる。さらに、アスコルビン酸を含む緩衝液添加後は、血液試料の希釈率は血清換算値で５倍以上１２０倍以下、好ましくは１０倍以上１００倍以下、一例として８０倍であってよい。

アスコルビン酸の終濃度が上記下限値以上であることは、アンバウンドビリルビンＵＢの分解を確実に停止する点で好ましく、アスコルビン酸濃度が上記上限値以下であることは、ｐＨが酸性に傾き過ぎることを防止することで、引き続く接触工程（iii）において蛍光性ポリペプチドとの結合特性に悪影響を与えない中性に回復させることが容易となる点で好ましい。また、血液試料の希釈率が上記上限値以下であることは、ビリルビンの自然消費回避の点で好ましい。

［２−３．接触工程（iii）諸条件］
接触工程（iii）では、Ａ系統の未反応試料（ａ１）およびＢ系統の試料分解物（ｂ１）両方に、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液を添加する。蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含ませる緩衝液は、最初の希釈時で使用可能として挙げた緩衝液の中から適宜選択されてよい。蛍光性ポリペプチドＵｎａＧと非抱合型ビリルビンｉＤ−Ｂｉｌとが特異的に結合した複合体を形成することにより、それぞれ、Ａ系統では蛍光化未反応試料（ａ２）へ、Ｂ系統では蛍光化試料分解物（ｂ２）へ変換される。

接触工程（iii）は、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧの特異的結合性に実質的な悪影響が生じない条件下で行われる。このような条件としては、たとえば温度条件が４℃以上６５℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下であってよく、ｐＨがおおよそ中性、たとえば６．５以上８．０以下、好ましくは７．０以上７．５以下、特に７．４であってよい。図示したようにアスコルビン酸を使用する場合は、ｐＨは低めとなる傾向がある。接触工程（iii）におけるアスコルビン酸の終濃度は、たとえば０．０１重量％以上０．８重量％以下であってよい。好ましくは、アスコルビン酸の終濃度は０．５重量％以下、さらに好ましくは０．２５重量％以下、一層好ましくは０．２重量％以下、より一層好ましくは０．０５重量％以下であってよい。アスコルビン酸の終濃度が上記上限値以下であることは、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧの特異的結合性に実質的な悪影響が生じない点で好ましい。また、反応時間は２０秒以上３５秒以下、好ましくは２５以上３０秒以下であってよい。

接触工程（iii）における蛍光性ポリペプチドＵｎａＧ添加後の反応液において、血液試料は、蛍光検出工程（iv）における内部遮断効果が無視できる程度まで希釈されることが極めて好ましい。たとえば、血液試料の希釈率は、血清換算値で２００倍以上３２００倍以下、好ましくは４００倍以上１６００倍以下、一例として８００倍であってよい。

蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液の濃度および添加量は、上記の血液試料の希釈率および上記のｐＨを考慮して決定することができる。たとえば、蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを含む緩衝液の濃度は、測定の正確性の点などから、添加後のＵｎａＧの終濃度が０．５μＭ以上４μＭ以下、好ましくは１．０μＭ以上３μＭ以下、一例として２μＭとなるように調製することができる。

［２−４．検出工程（iv）諸条件］
検出工程（iv）では、Ａ系統の蛍光化未反応試料（ａ２）およびＢ系統の蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対して、蛍光性ポリペプチドの蛍光特性に応じた励起光を照射し、所定の波長の蛍光強度を測定する。励起波長は、４８０ｎｍ以上５２０ｎｍ以下、または４９０ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、または４９４ｎｍ以上５０４ｎｍ以下であってよい。検出波長は、緑色光の５０７ｎｍ以上５４７ｎｍ以下、または５１７ｎｍ以上５３７ｎｍ以下、または５２２ｎｍ以上５３２ｎｍ以下であってよい。特に蛍光性ポリペプチドＵｎａＧを用いる場合は、励起波長が４９８ｎｍ以上４９９ｎｍ以下、検出波長が５２５ｎｍ以上５３０ｎｍ以下であってよい。

蛍光の検出手段は特に限定されないが、たとえば、ＵＶトランスイルミネータ、ＬＥＤトランスイルミネータ、蛍光顕微鏡、蛍光検出器、およびフローサイトメトリなどを用いることができる。

検出工程（iv）では、Ａ系統の蛍光化未反応試料（ａ２）およびＢ系統の蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれから検出された蛍光強度の差を計算し、アンバウンドビリルビンＵＢの濃度として算出する。この場合、蛍光強度の差分は、たとえば既知濃度試料に基づいて予め作成された検量線と照合されることで、アンバウンドビリルビンＵＢの絶対量として導出することができる。

さらに、蛍光強度の差分は、適宜較正が行われてよい。たとえば本発明では全血を血清化処理することなく血液試料（ａ１）として測定に供することができるため、この場合、本工程でヘマクリット値を考慮することで蛍光強度の差分を較正し、正しいアンバウンドビリルビンＵＢを導出することができる。

［５．アンバウンドビリルビン測定装置］
図３に、本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置および本発明のアンバウンドビリルビン測定装置の一例のブロック図を示す。
図３に示すように、アンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、インキュベータと、試薬液添加部と、試薬ブランク液添加部と、タイマーと、停止剤添加部と、混和部と、を含む。これにより、上記のアンバウンドビリルビンの測定方法の分解工程（i）および分解停止工程（ii）を自動化することができる。

インキュベータは、反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含む。反応用容器収容部には反応用容器が収容され、対照用容器収容部には対照用容器が収容され、インキュベータにより、それらの内容物が所定の温度に維持される。

反応用容器および対照用容器に最初に添加される内容物は、血液試料の希釈物であって組成が同じものである。反応用容器に添加された血液試料希釈物は図２に示すうちのＡ系統であり、対照用容器に添加された血液試料希釈物は図２に示すうちのＢ系統である。

反応用容器および対照用容器に添加される血液試料の希釈物は、たとえば、グルコース含有緩衝液と混和された血液試料であってよい。具体的には、血液試料とグルコース含有緩衝液とを混和した後、得られた混和物の一部を反応用容器に、他の一部を対照用容器に、分割添加することができる。この混和および分割添加の工程は、手動で行うことができる。しかしながら、本発明のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置は、この混和および分割添加の工程を自動化するように構成されることを除外するものではない。

インキュベータにおいては、反応用容器および対照用容器中のビリルビン自然消費を回避する観点から、反応用容器収容部と対照用容器収容部が遮光されるように構成されることが好ましい。

試薬液添加部は、反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液を所定量添加する。これによって、反応用容器中のアンバウンドビリルビンの分解工程（i）が行われる。そして、混和部によって、反応用容器の内容物が混和される。なお、アンバウンドビリルビン酸化分解試薬液は、たとえばＧＯＤおよびＰＯＤを含む緩衝液である。アンバウンドビリルビン酸化分解試薬液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。

試薬ブランク液添加部は、対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液を所定量添加する。したがって、対照用容器内では、アンバウンドビリルビンの分解工程（i）は行われない。そして、混和部によって、対照用容器の内容物が混和される。なお、試薬ブランク液は、たとえば、上記のＧＯＤおよびＰＯＤを含む緩衝液からＧＯＤおよびＰＯＤが除外された組成の緩衝液である。試薬ブランク液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。

タイマーは、試薬液添加部および試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動するように制御される。これにより、分解工程（i）の時間を正確に測定することができる。

停止剤添加部は、タイマーの計測時間に基づいて制御される。具体的には、タイマーが、分解工程（i）の反応開始前から既に血液試料中で遊離していた分のアンバウンドビリルビンの分解が完了するまでにかかるとされる所定の時間（好ましくは３０秒）をカウントした時に、反応用容器および対照用容器それぞれに酸化分解停止剤を所定量添加する動作を行うように制御される。酸化分解停止剤を添加した後も、反応用容器および対照用容器それぞれの内容物は混和部によって混和される。これによって、アンバウンドビリルビンの酸化分解反応の停止が正確なタイミングで行われる。なお、酸化分解停止剤は、緩衝液中で溶解された状態で使用されてよく、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてよい。

図３に示すように、本発明のアンバウンドビリルビン測定装置は、上記のアンバウンドビリルビン測定用試料調製装置を含んで構成され、さらに、蛍光測定部と、演算処理部と、出力部とを含む。本実施形態の場合は、分取部と添加部も含む。

蛍光測定部には、測定用容器収容部が含まれ、公知の分光光学系で構成されている。測定用容器収容部に収容される測定用容器は、多穴ウェルのように複数の試料について効率的に蛍光観察できるものであることが好ましい。本実施形態では、測定用容器として多穴ウェルを挙げて説明する。

酸化分解停止剤の添加後、反応用容器の内容物（試料分解物（ｂ１）、図１および図２参照）および対照用容器の内容物（未反応試料（ａ１）、図１および図２参照）はそれぞれ一部がそれぞれのウェルに添加される。この操作は手動で行ってもよいが、本実施形態のように、分取部によって自動に行われてもよい。また、この分取部は、停止剤添加部の動作またはタイマーの計測時間に基づいて、その稼動が自動制御されていてもよいし、手動命令（たとえば手動スイッチ）により稼動させてもよい。

また、蛍光測定部は、反応用容器および対照用容器の内容物のそれぞれ一部がそれぞれのウェルに添加された時点（かつ、後述の蛍光特性を示すポリペプチドの添加前）で、ブランク測定を行ってよい。ブランク測定は、手動命令によって行われてもよいし、分取部を含む本実施形態では、分取部の稼動終了に基づいた蛍光測定部の自動制御により自動的に行われてもよい。

それぞれのウェルの内容物に対しては、蛍光特性を示すポリペプチドが添加される。これによって、接触工程（iii）が行われ、未反応試料（ａ１）が入ったウェルからは蛍光化未反応試料（ａ２）が、試料分解物（ｂ１）が入ったウェルからは蛍光化試料分解物（ｂ２）が、それぞれ蛍光用測定試料として得られる（図１、図２参照）。

蛍光特性を示すポリペプチドを添加する操作は手動で行ってもよいが、本実施形態のように、添加部によって行われてもよい。また、この添加部は、たとえば上述のブランク測定の終了に基づいて、その稼動が自動制御されていてもよいし、手動命令により稼動させてもよい。なお、蛍光特性を示すポリペプチドは、たとえばＵｎａＧを基本構造とするポリペプチドを含む緩衝液の態様で使用される。このポリペプチドを含む緩衝液は、インキュベータ内で、所定の温度に維持された状態で用意されていてもよい。

蛍光測定部は、蛍光用測定試料、つまり、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれに対し、蛍光検出を行う。これによって、検出工程（iv）が行われる。この操作は、手動命令によって行われてもよいし、添加部を含む本実施形態では、添加部の稼動に基づいた蛍光測定部の自動制御により行われてもよい。

蛍光測定部による検出工程（iv）が自動制御により行われる場合、添加部によって蛍光特性を示すポリペプチドが添加された時点からタイマーが始動するようにタイマーが制御され、当該タイマーの計測時間に基づいて蛍光測定部が稼動するように制御されてよい。たとえば、タイマーが、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントした時に、蛍光測定部が稼動し蛍光測定するように制御されてよい。あるいは、タイマーが、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントする間、蛍光測定部を稼動し続けることで蛍光測定し続けてもよい。

演算処理部は、少なくとも反応用容器の内容物の蛍光値と対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する。上記のように、蛍光測定部が、蛍光特性を示すポリペプチドが最大蛍光強度を示すとされる所定の時間（好ましくは１０分以上１５分以下）をカウントする間蛍光測定し続ける場合は、演算処理部は、取得したそれぞれの蛍光強度から最大蛍光強度を割り出す処理を行った後に、アンバウンドビリルビン値を導出することができる。また、蛍光化未反応試料（ａ２）および蛍光化試料分解物（ｂ２）それぞれについて、同じ条件の試料を複数作成することで複数の蛍光強度を取得した場合は、演算処理部は、取得したそれぞれの蛍光強度から代表値（たとえば平均値、中央値など）を割り出す処理を行った後に、アンバウンドビリルビン値を導出することができる。さらに、血液試料が血清でなく全血である場合には、演算処理部は、ヘマクリット値による補正を行ってもよい。
出力部は、導出されたアンバウンドビリルビン値を表示する。

［６．アンバウンドビリルビン測定キット］
本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、上記のアンバウンドビリルビンの測定方法を実施するためのキットである。本発明のアンバウンドビリルビン測定キットは、アイテムとして、アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、を少なくとも含む。

酸化還元酵素としてはペルオキシダーゼであることが好ましい。酸化還元酵素の態様は、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましいが、後述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。

酸化分解停止剤は、上述のアンバウンドビリルビン測定において例示した物質から適宜選択して含ませることができる。酸化分解停止剤は、粉末剤の態様であってもよいし、前述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。酸化分解停止剤としては抗酸化剤であることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましいが、特にアスコルビン酸である場合は、保存安定性などの観点から粉末剤の態様であることが好ましい。

蛍光特性を示すポリペプチドは、上述のアンバウンドビリルビン測定において例示した物質から適宜選択して含ませることができる。蛍光特性を示すポリペプチドは、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましい。

アンバウンドビリルビン測定キットには、グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含むことができる。グルコースは、粉末剤の態様であってもよいし、測定時の簡便性および／または正確性などの観点から、前述の緩衝液中に溶解された液剤の態様であってもよい。グルコースオキシダーゼは、保存安定性などの観点から凍結乾燥品であることが好ましいが、前述の緩衝液を溶媒として溶解させた液剤の態様であってもよい。

アンバウンドビリルビン測定キットには、標準物質としてのアンバウンドビリルビンをさらなるアイテムとして含むことができる。標準物質は、粉末剤の態様であってもよいし、前述の緩衝液中に溶解された液剤の態様であってもよい。

それぞれのアイテムは、適宜遮光包装されてよく、１回分の使用に適した量が分包され、複数回分のアイテムセットが含まれてもよい。

また、アンバウンドビリルビン測定キットには、酸化還元酵素、酸化分解停止剤、蛍光特性を示すポリペプチド、グルコース、グルコースオキシダーゼおよび標準物質の少なくともいずれかのための溶媒または希釈剤としての緩衝液（ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水）、酢酸緩衝液、トリス緩衝液など）をさらなるアイテムとして含んでもよい。

アンバウンドビリルビン測定キットには、上記のアンバウンドビリルビン測定方法を示すプロトコルに関する情報をさらに含んでよい。当該情報は、プロトコルを掲載した印刷物であってもよいし、プロトコルがインターネット等で閲覧または取得可能となるように、ウェブ上の閲覧または取得場所についての情報を掲載した印刷物であってもよい。

さらに、アンバウンドビリルビン測定キットが、上述のアンバウンドビリルビン測定装置の専用キットである場合などは、専用の測定用容器（たとえば多穴ウェル）がアイテムとして含んでいてもよい。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

以下の参考例および実施例において、人工ビリルビン標準液（単にビリルビン標準液と記載する場合もある）には、株式会社アローズ製のビリルビン標準液を用いた。新生児血清には、神戸大学病院の新生児特定集中治療室に入院した新生児において、黄疸評価目的に行った血液検査の中で発生した余剰検体であり、神戸大学病院の倫理委員会の承認を受け、かつ、余剰検体の基礎研究への使用について患児の代諾者の了承を得たものを用いた。

ＵｎａＧおよびＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧには、独立行政法人理化学研究所脳科学総合研究センターより提供された、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチドを用いた。

ＧＯＤ−ＰＯＤ酵素液には、乾燥凍結品のグルコースオキシダーゼ３．２単位と凍結乾燥品のペルオキシダーゼ３．２単位とを、リン酸二水素カリウム０．００６８ｍｇとリン酸水素二ナトリウム１２水和物０．７２０ｍｇと精製水に溶解させて２５μＬとした液剤中に溶解させたものを用いた。溶媒、希釈液、および酵素希釈液に用いたBufferとしては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。

マイクロプレートリーダには、コロナ電気株式会社製ＳＨ−９０００を用いた。総ビリルビンＴＢおよびアンバウンドビリルビンＵＢは、ＵＢアナライザ（株式会社アローズ製の専用測定器ユービーアナライザ）を用いた。総ビリルビンＴ−ｂｉｌおよび抱合型ビリルビンＤ−ｂｉｌは、それぞれ、酵素法を用いたイアトロＱ Ｔ−ＢＩＬIIおよびイアトロＱ Ｄ−ＢＢＩＬ（Ａ）（いずれも株式会社ＬＳＩメディエンス製）によって測定し、非抱合型ビリルビンｉＤ−ｂｉｌはそれらの差分を求めることにより導出した。

［参考例１：ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（１）］
図４に、本参考例１で行ったＵｎａＧ法のプロトコルを模式的に示す。
（検量線の作成）
まず、人工ビリルビン標準液を段階希釈し、コントロールとともに、ビリルビン濃度が０．０ｍｇ／ｄＬから３３．６ｍｇ／ｄＬまでの段階希釈系列を調製した。
人工ビリルビン標準液の段階希釈系列それぞれ５０μＬと、ＵｎａＧ溶液１５０μＬとを混和し、総量２００μＬの混合溶液を作成した。混合溶液中のＵｎａＧの最終濃度は２μＭであった。

混合溶液の蛍光強度は、混和後１０分経過時に最大となった。したがって、混和後１０分経過時に、マイクロプレートリーダを用い、励起波長498nmに対する蛍光波長527nmの蛍光強度を測定した。非抱合型ビリルビン（ｉＤ−Ｂｉｌ）濃度に対する蛍光強度をプロットし、検量線を作成した。得られた検量線を図５に示す。

（検体）
新生児２８例より採取した４８検体を入手した。２８例の症例背景を表１に、４８検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表２に示す。

（非抱合型ビリルビン濃度の測定）
図４に示すように、上述の新生児血清をそれぞれＰＢＳで２００倍希釈した。希釈した各新生児血清５０μＬとＵｎａＧ溶液１５０μＬ（４００ｍｏｌ）とを混和し、１０反応分後、同様に蛍光強度を測定した。上記の検量線に基づいて、測定値から非抱合型ビリルビン濃度（ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン濃度）を求めた。

４８検体について、ＵｎａＧ法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度（総ビリルビン測定値と抱合型ビリルビン値との差分として導出）との相関を調べた。その結果、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０４ｘ＋０．１８、Ｒ＝０．９５４、Ｐ＜０．００１）。

（光線療法の影響の検証）
さらに、上述の相関について、光線治療中の新生児の検体（１１検体）と、光線治療を行っていない新生児の検体（３７検体）との間で相違はなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。

なお、さらに症例数および検体数を増やした例を後述の参考例３に示す。

［参考例２：ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（１）］
（検体）
新生児２９例より採取した５３検体を入手した。２９例の症例背景を表３に、５３検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表４に示す。

（非抱合型ビリルビンの測定）
上記の検体を用い、ＵｎａＧ法に用いる蛍光性タンパク質としてＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたことを除いて、参考例１と同じように、検量線を作成し、ＵｎａＧ法と酵素法とで測定された非抱合型ビリルビン測定値の相関を調べた。その結果、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０２ｘ−０．０８、Ｒ＝０．９５４、Ｐ＜０．００１）。
なお、ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧは、参考例１で用いたＵｎａＧにヒスチジンタグを介してＦＬＡＧタグが付された、ＵｎａＧの変形例である。

（光線療法の影響の検証）
さらに、上述の相関について、光線治療中の新生児の検体（１９検体）と、光線治療を行っていない新生児の検体（３４検体）との間で相違はなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。

なお、さらに症例数および検体数を増やした例を後述の参考例３に示す。

［参考例３：ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（２）、およびＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法と酵素法とによる新生児血清中の非抱合型ビリルビン濃度の比較（２）］
（検体）
上述の参考例１および参考例２に、新生児の症例および血清検体をさらに増やし、参考例１および参考例２における症例および血清検体数を含めた合計９３例より採取した血清１４０検体（抱合型ビリルビン＜１．０ｍｇ／ｄＬ）について、症例背景をまとめて表５に、１４０検体の血清採取日齢および酵素法に基づく抱合型ビリルビンの値をまとめて表６に示す。

（非抱合型ビリルビンの測定）
上記の１４０検体を用い、７２検体についてはＵｎａＧを使用して参考例１と同様の操作を行い、６８検体についてはＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを使用して参考例２と同様の操作を行うことで検量線を作成し、ＵｎａＧ法（UnaG method）と酵素法（BOD method）とで測定された非抱合型ビリルビン測定値の相関を調べた。１４０検体の結果をまとめて図６に示す。図６に示すように両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０１ｘ＋０．１７、ｒ＝０．９４３、Ｐ＜０．００１）。

（非抱合型ビリルビンの測定−ＵｎａＧ使用とＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ使用との比較）
図６に示された１４０検体のうち、ＵｎａＧを使用した７２検体と、ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いた６８検体とを区別して図７に示す。

図７では、ＵｎａＧを用いた検体（７２検体）を×ドットで、ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いた検体（６８検体）を○ドットで、区別可能にプロットしている。図７に示すように、ＵｎａＧを用いた検体群（７２検体、×ドット）では、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝１．０３ｘ＋０．１８、ｒ＝０．９５６、ｐ＜０．００１）。同様に、ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いた検体群（６８検体、○ドット）でも、両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．９９６ｘ＋０．１１、ｒ＝０．９３５、ｐ＜０．００１）。さらに、両検体群で相関の相違はみられなかった。

さらに、同日同時間に採取した別の５種類の血清検体について、ＵｎａＧまたはＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法の検証を行った。その結果を以下の表７に示す。表７に示すように、ＵｎａＧおよびＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧのいずれを用いた場合も、ほぼ同じ非抱合型ビリルビン濃度が導出されることを確認した。

（光線療法の影響の検証）
上述の１４０検体について、光線療法を受けていない時間帯に採取した検体群（１０５検体、丸ドット）と、光線療法を受けている時間帯に採取した検体群（３５検体、三角ドット）とを区別可能にプロットした。その結果を図８に示す。図８に示すように、両検体群で有意な差は見られなかった。したがって、光線療法の測定系への悪影響は確認されなかった。

［参考例４：高濃度抱合型ビリルビン血清を用いた場合のＵｎａＧ法と酵素法とによる非抱合型ビリルビン濃度の比較］
抱合型ビリルビン濃度が高い１４検体（抱合型ビリルビン≧１．０ｍｇ／ｄＬ）について、ＵｎａＧ法（UnaG method）によって得られた非抱合型ビリルビン濃度と、酵素法（BOD method）によって得られた総ビリルビン（Total bilirubin）濃度、抱合型ビリルビン（Conjugated bilirubin）濃度、それらから導出された非抱合型ビリルビン（Unconjugated bilirubin）濃度と、の比較、ならびに、ＵｎａＧ法（ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ使用）および酵素法によって得られたそれぞれの非抱合型ビリルビン濃度の差（Difference）を表８に示す。表８では、酵素法（BOD(bilirubin oxidase) method）によって得られた総ビリルビン（Total bilirubin）濃度、抱合型ビリルビン（Conjugated bilirubin）濃度、およびその差（Difference）について、平均値（Mean）および標準偏差（SD）も併せて示す。なお、酵素法による非抱合型ビリルビンの導出方法は、以下の式に従った。
[非抱合型ビリルビン]＝[総ビリルビン]−[抱合型ビリルビン]
１ｍｇ／ｄＬ＝１７．１μＭ

表８より、酵素法とＵｎａＧ法による抱合型ビリルビン濃度は同等であり有意差はなかった（p=0.31）。したがって、ＵｎａＧ法は、抱合型ビリルビン濃度の高低に関わらず非抱合型ビリルビンを直接的に測定することができることが示された。

［参考例５：ビリルビン測定値の安定性評価］
新生児血清５検体を用い、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値について、日中変動および日間変動を検証した。その結果を表９に示す。表９では、日中変動についての検証（A. Intra-day assay）と日間変動についての検証（B. Inter-day assay）を表し、それぞれ、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値（A:時刻を変えて測定、B:日を変えて測定）、その中央値（Median）、平均値（Mean）、標準偏差（SD）および変動係数（CV）を、酵素法（BOD method）による非抱合型ビリルビン測定値とともに示す。
なお、日中変動の検証では、調製された同一の血清から時間を異にして測定用試料を調製して得られるiDBの測定値が変化するかどうかを検証した。具体的には、血清を調製後、約２０分毎に毎回測定用試料を調製し、合計６回測定した。
また、日間変動の検証では、調製された同一の血清から日を異にして測定用試料を調製して得られるiDBの測定値が変化するかどうかを検証した。具体的には、血清を調製後、毎日測定用試料を調製し、合計６日間に亘って測定を行った。
表９に示すように、日中および日間のいずれにおいても、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値が安定的に得られることが示された。

［参考例１−参考例５まとめ］
以上の参考例１から参考例３より、新生児合計９３例からの血清合計１４０検体について、酵素法による非抱合型ビリルビン測定値とＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値とはきわめて良好な相関関係を示した。

参考例１から参考例３より、蛍光タンパク質のバリエーションに関し、蛍光タンパク質ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法および蛍光タンパク質ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法いずれにおいても、ほぼ同等の非抱合型ビリルビン測定値を示した。

参考例１から参考例３より、光線療法の影響に関し、蛍光タンパク質ＵｎａＧを用いたＵｎａＧ法および蛍光タンパク質ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧを用いたＵｎａＧ法いずれにおいても、光線療法の有無による明らかな影響は確認できなかった。

参考例４より、抱合ビリルビン濃度の影響に関し、抱合ビリルビン濃度が高い１４検体においても酵素法による非抱合型ビリルビン測定値とＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定値とはほぼ同値であった。

さらに、参考例５より、血清調製後の２４時間未満のいずれの時点であっても、かつ、１日以上（１日以上６日以下）経過後のいずれの時点であっても、安定した非抱合型ビリルビン測定値が得られた。

したがって、検体は、抱合ビリルビンの高低、蛍光タンパク質のバリエーション、被験者の光線療法歴の有無、血清調製後の経過時間にかかわらず本発明へ適用可能であることが容易に推認される。

［参考例６：ＵｎａＧ法による溶血検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、検体中のヘモグロビン（溶血）の影響を検証した。

（ヘモグロビン含有溶液の作成）
１．健常成人から全血５ｍＬを採取した（血液ガス測定：Ｈｂ１６ｇ／ｄＬ）
２．遠心して上清成分を吸引破棄し、赤血球成分のみを残した。
３．血球成分２ｍＬとｄＨ_２Ｏ３ｍＬとを加えて溶血させ、全量５ｍＬとした。
４．十分混和したうえで、遠心して上済み液のみを新しいチューブに移した。
これにより、赤血球膜成分を除いた。結果、全量は約４ｍＬ程度となった。
５．ＳＬＳ−ヘモグロビン法によるＸＮ−ｓｅｒｉｅｓ ９０００（シスメックス株式会社製）を用いてＨｂ濃度を測定した（Ｈｂ１３．４）。
６．Ｂｕｆｆｅｒを用いて、Ｈｂ５ｇ／ｄＬ、Ｈｂ２．５ｇ／ｄＬ、Ｈｂ１ｇ／ｄＬ、Ｈｂ０．５ｇ／ｄＬの希釈系列を作成した。

（検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．１ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒを用いて段階希釈し、ビリルビン濃度が１．７１ｎｇ／μＬ、０．８５５ｎｇ／μＬ、０．４２７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとして、当該Ｂｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ−Ｈｉｓ ＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１５０μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ−Ｈｉｓ ＦＬＡＧ溶液１５０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５０μＬとを混合し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。

（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．２種類の新生児血清（血清２２５、血清２２７）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ−ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ−ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ−ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１０に示す。

２．新生児血清１０μｌと、上記で段階希釈により調製した各ヘモグロビン含有溶液１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９８０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）におけるヘモグロビンの最終濃度は、２５ｍｇ／ｄｌ、１２．５ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌおよび２．５ｍｇ／ｄｌであった。
また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（ヘモグロビン不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（ヘモグロビン含有）４種および２００倍希釈液（ヘモグロビン不含）を作成した。

４．検量線作成で用いたＵｎａＧ−Ｈｉｓ ＦＬＡＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．上述の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ−ｂｉｌ値を算出した。

（結果）
ビリルビン標準液では、いずれのヘモグロビン濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
新生児血清でも、いずれのヘモグロビン濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１１および図９（四角ドット：血清２２５、丸ドット：血清２２７）に示す。

［参考例７：ＵｎａＧ法による乳び含有検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、乳びの影響を検証した。

（乳び溶液の作成）
１．２０％（２０ｇ／１００ｍＬつまり２００ｍｇ／ｍＬ）イントラリポス輸液を用意した。
２．Ｂｕｆｆｅｒを用いて、２０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬのイントラリポス溶液を作成した。これによって、２００ｍｇ／ｍＬ（２０％）、２０ｍｇ／ｍＬ（２％）、２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）および０．２ｍｇ／ｍＬ（０．０２％）のイントラリポス希釈系列を作成した。

（検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質，アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．１ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒを用いて段階希釈し、ビリルビン濃度が１．７１ｎｇ／μＬ、０．８５５ｎｇ／μＬ、０．４２７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとして、当該Ｂｕｆｆｅｒのみを用意した。３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧの４００ｐｍｏｌ／１５０μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ １５０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５０μＬとを混合し、マイクロプレートリーダ測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。

（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．２種類の新生児血清（血清１７３、血清２００）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ−ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ−ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ−ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１２に示す。

２．新生児血清１０μｌと、上記で調製した各乳び溶液１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９８０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（乳び含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（乳び含有）におけるイントラリポス最終濃度は、０．１％、０．０１％、０．００１％および０．０００１％であった。
また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（乳び不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（乳び含有）４種および２００倍希釈液（乳び不含）を作成した。

４．検量線作成で用いたＵｎａＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．上述の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ−ｂｉｌ値を算出した。

（結果）
ビリルビン標準液では、いずれのイントラリポス濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
新生児血清でも、いずれのイントラリポス濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１３および図１０（四角ドット：血清１７３、丸ドット：血清２００）に示す。

［参考例８：ＵｎａＧ法によるアスコルビン酸含有検体の非抱合型ビリルビン濃度測定］
本参考例では、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン（ｉＤＢ）測定における、アルコルビン酸の影響を検証した。

（アスコルビン酸溶液の作成）
１．アスコルビン酸 1000mgをBuffer 10mLに溶解し、100mg/mLのアスコルビン酸溶液を調製した。
２．Bufferを用いて、10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mLのアスコルビン酸溶液も調製した。これによって、１００ｍｇ／ｍＬ（１０％）、１０ｍｇ／ｍＬ（１％）、１ｍｇ／ｍＬ（０．１％）および０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１％）のアスコルビン酸希釈系列を作成した。

（標準液および新生児検体を用いた検証）
１．参考例７と同じ新生児血清（血清１７３、血清２００）を用意した。
２．新生児血清１０μｌと、上記で調製した各アスコルビン酸溶液２００μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１７９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）を作成した。それぞれの２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）におけるアスコルビン酸最終濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．０１ｍｇ／ｍＬであった。
また、新生児血清１０μｌと、Ｂｕｆｆｅｒ１９９０μｌとを混和し、新生児血清の２００倍希釈液（アスコルビン酸不含）も作成した。
３．同様に、ビリルビン標準液についても、２００倍希釈液（アスコルビン酸含有）４種および２００倍希釈液（アスコルビン酸不含）を作成した。

４．参考例７の検量線作成で用いたＵｎａＧ溶液１５０μＬと、新生児血清またはビリルビン標準液の２００倍希釈液５０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１０分経過時の蛍光強度（最大蛍光強度）を測定した。測定値は、中央値を採用した。
５．参考例７の検量線を用いて、ＵｎａＧ法でのｉＤ−ｂｉｌ値を算出した。

（結果）
ビリルビン標準液では、いずれのアスコルビン酸濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。
新生児血清でも、いずれのアスコルビン酸濃度であってもＵｎａＧ法によるｉＤＢ値はほとんど変化しなかった。この結果を下記表１４および図１１（四角ドット：血清１７３、丸ドット：血清２００）に示す。

［参考例６−参考例８まとめ］
以上より、検体中にヘモグロビン、乳び、およびアルコルビン酸のいずれが含まれていても、ＵｎａＧ法による非抱合型ビリルビン測定に悪影響がないことを確認した。したがって、検体中にヘモグロビン、乳び、およびアルコルビン酸のいずれが含まれていても、本発明へ適用可能であることが容易に推認される。

［参考例９：全血を用いたＵｎａＧ法（１）］
本参考例から、新生児血液の一部から調製した血清試料と、他の一部である全血試料とを用いて、血球成分の影響を調べた。
血清試料と全血試料とのそれぞれについて、参考例１と同様にしてマイクロプレートリーダでＵｎａＧの蛍光を検出し、非抱合ビリルビン値を３回測定した。下記表１５に示すように、ヘマトクリット値Ｈｔで補正することによって、全血でも非抱合ビリルビン値を測定することができた。

したがって、検体が全血であっても本発明へ適用可能であることが推認される。

［参考例１０：全血を用いたＵｎａＧ法（２）］
新生児１８例から採取した全血２６検体について、参考例１と同様に検量線を作成し、ＵｎａＧ法によって非抱合型ビリルビン濃度を得た。また、当該全血２６検体それぞれから血清検体を調製し、血清検体について、参考例１と同様にＵｎａＧ法および酵素法によって非抱合型ビリルビン濃度を得た。

得られた非抱合型ビリルビン濃度について、ＵｎａＧ法による全血中の濃度（Concentration in whole blood by the UnaG method）の、酵素法による血清中の濃度（Concentration in serum by BOD method）との相関を調べた。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、両検体／両方法によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．７６ｘ＋０．３０、ｒ＝０．９６２、ｐ＜０．００１）。
また、得られた非抱合型ビリルビン濃度について、ＵｎａＧ法による全血中の濃度（Concentration in whole blood by the UnaG method）の、ＵｎａＧ法による血清中の濃度（Concentration in serum by UnaG method）との相関を調べた。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、両検体によって得られた非抱合型ビリルビン濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．７３ｘ＋０．７７、ｒ＝０．９６２、ｐ＜０．００１）。

［参考例１１：ＵＢアナライザで測定した新生児血清のＵＢ／ＴＢ比の統計］
抱合型ビリルビン濃度が高い６５検体（高ＤＢ）の新生児血清と、通常の抱合型ビリルビン濃度である２４５検体（通常ＤＢ）の新生児血清とを入手した。それぞれの検体を酵素法によって総ビリルビン濃度および抱合型ビリルビン濃度を測定した。それらの比（抱合型ビリルビン濃度／総ビリルビン濃度）の分布を以下の表１６に示す。

それぞれの検体について、ＵＢアナライザを用いてアンバウンドビリルビン濃度を測定し、総ビリルビン濃度との相関を調べた。その結果を図１４に示す。図１４に示すように、抱合型ビリルビン濃度／総ビリルビン濃度比が５％未満および５％以上１０％未満であればおおよそＴＢとＵＢとの関係は相関が取れている。しかしながら、当該比が１０％以上２０％未満となると相関は大きく崩れ、当該比が２０％以上となると相関の崩れはさらに顕著になる。

［実施例１：ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定］
本実施例では、新生児血清を用いて、本発明の方法によってアンバウンドビリルビンの測定を行った。

（ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質， アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．８ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒで段階希釈し、ビリルビン濃度が１７．８ｎｇ／μＬ、８．９ｎｇ／μＬおよび４．４５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとしてＢｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ−Ｈｉｓ ＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１９５μＬ溶液を作成した。（Ｈｉｓ ＦＬＡＧは、量産用に付されたアフィニティ精製タグ）
４．ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１９５μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列５μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定した。測定値（最大蛍光強度）は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。

（標準液および新生児検体）
１．ビリルビン標準液および３種類の新生児血清（血清１７２、血清２１１、血清２１５）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ−ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ−ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ−ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）、アンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表１７に示す。

（各試薬の作成）
１．アスコルビン酸１６００ｍｇをＢｕｆｆｅｒ１０ｍＬに溶解し、１６％（１６０ｍｇ／ｍＬ）アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
２．ＧＯＤ−ＰＯＤ酵素液５０μＬを酵素液希釈液９５０μＬに溶解し、２０倍希釈ＧＯＤ−ＰＯＤ溶液を作成した。
３．Ｂｕｆｆｅｒ１０ｍＬにＧｌｕｃｏｓｅ５００ｍｇを加え、５０ｍｇ／ｍｌＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
４．上述のＵｎａＧ法の検量線の作成に用いたＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧの４００ｐｍｏｌ／１９５μＬ溶液（ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ溶液）を用意した。

（ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．５０ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬにビリルビン標準液２５μＬ（ＴＢ１７．８ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち２０μＬを別のチューブに移し、Ｂｕｆｆｅｒ８０μＬを加え、さらに１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた。これによって、合計２００μＬの２０倍希釈０秒時点サンプルが得られた。
３．標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち別の２０μＬに２０倍希釈ＧＯＤ−ＰＯＤ溶液８０μＬを加え、３０秒後に１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた。これによって、合計２００μＬの２０倍希釈３０秒時点サンプルが得られた。
４．０秒時点サンプルと３０秒時点サンプルとから５μＬずつ採取し、ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１９５μＬを入れたウェル内に注入し、蛍光強度を測定した。この場合、各サンプルにつき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定し、最大蛍光強度の中央値を採用した（表１８参照）。
５．０秒時点サンプルの最大蛍光強度から検量線を作成した。
６．検量線を用いて、０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプルのｉＤ−ｂｉｌを算出した（表１８参照）。

上記の情報を下記式（Ｉ）にあてはめることによりＫ値を求めた。
ΔiD-bil / ΔTime = K × [POD] × [U-bil] （Ｉ）
その結果、Ｋ値は４．７７と算出された。

（ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法による血清のアンバウンドビリルビンの測定）
１．５０ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬに血清２５μＬを加え、血清−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。このとき、血清は２倍希釈相当であった。
２．血清−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち２０μＬに、Ｂｕｆｆｅｒ ８０μＬを加え（この時点で、血清は１０倍希釈相当）、さらに１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ １００μＬを加えた（この時点で、血清は２０倍希釈相当、アスコルビン酸は８％）。これによって、合計２００μＬの０秒時点サンプルが得られた。

３．血清−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液のうち他の２０μＬに２０倍希釈ＧＯＤ−ＰＯＤ溶液８０μＬを加え（この時点で、血清は１０倍希釈相当）、３０秒後に１６％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加えた（この時点で、血清は２０倍希釈相当、アスコルビン酸は８％）。これによって、合計２００μＬの３０秒時点サンプルが得られた。
なお、分解反応時（つまりＧＯＤ−ＰＯＤ溶液８０μＬを加えた時）において、血清１０μＬに対し原液（ＧＯＤ−ＰＯＤ酵素液）ＧＯＤ−ＰＯＤ４μＬの量関係となった。また、分解反応液２００μＬあたりのＧＯＤ−ＰＯＤの量は０．５２Ｕとなった。

４．上記項目２および項目３で作成された０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプル２００μＬのうち５μＬずつ採取し、ＵｎａＧ溶液１９５μＬを入れたウェルに注入し（この時点で、血清は８００倍相当、アスコルビン酸は０．２％、ｐＨは７．１から７．２）、マイクロプレートリーダで蛍光強度を測定した。

５．各検体につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定し、最大蛍光強度の中央値を採用した（表１９参照）。
６．検量線を用いて、最大蛍光強度から、０秒時点サンプルおよび３０秒時点サンプルのｉＤ−ｂｉｌを算出した（表１９参照）。

ビリルビン標準液を用いて算出されたＫ値（４．７７）を用い、上記式（Ｉ）から、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビン値（[U-bil]）を求めた。その結果、それぞれの血清のアンバウンドビリルビン値は、血清１７２の場合で０．５１、血清２１１の場合で０．７５、血清２１５の場合で０．３２であった。

［実施例２：ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定］
本実施例では、新生児血清を用いて、本発明の方法によってアンバウンドビリルビンの測定を行った。

（ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．ビリルビン標準液（アンバウンドビリルビン標準物質， アローズ社）を用意した。このビリルビン標準液のＵＢアナライザでの測定値はＴＢ１７．７ｍｇ／ｄＬであった。
２．ビリルビン標準液をＢｕｆｆｅｒで段階希釈し、ビリルビン濃度が４．４３５ｎｇ／μＬ、２．２１７５ｎｇ／μＬおよび１．１０８７５ｎｇ／μＬの希釈系列を作成した。また、コントロールとしてＢｕｆｆｅｒのみを用意した。
３．Ｂｕｆｆｅｒを用いてＵｎａＧ−Ｈｉｓ ＦＬＡＧの１３２．４ｐｍｏｌ／μＬ溶液を作成した。
４．ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ溶液１８０μＬと、ビリルビン標準液の希釈系列２０μＬとを混和し、マイクロプレートリーダで測定した。この場合、測定感度は×１とし、各希釈系列につき３回ずつ、注入開始後１５分までの蛍光強度を測定した。測定値（最大蛍光強度）は、中央値を採用した。
５．ビリルビン濃度と最大蛍光強度とから検量線を作成した。

（標準液および新生児検体）
１．ビリルビン標準液および４種類の新生児血清（血清１７９、血清１８０、血清１８１、血清１８５）をそれぞれ用意した。それぞれの検体について、酵素法で測定された総ビリルビン値（Ｔ−ｂｉｌ）、抱合型ビリルビン（Ｄ−ｂｉｌ）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン（ｉＤ−ｂｉｌ）と、ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（ＴＢ）およびアンバウンドビリルビン（ＵＢ）と、アルブミン値（Ａｌｂ）とを、ビリルビン標準液のＴＢおよびＵＢと共に下記表２０に示す。

（各試薬の用意）
１．アスコルビン酸４００ｍｇをＢｕｆｆｅｒ４０ｍＬに溶解し、１％（１０ｍｇ／ｍＬ）アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを作成した。
２．アローズ社ＵＢアナライザ用試薬であるＧＯＤ−ＰＯＤ溶液を用意した（下記表２１参照）。
３．アローズ社ＵＢアナライザ用試薬である１ｍｇ／ｍｌＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ（下記表２１参照）を用意した。
４．上述のＵｎａＧ法の検量線の作成に用いたＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧの１３２．４ｐｍｏｌ／μＬ溶液（ＵｎａＧ−ＨｉｓＦＬＡＧ溶液）を用意した。

（ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法の検量線の作成）
１．１ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液２０μＬ（ｉＤ−ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液に、Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬを加え、さらに１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬを加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈サンプルが得られた。
３．８０倍希釈サンプルを２０μＬ採取し、ＵｎａＧ溶液１８０μｌをセットしたＵＢアナライザ内のウェルに加え、蛍光強度を測定した。
４．上記項目３の操作を３回行い、ＵｎａＧ溶液注入開始後１０分までの蛍光強度を測定した。
５．最大蛍光強度とｉＤ−ｂｉｌ濃度とから検量線を作成した。この場合、最大蛍光強度としては注入開始後１０分までの蛍光強度のうちの最大値であって、かつ中央値を採用した。

結果、非抱合型ビリルビン濃度ｉＤＢ＝最大蛍光強度／２５５．９ という関係が導出された。つまり、図５の検量線と同等であることを確認した。

（０秒時点のｉＤ−ｂｉｌ測定）
１． １ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液または血清２０μＬ（ｉＤ−ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液に、Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬと１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬとを同時に加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈０秒時点サンプルが得られた。
３．血清、Ｂｕｆｆｅｒ、アスコルビン酸混和前のサンプルおよびアスコルビン酸混和後のサンプルのＴＢ値をＵＢアナライザで測定し記録した。

（２０秒時点のｉＤ−ｂｉｌ測定）
１． １ｍｇ／ｍＬＧｌｕｃｏｓｅ含有Ｂｕｆｆｅｒ１０００μＬにビリルビン標準液または血清２０μＬ（ｉＤ−ｂｉｌ１７．７ｍｇ／ｄＬ）を加え、標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液を作成した。
２．標準液−Ｇｌｕｃｏｓｅ混合溶液にＧＯＤ−ＰＯＤ溶液２５μＬを加え、２０秒後に１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒ５５５μＬを加えた。これによって、合計１６００μＬの８０倍希釈２０秒時点サンプルが得られた。
３．血清、Ｂｕｆｆｅｒ、アスコルビン酸混和前のサンプルおよびアスコルビン酸混和後のサンプルのＴＢ値をＵＢアナライザで測定し記録した。
なお、血清１０μｌあたり原液ＧＯＤ−ＰＯＤ１２．５μｌとなり、１６００μＬの２０秒時点サンプルあたりＧＯＤ−ＰＯＤ３．２Ｕとなり、アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを加えた後のアスコルビン酸の終濃度は０．３５％となった。

（検討方法）
１．上記の０秒時点サンプル（以下、単に０秒サンプルと記載）および２０秒時点サンプル（以下、単に２０秒サンプルと記載）それぞれ１６００μｌのうち２０μｌずつを採取し、ＵｎａＧ溶液１８０μｌを入れたウェルに注入し、蛍光強度を測定した。この場合、８０倍希釈血清２０μｌを採取したこととなり、アスコルビン酸の終濃度は０．０３５重量％となり、ｐＨは７．３０以上７．３５以下の範囲となった。

２．各サンプルについて３回ずつ、注入開始後１０分までの蛍光強度を測定した。
３．最大蛍光強度から、０秒時点のｉＤ−ｂｉｌ（０秒値）および２０秒時点のｉＤ−ｂｉｌ（２０秒値）を算出した。
４．標準液の０秒値および２０秒値と、下記式（Ｉ）とから、Ｋ値を求めた。
ΔiD-bil / ΔTime = K × [POD] × [U-bil] （Ｉ）
５．新生児血清の０秒値および２０秒値と、上記項目４で得られたＫ値と、上記式（I）とを用いて、U-bil値を求めた。
６．上記項目５で得られたU-bil値と、UBアナライザで測定したU-bil値の相関関係を調べた。

（参考）
まず、上記と同様に３０秒時点サンプル（つまり２０秒後に１％アスコルビン酸含有Ｂｕｆｆｅｒを加えた場合のサンプル）を作成し、分解反応時間が２０秒（表２２参照）である場合と３０秒（表２３参照）である場合とでどちらがよりΔＴＢ％が安定するか検討した。

上記表２２および表２３より、分解反応時間が２０秒である２０秒サンプルを採用した。

（結果）
１．標準液
標準液のＴＢ値とＵＢ値とを下記表２４に示す。

記録した測定値を下記表２５に示す。なお、表２５において換算値とは、容量変化をもとに1600/1045を乗じて算出した値である（以下の表において同様）。

ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表２６に示す。表２６が示すように、ＵＢアナライザによるＴＢ値およびＵｎａＧによるｉＤＢ値について、いずれもΔ％が２０％前後で安定していることを確認した。

以下のようにＫ値を算出した。
ΔTB/Δt=Kx[POD]x[UB]
K=ΔTB/Δt/[POD]/[UB]
Δtおよび[POD]はこの実験系では一定であることから1とすると
K=ΔTB/0.71と算出された。
なお、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法では、ｉＤＢ値とＴＢ値として使用した。

２．血清１７９
血清１７９のＴＢ値とＵＢ値とを下記表２８に示す。

記録した測定値を下記表２９に示す。

ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３０に示す。

３．血清１８１
血清１８１のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３１に示す。

記録した測定値を下記表３２に示す。

ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３３に示す。

４．血清１８５
血清１８５のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３４に示す。

記録した測定値を下記表３５に示す。

ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３６に示す。

５．血清１８０
血清１８０のＴＢ値とＵＢ値とを下記表３７に示す。

記録した測定値を下記表３８に示す。

ＵｎａＧ溶液添加後の各測定値を下記表３９に示す。

（ＵＢ値の導出）
１．下記表４０に、従来の測定方法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、２０秒時点のＴＢ値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／４．６５）とを示す。

さらに、図１５に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＴＢ値を基にしたＵＢ値（UB analyzer−0-20s）との相関を示す。図１５に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、ＧＯＤ−ＰＯＤ液を混和した後の、ＵＢアナライザを用いて測定されたＴＢ値の推移（０秒値と２０秒値とのΔＴＢ）に基づいてＵＢ値を算出できることが示された。

２．下記表４１に、従来の測定方法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／４．５１）とを示す。

さらに、図１６に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、アスコルビン酸混和後の換算値を基にしたＵＢ値（UB analyzer−0-20s）との相関を示す。図１６に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、アスコルビン酸で反応停止後、ＵＢアナライザを用いて０秒値と２０秒値とのΔＴＢからＵＢ値を算出できることが示された。

上記項目１および項目２より、ＵＢアナライザを用いた従来の測定方法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）では、ＧＯＤ−ＰＯＤ液を混和した後においてＴＢ値が９５％から７６％まで低下するまでにかかる時間からＵＢ値を算出していた（図１７（ａ）参照）が、本発明では、ＧＯＤ−ＰＯＤ液の混和時点から２０秒時点のΔＴＢ（比色法で測定）からでも、ＧＯＤ−ＰＯＤ液の混和時点から２０秒時点のΔｉＤＢ（ＵｎａＧ法で測定）からでも、ＵＢ値を算出できる（図１７（ｂ）参照）ことが示された。

３．下記表４２に、従来の測定方法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値と、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（ΔＴＢ／５．４９）とを示す。

さらに、図１８に、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法のｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を示す。図１８に示すように、両者は良好な相関を示した。したがって、アスコルビン酸で反応停止させた後、ＵＢアナライザを用いてＵｎａＧ法でのｉＤＢ値に基づいてＵＢ値を算出できることが示された。

［実施例３：ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定（ＤＢ低値例）］
（検体）
新生児３３例より採取した、ＤＢ低値（ＤＢ＜１．０ｍｇ／ｄＬ）の血清４５検体を検証した。３３例の症例背景を表４３に、４５検体の血清採取日齢および酵素法に基づく非抱合型ビリルビンの値を表４４に示す。

（非抱合型ビリルビンの測定−ＧＯＤ−ＰＯＤ法との比較）
上記の４５検体を用い、実施例２と同様に、本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によりアンバウンドビリルビン（ＵＢ）の測定を行った。参考用に、上記の４５検体を用い、ＵＢアナライザ（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）によりＵＢの測定を行った。ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法とＧＯＤ−ＰＯＤ法とで測定されたＵＢ測定値の相関を調べた。その結果を図１９に示す。図１９に示すように両方法によって得られたＵＢ濃度には良好な相関が認められた（ｙ＝０．８７６ｘ＋０．０７、ｒ＝０．９４７、Ｐ＜０．００１）。

［実施例４：ＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるアンバウンドビリルビンの測定（ＤＢ高値例）］
（検体）
新生児４例より採取した、ＤＢ高値（ＤＢ≧１．０ｍｇ／ｄＬ）の血清１１検体を検証した。１１検体の検体番号；症例番号（症例番号１はトリソミー１８、症例番号２および３は先天性サイトメガロウイルス感染症、症例番号３はメチルマロン酸血症）；在胎週数；出生体重（BW）；血清採取日齢；酵素法で測定された総ビリルビン値（T-bil(mg/dL)）、抱合型ビリルビン値（D-bil(mg/dL)）、およびそれらから導出された非抱合型ビリルビン値（iD-bil(mg/dL)）と総ビリルビンに対する抱合型ビリルビンの比率（DB/TB(%)）；ＵＢアナライザで測定された総ビリルビン値（TB(mg/dL)）およびアンバウンドビリルビン（非抱合型ビリルビン）値（UB(μg/dL)）；ならびにアルブミン値（Alb(g/dL)）を、表４５に示す。

（非抱合型ビリルビンの測定−ＧＯＤ−ＰＯＤ法との比較）
上記の１１検体を用い、実施例２と同様に、本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によりアンバウンドビリルビン（ＵＢ）の測定を行った。従来の測定方法（ＧＯＤ−ＰＯＤ法）によるＵＢアナライザのＵＢ値（UB analyzer UB）と、本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるｉＤＢ値を基にしたＵＢ値（GOD-POD-UnaG-UB）との相関を調べた。その結果を図２０に示す。図２０においては、１１検体の結果（Ｘドットでプロット）を実施例３の図１９に重ねて示している。
図２０に示すように、ＤＢ高値例の本実施例では、ＤＢ低値例の実施例３とはプロットの分布が異なり、従来のＧＯＤ−ＰＯＤ法では比較的高値を示す傾向が明らかとなった。

［ｉＤＢ／Ａｌｂ比とＵＢとの関係］
実施例３での低ＤＢ値（ＤＢ＜１．０ｍｇ／ｄＬ）の検体と、実施例４での高ＤＢ値（ＤＢ≧１．０ｍｇ／ｄＬ）の検体とについて、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比とＵＢ値との関係を調べた。その結果を図２１および図２２に示す。図２１は、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と、従来の測定方法によるＵＢアナライザのＵＢ値との関係を示し、図２２は、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比と、本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によるＵＢ値との関係を示す。なお、図２１および図２２では、ｉＤＢ／Ａｌｂモル比が０．６以下である検体、具体的には低ＤＢ値の４０検体（●ドットでプロット）および高ＤＢ値の１１検体（×ドットでプロット））について示している。

図２１に示すように、従来のＧＯＤ−ＰＯＤ法によると、低ＤＢ値の４０検体では良好な相関関係（ｒ＝０．８４９、Ｐ＜０．００１）が認められたが、高ＤＢ値の１１検体では相関関係は不良（ｒ＝０．３７５、ｐ＝０．２５５）であった。
一方、図２２に示すように、本発明のＧＯＤ−ＰＯＤ−ＵｎａＧ法によると、低ＤＢ値の４０検体で良好な相関関係（ｒ＝０．８７４、Ｐ＜０．００１）が認められた上に、高ＤＢ値の１１検体でも良好な相関関係（ｒ＝０．８９５、ｐ＜０．００１）が認められた。

本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な変形がなされる。

Claims (21)

1. 非抱合型ビリルビンおよび抱合型ビリルビンを含む血液試料を、前記非抱合型ビリルビンのうちのアンバウンドビリルビン、および前記抱合型ビリルビンの酸化分解反応に供する分解工程（i）と、
   前記酸化分解反応を停止して試料分解物を得る分解停止工程（ii）と、
   前記試料分解物と、前記血液試料が前記酸化分解反応に供されなかった未反応試料とを、それぞれ別個に、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドに接触させる接触工程（iii）と、
   前記試料分解物と前記未反応試料とのそれぞれについて、前記ポリペプチドに起因する蛍光を検出し、前記蛍光の差から前記アンバウンドビリルビンの量を導出する検出工程（iv）と、を含み、
   前記非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドが、前記抱合型ビリルビンおよびその分解物と、前記アンバウンドビリルビンの分解物とに対する結合性は有さず；前記非抱合型ビリルビンと特異的結合した場合に励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発する一方、前記非抱合型ビリルビンが存在しない場合には前記励起光の照射を受けても蛍光を発さず；且つ、アルブミン結合性ビリルビンと接触した場合、アルブミンと前記非抱合型ビリルビンとの結合を切断して前記非抱合型ビリルビンと結合するものであり、以下の（Ａ）から（Ｄ）：
   （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド；
   （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個以上７個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド；
   （Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する蛍光性ポリペプチド；および
   （Ｄ）上述の（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド
   の少なくともいずれかである、血液試料中のアンバウンドビリルビンの測定方法。
2. 前記血液試料が早産児由来の血液試料である、請求項１に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
3. 前記血液試料の血清総ビリルビン濃度が８ｍｇ／ｄＬ以上である、請求項１または２に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
4. 前記血液試料の前記抱合型ビリルビン濃度が１ｍｇ／ｄＬ以上である、請求項１から３のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
5. 前記酸化分解反応の停止を抗酸化物質の添加によって行う、請求項１から４のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
6. 前記抗酸化物質がアスコルビン酸である、請求項５に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
7. 前記酸化分解反応の停止を、分解工程（i）の反応開始後１０秒以上６０秒以下の時点で行う、請求項１から６のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
8. 前記抗酸化物質は、前記分解停止工程（ii）の反応系において０．１重量％以上となるように添加される、請求項５から７のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
9. 前記抗酸化物質がアスコルビン酸である場合、前記アルコルビン酸は前記分解停止工程（ii）の反応系において３２重量％以下となるように添加される、請求項８に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
10. 前記アスコルビン酸は、前記接触工程（iii）の反応系において０．８重量％以下となるように希釈される、請求項６から９のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
11. 前記分解工程（i）の反応系における前記血液試料の希釈率が、血清換算値で５倍以上１２０倍以下である、請求項１から１０のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
12. 前記分解工程（i）において、前記酸化分解反応が、グルコースオキシダーゼの存在下でグルコースから生じさせた過酸化水素とペルオキシダーゼとにより進行させるものであり、前記酸化分解反応の反応系において、前記グルコースオキシダーゼおよび前記ペルオキシダーゼ量が、それぞれ、血清１μＬに対して０．０１２８Ｕ以上０．２５６Ｕ以下である、請求項１１に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
13. 前記血液試料が全血試料である、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
14. 前記検出工程（iv）において、ヘマトクリット値による補正を行って前記アンバウンドビリルビンの量を導出する、請求項１３に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法。
15. 反応用容器収容部と対照用容器収容部とを含むインキュベータと、
    前記反応用容器収容部内の反応用容器にアンバウンドビリルビン酸化分解試薬液の添加を行う試薬液添加部と、
    前記対照用容器収容部内の対照用容器に試薬ブランク液の添加を行う試薬ブランク液添加部と、
    前記試薬液添加部および前記試薬ブランク液添加部の動作に基づいて始動するタイマーと、
    前記タイマーの計測時間に基づいて制御されかつ前記反応用容器および前記対照用容器それぞれに酸化分解停止剤の添加を行う停止剤添加部と、
    前記反応用容器の内容物および前記対照用容器の内容物それぞれを混和する混和部と、
    を含む、アンバウンドビリルビン測定用試料調製装置と、
    前記酸化分解停止剤が添加された前記反応用容器の内容物および前記対照用容器の内容物それぞれに、非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドが添加された蛍光測定用試料について蛍光測定を行う蛍光測定部と、
    少なくとも前記反応用容器の内容物の蛍光値と前記対照用容器の内容物の蛍光値との差分からアンバウンドビリルビン値を導出する演算処理部と、
    導出された前記アンバウンドビリルビン値を表示する出力部と、
    を含み、
    前記非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドが、抱合型ビリルビンおよびその分解物と、アンバウンドビリルビンの分解物とに対する結合性は有さず；前記非抱合型ビリルビンと特異的結合した場合に励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発する一方、前記非抱合型ビリルビンが存在しない場合には前記励起光の照射を受けても蛍光を発さず；且つ、アルブミン結合性ビリルビンと接触した場合、アルブミンと前記非抱合型ビリルビンとの結合を切断して前記非抱合型ビリルビンと結合するものであり、以下の（Ａ）から（Ｄ）：
    （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個以上７個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光性ポリペプチド；
    （Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する蛍光性ポリペプチド；および
    （Ｄ）上述の（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド
    の少なくともいずれかである、アンバウンドビリルビン測定装置。
16. 前記酸化分解停止剤の添加後に前記反応用容器および前記対照用容器それぞれから内容物を測定用容器に分取する分取部と、
    前記測定用容器に蛍光特性を示すポリペプチド液を添加する添加部と、
    をさらに含む、請求項１５に記載のアンバウンドビリルビン測定装置。
17. 請求項１から１４のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビンの測定方法を示すプロトコルに関する情報と、
    アンバウンドビリルビンを酸化分解するための酸化還元酵素と、
    前記酸化分解を停止するための酸化分解停止剤と、
    非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドと、
    を少なくとも含み、
    前記非抱合型ビリルビンに対する特異的結合により蛍光特性を示すポリペプチドが、抱合型ビリルビンおよびその分解物と、アンバウンドビリルビンの分解物とに対する結合性は有さず；前記非抱合型ビリルビンと特異的結合した場合に励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発する一方、前記非抱合型ビリルビンが存在しない場合には前記励起光の照射を受けても蛍光を発さず；且つ、アルブミン結合性ビリルビンと接触した場合、アルブミンと前記非抱合型ビリルビンとの結合を切断して前記非抱合型ビリルビンと結合するものであり、以下の（Ａ）から（Ｄ）：
    （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド；
    （Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１個以上７個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド；
    （Ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する蛍光性ポリペプチド；および
    （Ｄ）上述の（Ａ）に記載の蛍光性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛍光性ポリペプチド
    の少なくともいずれかである、アンバウンドビリルビン測定キット。
18. グルコースおよびグルコースオキシダーゼをさらに含む、請求項１７に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
19. 前記酸化還元酵素がペルオキシダーゼである、請求項１７または１８に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
20. 前記酸化分解停止剤が抗酸化物質である、請求項１７から１９のいずれか１項に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。
21. 前記抗酸化物質がアスコルビン酸である、請求項２０に記載のアンバウンドビリルビン測定キット。