WO2014202778A1 - Procédé de production de lipides par des microorganismes, et utilisation desdits lipides - Google Patents

Procédé de production de lipides par des microorganismes, et utilisation desdits lipides Download PDF

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lipids
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Marie-Joëlle Virolle
Thierry Dulermo
Maxime VERGNE
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Societe Interoleagineuse D'assistance Et De Developpement (S.I.A.)
Universite Paris-Sud
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Definitions

  • the present invention relates to the technical field of the production of lipids by microorganisms, and in particular the use of said lipids.
  • Biodiesel can be made from oleaginous crops, animal fats or recycled fats.
  • Campbell 2008 and Strobel et al. 2008 described the optimization of algal and mushroom growing conditions in different types of bioreactors to maximize lipid and fatty acid yields for biofuel refining.
  • An alternative to photosynthetic lipid production is to use heterotrophic organisms that produce lipids from organic molecules (such as sugars) without light.
  • Oils from single-cell organisms have traditionally been used as special products, for example in health foods, and not as basic chemicals.
  • WO 2009/034217 has described a fermentation method for producing paraffins, fatty acids and alcohols using waste and microorganisms.
  • Application WO 2009/046375 describes the conversion of polysaccharides from biomass into monosaccharides, oligosaccharides, and their transformation into biofuels by using recombinant microorganisms comprising exogenous genes which enable said microorganism to develop on the polysaccharide as the sole source of carbon.
  • US application 2009/0064567 describes the production of biological oils by heterotrophic fermentation of microorganisms using raw materials containing cellulose as the main source of carbon.
  • the application WO2009 / 011480 A1 describes the production of biological oils of cellulosic material depolymerized by microalgae and fungi.
  • WO 2009/009391 A2 describes the preparation of fatty esters by first producing an alcohol composition and supplying this product to a host for the production of a fatty ester.
  • US2011294173 discloses a method for producing lipids from bacteria of the genus Streptomyces by providing as a carbon source organic waste.
  • the invention aims to overcome these disadvantages.
  • One of the aims of the invention is to provide a process for the production of lipids which is inexpensive and which has a high yield.
  • Another object of the invention is to provide culture media for carrying out the process from microorganisms.
  • the description relates to the use of glycerol, or a C3-C5 sugar as a major source of carbon when culturing Actinomycete bacteria for the production of lipids by said bacteria, said bacteria being cultured in a first medium enriched in phosphate and / or nitrogen, and then cultured in a second culture medium depleted of phosphate and / or nitrogen.
  • the invention relates to the use of glycerol, or a C3-C5 sugar as a major source of carbon when culturing Actinomycete bacteria for the production of lipids by said bacteria, said bacteria being cultured in a first phosphate-enriched medium, then cultured in a second phosphate-depleted culture medium.
  • the invention is based on the surprising finding made by the inventors that actinomycetes bacteria grown in the presence of glycerol as a carbon source accumulate a large amount of reserve lipids.
  • the bacteria in order to produce a large quantity of lipids, are first cultured in a medium enriched in nitrogen and / or in phosphate for a certain time (preculture).
  • the sources of phosphate or nitrogen are organic or mineral sources. This first crop is made for a short time and is considered a "preculture”.
  • the bacteria are then transferred to a second medium that still contains glycerol as the major source of carbon, but depleted of nitrogen and / or phosphate. This second culture is the main culture.
  • the nutrients will be called nitrogen and organic or inorganic phosphate.
  • the inorganic or mineral terms will be uniformly used to designate nutrients that are not organic.
  • the culture will be carried out in a nitrogen-depleted environment
  • the culture will be carried out in a medium depleted in inorganic or organic phosphate
  • the culture will be carried out in an environment depleted of inorganic or organic phosphate and nitrogen.
  • the preculture medium of 2.5 to 50 mM of inorganic phosphate, preferably 3 to 40 mM, more particularly 4 to 30 mM, more particularly of 5 to 20 mM, especially 5 to 10 mM inorganic phosphate.
  • the organic phosphate added in such a pre-culture medium is made using the following compounds: phosphate carried by nucleotides derived from nucleic acids such as ribonucleic acid (RNA), deoxyribonucleic acid (DNA), or from adenosine triphosphate (ATP), guanosine triphosphate (GTP), yeast extract ... this list is not exhaustive, and the skilled person will be able to determine the appropriate source of organic phosphate.
  • the inorganic phosphate used in the pre-culture medium is made by means of the following soluble compounds: K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 OR of HPC Nal -1 PC
  • the phosphate concentration inorganic varies from 4mM to 20mM, especially the concentration is about 5mM.
  • the concentration of glycerol in the pre-culture and the culture does not exceed 2M, advantageously 1.5M, in particular 1M.
  • lipid production by Actinomycetes is correlated with the concentration of glycerol present in the culture and pre-culture medium. Dose-dependent or "dose-dependent" lipid production of glycerol will be considered to be up to 2M glycerol.
  • glycerol as the major carbon source of the invention is more advantageous than the conventional use of glucose. Indeed, as shown in the examples below, the lipid production by the actinomycetes is dose dependent, or concentration, glycerol, while high glucose concentrations have the effect of inhibiting the growth and production or accumulation of lipids.
  • the term "major source of carbon” means an amount of carbon compound (s) metabolizable by bacteria and for producing energy, especially in the form of adenosine triphosphate (ATP). ), and allowing the biosynthesis of the organic molecules necessary for the growth and multiplication of said bacteria.
  • the majority source of carbon represents more than 90% of the carbon input in the culture or pre-culture medium.
  • C3-C5 sugars sugars comprising 3, or 4 or 5 carbons. These are at the same time aldoses (polyalcohols comprising an aldehyde function) or ketoses (polyalcohols comprising a ketone function), said C3, C4 and C5 sugars being in their linear or cyclic form, as appropriate, and possibly modified.
  • the lipids thus produced by actinomycetes using glycerol or a C3-C5 sugar are produced in the form of a composition comprising a mixture of fatty acids, said mixture comprising essentially triacylglycerols or TAG.
  • composition essentially comprising triacylglycerols is meant an oleaginous composition comprising more than 75% of trialkylglycerols, in particular more than 80%, in particular more than 85%, more particularly more than 90%, relative to the total amount of lipid. contained in said composition.
  • composition also includes, in a minor manner, free fatty acids, monoacylglycerols and diacylglycerols.
  • the actinomycetes producing lipids according to the invention are essentially bacteria belonging to the following genera: Streptomyces, Rhodococcus, Amycolatopsis, Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Frankia, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, etc.
  • the invention also relates to the use as defined above, wherein the cultivation in the first medium is carried out for a period of 15 to 120 hours.
  • the preculture is advantageously carried out for a time of about 15 to 120 hours, in particular from 20 to 90 hours, more particularly from 24 to 60 hours, in particular from 36 to 48 hours.
  • the preculture can thus be carried out during 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35.
  • the culture, in the nutrient-poor medium, as defined above, is carried out for a time of about 15 to 120 hours, preferably 20 to 80 hours, especially 72 hours.
  • the concentration of said phosphate varies from 0.5 mM to 2 mM, in particular is 1 mM.
  • the invention relates to the previously defined use, wherein said C3-C5 sugar is a triose, a tetrose or a pentose.
  • the invention also relates to the use as defined above, in which the C 3 -C 5 sugars are: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose , lyxose, dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose and xylulose.
  • the C 3 -C 5 sugars are: glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose , lyxose, dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose and xylulose.
  • the invention relates to the above-mentioned use, wherein said bacteria are actinomycetes of the genus Streptomyces.
  • the invention relates to the aforementioned use, wherein the glycerol is selected from refined glycerol and unrefined glycerol.
  • the unrefined glycerol is advantageous, because of the production costs, it is also advantageous to use essentially pure or refined glycerol, that is to say enriched to at least 90%, especially 95%, in particular. 99%, especially 100%.
  • epichlorohydrin is the most important; it involves the chlorination of propylene to give allyl chloride which is oxidized with hypochlorite to dichlorohydrin and which reacts with a strong base to give epichlorohydrin. Epichlorohydrin is then hydrolysed to give glycerol.
  • Glycerol can also be produced by fermentation processes, for example involving yeasts, from monosaccharides by:
  • glycerol is produced industrially according to two main processes: the saponification of fatty substances or the transesterification of vegetable oils.
  • the saponification reaction is a reaction that produces soap and glycerol from fat and soda.
  • the glycerol resulting from the saponification is very pure (> 99%) and is therefore mainly used for pharmaceutical and cosmetic applications.
  • Glycerol or glycerin
  • VOMEs vegetable oil methyl esters
  • Transesterification is a three-step, reversible series reaction in which triglycerides are converted to diglycerides, converted to monoglycerides, and monoglycerides are converted to esters (biodiesel) and glycerol (co-product).
  • the oils or fats react with a short chain alcohol (usually methanol) in the presence of a catalyst.
  • a short chain alcohol usually methanol
  • This reaction can be carried out by homogeneous catalysis, with catalysts soluble in the reaction medium, or by heterogeneous catalysis, with catalysts totally insoluble in the reagents.
  • homogeneous catalysis is the technique most commonly used in biodiesel production processes. Transesterification can be performed by basic or acidic catalysis. A greater reactivity is generally obtained in basic medium.
  • Titanium alkoxides Ti (OBu) 4 , Ti (OPr) 4 ...,
  • Oxides of various metals such as Sn, Mg, Zn, Ti, Pb ...
  • Acid catalysts are rarely used because of their lower reactivity and the high risks of corrosion in industrial plants.
  • the alcoholates or metal oxides are mainly used for the synthesis of esters of heavy alcohols from different cuts of fatty acid methyl esters.
  • Soda in methanolic solution or sodium methylate are the catalysts selected for the production of biodiesel.
  • the chemical composition of unrefined glycerol varies depending on the production process.
  • components such as methanol, various salts or potassium chloride may be present therein with varying contents in the final product.
  • glycerol represents from 63 to 99% of the total product.
  • the methanol content ranges from 0 to about 25%.
  • the contents of phosphorus and potassium are between 1 and 2% of the dry matter.
  • Sodium is present at 1% of the dry matter.
  • Heterogeneous catalysis has significant advantages in terms of respecting the environment which limits discharges, and a neutral and salt or water-free glycerol results from such a process, for example that described in patent FR-B-2,752. 242.
  • the absence of salts in the reaction products does not, unlike homogeneous catalysis, require purification treatments.
  • the crude glycerol product can be purified or refined by treatment with activated carbon to remove organic impurities, by alkaline treatment to remove unreacted glycerol esters, and by ion exchange to remove salts.
  • the glycerol obtained by a distillation series has a high purity (> 99.5%).
  • the invention relates to the above-mentioned use, wherein said bacteria are lipogenic bacteria.
  • lipogenic bacteria is meant in the invention bacteria which are capable of naturally producing at least 20% of their biomass in lipids.
  • Such bacterial strains are advantageous because they make it possible, when they are cultured according to the method of the invention, to produce large quantities of lipids, representing more than 50% of their biomass.
  • Advantageous lipogenic strains of the invention are the following strains: Streptomyces antibioticus 3137, Streptomyces peuceius, Streptomyces rimosus 2535, Streptomyces coelicolor ATCC 19832, Streptomyces coelicolor ATCC21666, Streptomyces coelicolor Variant M 145, Streptomyces coelicolor Variant M145M1155, Streptomyces coelicolor Variant M145M1146, Streptomyces coelicolor Variant M145M1141, Streptomyces coelicolor Variant M ⁇ 45 ⁇ '1148, Streptomyces coelicolor Variant M145M1142 and Streptomyces coelicolor Variant M145M1144, Streptomyces linolmensis NRRL2936, Streptomyces exfoliatus, Streptomyces cealestius ATCC 15084, Streptomyces lividans 13
  • Another advantageous embodiment of the invention relates to the aforementioned use, wherein said lipogenic bacteria are genetically modified by substitution, deletion or insertion of at least one nucleic acid of their genome, so that they accumulate more lipids. than the original strain.
  • AbsA1 / AbsA2 of the biosynthetic pathway of the peptidic antibiotic "Calcium Dependent Antibiotic” led to an increase in the accumulation of triacylglycerols (TAG) in Streptomyces, under the conditions as described above (ie according to the method of the invention).
  • TAG triacylglycerols
  • strain of Streptomyces coelicolor M145 in which the four major pathways of antibiotic biosynthesis have been deleted (CPK, CDA, RED and ACT) and where two point mutations A262G and C271T have been introduced into the gene.
  • rpsL SC04659, 30S ribosomal protein S12
  • Variant strain M145: M1155 has increased lipid production by compared to M145 and this especially in the presence of glucose. In the presence of glycerol, the accumulation of lipids is strong even in the strain of origin M145 and the various introduced genetic modifications have a much lower impact than in glucose.
  • S. coelicolor strain M145 accumulates about 30% / 6% of its biomass in TAG when grown in R2YE glycerol / 0.1M glucose for 96h, respectively.
  • strain varying from M145, M1155, described in Gomez-Escribano and Bibb, Microbial Biotechnology (2011) 4 (2), 207-215 accumulates 40% of its biomass in TAG when it is cultured in R2YE glycerol 0.2M medium. , in condition of hypercompensation.
  • rpoB and / or rpsL genes can be mutated (by point mutation). These mutations have a positive effect both on the accumulation of reserve lipids and on the production of antibiotics (especially polyketide type) suggesting that these mutations have a positive effect on the generation of acetylCoA.
  • genes or gene combinations involved in the production of reserve lipids can also be mutated:
  • bacterial strains with gene modifications increasing the availability of precursors for lipid synthesis.
  • intermediate metabolites such as glycerol 3-phosphate (G3P) or else acetyl and malonyl coenzyme A (acetylCoA, malonylCoA).
  • bacterial strains with gene modifications increasing the availability of precursors for lipid synthesis.
  • intermediate metabolites such as glycerol 3-phosphate (G3P) or acetyl coenzyme A (acetyl CoA).
  • Glycerol can be metabolized by two potentially competing pathways, both of which lead to the synthesis of acetylCoA:
  • glycerol dehydrogenase SC02598 / SC06754
  • DHA kinase SCO0580, SCO0581 to SCO0576 operon, with divergence regulator, SCO0582
  • SCO7073 SCO7071 operon.
  • the genes coding for the enzymes of the glyoxylate pathway may be advantageous to reduce the expression of the genes coding for the enzymes of the glyoxylate pathway.
  • the SCO0982 gene and the neighboring genes may be deleted or mutated so that their products are no longer synthesized or are no longer functional.
  • the description also relates to a set of culture media comprising glycerol, or a C3-C5 sugar, as a majority source of carbon, said set of culture media comprising:
  • first culture medium enriched with inorganic phosphate and / or nitrogen
  • second culture medium that is poor in inorganic phosphate and / or in nitrogen
  • the description relates to a set of culture media comprising glycerol, or a C3-C5 sugar, as a majority source of carbon, said set of culture media comprising:
  • first culture medium enriched with inorganic phosphate and / or nitrogen
  • second culture medium that is poor in inorganic phosphate and / or in nitrogen
  • the invention also relates to a set of culture media comprising glycerol, or a C3-C5 sugar, as a majority source of carbon, said set of culture media comprising:
  • the description also relates to a set of culture media comprising glycerol, or a C3-C5 sugar, as a majority source of carbon, said set of culture media comprising:
  • culture media are media commonly used by those skilled in the art to allow the growth of actinomycetes bacteria.
  • the HT, YEME, MP5, SL11, R2 or R2YE and modified YEME media may be used.
  • the compositions of different advantageous media are described in the example section, hereinafter.
  • the first and the second culture medium are of the same nature.
  • the first medium is R2YE medium
  • the second medium is preferably R2YE medium, possibly slightly modified, including no longer including sucrose.
  • first medium of a different nature it may be appropriate to choose a first medium of a different nature from the second medium.
  • the description also relates to an assembly comprising:
  • said first and second culture media comprising as majority source of glycerol carbon, or a C3-C5 sugar, in particular a sugar chosen from glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxosis, dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose and xylulose and
  • the invention furthermore relates to an assembly comprising:
  • said first and second culture media comprising as majority source of glycerol carbon, or a C3-C5 sugar, in particular a sugar chosen from glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxosis, dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose and xylulose and
  • the description also relates to an assembly comprising:
  • said first and second culture media comprising as majority source of glycerol carbon, or a C3-C5 sugar, in particular a sugar chosen from glyceraldehyde, erythrose, threose, ribose, arabinose, xylose, lyxosis, dihydroxyacetone, erythrulose, ribulose and xylulose and
  • the Actinomycetes bacteria are in particular lipogenic strains, in particular streptomyces, chosen in particular from Streptomyces antibioticus 3137, Streptomyces peuceius, Streptomyces rimosus 2535, Streptomyces coelicolor ATCC 19832, Streptomyces coelicolor ATCC21666, Streptomyces coelicolor Variant M 145, Streptomyces coelicolor Variant M145M1155, Streptomyces coelicolor Variant M145M1146, Streptomyces coelicolor Variant M145M1141, Streptomyces coelicolor Variant M 145M 1148, Streptomyces coelicolor Variant M145M1142 and Streptomyces coelicolor Variant M145M1144, Streptomyces linolmensis NRRL2936, Streptomyces exfoliatus, Streptomyces cealestius ATCC
  • the disclosure further relates to a method for producing lipids by Actinomycete bacteria, said method comprising
  • said first and second culture media comprising as a majority / main carbon source of glycerol, or a C3-C5 sugar.
  • the invention relates to a process for producing lipids by Actinomycete bacteria, said process comprising
  • said first and second culture media comprising as a majority / main carbon source of glycerol, or a C3-C5 sugar.
  • the description relates to a process for producing lipids by Actinomycete bacteria, said process comprising
  • said first and second culture media comprising as a majority / main carbon source of glycerol, or a C3-C5 sugar.
  • the invention relates to a method as defined above, in which said bacteria are Actinomycetes of the family Streptomycetes.
  • the invention relates to a method as defined above, wherein said bacteria are lipogenic bacteria, in particular bacteria genetically modified by substitution, deletion or insertion of at least one nucleic acid of their genome, so that they accumulate more fat than the original strain.
  • the invention furthermore relates to a lipid composition comprising lipids that can be obtained by the process as defined above.
  • the percentages being expressed by weight of the total fatty acids of the composition.
  • the fatty acids are predominantly in the form of TAG, that is to say that at least 50% of the fatty acids are in the form of TAG.
  • the fatty acids are as follows:
  • 14-methylpentadecanoic acid isoC16: 0 / isohexadecanoic acid
  • 14-methylpentadecenoic acid iso C16: 1 / iso hexadecenoic acid
  • the invention furthermore relates to the use of the aforementioned process for the manufacture of lubricants, surfactants, coatings (paints, inks, etc.), solvents, food ingredients or as synthesis intermediates for oleochemicals.
  • biodiesel by known trans-esterification processes, for example a trans-esterification process of the triglycerides present in the composition according to the invention or the microorganism extract according to the invention by methanol in the presence of a catalyst, to obtain methyl esters of fatty acids and glycerol.
  • the biodiesel obtained can be used in mixture with fossil fuel or pure diesel fuel.
  • biokerosene by means of a hydrogen treatment.
  • This process consists of a first step aimed at removing the oxygen present in the charges and converting them into a section composed of paraffinic hydrocarbons and a so-called decarboxylation pathway, which leads to hydrocarbons having one carbon atom less than the initial fatty chain, and is accompanied by the formation of CO and C0 2 .
  • the unsaturations of the fatty chains are completely hydrogenated, and the glycerol group is converted into propane.
  • secondary reactions such as shift and methanation reactions can lead to the formation of CO and methane.
  • the isomerizing hydrocracking stage makes it possible to crack parraffinic diesel chains in branched kerosene and in naphtha.
  • the kerosene yield on diesel is about 60% (40% naphtha).
  • the overall yield kerosene on crude oil is of the order of 55%.
  • the description also relates to a process for producing biofuel, lubricants, surfactants, coatings (paints, inks, etc.), solvents, and synthesis intermediates from lipids derived from bacteria Actinomycete, said process comprising
  • said first and second culture media comprising as a major source of glycerol carbon, or a C3-C5 sugar.
  • the invention also relates to a process for manufacturing biofuel, lubricants, surfactants, coatings (paints, inks, etc.), solvents, and synthesis intermediates from lipids derived from Actinomycete bacteria, said process comprising:
  • said first and second culture media comprising as a major source of glycerol carbon, or a C3-C5 sugar.
  • the lipid composition obtained according to the process of the invention can be used to manufacture a biofuel using the process described in the application WO2005093015
  • the process for producing a lipid composition that can be used as a biofuel or as a fuel component from the composition obtained by the process of the invention comprises the said process
  • At least one trans-esterification step in which the composition obtained by the process according to the invention is reacted by heterogeneous catalysis with at least one primary monoalcohol chosen from methanol and ethanol, to give, on the one hand, at least one methyl and / or ethyl ester of the fatty acid (s) of the starting (or more) triglyceride (s) and, secondly, glycerol, these products being free of by-products; and
  • an acetalisation step in which the glycerol is reacted with at least one compound chosen from aldehydes, ketones and acetals derived from aldehydes or ketones.
  • catalysis Two types of catalysis can be envisaged for transesterification of a vegetable oil into methyl (or ethyl) esters from heterogeneous catalysts: catalysis in a batch reactor or continuous catalysis using the fixed bed principle. Generally, one works continuously in fixed bed.
  • Figure 1 is a graph showing the percentage proportion of TAG accumulated by strains.
  • the strains tested are as follows: A: S.antibioticus 3137 II, B: S.peucetius, C: S.rimosus 2535 J11, D: S.coelicolor VariantM145M1155, E: S.lincolnensis NRRL 2936, F: S .exfoliatus, G: S.avermitilis NRRL 8165, H: S.coelicolor M145 Variant M1146, I: S.coelicolor M145 Variant M1141, J: S.coelicolor M145 Variant M1148, K: S.cealestis ATCC 15084, L: S.
  • Figures 2A-C show TAG accumulation by Streptomyces lividans TK24.
  • Figure 2A shows a photo of electron microscopy of streptomyces lividans mycelium grown for 48 hours, from spores, on R2YE medium in the presence of glycerol and inorganic phosphate (5 mM).
  • Figure 2B shows a photo of electron microscopy of streptomyces lividans mycelium from the step described in Figure 2A, and cultured for 48 hours on a fresh R2YE medium in the presence of glycerol and depleted in inorganic phosphate (5 mM).
  • Figure 2C shows a photo of electron microscopy of streptomyces lividans mycelium from the step described in Figure 2A, and cultured for 48 hours on a fresh R2YE medium in the presence of glycerol and depleted in inorganic phosphate (1 mM).
  • the presence of accumulated lipids is identified by the presence of white lipid vesicles.
  • FIG. 3 represents a graph showing the carbonyl band ratio of the TAG / protein amide band I, which corresponds to the percentage of TAG relative to the dry weight, of different streptomyces strains (1: S. coelicolor M145, 2: S. coelicolor M1146, 3: S. coelicolor M1155, 4: S. antibioticus and 5: S. rimosus) cultured for 72 h on R2YE medium in the presence of 0.1 M glucose (bars). white) or in the presence of 0.2M glycerol (black bars).
  • FIG. 4 represents a graph showing the carbonyl band ratio of the TAG / protein amide band I, which corresponds to the percentage of TAG relative to the dry weight, of a strain of Streptomyces (S.lividans TK24) cultivated in the presence of various sources of carbon (C3 or C5) (1: 0.2M glycerol, 2: 0.17M xylose and 3: 0.17M arabinose) for 72 hours on R2YE medium. The same amounts of carbon equivalent were used.
  • C3 or C5 sources of carbon
  • FIGS. 5A-C show the fatty acid composition of the lipids accumulated under the conditions of the invention, during a culture in the presence of glucose, glycerol, or refined glycerol.
  • FIG. 5A represents a graph showing the proportion, in g per mg of dry biomass, of each of the indicated fatty acids, after culturing for 96h in the presence of 0M glucose (white bars), 0.1M glucose (black bars) and 0.2M glycerol (bars with hatching) of a strain of Streptomyces.
  • FIG. 5B represents a graph showing the proportion, in g per mg of dry biomass, of each of the indicated fatty acids, after culturing for 96 h in the presence of 0M of refined glycerol (white bars), 0.1 M of glycerol (black bars ) and 0.2M glycerol (bars with hatching) of a strain of Streptomyces.
  • FIG. 5C represents a graph showing the proportion, in g per mg of dry biomass, of each of the indicated fatty acids, after culturing for 96h in the presence of 0M of refined glycerol (white bars), 0.1M of refined glycerol (bars). black) and 0.2M refined glycerol (bars with hatching) of a strain of Streptomyces.
  • Figures 6A-B illustrate the advantageous effect of mutations on the production of lipids in R2YE glucose medium.
  • FIG. 6A schematically shows the genes involved in the degradation of lipids by the glyoxylate route, which route is essentially present in oleaginous microorganisms.
  • Figure 6B is a graph showing the accumulation of TAG in strains of Streptomyces lividans having a deletion of at least one gene from the glyoxylate pathway.
  • FIG. 7 is a graph showing the carbonyl band ratio of the TAG / protein amide band I, which corresponds to the percentage of TAG relative to the dry weight, of a strain of Streptomyces (S.coeiicolo MS) cultured on a medium comprising carbon source of glucose (white columns) or glycerol (black columns), the carbon sources being at concentrations of 1: 18g / L, 2 .: 45g / L, 3 .: 68g / L and 4 .: 90g / L, for 96h on a medium R2YE devoid of sucrose.
  • the following culture media can be used in the context of the invention. All of the culture media described below are supplemented with C3-C5 sugars, glucose or glycerol: glucose (10 g / l or 18 g / l) or glycerol (0.2 mol / l and 18 g, 4 g / L).
  • the HT medium comprises, for one liter: 1 g of yeast extract (Yeast extract-Difco), 1 g of beef extract (Difco), 10 g of white dextrin (Prolabo), 2 g of NZ amine type A, 20 mg of CoCl 2 , 7H 2 O.
  • DALP culture medium 3 g of yeast extract, 5 g of bacto-peptone, 3 g of malt extract, and 5 mM of MgCl 2 .
  • the DALP medium comprises for one liter: 10 g of bacto-peptone, 5 g of yeast extract and 10 g of white dextrin. The pH is adjusted to 7.0.
  • the MP5 medium comprises for one liter: 7 g of yeast extract, 5 g of NaCl, 36 ml of glycerol, 20.9 g of MOPS. The pH is adjusted to 7.5.
  • the medium SL1 1 comprises for one liter: 25 g of white dextrin, 12.5 g of yeast extract, 1 g of MgSO 4 , 1 g of KH 2 PO 3 , 20.9 g of MOPS. The pH is adjusted to 7.1.
  • Modified YEME culture medium :
  • the modified YEME medium comprises for one liter: 3 g of yeast extract, 5 g of bactopeptone, 3 g of malt extract.
  • the samples taken are then centrifuged, the bacterial pellet is frozen at -80 ° C. and lyophilized in order to obtain the dry mass. It is used for TAG content analysis by Fourier Transformed Infra Red Spectroscopy (FTIRS).
  • FIRS Fourier Transformed Infra Red Spectroscopy
  • a first Petri dish of a sporulation medium (SFM: Soy flour 20g, Mannitol 20g, Bacto agar 15g, tap water qs 1L) is seeded from spores in order to obtain a bacterial mat. This petri dish is incubated for 5 to 10 days until sporulation of the strain.
  • SFM Soy flour 20g, Mannitol 20g, Bacto agar 15g, tap water qs 1L
  • the culture dish consists of 8mL of R2YE medium, covered with a cellophane. This box is seeded with a wooden stick. 20 ⁇ of water are deposited on the cellophane, the rod having previously touched the SFM box containing the sporulated strain is saturated in "fresh spores" and then immersed in the 20 ⁇ of water present on the R2YE box and spread over the entire cellophane surface. The culture dishes are then incubated 72 to 96h to 28 in the dark.
  • the bacteria were recovered by scraping the cellophane then frozen at -80 ⁇ C and lyophilized for dry weight analysis and content of TAG by FTIRS.
  • streptomyces strains considered as lipogenic that is to say strains that produce more than 20% of their biomass in TAG.
  • the bacteria were spread on the surface of a cellophane deposited on medium
  • the inventors compared the accumulation of TAG under conditions of hypercompensation in Pi of different strains of streptomyces, in the presence of glucose (0.1 M) or glycerol (0.2M).
  • the bacteria cultured according to the process of the invention accumulate more TAG than the same bacteria grown in the presence of glucose.
  • the inventors compared the accumulation of TAG under Streptomyces P1 hypercompensation conditions, coelicolor in the presence of C5 (0.17mM) or glycerol (0.2M) sugars.
  • the cells are lyophilized and then crushed to have a powder that is directly analyzable to the FTIR spectrometer as described for example in [Dean et al. 2010 Bioresource Technology, 101 (12), 4499-4507 ⁇ .
  • the bacterium is able to accumulate significant amounts of TAG including with C5 sugars.
  • the inventors have also identified the fatty acid composition accumulated by the bacteria cultured under the conditions of the invention, in the presence of crude glycerol (FIG. 5B) or of refined glycerol (FIG. 5C), the glycerol being present at a concentration varying from 0 to 0.2M.
  • the same culture in the presence of glucose is used as a control ( Figure 5A).
  • the quantification of fatty acids accumulated as TAG in bacteria grown in the presence of unrefined glycerol is as follows: per 100 g of dry biomass:
  • Example 8 Hyperconpensation in a medium comprising glycerol and having a deletion of genes for the degradation of fatty acids.
  • Bacteria (S. coelicolor M145) with deletions of different genes from the glyoxylate pathway were cultured under the conditions of the invention in the presence of glycerol.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de glycérol, ou d'un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone lors de la mise en culture de bactéries Actinomycètes pour la production de lipides par lesdites bactéries.

Description

Procédé de production de lipides par des microorganismes, et utilisation desdits lipides
La présente invention concerne le domaine technique de la production de lipides par des microorganismes, et notamment l'utilisation desdits lipides.
L'utilisation de matériaux biologiques renouvelables pour la production de biocarburants est généralement motivée par la diminution des impacts sur le climat et sur la production alimentaire, la sécurisation de l'approvisionnement en combustibles, et autres facteurs économiques.
Les ressources biologiques qui ne peuvent pas être utilisées pour l'alimentation humaine ou du bétail et qui peuvent être fabriquées de manière respectueuse de l'environnement, sont d'un intérêt croissant. Le biodiesel peut être fabriqué à partir de cultures oléagineuses, de graisses animales ou de graisses recyclées.
Puisque l'on sait que les algues et certains micro-organismes sont capables de produire et / ou d'accumuler des lipides, leur utilisation comme source d'huile pour le biodiesel a également été suggérée.
Campbell 2008 et Strobel et al. 2008 ont décrit l'optimisation des conditions de culture d'algues et de champignons dans les différents types de bioréacteurs afin de maximiser les rendements en lipides et en acides gras pour le raffinage des biocarburants.
Une alternative à la production photosynthétique de lipides consiste à utiliser des organismes hétérotrophes qui produisent des lipides à partir de molécules organiques (tels que les sucres) sans lumière.
Les huiles issues des organismes mono-cellulaires ont traditionnellement été utilisées comme produits spéciaux, par exemple dans les aliments de santé, et non comme produits chimiques de base.
Ce genre de production est malheureusement à rendements relativement faibles et le produit final devient cher.
Une nouvelle génération de procédés utilisant des matières premières moins coûteuses pour la production de lipides par des micro-organismes hétérotrophes a été proposée dans certaines publications récentes de brevet.
La demande WO 2009/034217 a décrit une méthode de fermentation pour produire des paraffines, des acides gras et des alcools au moyen de déchets et de microorganismes.
La demande WO 2009/046375 décrit la conversion des polysaccharides issus de la biomasse en monosaccharides, oligosaccharides, et leur transformation en biocarburants en utilisant des micro-organismes recombinants comprenant des gènes exogènes qui permettent audit micro-organisme de se développer sur le polysaccharide en tant que seule source de carbone.
La demande US 2009/0064567 décrit la production d'huiles biologiques par fermentation hétérotrophe de micro-organismes en utilisant des matières premières contenant de la cellulose comme source principale de carbone.
La demande WO2009/011480 A1 décrit la production d'huiles biologiques de matière cellulosique dépolymérisée par les micro-algues et les champignons.
Par ailleurs le document WO 2009/009391 A2 décrit la préparation d'esters gras en produisant d'abord une composition d'alcool et la fourniture de ce produit à un hôte pour la production d'un ester gras.
La demande US2011294173 décrit un procédé de production de lipides à partir de bactéries du genre Streptomyces en fournissant comme source carbonée des déchets organiques.
Ces documents ne résolvent toutefois pas un problème majeur : le rendement en lipides produit par les différents microorganismes.
Aussi, la réduction des coûts de production et l'augmentation de la quantité de lipide restent des problèmes non encore résolus.
L'invention a pour but de palier à ces inconvénients.
Un des buts de l'invention est de fournir un procédé de production de lipides qui soit peu coûteux, et qui présente un fort rendement.
Un autre but de l'invention est de fournir des milieux de cultures permettant de mettre en œuvre le procédé à partir de microorganismes.
La description concerne l'utilisation de glycérol, ou un sucre en C3-C5 en tant que source majoritaire de carbone lors de la mise en culture de bactéries Actinomycète pour la production de lipides par lesdites bactéries, lesdites bactéries étant mises en culture dans un premier milieu enrichi en phosphate et/ou en azote, puis mises en culture dans un second milieu de culture appauvri en phosphate et/ou en azote. Aussi, l'invention concerne l'utilisation de glycérol, ou un sucre en C3-C5 en tant que source majoritaire de carbone lors de la mise en culture de bactéries Actinomycète pour la production de lipides par lesdites bactéries, lesdites bactéries étant mises en culture dans un premier milieu enrichi en phosphate, puis mises en culture dans un second milieu de culture appauvri en phosphate.
L'invention est basée sur la constatation surprenante faite par les inventeurs que les bactéries actinomycètes, cultivées en présence de glycérol en tant que source de carbone accumulent une grande quantité de lipides de réserve.
Dans l'invention, afin de produire une grande quantité de lipides, dans un premier temps les bactéries sont cultivées dans un milieu enrichi en azote et/ou en phosphate pendant un temps déterminé (pré-culture). Dans l'invention les sources de phosphate ou d'azote sont des sources organiques ou minérales. Cette première culture est réalisée pendant un temps court et est considérée comme une « préculture ». Les bactéries sont ensuite transférées dans un second milieu comprenant toujours du glycérol comme source majoritaire de carbone, mais appauvri en azote et/ou en phosphate. Cette seconde culture est la culture principale.
De manière uniforme, on nommera par la suite nutriments l'azote et le phosphate organique ou minéral. Egalement, dans l'invention on utilisera uniformément les termes inorganique ou minéral pour désigner les nutriments qui ne sont pas organiques.
Il est avantageux de réaliser la pré-culture dans un milieu enrichi en azote et/ou en phosphate, et de réaliser la culture dans un milieu appauvri des mêmes nutriments. Aussi :
- si la pré-culture est enrichie en azote, la culture sera réalisée dans un milieu appauvri en azote,
- si la pré-culture est enrichie en phosphate minéral ou organique, la culture sera réalisée dans un milieu appauvri en phosphate minéral ou organique, et
- si la pré-culture est enrichie en phosphate minéral ou organique et en azote, la culture sera réalisée dans un milieu appauvri en phosphate minéral ou organique et en azote.
La culture dans un milieu riche puis dans un milieu appauvri en nutriment est connue de l'état de la technique comme « hypercompensation ».
Dans le cadre de l'hypercompensation en phosphate, il est avantageusement ajouté au milieu de pré-culture de 2,5 à 50 mM de phosphate inorganique, préférentiellement de 3 à 40 mM, plus particulièrement de 4 à 30 mM, encore plus particulièrement de 5 à 20 mM, notamment de 5 à 10 mM de phosphate inorganique. Le phosphate organique ajouté dans un tel milieu de pré-culture se fait au moyen de composés suivants : phosphate porté par nucléotides issus des acides nucléiques tels que l'acide ribonucléique (ARN), l'acide désoxyribonucléique (ADN), ou de l'adénosine triphosphate (ATP), du guanosine triphosphate (GTP), de l'extrait de levure ... cette liste n'est pas limitative, et l'homme de métier sera capable de déterminer la source de phosphate organique appropriée.
Le phosphate minéral utilisé dans le milieu de pré-culture se fait au moyen des composés solubles suivants : le K2HPO4/KH2PO4 OU de ^HPC Nal-^PC Dans le milieu de pré-culture, la concentration en phosphate inorganique varie de 4mM à 20 mM , en particulier la concentration est d'environ 5 mM.
De manière avantageuse, la concentration en glycérol dans la pré-culture et la culture n'excède pas 2 M, avantageusement 1 ,5M, en particulier 1 M.
Dans les exemples ci-après, il est montré que la production de lipides par les Actinomycètes est corrélée à la concentration de glycérol présent dans le milieu de culture et de pré-culture. On considérera qu'il y a une production de lipides dépendante de la dose, ou « dose-dépendante », de glycérol, jusqu'à un plateau atteint vers 2M glycérol.
L'utilisation du glycérol comme source de carbone majoritaire de l'invention est plus avantageuse que l'utilisation classique du glucose. En effet, comme il est montré dans les exemples ci-après, la production de lipides par les actinomycètes est dépendante de la dose, ou concentration, de glycérol, alors que de fortes concentrations en glucose ont pour effet d'inhiber la croissance et la production ou accumulation de lipides.
Dans l'invention, on entend par « source majoritaire de carbone » une quantité de composé(s) carboné(s) métabolisable(s) par les bactéries et permettant de produire de l'énergie, notamment sous forme d'adénosine triphosphate (ATP), et permettant la biosynthèse des molécules organiques nécessaires à la croissance et à la multiplication desdites bactéries. La source majoritaire de carbone représente plus de 90% de l'apport en carbone dans le milieu de culture ou de pré-culture.
Dans l'invention, on entend par « sucres en C3-C5 », des sucres comprenant 3, ou 4 ou 5 carbones. Il s'agit à la fois des aldoses (polyalcools comprenant une fonction aldéhyde) ou des cétoses (polyalcools comprenant une fonction cétone), lesdits sucres en C3, en C4 et en C5, étant sous leur forme linéaire ou cyclique, le cas échéant, et éventuellement modifiés.
Dans l'invention, les lipides ainsi produits par les actinomycètes en utilisant du glycérol ou un sucre en C3-C5 sont produits sous la forme d'une composition comprenant un mélange d'acides gras, ledit mélange comprenant essentiellement des triacylglycérols ou TAG.
Par « composition comprenant essentiellement des triacylglycérols », on entend une composition oléagineuse comprenant plus de 75% de trialcylglycérols, notamment plus de 80%, en particulier plus de 85%, plus particulièrement plus de 90%, par rapport à la quantité totale de lipide contenue dans ladite composition.
La composition comprend également de manière minoritaire des acides gras libres, des monoacylglycérols et des diacylglycérols.
Les actinomycètes producteurs de lipides selon l'invention sont essentiellement des bactéries appartenant aux genres suivant : Streptomyces, Rhodococcus, Amycolatopsis, Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Frankia, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium etc Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle la mise en culture dans le premier milieu est réalisée pendant un temps de 15 à 120 heures.
La pré-culture est avantageusement réalisée pendant un temps d'environ 15 à 120 heures, notamment de 20 à 90 heures, plus particulièrement de 24 à 60 heures, en particulier de 36 à 48 heures. La pré-culture peut donc être réalisée pendant 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ou 120 heures.
La culture, dans le milieu pauvre en nutriment, telle que cela a été définie ci-dessus, est réalisée pendant un temps d'environ 15 à 120 heures, avantageusement de 20 à 80 heures, notamment 72 heures.
Lorsque le milieu de culture est appauvri en phosphate inorganique, la concentration dudit phosphate varie de 0,5mM à 2mM, en particulier est de 1 mM.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation précédemment définie, où ledit sucre en C3-C5 est un triose, un tétrose ou un pentose.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne également l'utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle les sucres en C3-C5 sont : la glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où lesdites bactéries sont des actinomycètes du genre Streptomyces.
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, dans lequel le glycérol est choisi parmi le glycérol raffiné et le glycérol non raffiné.
Bien que le glycérol non raffiné soit avantageux, en raisons des coûts de production, il est également avantageux d'utiliser essentiellement du glycérol pur ou raffiné, c'est-à-dire enrichi à environ au moins 90%, notamment 95%, en particulier 99%, notamment 100%.
Différents procédés sont connus pour produire du glycérol.
La synthèse historique de la glycérine ou glycérol est due à Wurtz, à partir du tribromure d'allyle. Toutefois cette synthèse n'est pas totale car le tribromure d'allyle est lui-même préparé à partir de la glycérine. La synthèse totale est due à Charles Friedel et Silva à partir du propylène.
Diverses voies de synthèse à partir du propylène existent. Le processus de l'épichlorhydrine est le plus important ; il comporte la chloration du propylène pour donner le chlorure d'allyle qui est oxydé avec de l'hypochlorite en dichlorohydrine et qui réagit avec une base forte pour donner l'épichlorhydrine. L'épichlorhydrine est ensuite hydrolysée pour donner le glycérol.
Le glycérol peut également être produit par des procédés de fermentation, impliquant par exemple des levures, à partir de monosaccharides par:
(1 ) formation d'un complexe entre les ions d'acétaldéhyde et de bisulfite retardant ainsi la production d'éthanol et restaurant la balance d'oxydo-réduction dans la synthèse du glycérol, ou
(2) des cultures de microorganismes en croissance à des valeurs de pH proches de 7 ou au-dessus, ou
(3) en utilisant des microorganismes osmotolérants.
Cependant, aujourd'hui, le glycérol est produit industriellement selon deux processus principaux : la saponification des corps gras ou la transestérification d'huiles végétales.
La réaction de saponification est une réaction qui permet de produire du savon et du glycérol à partir de corps gras et de soude. Le glycérol issu de la saponification est très pur (> 99%) et de ce fait, est majoritairement utilisé pour des applications pharmaceutiques et cosmétiques.
Le glycérol, ou glycérine, est également produit par la transestérification d'huiles végétales, dont elle est un co-produit, lors de la production d'esters méthyliques d'huiles végétales (EMHV) qui servent de carburants sous la dénomination de biodiesel.
La transestérification est une réaction comportant trois étapes réversibles en série dans lesquelles les triglycérides sont convertis en diglycérides, puis ceux-ci sont convertis en monoglycérides et enfin les monoglycérides sont convertis en esters (biodiesel) et glycérol (co-produit).
Au cours de la réaction de transestérification, les huiles ou graisses réagissent avec un alcool à chaîne courte (généralement le méthanol) en présence d'un catalyseur. Cette réaction peut être effectuée par catalyse homogène, avec des catalyseurs solubles dans le milieu réactionnel, ou par catalyse hétérogène, avec des catalyseurs totalement insolubles dans les réactifs.
A l'heure actuelle, la catalyse homogène est la technique la plus généralement utilisée dans les procédés de production de biodiesel. La transestérification peut être réalisée par catalyse basique ou acide. Une plus grande réactivité est généralement obtenue en milieu basique.
Trois grandes classes de catalyseurs existent :
- les catalyseurs basiques :
· hydroxydes, alcoolates ou savons de métaux alcalins ou alcalino-terreux (Li, Na,
K,Ca, Ba, Cs...),
• aminés de la famille des guanidines, par exemple ;
- les catalyseurs acides :
• acides minéraux : HCI, H2S04,
· acides sulfoniques,
• résines échangeuses d'ions (acide fort),
• zéolithes ;
- les autres catalyseurs :
• alcoolates de titane : Ti (OBu)4, Ti (OPr)4...,
· oxydes de divers métaux tels que Sn, Mg, Zn, Ti, Pb...
Les catalyseurs acides sont rarement utilisés du fait de leur moindre réactivité et des risques élevés de corrosion des installations industrielles. Les alcoolates ou oxydes de métaux sont surtout employés pour la synthèse d'esters d'alcools lourds à partir de différentes coupes d'esters méthyliques d'acides gras.
La soude en solution méthanolique ou le méthylate de sodium sont les catalyseurs retenus pour la production de biodiesel.
La composition chimique du glycérol non raffiné varie en fonction du procédé de production. Ainsi, les composants tels que le méthanol, divers sels ou le chlorure de potassium peuvent s'y trouver avec des teneurs variables dans le produit final.
De manière générale, quel que soit le procédé de production utilisé, le glycérol représente de 63 à 99% du produit total. La teneur en méthanol varie de 0 à environ 25%. Les teneurs en phosphore et potassium sont comprises entre 1 et 2% de la matière sèche. Le sodium est présent à raison de 1 % de la matière sèche.
La catalyse hétérogène présente des avantages significatifs en matière de respect de l'environnement limitant les rejets et un glycérol neutre et exempt de sels ou d'eau résulte d'un tel procédé, par exemple celui décrit dans le brevet FR-B- 2 752 242. L'absence de sels dans les produits de réaction n'impose pas, à la différence de la catalyse homogène, des traitements de purification.
D'autres techniques permettent d'effectuer cette réaction en utilisant des technologies innovantes comme le chauffage par micro-ondes, par catalyse enzymatique ou encore en utilisant du méthanol super critique.
Le glycérol brut produit peut être purifié ou raffiné par traitement au charbon actif pour éliminer les impuretés organiques, par traitement alcalin pour éliminer les esters du glycérol qui n'ont pas réagi, et par l'échange d'ions pour éliminer les sels. Le glycérol obtenu par une série de distillation présente une de pureté élevée (> 99,5%).
Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où lesdites bactéries sont des bactéries lipogéniques. Par « bactéries lipogéniques », on entend dans l'invention des bactéries qui sont capables de produire naturellement au moins 20% de leur biomasse en lipides.
De telles souches bactériennes sont avantageuses car elles permettent, lorsqu'elles sont cultivées selon le procédé de l'invention, de produire de grandes quantités de lipides, représentant plus de 50% de leur biomasse.
Des souches lipogéniques avantageuses de l'invention sont les souches suivantes : Streptomyces antibioticus 3137, Streptomyces peuceius, Streptomyces rimosus 2535, Streptomyces coelicolor ATCC 19832, Streptomyces coelicolor ATCC21666, Streptomyces coelicolor Variant M 145, Streptomyces coelicolor Variant M145M1155, Streptomyces coelicolor Variant M145M1146, Streptomyces coelicolor Variant M145M1141, Streptomyces coelicolor Variant M Ί45Μ '1148, Streptomyces coelicolor Variant M145M1142 et Streptomyces coelicolor Variant M145M1144, Streptomyces linolmensis NRRL2936, Streptomyces exfoliatus, Streptomyces cealestius ATCC 15084, Streptomyces lividans 1326, Streptomyces actuosus, Streptomyces ambofaciens OS MAROC J9 et J5, Streptomyces reticuli DSM 40776, Streptomyces parvulus 2283FB, Streptomyces Venezuela 5110, Streptomyces noursei et Streptomyces cinabarinnus.
Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne l'utilisation susmentionnée, où lesdites bactéries lipogéniques sont génétiquement modifiées par substitution, délétion ou insertion d'au moins un acide nucléique de leur génome, de telle sorte qu'elles accumulent plus de lipides que la souche d'origine.
Par exemple, les inventeurs ont montré que la délétion des deux composants
AbsA1/AbsA2 de la voie de biosynthèse de l'antibiotique de type peptidique « Calcium Dépendent Antibiotic » conduisait à une augmentation de l'accumulation de triacylglycérols (TAG) chez Streptomyces, dans les conditions telles que décrites ci-dessus (i.e. selon le procédé de l'invention).
Les inventeurs ont également constaté que la souche de Streptomyces coelicolor M145 dans laquelle les quatre voies majeures de la biosynthèse d'antibiotique ont été délétées (CPK, CDA, RED et ACT) et où deux mutations ponctuelles A262G et C271T ont été introduites dans le gène rpsL (SC04659, 30S ribosomal protein S12) ; Souche Variant M145 : M1155, présente une production de lipide augmentée par rapport à M145 et ceci surtout en présence de glucose. En présence de glycérol, l'accumulation de lipides est forte même chez la souche d'origine M145 et les différentes modifications génétiques introduites ont un impact beaucoup moins fort qu'en glucose.
La souche S. coelicolor M145 accumule environ 30% / 6% de sa biomasse en TAG lorsqu'elle est cultivée dans le milieu R2YE glycérol 0,2M / glucose 0,1 M pendant 96h, respectivement.
La souche variant de M145, M1155, décrite dans Gomez-Escribano and Bibb, Microbial Biotechnology (2011 ) 4(2), 207-215 accumule 40% de sa biomasse en TAG lorsqu'elle est cultivée dans le milieu R2YE glycérol 0,2M, en condition d'hypercompensation.
Au vu de la connaissance des génomes des bactéries, et de la connaissance de l'homme de métier sur les voies de biosynthèse des antibiotiques, l'homme de métier peut aisément déterminer les gènes ou séquences géniques qui doivent être ciblées.
Par ailleurs, les gènes rpoB et/ou rpsL peuvent être mutés (par mutation ponctuelles). Ces mutations ont un effet positif aussi bien sur l'accumulation de lipides de réserve que sur la production d'antibiotiques (notamment de type polycetide) suggérant que ces mutations auraient un effet positif sur la génération d'acétylCoA.
De plus, les gènes ou combinaisons de gènes participant à la production de lipides de réserve peuvent également être mutés :
- les gènes impliqués dans l'augmentation du flux de glycérol entrant (transport), sa conversion en glycérol 3P (précurseur des TAGs) et son catabolisme en acétylCoA (fonctions enzymatique et/ou de signalisation/régulation),
- les gènes impliqués la biosynthèse des TAGs, biosynthèse des acides gras et leur charge sur le squelette glycérol (fonctions enzymatique et/ou de signalisation/régulation),
- les gènes impliqués dans la dégradation des TAGs.
II est également avantageux, dans le cadre de l'utilisation susmentionnée d'utiliser des souches bactériennes présentant des modifications géniques augmentant la disponibilité en précurseurs pour la synthèse des lipides. Ainsi, par exemple, il est avantageux de disposer de souches bactériennes accumulant des métabolites intermédiaires tels que le glycérol 3-phosphate (G3P) ou encore l'acétyl et le malonyl coenzyme A (acétylCoA, malonylCoA).
Il est en outre avantageux, dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, d'utiliser des souches bactériennes présentant des modifications géniques augmentant la disponibilité de précurseurs de la synthèse des lipides. Aussi, par exemple, il est avantageux de disposer de souches bactériennes accumulant des métabolites intermédiaires tels que le glycérol 3-phosphate (G3P) ou encore l'acétyl coenzyme A (acétylCoA).
En outre, il est avantageux, dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, d'utiliser des souches bactériennes présentant des modifications géniques augmentant l'activité des systèmes enzymatiques impliqués dans la génération des précurseurs (acétyl et malonylCoA) et la biosynthèse de TAG parmi lesquels on peut citer l'augmentation de la disponibilité en co-facteurs indispensables à l'activité enzymatique (biotine etc..) ou de l'intensité de modifications post-traductionnelles (phosphorylation, acetylation, glycosylation etc..) ayant un effet positif sur l'activité des enzymes jouant un rôle dans la génération de précurseurs et la biosynthèse de TAG .
Le glycérol peut être métabolisé par deux voies potentiellement concurrentes qui toutes deux aboutissent à la synthèse d'acétylCoA :
- la voie glycérol kinase, Gly3P DH (opéron SC01659 à SC01661 sous le contrôle du répresseur GylR, SC01658) et SC04774 (glycérol 3P déshydrogénase putative). Cette voie conduit à la fabrication de Gly3P nécessaire à la biosynthèse des TAGs.
Pour augmenter le pool de G3P, il est notamment possible de sur-exprimer conjointement les gènes SC01659 (transporteur du glycérol) et SCO1660 (glycérol kinase) voir d'inactiver SC04774 qui est supposé convertir le Gly3P en DHAP qui rentre dans la glycolyse.
- la voie glycérol déshydrogénase (SC02598 / SC06754), DHA kinase (SCO0580, opéron SCO0581 à SCO0576, avec régulateur en divergence, SCO0582) et/ou opéron SCO7073 à SCO7071 .
On peut envisager également d'augmenter le catabolisme du glycérol par la voie glyDH / DHA Kinase pour augmenter le pool d'acétylCoA.
Dans tous les cas une attention particulière sera portée à l'équilibre rédox de la cellule (le NADH généré devra être réoxydé).
Pour augmenter le pool d'acétylCoA, il est également possible d'augmenter, l'expression des gènes codant les enzymes de la glycolyse et/ou l'activité des enzymes correspondantes en jouant sur d'éventuelles régulations post- traductionnelles et/ou sur l'abondance de cofacteurs nécessaires à l'activité de ces enzymes. Un intérêt particulier sera porté aux enzymes de la partie basse de la glycolyse et notamment au complexe Pyruvate Déshydrogénase.
Pour augmenter la production de lipides par les bactéries, il est également avantageux de réaliser des modifications génétiques chez les dites bactéries afin de réduire la dégradation des acides gras.
A titre illustratif, il peut être avantageux de réduire l'expression des gènes codant les enzymes de la voie du glyoxylate. En particulier, le gène SCO0982 et les gènes avoisinant peuvent être délétés ou muté de telle sorte que leurs produits ne soient plus synthétisés ou ne soient plus fonctionnels.
Les exemples susmentionnés de modifications géniques ne sont donnés qu'à titre indicatif et ne doivent pas être considérées comme limitant la portée de l'invention. L'homme de métier, avec ses connaissances générales du domaine en cause est capable de déterminer les modifications les plus appropriées.
La description concerne également un jeu de milieux de culture comprenant du glycérol, ou un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone, ledit jeu de milieux de culture comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate minéral et/ou en azote, et - un second milieu de culture pauvre en phosphate minéral et/ou en azote.
De plus, la description concerne un jeu de milieux de culture comprenant du glycérol, ou un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone, ledit jeu de milieux de culture comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate minéral et/ou en azote, et - un second milieu de culture pauvre en phosphate minéral et/ou en azote.
Avantageusement, l'invention concerne également un jeu de milieux de culture comprenant du glycérol, ou un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone, ledit jeu de milieux de culture comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate minéral, et
- un second milieu de culture pauvre en phosphate minéral.
Avantageusement, la description concerne également un jeu de milieux de culture comprenant du glycérol, ou un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone, ledit jeu de milieux de culture comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en azote, et
- un second milieu de culture pauvre en azote.
Dans l'invention, les milieux de cultures sont des milieux couramment utilisés par l'homme de métier pour permettre la croissance des bactéries actinomycètes.
A titre d'exemple, dans le cadre de la culture de Streptomycètes, les milieux HT, YEME, MP5, SL11 , R2 ou R2YE et YEME modifié peuvent être utilisés. Les compositions de différents milieux avantageux sont décrites dans la partie exemple, ci-après.
De manière avantageuse, dans l'invention le premier et le second milieu de culture sont de même nature. Aussi, si le premier milieu est du milieu R2YE, le second milieu sera avantageusement du milieu R2YE, éventuellement légèrement modifié, notamment ne comprenant plus de sucrose.
Dans certains aspects de l'invention, il pourra être opportun de choisir un premier milieu de nature différente du second milieu. L'homme de métier, selon les souches bactériennes utilisées, sera à même de choisir les milieux les plus appropriés.
La description concerne par ailleurs un ensemble comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate et/ou en azote, et
- un second milieu de culture pauvre en phosphate et/ou en azote,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5, notamment un sucre choisi parmi la glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose et
- au moins une souche de bactéries Actinomycètes.
Avantageusement, l'invention concerne par ailleurs un ensemble comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate, et
- un second milieu de culture pauvre en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5, notamment un sucre choisi parmi la glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose et
- au moins une souche de bactéries Actinomycètes.
Avantageusement, la description concerne par ailleurs un ensemble comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en azote, et
- un second milieu de culture pauvre en azote,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5, notamment un sucre choisi parmi la glycéraldéhyde, l'érythrose, le thréose, le ribose, l'arabinose, le xylose, le lyxose, la dihydroxyacétone, l'érythrulose, le ribulose et le xylulose et
- au moins une souche de bactéries Actinomycètes.
Comme mentionné précédemment les bactéries Actinomycètes sont notamment des souches lipogéniques, notamment des streptomyces, notamment choisies parmi Streptomyces antibioticus 3137, Streptomyces peuceius, Streptomyces rimosus 2535, Streptomyces coelicolor ATCC 19832, Streptomyces coelicolor ATCC21666, Streptomyces coelicolor Variant M 145, Streptomyces coelicolor Variant M145M1155, Streptomyces coelicolor Variant M145M1146, Streptomyces coelicolor Variant M145M1141 , Streptomyces coelicolor Variant M 145M 1148, Streptomyces coelicolor Variant M145M1142 et Streptomyces coelicolor Variant M145M1144, Streptomyces linolmensis NRRL2936, Streptomyces exfoliatus, Streptomyces cealestius ATCC 15084, Streptomyces lividans 1326, Streptomyces actuosus, Streptomyces ambofaciens OS MAROC J9 et J5, Streptomyces reticuli DSM 40776, Streptomyces parvulus 2283FB, Streptomyces Venezuela 5110, Streptomyces noursei et Streptomyces cinabarinnus.
La description concerne de plus un procédé pour produire des lipides par des bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate et/ou en azote, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu pauvre en phosphate et/ou en azote,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire/principale de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
Avantageusement, l'invention concerne un procédé pour produire des lipides par des bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu pauvre en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire/principale de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
Avantageusement, la description concerne un procédé pour produire des lipides par des bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un premier milieu enrichi en azote, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu pauvre en en azote,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire/principale de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
Avantageusement, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment, dans lequel lesdites bactéries sont des Actinomycètes de la famille des Streptomycètes.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un procédé tel que défini précédemment, où lesdites bactéries sont des bactéries lipogéniques, en particulier des bactéries génétiquement modifiées par substitution, délétion ou insertion d'au moins un acide nucléique de leur génome, de telle sorte qu'elles accumulent plus de lipides que la souche d'origine.
L'invention concerne par ailleurs une composition lipidique comprenant des lipides susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini ci-dessus.
Une composition avantageuse de l'invention, susceptible d'être obtenue par le procédé susmentionné comprend, ou est essentiellement constituée, ou est constituée des acides gras suivants :
- de 6,7% à 7,7 % d'iso C14:0,
- de 3,1% à 4 % C14:1 ,
- de 9,8 à 1 1 % d'antéiso C15:0,
- de 0,1% à 0,7 % de C15:0,
- de 61 ,5% à 62,5% d'isoCI 6:0,
- de 0,5% à 1 ,5 % d'isoCI 6:1 ,
- de 3,1% à 4 % d'C16:0,
- de O,1% à 7,7 % d'C16:1 ,
- de 0,5% à 1 ,5 % de C17:0,
- de 0,5% à 1 , 5 % de C17:1 ,
- de 1 ,1% à 2,1 % d'isoCI 7:0, et
- de 6,7% à 7,7 % d'anteisoCI 7:0,
les pourcentages étant exprimés en poids des acides gras totaux de la composition. Par ailleurs, dans la composition selon l'invention, les acides gras sont majoritairement sous forme de TAG, c'est-à-dire qu'au moins 50% des acides gras sont sous forme de TAG.
Dans l'invention, les acides gras sont les suivants :
- l'acide 12-méthyl tridécanoïque (iso C14:0/ acide iso tétradécanoïque),
- l'acide tétradécénoïque (C14:1 ),
- l'acide 12-méthyl tétradécanoïque (antéiso C15:0/ acide antéiso pentadécanoïque),
- l'acide pentadécanoïque (C15:0),
- l'acide 14-méthyl pentadécanoïque (isoC16:0/ acide iso hexadécanoïque), - l'acide 14-méthyl pentadécénoïque (iso C16:1/ acide iso hexadécénoïque),
- l'acide hexadécanoïque (C16:0),
- l'acide hexadécénoïque (C16:1 ),
- l'acide 15-méthyl hexadécanoïque (iso C17:0/ acide iso heptadécanoïque),
- l'acide heptadécanoïque (C17:0),
- l'acide heptadécénoïque C17:1 , et
- l'acide 14-méthyl hexadécanoïque (antéiso C17:0/ acide antéiso heptadécanoïque). L'invention concerne en outre l'utilisation du procédé susmentionné, pour la fabrication de lubrifiants, de tensio-actifs, de revêtements (peintures, encres,..), de solvants, d'ingrédients alimentaires ou comme intermédiaires de synthèse pour l'oléochimie.
II est possible, par exemple, d'obtenir du biodiesel par des procédés connus de trans-estérifications, par exemple un procédé de trans-estérification des triglycérides présents dans la composition selon l'invention ou l'extrait de microorganisme selon l'invention par le méthanol en présence d'un catalyseur, afin d'obtenir les esters méthylique d'acides gras et du glycérol. Le biodiesel obtenu peut être utilisé en mélange avec du diesel d'origine fossile ou pur comme carburant.
Il est également possible de produire du biokérosène au moyen d'un traitement à l'hydrogène. Ce procédé consiste à une première étape visant à éliminer l'oxygène présent dans les charges et à les convertir en une coupe composée d'hydrocarbures paraffiniques et une voie dite de décarboxylation, qui conduit à des hydrocarbures comportant un atome de carbone de moins que la chaîne grasse initiale, et s'accompagne de la formation de CO et C02. Dans tous les cas, les insaturations des chaînes grasses sont totalement hydrogénées, et le groupement glycérique est transformé en propane. Par ailleurs, des réactions secondaires comme les réactions de shift et de méthanation, peuvent conduire à la formation de CO et de méthane. Sur les catalyseurs de type sulfures classiquement utilisés en hydrotraitement, les deux voies d'élimination de l'oxygène (hydrogénation et décarboxylation) coexistent. Les consommations d'hydrogène correspondant à cette étape d'hydrodésoxygénation dépendent de la nature de l'huile ou des graisses animales de départ, en particulier du nombre moyen d'insaturations par chaîne et de la longueur des chaînes grasses hydrocarbonées.
Ensuite, l'étape d'hydrocraquage isomérisant permet de craquer les chaînes diesel parraffinique en kérosène ramifié et en naphta. Le rendement de kérosène sur diesel est de 60% environ (40% de naphta). Dans l'état de l'art, le rendement global kérosène sur huile brute est de l'ordre de 55%.
Par trans-estérification ou hydrolyse chimique ou enzymatique et/ou associé à d'autres procédés chimiques, il est également possible d'obtenir à partir du procédé susmentionné, des lubrifiants, des solvants et des tensio-actifs ou des ingrédients alimentaires.
L'ensemble de ces techniques est bien connu de l'homme du métier.
La description concerne également un procédé de fabrication de biocarburant, de lubrifiants, de tensio-actifs, de revêtements (peintures, encres,..), de solvants, et des intermédiaires de synthèse à partir de lipides issus de bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture des bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate et/ou en azote, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu appauvri en phosphate et/ou en azote,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
L'invention concerne également un procédé de fabrication de biocarburant, de lubrifiants, de tensio-actifs, de revêtements (peintures, encres,..), de solvants, et des intermédiaires de synthèse à partir de lipides issus de bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant :
- une étape de mise en culture des bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu appauvri en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
La composition lipidique obtenue selon le procédé de l'invention peut être utilisée pour fabriquer un biocarburant en utilisant le procédé décrit dans la demande WO2005093015
A titre indicatif, le procédé de fabrication d'une composition lipidique utilisable comme biocarburant ou comme constituant de carburant à partir de la composition obtenue par le procédé de l'invention comprend ledit procédé
- au moins une étape de trans-estérification dans laquelle on fait réagir par catalyse hétérogène la composition obtenue par le procédé selon l'invention avec au moins un mono alcool primaire choisi parmi le méthanol et l'éthanol, pour donner, d'une part, au moins un ester méthylique et/ou éthylique du ou des acide(s) gras du (ou des) triglycéride(s) de départ et, d'autre part, du glycérol, ces produits étant exempts de sous-produits ; et
- une étape d'éthérification dans laquelle on fait réagir le glycérol avec au moins un hydrocarbure oléfinique de 4 à 12 atomes de carbone ; et/ou
- une étape d'acétalisation dans laquelle on fait réagir le glycérol avec au moins composé choisi parmi les aldéhydes, les cétones et les acétals dérivés d'aldéhydes ou de cétones.
Deux types de catalyse sont envisageables pour réaliser la trans-estérification d'une huile végétale en esters méthyliques (ou éthyliques) à partir de catalyseurs hétérogènes : une catalyse en réacteur batch ou une catalyse en continu en utilisant le principe du lit fixe. Généralement, on travaille en continu en lit fixe.
Le procédé susmentionné est donné à titre d'exemple et ne devrait pas être considéré comme limitatif. L'homme de métier sera capable d'utiliser tout autre procédé similaire à l'aide de ses connaissances générales dans le domaine.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples et des sept figures suivantes. DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est un graphique représentant la proportion en pourcentage de TAG accumulés par souches. Les souches testées sont les suivantes : A : S.antibioticus 3137 J II, B : S.peucetius, C : S.rimosus 2535 Jll, D : S.coelicolor VariantM145 M 1155, E: S.lincolnensis NRRL 2936, F : S.exfoliatus, G : S.avermitilis NRRL 8165, H : S.coelicolor Variant M145 M1146, I : S.coelicolor Variant M145 M1141 , J : S.coelicolor Variant M145 M1148, K: S.cealestis ATCC 15084, L : S. lividans 1326, M : S.coelicolor Variant M145 M1142, N : S.actuosus, O : S. ambofaciens. OS. MAROC J 9, P : S.reticuli DSIVI 40776, Q : S.ambofaciens.05.MAROC J 5, R : S.parvulus 2283 FB, S : S.coelicolor Variant M145 M1144, T : S.coelicolor M145, U : S.coelicolor ATCC 19832, V : S.venezuela 5110J II, W : S.noursei, X : S.cinabarinnus ATCC 23617, Y : S.coelicolor ATCC 21666 et Z : S.venezuelae ATCC 15439.
Les figures 2A-C représentent l'accumulation de TAG par Streptomyces lividans TK24.
La figure 2A montre une photo de microscopie électronique de mycélium de streptomyces lividans cultivées pendant 48 heures, à partir de spores, sur un milieu R2YE en présence de qlycérol et de phosphate inorganique (5 mM).
La figure 2B montre une photo de microscopie électronique de mycélium de streptomyces lividans issu de l'étape décrite à la figure 2A, et cultivé pendant 48 heures sur un milieu R2YE neuf en présence de glycérol et appauvri en phosphate inorganique (5 mM).
La figure 2C montre une photo de microscopie électronique de mycélium de streptomyces lividans issu de l'étape décrite à la figure 2A, et cultivé pendant 48 heures sur un milieu R2YE neuf en présence de glycérol et appauvri en phosphate inorganique (1 mM).
La présence de lipides accumulés est identifiée par la présence de vésicules lipidiques blanches.
La figure 3 représente un graphique montrant le rapport bande carbonyl des TAG / bande amide I des protéines, qui correspond au pourcentage de TAG par rapport au poids sec, de différentes souches de streptomyces (1 : S. coelicolor M145, 2 : S. coelicolor M1146, 3 : S. coelicolor M1155, 4 : S. antibioticus et 5 : S. rimosus) cultivées pendant 72h sur un milieu R2YE en présence de 0, 1 M de glucose (barres blanches) ou en présence de 0,2M de glycérol (barres noires).
La figure 4 représente un graphique montrant le rapport bande carbonyl des TAG / bande amide I des protéines, qui correspond au pourcentage de TAG par rapport au poids sec, d'une souche de Streptomyces (S.lividans TK24) cultivée en présence de différentes sources de carbone (de C3 ou C5) (1 : glycérol 0,2M, 2 : xylose 0,17M et 3 : arabinose 0,17M) pendant 72h sur un milieu R2YE. Les mêmes quantités d'équivalent carbone ont été utilisées.
Les figures 5A-C représentent la composition en acide gras des lipides accumulés dans les conditions de l'invention, lors d'une culture en présence de glucose, glycérol, ou de glycérol raffiné.
La figure 5A représente un graphique montrant la proportion, en g par mg de biomasse sèche, de chacun des acides gras indiqués, après culture pendant 96h en présence de 0M de glucose (barres blanches), 0,1 M de glucose (barres noires) et 0,2M de glycérol (barres avec des hachures) d'une souche de Streptomyces.
La figure 5B représente un graphique montrant la proportion, en g par mg de biomasse sèche, de chacun des acides gras indiqués, après culture pendant 96h en présence de 0M de glycérol raffiné (barres blanches), 0,1 M de glycérol (barres noires) et 0,2M de glycérol (barres avec des hachures) d'une souche de Streptomyces.
La figure 5C représente un graphique montrant la proportion, en g par mg de biomasse sèche, de chacun des acides gras indiqués, après culture pendant 96h en présence de 0M de glycérol raffiné (barres blanches), 0,1 M de glycérol raffiné (barres noires) et 0,2M de glycérol raffiné (barres avec des hachures) d'une souche de Streptomyces.
Les figures 6A-B illustrent l'effet avantageux de mutations sur la production de lipides en milieu R2YE glucose.
La figure 6A montre schématiquement les gènes impliqués dans la dégradation des lipides par la voie du glyoxylate, voie présente essentiellement chez les microorganismes oléagineux.
La figure 6B représente un graphique montrant l'accumulation de TAG chez des souches de Streptomyces lividans ayant une délétion d'au moins un gène de la voie du glyoxylate.
La figure 7 représente un graphique montrant le rapport bande carbonyl des TAG / bande amide I des protéines, qui correspond au pourcentage de TAG par rapport au poids sec, d'une souche de Streptomyces (S.coeiicolo M S) cultivée sur un milieu comprenant comme source de carbone du glucose (colonnes blanches) ou du glycérol (colonnes noires), les sources de carbone étant à des concentrations de 1 .: 18g/L, 2.: 45g/L, 3.: 68g/L et 4.: 90g/L, pendant 96h sur un milieu R2YE dépourvu de sucrose.
EXEMPLES :
Exemple 1 : Milieux de culture
Les milieux de culture suivants peuvent utilisés dans le cadre de l'invention. L'ensemble des milieux de culture décrits ci-après sont complémentés de sucres en C3-C5, de Glucose ou de glycérol : Glucose (10 g/L ou 18 g/L) ou glycérol (0,2 mol/L et 18,4 g/L).
Milieu de culture HT:
Le milieu HT comprend pour un litre : 1 g d'extrait de levure (Yeast extract-Difco), 1 g d'extrait de bœuf (Difco), 10 g de dextrine blanche (Prolabo), 2g de NZ amine de type A, 20 mg de CoCI2, 7H20.
Milieu de culture R2YE modifié :
K2S04 (1 ,4 .10-3 mol/L et 0,25 g/L) MM=174 g/mol
MgCI2 6H20 (5.10-2 mol/L et 10, 12 g/L) MM=203 g/mol
Acides aminés de caséine (0.1 g/L)
CaCI2 2H20 (2.10-2 mol/L et 2.94 g/L) MM=147 g/mol
L-proline (2,6.10-2 mol/L et 3 g/L) MM=1 15 g/mol
TES buffer (2,5.10-2 mol/L et 5.73 g/L) MM=2304 g/mol
Oligoélément (2 mL/L)
Yeast Extract (5 g/L)
NaOH (5.10-3 mol/L et 0.2 g/L) MM=30 g/mol
Solution Stock d'oligo-éléments R2YE :
ZnCI2 40 mg/L ; FeCI3.6H20 200 mg/L ; CuCI2.2H20 10 mg/L ; MnCI2.4H20 10 mg/L ; Na2B4O7.10H2O 10 mg/L ; (NH4)6Mo7024.4H20 10 mg/L
Milieu synthétique Milieu 194:
TES 22,8 mM ;
Acide Citrique.H20 2,0 mM ;
NaCI 2,2 mM ;
KH2P04 1 1 ,0 mM ;
(NH4)2S04 43,0 mM ;
MgS04.7H20 1 ,7 mM ;
CaCI2.2H20 0,2 mM ;
FeS04.7H20 137,6 μΜ ;
CuS04.5H20 12,0 μΜ ;
ZnS04.7H20 1 1 ,7 μΜ ;
MnS04.H20 33,9 μΜ ; Na2Mo04.2H20 1 ,6 μΜ ;
CoCI2.6H20 3,2 μΜ ;
Kl 1 ,5 μΜ ;
AICI3.6H20 1 ,3 μΜ ;
Η3Β03 2,5 μΜ ;
NiCI2.6H20 1 ,6 μΜ ;
Thiamine-HCI 21 ,0 μΜ (7 mg/L) ;
Biotine 1 ,2 μΜ (0,30 mg/L) ;
Riboflavine 5,0 μΜ (2 mg/L) ;
Acide Pantothénique de Calcium 8,4 μΜ (2 mg/L) ;
Acide folique 0,6 μΜ (0,25 mg/L) ;
Acide p-amino-benzoïque 1 ,8 μΜ (0,25 mg/L) ;
Pyridoxine-HCI 9,7 μΜ (2 mg/L) ;
Nicotinamide 16,3 μΜ (2 mg/L) ;
Acide nicotinique 0,5 μΜ (0,0625 mg/L) ;
Antifoam 204 100,0 μ _ ;
Pluronic F68 10 % 0,5 ml_/L
Milieu de culture YEME :
3 g d'extrait de levure, 5 g de bacto-peptone, 3g d'extrait de malt, et 5mM de MgCI2. Milieu de culture DALP :
Le milieu DALP comprend pour un litre : 10g de bacto-peptone, 5g d'extrait de levure et 10 g de dextrine blanche. Le pH est ajusté à 7,0.
Milieu de culture MP5 :
Le milieu MP5 comprend pour un litre : 7 g d'extrait de levure, 5 g de NaCI, 36 ml de glycérol, 20,9 g de MOPS. Le pH est ajusté à 7,5.
Milieu de culture SL1 1 :
Le milieu SL1 1 comprend pour un litre : 25 g de dextrine blanche, 12,5 g d'extrait de levure, 1 g de MgS04, 1g de KH2P03, 20,9 g de MOPS. Le pH est ajusté à 7,1 . Milieu de culture YEME modifié :
Le milieu YEME modifié comprend pour un litre : 3 g d'extrait de levure, 5 g de bactopeptone, 3 g d'extrait de malt.
Exemple 2 : conditions de culture
cultures liquides (fiole 50 ml, fermenteur 2L)
Pré-culture ensemencé avec 106 spores/mL et incubé 48h à 28°C pH 7, agitation 180-200 rpm (rotations par minute) La culture ensemencée avec un volume de pré-culture représentant 2.5% du volume final de la culture. La culture est incubée 72 à 96 h à 28 <€ pH 7 180-200 rpm pour fiole (pour fermenteur: p02 70%, agitation 400-600 rpm)
Les prélèvements effectués sont ensuite centrifugés, le culot bactérien est congelé à -80°C et lyophilisé afin d'obtenir la masse sèche. Il est utilisé pour l'analyse du contenu en TAG par FTIRS (Fourier Transformed Infra Red Spectroscopy).
Cultures solides (boites de Pétri)
Une première boite de Pétri d'un milieu de sporulation (SFM : Farine de soja 20g, Mannitol 20g, Bacto agar 15g, eau du robinet qsp 1 L) est ensemencé à partir de spores afin d'obtenir un tapis bactérien. Cette boite de Pétri est incubée entre 5 et 10 jours jusqu'à sporulation de la souche.
La boite de culture est composée de 8mL de milieu R2YE, recouvert d'un cellophane. Cette boite est ensemencée à l'aide d'un bâtonnet en bois. 20μί d'eau sont déposés sur le cellophane, le bâtonnet ayant préalablement touché la boite de SFM contenant la souche sporulé est saturé en « spores fraîches » et ensuite plongé dans les 20μί d'eau présent sur le boite de R2YE et étalé sur toute la surface du cellophane. Les boites de culture sont ensuite incubées 72 à 96h à 28 à l'obscurité.
A la fin de la culture, les bactéries sont récupérées en grattant le cellophane puis congelées à -80 <C et lyophilisées pour l'analyse du poids sec et du contenu en TAG par FTIRS.
Exemples 3 : souches lipogéniques
Les inventeurs ont identifiés des souches de streptomyces considérées comme lipogéniques, c'est-à-dire des souches qui produisent plus de 20% de leur biomasse en TAG.
Les résultats sont présentés dans la figure 1 .
Exemple 4 : Hyperconpensation en milieu glycérol
Afin de déterminer la proportion de TAG accumulés par les microorganismes, les inventeurs ont testé la souche de Streptomyces lividans.
Les bactéries ont été étalées à la surface d'un cellophane déposé sur du milieu
R2YE solide contenant du glycérol (0,2M) et 5mM de phosphate inorganique (Pi) pendant 48h. L'observation en microscopie électronique des bactéries montre qu'elles contiennent très peu de vésicules lipidiques (figure 2A).
A l'issue des 48h, les bactéries sont déplacées à la surface d'un milieu R2YE solide neuf, contenant du glycérol (0,2M) et soit 5 mM de Pi (figure 2B) soit 1 mM de Pi
(Figure 2C). L'observation en microscopie électronique montre que les bactéries ayant été soumises à une limitation en phosphate (transfert de 5mM à 1 mM Pi) accumulent très fortement des TAG (phénomène hyper compensation), alors que celles qui n'ont pas été soumises à une telle limitation (transfert de 5mM à 5 mM) ne montrent pas ce phénomène et accumulent une quantité de TAG plus faible.
Des résultats similaires sont obtenus dans le cadre d'une hypercompensation en azote.
Ces résultats sont confirmés avec la souche Streptomyces coelicolor M1 155, comme le montre la figure 7. Pour cette souche (M1 155), on constate que de manière dose dépendante, les bactéries cultivées sur R2YE/glycérol accumulent plus de TAG que celles cultivées en R2YE/glucose.
Exemple 5 : Hyperconpensation en milieu glycérol et en glucose.
Afin de valider les résultats précédents, les inventeurs ont comparé l'accumulation de TAG dans des conditions d'hypercompensation en Pi de différentes souches de streptomyces, en présence de glucose (0,1 M) ou de glycérol (0,2M).
Les résultats sont représentés figure 3.
On constate que quel que soit la souche utilisée, les bactéries cultivées selon le procédé de l'invention accumulent plus de TAG que les mêmes bactéries cultivées en présence de glucose.
Exemple 6 : Hyperconpensation en milieu comprenant des suces en C5
Afin de valider les résultats précédents, les inventeurs ont comparé l'accumulation de TAG dans des conditions d'hypercompensation en Pi de Streptomyces, coelicolor en présence de sucres en C5 (0,17mM) ou de glycérol (0,2M).
Les cellules sont lyophilisées et ensuite écrasées pour avoir une poudre qui est directement analysable au FTIR spectromètre tel que décrit par exemple dans [Dean et al. 2010 Bioresource Technology, 101(12),4499-4507\.
Les résultats sont représentés figure 4.
On constate que la bactérie est capable d'accumuler des quantités significatives de TAG y compris avec des sucres en C5.
Exemple 7 : Hyperconpensation en milieu comprenant du glycérol raffiné ou non
Les inventeurs ont également identifié la composition en acides gras accumulés par les bactéries cultivées dans les conditions de l'invention, en présence de glycérol brut (figure 5B) ou de glycérol raffiné (Figure 5C), le glycérol étant présent à une concentration variant de 0 à 0,2M. La même culture en présence de glucose est utilisée comme témoin (Figure 5A). Ces résultats montrent une accumulation plus importante lorsque la source de glycérol n'est pas raffinée.
Par ailleurs ces résultats montrent que les TAG qui s'accumulent lorsque les bactéries sont mises en culture en utilisant le procédé selon l'invention, présent une forte quantité d'acide gras iso C16 :0, et dans une moindre mesure une quantité non négligeable d'antéiso C15 :0.
La quantification des acides gras accumulés sous forme de TAG dans les bactéries cultivées en présence de glycérol non raffiné est la suivante : pour 100g de biomasse sèche :
isoC14:0 : 3,5g,
isoC14:1 : 1 ,75g,
anteisoC15:0 : 5g,
C15:0 : 0,1 g,
isoC16:0 : 30g,
isoC16:1 : 0,5g,
C16:0 : 1 ,75g,
C16:1 : 0,25g,
isoC17:0 : 0,8g,
anteisoC17:0 : 3,5g,
C17:0 : 0,5g, et
C17:1 : 0.5g.
Exemple 8 : Hyperconpensation en milieu comprenant du glycérol et présentant une délétion de gènes de la dégradation des acides gras.
Afin d'augmenter le contenu en TAG des bactéries, les inventeurs ont testé l'impact de modifications des voies de dégradation des acides gras.
Des bactéries (S. coelicolor M145) présentant des délétions de différents gènes de la voie du glyoxylate ont été cultivées dans les conditions de l'invention en présence de glycérol.
Les résultats sont présentés dans la figure 6B.
On constate que des bactéries présentant une délétion des gènes SCO0981 , SCO0982, SCO0983 et SCO0984 (ICL4 sur la figure 6B) accumulent jusqu'à plus de 200% de TAG en plus que les bactéries ne présentant pas de telles délétions.
Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention, combiné à des modifications géniques de voies du métabolisme des acides gras, permet d'augmenter considérablement l'accumulation des acides gras par les bactéries.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de glycérol, ou d'un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone lors de la mise en culture de bactéries Actinomycète pour la production de lipides par lesdites bactéries, lesdites bactéries étant mises en culture dans un premier milieu enrichi en phosphate, puis mises en culture dans un second milieu de culture pauvre en phosphate.
2. Utilisation selon la revendication 1 , où ledit sucre est un triose, un tétrose ou un pentose.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, où lesdites bactéries sont des Acticnomycètes du genre Streptomyces.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le glycérol est choisi parmi le glycérol raffiné et le glycérol non raffiné.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où lesdites bactéries sont des bactéries lipogéniques.
6. Utilisation selon la revendication 5, où lesdites bactéries lipogéniques sont génétiquement modifiées par substitution, délétion ou insertion d'au moins un acide nucléique de leur génome, de sorte qu'elles ne produisent substantiellement pas d'antibiotique.
7. Jeu de milieux de culture comprenant du glycérol, ou un sucre en C3-C5, en tant que source majoritaire de carbone, ledit jeu de milieux de culture comprenant :
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate, et
- un second milieu de culture pauvre en phosphate.
8. Ensemble comprenant
- un premier milieu de culture enrichi en phosphate, et
- un second milieu de culture pauvre en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5, et
- au moins une souche de bactéries Actinomycètes.
9. Procédé pour produire des lipides par des bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture de bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu appauvri en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire/principale de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel lesdites bactéries sont des Acticnomycètes de la famille des Streptomycetes.
11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, où lesdites bactéries sont des bactéries lipogéniques, en particulier des bactéries génétiquement modifiées par substitution, délétion ou insertion d'au moins un acide nucléique de leur génome, de telle sorte qu'elles ne produisent substantiellement plus d'antibiotique.
12. Composition lipidique comprenant des lipides susceptibles d'être obtenus par le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 9 à 11 .
13. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 , pour la fabrication de lubrifiants, de tensio-actifs, de revêtements, de solvants, d'ingrédients alimentaires ou d'intermédiaires de synthèse pour l'oléochimie.
14. Procédé de fabrication de lubrifiants, de tensio-actifs, de revêtements, de solvants, d'ingrédients alimentaires ou d'intermédiaires de synthèse pour l'oléochimie à partir de lipides issus de bactéries Actinomycète, ledit procédé comprenant
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un premier milieu enrichi en phosphate, et
- une étape de mise en culture desdites bactéries dans un second milieu pauvre en phosphate,
lesdits premier et second milieux de culture comprenant comme source majoritaire de carbone du glycérol, ou un sucre en C3-C5.
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