JPS6188889A - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 この発明は、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関す
る。更に詳しくは組換えＤＮＡ法によυ育種されたコリ
ネホルム細菌を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸の製造
法に関する。 従来の技術 組換えＤＮＡ法によジアミノ酸生産菌を育種した例はす
でに数多く知られているう これらの例はいずれも一種類のプラスミドベクターに一
″！之は二以上の酵素をコードする遺伝子を挿入して得
られた組換えプラスミドを有するＩ揉生物を用いるもの
でろシ、必ずしも高いアミノ酸の生産性が得られてはい
なく、さらに改善する必要があった。 発明が解決しようとする問題点 従ってこの発明の目的は、組換えＤＮＡ法によってＬ−
アミノ酸の生産性がさらに高いコリネホルム細菌を育種
しようとするものである。 問題点を解決するための手段 本発明者らは叙上の問題点を解決するためイ重々研究の
結果相互に異なる複製開始点を有する二つ以上のプラス
ミドベクターの一方に所望のＬ−アミノ酸の生合成系路
上にある１つの酵素をコードする遺伝子を挿入し、上記
二つ以上のプラスミドベクターの他方に、上記Ｌ−アミ
ノ酸の生合成系路上にあり、上記酵素とは異なる酵素を
コードする遺伝子を挿入し、上記二つ以上の酵素は上記
し−アミノ酸の生合成においていずれも高位の律速とな
っているものであって、得られたそれぞれの組換えグラ
スミドをコリネホルム細菌の菌株の１つの細胞に導入−
一することによって、高いＬ−アミノ酸の生産能を有す
る細菌を得ることに成功した。 本発明では、上記のように二つ以上のプラスミドベクタ
ーを用いるが、これは少なくとも二つのプラスミドベク
ターを用いるのであって、王ないし四のプラスミドベク
ターを用いても良い。しかじあま９数が多くなると技術
上困難となる。 この発明では、二つ以上のプラスミドが共存しうろこと
が必要である。本発明者らの研究によれば共存しうる条
件としては、例えばブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのもつグラスミドｐＡＭ　３３０よシ得た二つ
のプラスミドは、共存しえず、したがって共存しうるた
めには複製開始点が異なることが考えられた。共存しう
る条件として複製開始点のみが異っていればよく、他の
部分は同じでもかまわない。共存するかどうかを見分け
るには、二つ以上のプラスミドがもつ薬剤耐性がそれぞ
れ発現しているかどうかを調べることによフ分かる。複
製開始点とは、ｆ−）スミドＤＮＡの複製が開始される
ＤＮＡ領域をいう。 あるアミノ酸の生合成系路上にある酵素とは、例えば、
グルコースを炭素源とした場合、スレオニンであればグ
ルコースからホスホエノールピルビン酸さらにピルビン
酸までの一連の酵素、さらにホスホエノールピルビン酸
からオキサロ酢酸、アスパラギン酸へ、又、ピルビン酸
からアセチルＣｏＡを経て、ＴＣＡ回路を経てオキサロ
酢酸、アスパラギン酸へ、さらに、ノ々スノ４，７ギン
酸からホモセリンを経てスレオニンに至るまでの生合成
系をつかさどる一群の酵素である。又、トリプトファン
であれば、グルコースを炭素源とすれば、グルコースカ
ラホスホエノールピルビン酸までの酵素、さらにホスホ
エトルぎルピン酸からコリスミン酸、さらにアントラニ
ル酸からトリット７アンへの酵素群である。又、プロリ
ンでは同様にグルコースからホスホエノールピルビン酸
、ピルビン酸マでの酵素、さらに、ホスホエノールピル
ビン酸カラオキサロ酢酸を経てＴＣＡ回路に入る糸路、
又ぎルピン酸からアセチルＣｏＡを経てＴＣＡ回路に入
る経路の酵素、さらにＴＣＡ回路からグルタミン酸を経
てプロリンに至る一連の酵素群である。又、フェニルア
ラニンでハ、グルコースよりホスホエノールピルビン酸
、さらにコリスミン酸からグルタミン酸を経てフェニル
アラニンへ至る一連の酵素である。又、バリンについて
は、同様にグルコースからビルビル酸、スレオニンまで
の一連の酵素、さらに、α−アセト乳酸を経てバリンに
至る系路上のＣ４素である。 高位の律速であるかどうかを見分けるには、ある酵素の
生産物を添加することによシ、最終産物である目的アミ
ノ酸の生合成速度の上昇が見られれば、律速であること
がわかる。さらに、次位の律速も同様にして調べられる
。使用する酵素は、高位の律速のものよル挿入するが、
必ずしも順位の高いものから挿入する必要はない。挿入
する酵素の遺伝子とアミノ酸の例を以下に示す。 スレオニン発酵では、アスＩｆルトキナーゼ（２，７，
２，４’）　、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（６，４，１，１）　、ホモセリンデヒドロダナー
ゼ（Ｌｌ、１．３　）、ホモセリンキナーゼ（２，７，
１，３９）、スレオニンシンターゼ（４，２，９９，２
）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（２，６，１
，１）などがある。 ＩＪ　シン発酵では、アスパルトキナーゼ、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスｉＪ？ラギン酸
トランスアミナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデ
ヒドロｒナーゼ（１，２，１，１１）、ジヒドロピコリ
ン酸シンターゼ（４，２，１，５２）　、＆　ヒドロピ
コリン酸レダクターゼ（１，３，１，２６）　、スクシ
ニルジアミノ♂メリン酸トランスアミナーゼ（２，６，
１，１７”）　、スクシニルノアミノピメリン酸デアシ
ラーゼ（３，５，１，１８）、ノアミノピメリン酸エピ
メラーゼ（５，１，１，７）及びジアミノピメリン酸デ
カル？キシラーゼ（４，１，１，２０）などがある。 トリットファン発酵では、ホスホエノールピルビン酸に
いたるまでの生合成酵素に加え、デオキシアラビノヘグ
ツロン酸リン酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸シンタ
ーゼ（４，６，１，３）、３−７ｊヒドロキナ酸デヒド
ラターゼ（４，２，１，１０）　、シキミ酸デヒドロｒ
ナーゼ（１，１，１，２５）、シキミ酸キナーゼ（２，
７，１，７１）、５−エノールビルピルシキミ酸シンタ
ーゼ（２，５，１，１９）　、コリスミン酸シンターゼ
、アントラニル酸シンターゼ（４，１，３，２７）、ア
ントラニル岐ホスホリ？ジルトランスフェラーゼ、Ｎ−
（５’−ホスホリボシル）アントラニル酸インメラーゼ
、インドール３−グリセロールリン酸シンターゼ（４，
１，１，４８）、及びトリプトファンシンターゼ（４，
２，１，２０）がある。 フェニルアラニン発酵では、トリプトファンと同様にｒ
オキシーアラピノーヘプツロン酸リン酸７ンターゼよフ
コリスミン酸シンターゼまでの酵素に加えコリスミン酸
ムターゼ及びゾレフエン酸デヒドラターゼ（４，２，１
，５１）がおる。 コリネホルム細菌は、好気性、グラム陽性桿菌であり、
非抗酸性でパーデース・マニュアル・オツ・デターミネ
イティブパクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）
に記載されていて、そのうち特に以下に例示するような
Ｌ−グルタミン酸を大量に生産するものが知られている
。 ブレビバクテリウム・、ディバリカタム　　　　ＡＴＣ
Ｃ１４０２０プレビペクテリウム・サラカロリティクム
　　ＡＴＣＣ１４０６６プレヒイクテリウム・インマリ
オフィルム　　ＡＴＣＣ１４０６８プレピノ９クテリウ
ム・ラクトファーメンタム　ＡＴＣＣ１３８６９プレヒ
ハクテリクム・ロゼラム　　　　　　　ＡＴＣＣ１３８
２５！レピパクテリタム・フラバム　　　　　　　ＡＴ
ＣＣ１３８２６ゾンビΔクテリクム・チオｒニタリス　
　　　ＡＴＣＣ１９２４０コリネパクデリクム・アセト
アシドフィルム　ＡＴＣＣ１３８７０コリネパクテリク
ム・アセトグルタミクム　　ＡＴＣＣ１５８０６コリネ
パクテリクム・カルナエ　　　　　　　ＡＴＣＣ１５９
９１コリネパクテリクム・グルタミクム　　　　ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、１３）６０コリネパクテリクム・リリウ
ム　　　　　　　ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウ
ム・メシセコーラ　　　　　ＡＴＣＣ１７９６５ミクロ
バクテリウム・アンモニアフイラム　　ＡＴＣＣ１５３
５４コリネホルム細菌には上記のようなグルタミン酸生
産性を有するもののほかに、リジン、アルギニン等のア
ミノ酸を生産する変異株も含まれる。 アミノ酸生合成に関与する遺伝子を単離する方法は、コ
リネホルム細菌のうちより健全なアミノ酸生合成に関与
する遺伝子を有している株よシ、まず染色体遺伝子を抽
出しく例えばＨ，５ａｌｔｏ　ａｎｄに、　Ｍ４ｕｒａ
　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７
２６１９　（１９６３）の方法が利用できる）、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネホルム細菌
で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組
換えＤＮＡを用いてコリネホルム細菌のアミノ酸要求性
変異株を形質転換せしめ、アミノ酸要求性を消失するに
いたった菌株を単離し、それよυアミノ酸生合成に関与
する遺伝子を分離できる。 染色体遺伝子を、切断するには切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば巾広い鍾類の制限酵素が使
用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
＃ｌ菌則胞内において増殖し得るものであればどのよう
なものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。 （１）　　ｐＡＭ　３３０　　　特開昭５８−６７６９
９参照（２）ｐ出（１５１９４９開昭５８−７７８９５
参照（３）　　ｐＡＪ　６５５　　　特開昭５８−１９
２９００参照（４）　　ｐＡＪ　６１１　　　特開昭５
８−１９２９００参照（５）　　ｐＡＪ　１８４４　　
特開昭５８−１９２９００参照コリネホルム細菌細胞内
で増殖可能なプラスミドのその他の例としてはｐＣＧ　
１　（％開昭５７−１３４５００　　）、ｐＣＧ　２　
（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ　４　、　ｐＣＧ
　１１　（特開昭５７−１８３７９９　）がある。 これらのシラスミドのうち２種類以上のプラスミドを用
いれは本発明の目標を達することができる。 ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限１８素により切断され、または染色体ＤＮＡ切
断フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞ
れの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを接続せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体
ＤＮＡフラグメントとのライビーフ３フ反応に付される
。 このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクターグラ
スミドとの組換えＤＮＡをコリネホルム細菌に属する受
容菌へ導入するには、エシェリヒア・コリに−１２につ
いて報告されている様な（Ｍａｎｄｅｌ　７Ｍ、　ａｎ
ｄ　Ｈｉｇａ　、　Ａ、　、　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
−、５３，１５９（１９７０））受容菌細胞を塩化カル
シウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法、またはバ
チルス・ズブチリスについて報告されている様に（Ｄｕ
ｎｃａｎ　＊　Ｃ−Ｈ−・Ｗｉｌｓｏｎ　、Ｇ、Ａ、　
ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　ｒＦ、Ｅ、　＋Ｇｅｎｅ　ｒ　１
　＋　１５３（１９７７））細胞がＤＮＡを取シ込み得
る様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）に導
入する方法により可能である。あるいは、ノクチルス・
ズブチリス、放線菌類および酵母について知られている
様に（Ｃｈａｎｇ　！　Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｈｏｅｎ　＊
　８．Ｎ、　＋　Ｍｏ１ｅｃ　。 Ｇｅｎ、Ｇｅｎ５ｔ、＋　１６８．１１１　（１９７９
）：Ｂｉｂｂ＋Ｍ、Ｊ−＋Ｗａｒｄ　＊Ｊ、Ｍ、　ａｎ
ｄ　Ｈｏｐｗｏｏｄ　、　０．Ａ、＋Ｎａｔｕｒｅ　ｒ
　２７４　＋　３９８（１９７８）　：　Ｈｌｎｎｅｎ
　、Ａ、＋　Ｈｌｅｋｓ　、　Ｊ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｆｉ
ｎｋ　ｒＧ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ　、７５　１９２９（１９７８）　）、Ｄ
ＮＡ受容菌を、グラスミドＤＮＡを容易に取シ込む７０
ロトグラストまたはスフェロプラストにしてシラスミド
をＤＮＡ受容菌に導入することも可能である。 プロトグラスト法では上記のノ々チルス・ズブチリスに
おいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ること
ができるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたゴ
リネパクテリウムＦ４またはブレビバクテリウム属のグ
ミトゲラストにポリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをと
り込ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコ
ールまたはポリビニルアルコールのかわシに、カルピキ
シメチルセルロース、デキストラン、フィコール、クル
０ニツクＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡ
のとシ込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる
。 アミノ酸生合成に関与する遺伝子がベクタープラスミド
に接続された組換えＤＮＡを有する菌株を得るには、ア
ミノ酸要求株を受容菌として、上記のように組換えたＤ
ＮＡを形質転換してアミノ酸要求性が消失したような形
質転換株を分離すればよい。該アミノ酸生合成に関与す
る遺伝子の導入によりアナログ耐性などの形質が付与さ
れる場合にはその形質をアミノ酸要求性形質のかわ夛に
指標としても容易に目的の組換えＤＮＡを含む形質転換
株が得られる。 上記のようにして得られた形質転換株よりアミノ酸生合
成に関与する遺伝子が接続された組換えＤＮＡを分離し
、上記と同様にして得られたアミノ酸生合成に関与する
他の遺伝子が接続されたような組換えＤＮＡを有する菌
株に導入すれば、効率よくアミノ

【設を生産する菌株を
得ることができる。 組換えＤＮＡを単錐する方法は、例えば菌体をリゾチー
ムＳＤＳ処理により溶菌させ、フェノール処理ののち、
２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収する。 偵数のプラスミドを導入するには、−個づつを順次上記
のような方法によシ導入するのがよいが、複数個を混合
して導入してもよい。 上記のようにして得られた複数の組換えＤＮＡを有する
形質転換株はそれ自体が各毬のアミノ酸を生産する場合
が多いが、より生産性の高いアミノ酸生産菌を得るには
、所望のアミノ酸ｌよシ生産性の高い菌株を用いて組換
えＤＮＡによシ形質転−換すれば良い。組換えＤＮＡ受
容菌として、例えば、代表的なものを例示すればリジン
生産菌を得たい時にはホモセリン要求菌、５−（２−ア
ミノエチール）システィン耐性株等を用いる。アルギニ
ン生産においては２−チアゾールアラニン耐性菌、スレ
オニン生産においてはαアミノβヒドロキシ・ぐレリア
ン酸耐性株イソロイシン生産においてはαアミノβヒド
ロキシパレリアン酸耐性株、ゾロリン生産においては、
２−４デヒドログロリン酸性株、グルタミン酸生産にお
いては、ケトマレイン酸耐性株等が用いられる。 得られ、＋、Ｌ−アミノ酸生産菌を培養する方法は、従
来のＬ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即
ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に
必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含
有する通常のものである。 炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖
密等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、
アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地の声及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ−アミノ酸の生産蓄積が停止するまで行
なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−アミノ酸が生成蓄積さ
れる。培養液よシム−アミノ酸を採取する方法は通常の
方法が適用できる。 実施例１ （１）　　Ｐ　ＥＰＣ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９を１１のＣＤ、ｌＧ培地（ペグトン１　？／ｄ
ｉ。 酵母エキス１？屑、グルコース０．５　ｆ／ｄｉ　１及
びＮａＣｔｏ、５に包を含み、−７，２に調整したもの
）に植菌し、３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム・ＳＤＳ
で溶菌させたのち、通常のフェノール処理法により、染
色体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．５９のＤＮＡを
得た。 （２）　　ベクターＤＮＡの調製 １９２９００参照）から次の様にして調製した。 ｐＡＪ　６５５は、ブレビバクテリウム・ラクト７アー
メンタムＡＴＣＣ１３８６９が有していたｐＡＭ３３０
よ勺得られたものである。 １００μ？〜を含むＣＭＧ寒天培地（ペプトン１０Ｍ、
酵母エキス１０１−／ｌ、グルコース５１−／ｌ、Ｎａ
Ｃ２５？／ｌ　、寒天２０１−／１３を含み−７，２に
調製したもの）上で生育不可能であるが、本醒をＣＭＧ
培地で培養し、クロラムフェニコール１００μｆ７ｈｔ
　ｆ含むＣＭＧ液体培地に３０℃で一晩培養後、同濃度
のクロラムフェニコールを含むＣＭＧ培地に適当量塗布
し、３０℃１〜２日間培養することによシクロラムフェ
ニコール１００μｆ７ｆｎｌに耐性を示す株を１採得た
。本株のクロラムフェニコール耐性度をＣＭＧ培地で調
べたところ２００μｆ、ＡＩまで耐性を示した。 上記の結果、得られたクロラムフェニコール高４度耐性
株からｐＡＪ　４３　ＤＮＡを次のようにして調製した
。まず本株をクロラムフェニコールを１０ｐｆ／ｍｌ含
む１１のＣＭＧ液体培地に接種し、３０℃で対数増殖期
後期まで培養し、集菌した。常法によシリゾチームとＳ
ＤＳによシ溶菌せしめた後、３０．０００　Ｘ、Ｐ、３
０分の超遠心によシ上清を得た。 これにポリエチレングリコール（最終濃度１０チ）を添
加してＤＮＡを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をト
リス・ＥＤＴＡ−ＮａＣｔバッファ　−（ＰＨ８，０）
１０ゴに溶解した。ＤＮＡをリボヌクレアーゼで処理（
！Ｊ　ｇヌクｖ７−−Ｗ　１５０　μ？／ｍテ３７℃、
３０分間反応）後、フェノール抽出し、ついで２倍量の
エタノールを加え一２０℃でＤＮＡを沈澱させ、沈澱物
を１４のトリス・ＥＤＴＡ−ＮａＣＬバッファーに溶解
した。このＤＮＡ溶液をアガロースダル電気泳動法（電
圧ダル１１当、９５Ｖ　、１５時間）によって最終１５
０μ？の純粋なｐＡＪ　４３グラスミドＤＮＡを分画採
取した。 ｐＡＪ　４３　ＤＮＡの性質は次のとおシである。 ｐＡＪ　４３の分子量の決定はアガロースダル電気泳動
によった。 アガロースダル電気泳動はシャープ（Ｐ、Ａ。 ５ｈａｒｐ　）らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
１２　＋　３０５５（１９７３））によシ、０，８チｒ
ルを用い、ダル長さ二当シ、５ｖで１５時間、定電圧で
泳動した。 分子量はｐＡＪ　４３を１ケ所切断する制限酵素Ｈｉｎ
ｄ■０．５ユニットをｐＡＪ　４３　、０．５μｆＱｃ
３７℃、１時間反応させ、切断し、直線状にした後、分
子量既知の分子量マーカー、λファージのＨ１ｎｄＩＩ
Ｉフラグメン）　（ＢＲＬから購入）との移動度の比較
によって算出し、３．４Ｍｄと計算された。 制限酵素切断後のＤＮＡ断片をアがロースダルｉ二気泳
動で解析した結果、ｐＡＪ　４３はｐＡＪ　６５５から
ｉｎ　ｖｉｖｏでｄｅｌｅｔｉｏｎ　　によシ生じたｐ
ＢＲ３２５のクロラムフェニコール耐性遺伝子領域を含
む約ＩＭｄとｐＡＭ３３０の複製維持に必須の領域を含
む約２．４Ｍｄのフラグメントから成る小型シラスミド
であることが判明した。 （３）染色体ＤＮＡ　ｌｉ片のベクターへの挿入（１）
で得た染色体ＤＮＡ　２０　＃と（２）で得たゲラスミ
）’　ＤＮＡ　１０μｍとを制限エンドヌクレアーゼ）
Ｉｉｎｄ■でそれぞれを３７℃、１時間処理し、完全を
て切断した。６５℃、１０分の熱処理代、両反志液を混
合し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファ
ージ由来のＤＮＡ　ＩＪガーゼによって１０℃、２４時
間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。６５℃、５分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了
後のＤＮＡを沈澱採取した。 （４）　　ＰＥＰＣ、ａ公子のクローニングＰＥＰＣ活
性が５０％に減少したブレビバクテリウム・ラクト７ア
ーメンタム（ＡＪ　１２０６１　）を受容函として用い
た。 形質転換の方法としては、ゾロドプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５ｒＩＬｌのＣ
ＭＧ液体培地で対数増殖期の初期まで培巷し、ペニシリ
ンＧを０．６ユニツト／コ添加後、さらに１．５時間振
盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５　
Ｍシェークロース、２０ｍ１４マレイン酸、２０ｍＭ塩
化マグネシウム、３．５１ｒ−’？ナッセイプロスＪ　
（Ｄｉｒｃｏ　）からなるＳＭＭＰ培Ｍ　（ｐＨ６，５
）０．５ｄで洗浄した。次いで１０ψｇのリゾチームを
含むＳＭＭＰ培地に懸濁し３０℃で２０時間プロドグ２
スト化を図った。６０００Ｘ４．１゜分間遠心分離後、
プロトプラストをＳＭＭＰで洗浄し０．５ＭのＳＭＭＰ
に再度懸濁した。この様にして得られたプロトシラスト
と（３）で調製したＤＮＡｌ０μ？を５　ｍＭ　ＫＤＴ
Ａ　存在下で混合し、ダリエチレングリコールを最終濃
度が３０チになる様に添加した後、ＤＮＡをプロトシラ
ストに取シ込ませる為に室温に２分間放置した。このプ
ロトシラストをＳＭＭＰ培地ｌゴで洗浄後、５ｙｒｂｔ
ｉｐ　ＪＩ地１４に再懸濁し、形質発現の為、３０℃で
２時間培養した。この培養液を声７．０のプロトゲラス
ト再生培地上に塗布した。 プロトシラスト再生培地は蒸留水１１あたシトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン１２ｉＰ。 ＫＣｌ　Ｏ，５、Ｐ、グルコース１０　ｉＰＸＭｇＣ４
２・６Ｈ２０８、１ｙ−１ＣａＣ２ｚ　’　２Ｈ２０２
，２ｉＰ％　’プトン４ｆ１粉末酵母エキス４ノ、「カ
ブミノ酸Ｊ　（Ｄｉｒｃｏ社）１？、Ｋ２ＨＰＯ４０，
２ｉ！−、グルタミン酸１０ノ、ビオチン５００μ？、
コハク酸ナトリウム１３５ｆ１寒天８？及びクロラムフ
ェニコール３μＭを含む。 ３０℃で２週間培養後、約５００個のクロラムフェニコ
ール耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン
酸を含まない培地（Ｇｌｕ欠培地：２％グルコース、１
％硫酸アンモニクム、０．２５チ尿素、０．１チシん酸
二水素カリウム、０．０４チ硫酸マグネシウム７水塩、
２　ｐｐｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンがンイオン、２００
μｌ−／ｌサイアミン塩酸塩、５μ？／ｌビオチン、ｐ
ｉ（７，０、寒天１．８％）にレプリカし、クロラムフ
ェニコール耐性でかっグル（５）形質転換株のプラスミ
ド解析 ＡＪ１２０６６を（２）で述べた方法によ多、溶菌液を
調製シ、アがロースダル電気泳動法によシ、プラスミド
ＤＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡＪ＝１３よシ
も明らかに大きな分子量１０８５メがダルトンのプラス
ミドが検出された。この組換えプラスミドをｐＡＪ　２
００と名付けた。 （６）　　再トランスホーメーシ冒ン （５）で検出された７、　１メガダルトンのＤＮＡ！ｇ
ｒ片を含む組換え！ラスミド上にＰＥＰ　Ｃ遺伝子が存
在することを確認するためこのプラスミドＤＮＡ　ｆ、
用いブレビバクテリウム・ラクト７アーメンタムＡＪ１
２０６１を再度、形質転換した。 生シタクロラムフェニコール耐性コロニーノウちそれぞ
れ３０個を釣シ上げグルタミン８要求法をしらべると、
すべてのコロニーについて要求性が回復しており、上記
の組換え！ラスミド上にＰＥＰＣＪ：云子が存在するこ
とが明らかとなった。 （７）安定化プラスミド保持株の採取とプラスミー　　
　ド解析 上記シラスミドは、非常に不安定であったので小型化し
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。 コリネ型細菌のゾロトゾラスト形質転撲では分子量の大
きいグラスミドを菌体内に導入すると、ＤＮＡ鎖の一部
脱落をおこしグラスミドが小型化することがあシ、再形
質転換株１００株のグラスミド検索をおこなった。その
結果、８株中に小型化シラスミドが検出された。これら
小型化グラスミドは、菌株に安定に保持された。そのう
ち１株よシブラスミドを大量に調製し、ｐＡＪ　２０１
と名付けた。 （８）ＨＤ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の
α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性突然変異株Ａ
Ｊ　１１１８８　（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０　）（特公昭
５６−３０３８）を１１のＣＭＧ培地（−！））　ｙ　
１１／ｌｉｐ　、　酵母エキス１１７ｄｔ、グルコース
０、５１／ｄｉ　、及びＮａＣ６０，５１１／ｄｉを含
み、ｐ＋−１７，２に調整したもの）に植菌し、３０℃
で約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集め
た。この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、
通常のフェノール処理法によシ、染色体ＤＮＡを抽出精
製し、最終的に３．６■のＤＮＡを得た。 （９）ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ　１８４４　（特開昭５８−１９
２９００参照）（分子量５．４メガダルトン）を用い、
そのＤＮＡを次の様にして調製した。 ｐＡＪ　１８４４は、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８が有していたプラスミドｐＨ，Ｍ
　１５１９よシ誘導されたものである。 まずｐＡＪ１８４４をプラスミドとして保有するブ接種
し、３０℃で対数増殖期後期まで培養したのち、リゾチ
ームＳＤＳ処理によシ溶菌させ、　３０，０００×ｙ３
０分の超遠心によシ上清を得た。フェノール処理ののち
、２容のエタノールを加えてＤＮＡヲ沈澱回収し、ｐＡ
Ｊ　１８４４プラスミドＤＮＡ約８０μＩを得た。 αＱ　染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（８）で得
た染色体ＤＮＡ　４０μＩを、制限酵素Ｐｇｔｉ。 ０、１２４ユニツトで３０℃、１０分間部分消化した０ （９）で得たシラスミドＤＮＡ　１０μＩは制限エンド
ヌクレアーゼＰｓｔ　ｌで３７℃、２時間処理し、完全
に切断した。６５℃１０分の熱処理後、両反応液を混合
し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡ　ＩＪガーゼによって２２℃、１５時間
ＤＮＡ　釦の連結反応を行った。６５℃５分の熱処理後
、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後
のＤＮＡを沈澱採取した。 ａυ　ＨＤ遺伝子のクローニング 遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＪ　１２０１９　（ＮＲＲＬＢ　−１５３４６
）を受容菌として用い几。（４）で述べた方法で形質転
換をおこなった口 ３０℃で１０日間培養後、クロラムフェニコール耐性で
あってかつホモセリン要求性が消失しｔＡＪ　１２０２
０　（ＦＥＲＭ−ＢＰ２６９　）を得た。 α２　形質転換株のプラスミド解析 これらの株より（２）で述べた方法によシ、溶菌法を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドＤ
ＮＡを検出したところ、７．６４Ｍｄのプラスミドを検
出し、ｐＡＪ　２１０と名づけた。 ａ〜　カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
とプラスミドｐＡＪ　２０１への挿入プラスミドｐＵＣ
４Ｋ　（Ｖｅｒｌｅｒａ、　Ｊ　ａｎｄ　ＭｅｓｌＩｉ
ｎｇ。 Ｊ　Ｇｅｎｅ　１９：２５９１９８２−ファルマシア社
より購入）２０μｇに、２０ユニツトの制限酵素Ｂａｍ
　Ｈｌ　”Ｘ３７℃で２時間反応させ、完全に消化した
。アガロースゲル電気泳動によシカナマイシン耐性遺伝
子を含むＤＮＡ断片約１４００塩基対を分離し、精製し
た〇 （７）でイぴたン０ラスミドｐＡＪ　２０１　ＤＮＡ２
μＩを制限酵素Ｂｇｔ　ｉで完全に切断した。このＤＮ
Ａとカナマイシン面ｊ性遺伝子を含むＤＮＡ断片を混合
し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼにより１０℃、２４時間ＤＮＡ
鎖の連結反応を行った。６５℃、５分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて、連結反応終了後のＤ
ＮＡを沈澱採取した。 得られたシラスミドＤＮＡを（４）に記載した形質転換
法によシブレビパクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
Ｊ　１２０３６　（ＦＥＲＭ−Ｐ　１５４４　）に導入
した。 プロトプラスト再生培地は蒸留水１１あｆｃ、ＤｉＪス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン】２Ｉ。 ＫＣｌ　Ｏ，５１、ｌ’にコース１０１　ｓ　ＭｇＣｌ
２”６Ｈ２０Ｂ、１．９　、　ＣａＣｚ２”２Ｈ２０２
，２、！ｉ’、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４１１カ
デミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１１１に２ＨＰＯ４０，２，
９％　りｋ　ｌ’ミン９１０！！、ビオチン５００μＩ
、コハク酸ナトリウム１３５Ｆ、寒′天８９及びカナマ
イシン７５μｉ　／ｎｌ　ヲ含ｔｒ。 ３０℃で２週間培養したところ、１０株のカナマイシン
耐性コロニーが出現してきた。これらの株よシ溶菌液を
調製しく９）で述べた方法によシアガロースダル電気泳
動によってシラスミドＤＮＡを検出したところ、明らか
にｐＡＪ　２０１より大きいプラスミドが検出された。 このプラスミドをｐＡＪ　２０１にとした。ｐＡＪ　２
０１ＫをＰＥＰＣ活性の低下が原因でグルタミン酸要求
性を示すブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（
ＡＪ　１２０６１　）　Ｋ形質転換した。 生じたカナマイシン耐性コロニーのうち２５株をグルタ
ミン酸を含まない培地に釣シあげたところカナマイシン
耐性でかつ、グルタミン酸要求性を消失していた。よっ
てｐＡＪ　２０１に上にＰＥＰＣ遺伝子が存在し発現す
ることを確認した。 Ｃａ　形質転換株のスレオニン生産能 ｐＡＪ　２１０を形質転換法によシ、スレオニン生産菌
、α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性突然変異株
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１１
１８８　（ＦＥＲＭ−Ｐ４１９０　）中に導入し、形質
プラスミドＰＡＪ　２０１ＫをｐＡＪ　１２０２１に導
入し、クロラムフェニコール耐性かつカナマイシン耐性
で選択し、二種のプラスミドｐＡＪ　２０１にとｐＡＪ
　２１０を含むＡＪ　１２１６７　（ＦＥＲＮ−Ｐｑ９
”／ｑ　）を得た。 ＡＪ　１１１８８株、ＡＪ　１２０２１株及びＡＪ　１
２１６７株をスレオニン生産培地（グルコース１０１１
７ｄｔ　。 （ＮＨ４）２Ｓｏ４３　Ｅｌ／ｄｉ　、　ＫＨ２ＰＯ４
０，１１１／ｄｉ　、　ＭｇＳＯ４◆７Ｈ２００，０４
１／ｄｔ　、　ＦｅＳＯ４”７Ｈ２０１０ｍｇ　、　Ｍ
ｎＳＯ４’５Ｈ５Ｈ２Ｏ１０，チアミ７−　ＨＣｌ　３
００　ｔｔｌｉ／ｌ　、ビオチン１００μｌ／ｌ！　、
大豆蛋白酸加水分解液（「味＃Ｊ）４５　ｍ９７ｄ１．
（全窒素として）、イアｏイシ：ｙ　２５　ｍ９／　ｄ
ｉ　、　ｏイレン３０ｍ９／ｄｉ　、　ｐＨ７，Ｑ　、
　ＣａＣＯ３５ｇ／ｄｔ（別に殺菌した）３０℃にて７
２時間振盪培養した。培養後、遠心上清中のし一スレオ
ニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。その結
果を第１表に示した。 第１表 （１５１ｐＡＪ　２１０を、形質転換法たより、コリネ
バクテリウム・グルタミン酸のホモセリン要求株ＡＴＣ
Ｃ１３２８７に導入し、　ＳＲ８３０１（ＮＲＲＬ　Ｂ
−１５３４８）株を得た。これに更にｐＡＪ　２０１Ｋ
を形質転換し、カナマイシン耐性かつクロラムフェニコ
ール耐性で選択し、ｐＡＪ　２１０とｐＡＪ　２０１に
両者を含むＡＪ　１２１６８（ＦＥＲＭ　−Ｐ　ｒｙｇ
ｇｏ　）を得た。■のスレオニン生産培地にて、同様に
、スレオニン生産を行った。培巷後遠心上清中のＬ−ス
レオニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。結
果を第２表に示した。 第　　２　　表 実施例２ トリプトファンシンターゼ遺伝子を有するプラスミドと
３−デヒドロキナ酸シンターゼ及びシキミ酸キナーゼ遺
伝子を有するプラスミドの共存によるＬ−）リプトファ
ンの生産 １　シキミ酸キナーゼ（ＳＫ）遺伝子及び３−デヒドロ
キナ酸シンターゼ遺伝子のクローニング１−１　　供与
体ＤＮＡの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１１
２２５　（ＦＥＲ’＋−Ｐ４３７０　）を１１　ノＣＭ
Ｇ培地（ペプトン１１／ｌｚｅ、酵母ｘ　キス１　、！
ｉ’　／　ｄ７！、クルコー、ｘ、　０．５１　／　ｄ
ｌ及びＮａＣ４０，ｓ　ｉ／ｄｉを含み、ＰＨ７，２に
調製したもの）に植菌し、３０℃で振盪培養を行ない、
対数増殖期の菌体を集めた。この菌体を＋）シー！−ム
・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常のフェノール処理法に
より、染色体ＤＮＡを抽出精製し、最終的に３．５ｒｎ
９のＤＮＡを得た。 １−２　　ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ　１８４４　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｌａ　ｃｏｌｉＡＪ　１１８８３　ＦＥＲＭ−ＢＰ１
３７として寄託されている。）（分子量５．４メガダル
トン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。 まずｐＡＪ　１８４４をプラスミ・ドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１２０
３７を１００ｍ１のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理に
よシ溶菌させ、３０，０００　Ｘ　９　、３０分の超遠
心により上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエ
タノールを加えてＤＮＡを沈澱回収し友。これを少量の
ＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ　）リス塩酸塩、２゜ｍＭ　Ｎ
ａＣ１、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶解後、ア
ガロースダル電気泳動にかけ分離後、切シ出し、てｐＡ
Ｊ１８４４プラスミドＤＮＡ約１５μｇを得た。 １−３　　染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得た染色体ＤＮＡ　１０μｙと（２）で得たプラスミ
ドＤＮＡ　５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌ
でそれぞれを３７℃に１時間保持し、完全に切断した。 ６５℃に１０分間加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴ
Ｐ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来の
ＤＮＡ　リガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮ
Ａ鎖を連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５分
間加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結さ
れたＤＮＡの沈澱を採取した。 １−４　８に遺伝子のクローニング ゾレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子が欠損したブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪローＮ−二トロ
ソグアニジンにより変異処理することによυフェニルア
ラニン、トリプトファン。 チロシンの３アミノ酸を生育に要求する変異株として選
択した。）を受容菌として用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５−〇〇ＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニツト／コ添加後、さらに１．５時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５　Ｍシュ
ークロース、２０　ｍ＋ＭマレインＣ（１２，２０ｍＭ
塩化マグネシウム、３．５％ベナッセイブロス（Ｄｌｆ
ｃｏ　）からなるＳＭｂｉＰ培地（ｐＨ６，５）０、５
　ｍｌ　テ洗浄した。ツイテ１０１ｎ９７ｍ１Ｆ）リゾ
チームを含むｓｈＩＭｐ培地に懸濁し３０℃で２０時間
プロトシラスト化を図った。６０００Ｘ、９，１０分間
遠心分離後、プロトプラストをｓｒ割ｐで洗浄し、０．
５ｍｌのＳＭＭＰに再度懸濁した。　この様にして得ら
れたプロトプラストと１−３で調製したＤＮＡｌ０μｇ
を５ｍＭ　ＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最Ｐ：濃度が３０％になる様に添加した後、Ｄ
ＮＡをプロトプラストに取シ込ませる為に室温に２分間
放置した。このプロトプラストをＳＭＭＰ培地１ゴで洗
浄後、ＳＭＭＰ培地１　ｒｎｔに再懸濁し、形１１発現
の為、３０℃で２時間培養した。この培養液を声７，０
のプロトプラスト再生培地上に塗布した。 プロトプラスト再生培地は蒸留水１１あたｆｉ　）　Ｉ
Ｊス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２ｙ１ＫＣ１
０，５Ｎ　、グルコース１０　Ｎ　、　ＭｇＣｌ２・６
Ｈ２０８，１１、ＣａＣ７２’２Ｈ２０２，２ｆｉｌ、
ペグトン４１　ｓ粉末酵母エキス４Ｆ、カザミノ酸（Ｄ
ｌｆｃｏ社）Ｉｌｌに２ＨＰＯ４０，２、ｌｉ’　、コ
ハク酸ナトリウム１３５，９．寒天８Ｉ及びクロラムフ
ェニコール３μｇ／ｒＩＬｌヲ含ム。 ３０℃で２週間培養後、約２５０００個のクロラムフェ
ニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれを最少培
地（２％グルコース、ＩＸ硫酸アンモニウム、０．３　
Ｘ尿素、０．１Ｘシん酸二水素カリウム、０．０４　Ｘ
硫酸マグネシウム７水塩、２　ｐｐｍ鉄イオン、２　ｐ
ｐｍマンガンイオン、２００μｉ／１サイアミン塩酸塩
、５０μ、９／１１ビオチン、クロラムフ、　ニコー／
ｌ／　ｌ　Ｑ　ｐｉ　／ｍｌ　、　ｐＨ７，Ｑ　、寒天
１．８Ｘ）にレグリカし、クロラムフェニコール耐性で
かつフェニルアラニン、トリットファン、チロシン要求
性の消失しｆｃ５株を得た。 １−５　　形質転換株のプラスミド解析これらの株より
１−２で述べた方法により、溶菌液を調表し、アガロー
スゲル電気泳動法により、プラスミドＤＮＡを検出した
ところ、２株でベクターのｐＡＪ　１８４４よシも明ら
かに大きなプラスミドが検出された◎ ５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制限酵素Ｐ
ｓｔ　ｌで切断すると全てのプラスミドに共通な２．９
ｋｂ、０ＤＮＡＤＮＡ断片上められた。従ってＳＫ遺伝
子は２．９　ｋｂ、のＰｓｔ　（ＤＮＡ断片上に存在す
ると思われる。ベクターｐＡＪ　１８４４のＰｓｔ　ｌ
切断点に２．９ｋｂ、のＤＮＡ断片が挿入された組換え
プ１−６　　再トランスホーメーション １−５で検出された２、９キロベースのＤＮＡ断片を含
む組換えシラスミド上にＳＫ遺伝子が存在することを確
認するためこのプラスミドＤＮＡ　ｐＡＪ　９２７を用
い、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　
１２１５７を再度、形質転換した〇生シたクロラムフェ
ニコール耐性コロニーノウちそれぞれ１０個を釣シ上げ
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン要求性を
テストしたところ、これらのいずれも要求性が消失して
ｉ−Ｂ、上記の組換えプラスミド上にＳＫ遺伝子が存在
することが明らかとなった。 １−７　　ｐＡＪ　９２７上の３−デヒドロキナ酸シン
ターゼ遺伝子の同定 ＰＡＪ　９２７を大腸菌に一１２株由来の３−デヒドロ
キナ酸シンターゼ欠損株ＡＢ　２８４７　（Ｊ、　Ｐｉ
ｔｔａｒｄｅｔ、　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、　１４９４．９１．１９６６　）に形質転換した
。 ＡＢ　２８４７へのｐＡＪ　９２７の導入方法は、ＤＮ
Ａ受容細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性
を増す方ｒ去を用いた。 生シタクロラムフェニコール耐性コロニーノウち１０個
を釣す上げフェニルアラニン、チロシン、トリプトファ
ンの要求性を調べた。 その結果すべてのコロニーが全ての要求性を消失してい
た。従ってｐＡＪ　９２７にはＳＫ遺伝子、３−デヒド
ロキナ酸シンターゼ遺伝子が２．９ｋｂ、の挿入Ｐ＋ｓ
ｔ　ｌＤＮＡ断片上にクローニングされていることが明
らかとなった。 ２、　ＳＫ遺伝子、及び３−７′ヒドロキナ酸シンター
ゼ遺伝子を有する２、９　ｋｂ、　Ｐａｔ　Ｉ　ＤＮＡ
断片のｐＡＪ　２２６への移し変え ２−１トリメトプリム耐性を有するベクタープラスミド
ｐＡＪ　２２８の造成 （１）　　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＪ　１２０３６よシ変異訪導されたトリメトプリム耐
性変異株ＡＪ　１２１４６　（ＦＥＲＭ−Ｐ７６７２　
）を１ｄＯＣＳＸ；培地（ペプトンＩｌｌｄ１．酵母エ
キスＩｌｌ／ｄｉ。 グルコース０．５　、Ｐ　／ｄｌ　、及びＮａＣ１０，
５９／ｄｌを含み、Ｐ）′１７．２に調整１．［もの）
Ｋ植菌し％３０℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増
殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで
癌菌でせたのち、通常のフェノール処理法によ）、染色
体ＤＮＡを抽出ＦＲ製し、最終的に３．０　ｍ９のＤＮ
Ａを得た。 （２）ベクターとしてｐＡＭ　３３０を用いた。ｐにン
１３３０は次の様にして調製した〇 まずｐＡＭ　３３０をプラスミドとして保有するブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６
９を１００ｍ１のＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理によ
り溶菌させ、３０，０００　Ｘ　、Ｆ　３０分の超遠心
により上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈澱物として回収した。これを
少量のＴＥＮ緩衝液（２０ｍＭ　トＩＪス塩酸塩、２０
ｍＭ　ＮａＣ２％１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）
に溶解後、アがロースグル電気泳動にかけ分離後、切ス
ミドＤＮＡ　Ｉ　Ｏμｙとを制限エンド９ヌクレアーゼ
Ｍｂｏ　ｌでそれぞれを３７℃、３０分間処理し、部分
切断した。６５℃、１０分の熱処理後、両反応液を混合
し、ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファー
ジ由来のＤＮＡリガーゼによって１０℃。 ２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行った。６５℃、５分の
熱処理後、反ら液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。 （４）トリメトプリム耐性のブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムＡＪ　１２０３６を受容菌として用い
た。 形質転換の方法としては、１−４で述べた方法を用いた
。トリメトプリム（Ｓｉｇｍａ社）　２５　ｔｌｉ／ｍ
／！な含む再生培地にて、３０℃で１週間培善後、約１
００個のコロニーが出現してきたので、これをトリメト
プリムを含む最小培地（２％グルコース、１夕（硫酸ア
ンモニウム、０．２５Ｘ尿素、０．１９６’りん酸二水
素カリウム、０．０４５ぎ硫酸マグネシウム７水塩％２
ＰＰｍ鉄イオン、２ｐｐｍマンガンイオン、２００　ｐ
ｉ／ノサイアミン塩酸塩、５０μｌ／ｌビオチン、ｐＨ
７，０％寒天１．８％、トリメトプリム５０μｊｌ／ｍ
ｌ）にレプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た〇 （５）　　これらの株よシ１−２で述べた方法により、
溶函液を調製し、アガロースゲル電気泳動法によシ、プ
ラスミドＤＮＡを検出したところ、ベクターのｐＡＭ　
３３０よシも明らかに大きなプラスミドが検出され友。 この株をＡＪ　１２１４７　（ＦＥＲＭ　−Ｐ７６７３
　）と名付けた。 ｆ６）　　ＡＪ　１２１４７が有するプラスミド（ＰＡ
Ｊ　２２８　）上にトリメトプリム耐性遺伝子が存在す
ることを確認するため、このプラスミドＤＮＡを用いブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ　１２０
３６を再度、形質転換した。 生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ１０ｇを釣り上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドＤＮＡを検出したところ、これらのいずれにもｐ
ＡＪ　２２８と同じ大ききのプラスミドが存在していた
。上記組換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現
する遺伝子が存在することが明らかとなった０ ２−２　　ｐＡＪ　２２８　ヘのＰｓｔ　ｌリンカ−の
挿入ｐＡＪ　２２８　ＤＮＡ　０．５μ夕を制限エンド
ヌクレアーゼＨｐａ　Ｉで３７℃、１時間処理し、完全
切断した。 ７０℃、５分の熱処理後、ｐＰｓｔ　ｌリンカ−（宝酒
造）　Ｉ　Ａｌｌ　（１００ｐｍｏｌｅ　）と温合し、
ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由
来のＤＮＡりが−ゼ（宝酒造）によって１６℃、−晩Ｄ
ＮＡ鎖の連結反応を行なった。７０℃、５分の熱処理後
。 反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後の
ＤＮＡを沈澱採取した。このＤＮＡを用い、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６を形質
転換後、生じたトリメトプリム耐性コロニーからランダ
ムに５個を選び溶菌液を調製ｔ、、制限エンドヌクレア
ーゼＰｓｔｌｌＯユニ、トを３０℃、１時間反応させた
。各ＤＮＡを０．８　Ｘアガロースゲル電気泳動にかけ
、分子量既知のλファージのＨｉｎｄｌｌ［フラグメン
）　（ＢＲＬ社）との移動度を比較したところ、Ｐａｔ
　［で１ケ所に切断される分子量５．１　Ｍｄのプラス
ミドを１個倹田した。このプラスミドを１−２で述べた
方法により、調製後、各種制限エンドヌクレアーゼを反
Ｃｉせたトコ口、Ｈｐａｌで切断されず、Ｐｓｔ　ｌで
一ケ所に切断され、ＢｃｔＩ、　ＢｓｔＥｌ［、Ｈａｅ
ｌｒ、ＨｌｎｄｌＨ，Ｍｌｕ　Ｉなど他の者、’ＪｔＭ
エンドヌクレアーゼによる切断箇所はｐＡＪ　２２８と
同じであった。以上の結果から、ｐＡＪ　２２８のＨｐ
ａＩ切断部位にＰｓｔ　ｌ　ＩＪメンーが挿入でれたこ
とを確認し、このプラスミドをｐＡＪ　２２６と名付け
た。 ２−３　１）ＡＪ　９２７の２．９　ｋｂ、　Ｐｓｔ　
ｌ　ＤＮＡ断片のｐＡＪ２２６のＰｓｔ　ｌサイトへの
移し変えｐＡＪ　９２７５μＩを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで
完全に切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ２．９ｋ
ｂ、のＰｓｔｌＤＮＡ断片をグルから切シ出し、フェノ
ール処理、クロロホルム処理後、２倍容のエタノールを
加えてＤＮＡを沈澱物として回収した。一方ｐＡＪ　２
２６２μＩを同酵素で完全に切断し、６５℃、１０分間
の熱処理後、２倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱
物として回収した。回収した両ＤＮＡを各々２０μｌの
ＴＥＮ緩衝液に溶解し両者を混合後、ＡＴＰ及びジチオ
スレイトール存在下ｂ　Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ　Ｉ
Ｊガーゼによって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ鎖を連
結せしめた。ついで反応液を６５℃にて５分間加熱し１
反応液に２倍容のエタノールを加えて連結されたＤＮＡ
の沈澱を採取した。次にＳＫ遺伝子が欠損したブレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ　１２１５７を
受容菌として、１−４で使用した形質転換法によシ上述
のＤＮＡを用いて形質転換した。トリメトプリムを１０
０μｉ　１ｍｅ含む再生培地にて、１０日間、３０℃で
培養後生じたコロニーをトリメトプリム５０μｇ／＋ｍ
７含む最少培地にレプリカしフェニルアラニン、チロシ
ン、トリシトファン要求性が消失しかつトリメトプリム
耐性を示す株を多数得た。これらの株の代表様からシラ
スミドＤＮＡ検出したところｐＡＪ　２２６よシも明ら
かに大きなプラスミドを有していた。本プラスミドを組
換えに用いた制限酵素Ｐｇｔ　（で切断したところｐＡ
Ｊ　２２６７．６　ｋｂ、以外に２．９ｋｂ、のＤＮＡ
断片が検出された。本プラスミドｔ（ｐＡＪ　１２２０
と名付けた。 ３、トリプトファンシンターゼ遺伝子のクローニング ３−１トリプトフアンシンターゼ（Ｔ　Ｓ　）　ｍ伝子
を含む染色体ＤＮＡの調製 り一トリグトファンによるフィードバック阻害に耐性を
示すＴＳの遺伝子を有するブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタムＡＪ　１２０３０　（ＦＥＲＳｉ−ＢＰ
２７６　）から１−１と同じ方法を用いて染色体ＤＮＡ
を抽出精製し、最終的に３．５　ｍ９のＤＮＡを得た・
３−２　　ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ　１８４４　（分子景５．４メガ
ダルトン）を用い、そのＤＮＡを１−２の方法を用いて
精製し、最終的に１２μｓのＤＮＡを得た。 ３−３　　染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入３−１
で得た染色体ＤＮＡ２０μｇと（２）で得たシラスミド
ＤＮＡｌ０μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで
それぞれを３７℃、１時間処理し、完全に切断した。６
５℃、１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及
びジチオスレイトール存在下％Ｔ４ファージ由来のＤＮ
Ａりが−ゼによって１０℃。 ２４時間ＤＤＮＡ鎖連結反応を行った。６５℃、５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノ−ルビ加えて連結反
応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。 ３−４ＴＳ遺伝子のクローニング ＴＳのαサブユニット（以下ＴＳＡと略す）の遺伝子が
欠損したブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムム
２１株をＤＮＡ受容菌として、３−３で調製したＤＮＡ
　１０μＩを１−４で用いた方法により、形’ｆｔ　ｋ
　ｔ−ａした。クロラムフェニコール３μｌ／ｍｌ’ｆ
含む再生培地で３０℃にて２週間培養後、約１０．００
０（［）クロラムフェニコール耐性コロニーが出現して
きたので、これをトリシトファンを含まない培地（Ｔｒ
ｐ欠培地）（２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、
０．２５夕ぎ尿素、０．１夕ぎシん酸二水素カリウム、
０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２ｐｐｍ鉄イオン
ｓ　　２　ｐｐｍマンガンイオン、２００μＩ／／ｌサ
イアミン塩酸塩、５０μ９／ｌビオチン、ＰＨ７，０、
寒天１．８９（）にレプリカし、クロラムフェニコール
耐性であってかつトリシトファン要求性が消失した菌株
３株を得た。 ３−５　　形質転換法のプラスミド解析これらの株よシ
１−２で述べた方法によυ、溶菌液を調製し、アガロー
スゲル電気泳動法により、プラスミドＤＮＡを検出した
ところ、ベクターのｐＡＪ　１８４４よシも大きなプラ
スミドを有する形質転換法１株を得、本株保有のＭＡ換
えプラスミド上にＴＳＡ遺伝子が存在することを確；Σ
した。木像をＡＪ　１２１４０　、木組換えプラスミド
をｐＡＪ　３１９と命名した＠ まｆＣｐＡＪ　３］９をＴＳのβサブユニット（以下Ｔ
ＳＢと略す）欠損のＢ−５株に４人すると上述と同様に
、トリプトファン要求性が消失することより、ＰＡＪ　
１８４４のＰ！ＩｔＩサイトに挿入された３、０ｋｂ、
フラグメント上にｔｒｐ　Ａ及びｔｒｐ　Ｂ遺伝子が存
在することがｆｉｌ明した。 ４、　　ｐＡＪ　１２２０とｐｐ、Ｊ　３１９の共存に
よるり、−トリプトファンの生産 ｍ−フルオロフェニルアラニン及び５−フルオロトリシ
トファンに耐性示す変異株ブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタムＭ２４７にｐＡＪ　１２２０とｐＡＪ　
３１９を１−（４）で用いた方法を用いて形質転換した
。 クロラムフェニコール３μｍ７ｍｅ、トリメトプリム１
００μｇ／ｍｌを含む再生培地上で１０日間３０℃にて
培養後生じたコロニーを適当に選択した。 かくして得られた株はトリメトプリムとクロラムフェニ
コールの両者に耐性を示し、プラスミドの検出結果２搾
類プラスミドｐＡＪ　３１９　、　ｐＡＪ　１２２０を
有していた。この株ＡＪ　１２１７２　（ＦＥＲＭ−Ｐ
　１７９’ｇｌ　）を培養しＬ　−）　ＩＪブトファン
生産能を調べたところ第３表に示す結果を得た。培養は
グルコ−２１３０ｇ、（ＮＨ４）２Ｓｏ４２５　、Ｐ　
％　フマル酸１２．９、酢酸３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、
ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０８ｍ９、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１
Ｎ　、ビオチン５０μ１１サイアミン塩酸塩２０００μ
＆％Ｌ−チｏ　シン６５０　ｍ９、ＤＬ−メチオニン４
００１ｖ及びＣａＣＯ３５０ｇを水１１に含むｐＨ６，
５の培地３　ｍｌを試験管ないし２Ｑｍｌを肩付フラス
コに分注したものに被検法を植え、３０℃にて７２時間
振盪下で行なった。培養後遠心上清中のＬ−）リゾトフ
ァンをマイクロバイオアッセイにより定量した。 第３表　形質転換株のトリプトファン生産面ｐＡＪ　３
１９　、　ｐＡＪ　１２２０は寄託されたＡＪ　１２１
７２シ宿主細胞を損なうことなく宿主細胞中の複合プラ
スミドを除去することが可能である。即ち、プラスミド
は宿主より自然に失われることもあるし、除去操作によ
って除くこともできる（　ＢａｃｔｓＲｅｖ、。 ３６、　ｐ３６１−４０５　（１９７２）　）。他の除
去操作の例は以下の通シである。ＡＪ　１２１７２をＣ
ＭＧ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養後、培養液を
適当に希釈し、クロラムフェニコール、トリメトプリム
を含有する、又は含有しないＣＭＧ寒天培地に塗布し、
３０℃で１〜３日間培養する。かくしてクロラムフェｔ
Ｘ’７ 千暫：補正ｉ［１ １，串ｆｌの表示 ０［イ和５９／ｒ目’ｊ　；’ｔ　！ｍ’ｉイ５２０Ｂ
Ｇ７７弓２、発明の８拘−− ｆＥｌ”ｌ”；７１ζににるｌ　？ミノ酸の１ｙ力Δ法
３、補旧いする貨 事１′１との関係　　持π）　＋ｉｘ　Ｉ預入住所　　
　東京都中央区京僑−丁１１５７ｆｉ　８弓７．７市正
の内１容 （１）明細出力２７頁１２へ一１３行目（こ記・戊の１
−プレヒバクテ−リウム、・ラクト）戸−メンタｌ＼へ
Ｊ　　１２０３６　（Ｆ　ＦＲＭ　−Ｐ　　１　、”＋
　４４　）漫を［ブレビバクゾリウム・ラクトフッ７−
メンタム、△Ｊ　　１２０３６　（Ｆ　Ｅ　ＲＭ−Ｐ　
　７５５９　）　、−ど訂正する。 （２）　明１ｆｆｌ　’ａ：第４６真下から２行目Ｌ　
７ｒｔ　Ｑ、　Ｊ）　１△Ｊ　　　１２１４］　　を　
ｒＡＪ　　　１２１４ＯＣｒ　　口　［くＭ−Ｐ　　７
７　’１９　）−１と訂正りる。 ８、添イー」占ｆｆｉの１］録

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 相互に異なる複製開始点を有する二つ以上のプラスミド
   ベクターの一方に、所望のＬ−アミノ酸の生合成系路上
   にある、１つの酵素をコードする遺伝子を挿入し、上記
   二つ以上のプラスミドベクターの他方に、上記Ｌ−アミ
   ノ酸の生合成系路上にあり、上記酵素とは異なる酵素を
   コードする遺伝子を挿入し、得られたそれぞれの組換え
   プラスミドをコリネホルム細菌の菌株の１つの細胞に導
   入して得られかつ上記Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細
   菌を培養する方法であって、上記二つ以上の酵素は、上
   記Ｌ−アミノ酸の生合成においていずれも高位の律速と
   なっているものである、発酵法によるＬ−アミノ酸製造
   法。