JPH02473A - Ｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法に関する。

さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体で、かつ両Ｄ
ＮＡの少なくとも一方が宿主菌株に対して外来性である
組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株
を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、該
遺伝子の形質を発現させることを特徴とする遺伝子の形
質発現方法に関する。

組換え遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立され、現在
までにソマトスタチン、インシュリン、ヒ）生長ホルモ
ン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン
−β、口締病ワクチンなどのベブタイドやワクチンなど
の製造が可能であることが示された。生理活性の高いこ
れらベプタイドやワクチンの発現の宿主として大腸菌は
多くの場合十分であると考えられるが、さらに高い生産
性、菌体外への分泌、グリコジル化を求めあるいは菌体
内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌なども宿主と
して開発されてきている。

ベブタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産する場合
は、上記のような既に組換えＤＮＡ技法が確立されてい
るか、その基礎が整っている菌株を利用すればよいが、
アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物質などの物質の工業
的生産性の向上をＭｉ換えＤＮＡ技法により行う場合に
は、同技法を従来使用されているそれぞれの生産菌に適
用する工夫が必要である。

コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物によるアミ
ノ酸の工業的製造に最初に用いられた微生物で、以後コ
リネバクテリウム属を含むコリネフォルムバクテリアに
よるグルタミン酸、リジン、アラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニ
ン、インロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン、フ
ロリン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が開発
され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物により生産
されるに至っている。

従ってこれら微生物における組換えＤＮＡ技法の確立は
、今後アミノ酸生産の向上のために極めて重要であると
考えられる。

組換えＤＮＡ技法は、例えば （１）　　制隈酵素による目的遺伝子を含むＤＮＡの断
片化 （２）同一制限酵素によるベクターＤＮＡの単一切断に
よる直鎖状化 （３）上記（１）、（２）の生成物の混合によるアニー
リングとＤＮＡＩＪガーゼを用いる連結による組換え体
ＤＮＡの作成 （４）上記組換え体ＤＮＡの宿主菌株への導入（形質転
換） （５）目的遺伝子を含む紐換え体の選択と選択されたク
ローンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組換え体
保有株の造成の効率は、上記各段階の積ともいうべきも
ので各段階を検証する手段を準備し、各段階の効率を知
りこれを向上することなしには目的遺伝子の発現可能な
形質転換株を得ることができない。またこのようにして
目的遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する形質転換株が
得られたとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来性
である場合には該遺伝子の発現に際し種々の障壁がある
ことが知られており〔“化学と生物″１８．１１０〜１
１ｇ　（１９７８）　）その発現を行わせることは非常
に困難である。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性である目的遺伝子またはベクターを含む組換え体Ｄ
ＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させた例は今
まで全く知られていない。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とする組換えＤＮＡ技法においても、
これら微生物中で自律複製し、選択可能な表現型を有し
、多くの遺伝子のクローニングに用いうるベクター系の
造成と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。さ
らに上記したような障壁の解消方法の確立が必要である
。

本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
た〔特願昭５６−５ｆ！１８６（特開昭５７−１８３７
９９）　　、同５６−５８１８７　（特開昭５７１８６
４９２）　、同５６−６５７７７　（特開昭５７−１８
６４８９）　］。

そこで本発明者らは該プラスミドベクターに既に知られ
ているインビトロにおけるＤＮＡ組換え技法（口、Ｓ、
　Ｐａｔｅｎｔ　４．２３７．２２４）を用い、アミノ
酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含むＤＮＡ断片を
連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムし一２２株またはその誘導株を形質転
換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質を発現
され、アミノ酸などの有用物質の生産の増大に利用する
ことができることを見出し本発明を完成するに至った。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮＡの少な（も
一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮＡを
用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質を発
現させる方法を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核
生物、原核生物、ウィルス、バタテリオファージまたは
プラスミドに由来し少なくとも一種の完全な遺伝子を含
むＤＮＡ断片があげられる。

真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくにヒトの
インターフェロン、インシュリン、生長ホルモンなどの
ベプタイドをコードする遺伝子などがあげられる。原核
生物に由来する遺伝子としては細菌とくにエッシェリヒ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
バチルス属またはスタフィロコッカス属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、細胞の代謝、とくに合成活性
に関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝または
合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸または抗生物
質などの合成ならびにその合成に関与する代謝系を意味
し、本発明においてはアミノ酸とくにグルタミン酸、リ
ジン、スレオニン、ヒスチジンまたはトリプトファンの
生合成活性が好適にあげられる。

また目的とするベブタイド、蛋白質などのアミノ酸組成
が知られているときは、相当するＤＮＡを合成して用い
ることもできる。ＤＮＡ合成方法はたとえば、Ｋ、Ｉｔ
ａｋｕｒａ　ｅｔ　ＬＬ　５ｃｉｅｎｃｅ　１１Ｑ５５
（１９７７）に記載の方法に従って行なうことができる
。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和合性（ｃ
ｏｍｐａｔｉｂｌｅ）で自律増殖できるものでなくては
ならない。具体例としては本発明者らがコリネバクテリ
ウム属に属する微生物から採取した、または採取したも
のを誘導して造成したｐｃＧｌ〔特願昭５６−１８１０
１（特開昭５７−１３４５００）　）　、ｐＣＧ２〔特
願昭５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９７）
　）　、ｐＣＧ４〔特願昭５６−５８１８６　（特開昭
５７−１８３７９９＞　）、ｐＣＥ５３、ｐＣＥ５４、
ｐｃＧｌｌ、ｐｃＢｌｏｌ、ｐＥｔｈｒｌなどがあげら
れる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　　　Ｆ６ＲＩＪ−Ｐ　　　　　ＡＴ［Ｃｐ
　ＣＧ　１　　　　　５８６５　　　　　　３１８０８
ｐ　ＣＧ　２　　　　　５９５４　　　　　　３１８３
２ｐ　ＣＧ　４　　　　　５９３９　　　　　　３１８
３０ｐ　ＣＥ５４　　　　　　　　　　　　　　３９０
１９ｐ　ＣＧｌｌ　　　　　　　　　　　　　　　３９
０２２ｐ　ＣＢ　１０１　　　　　　　　　　３９０２
０ｐｆｉｔｈｒ　１　　　　　　　　　　　　　　３９
０２１好適にはｐｃＧｌｌ　ＳｐＣε５４が用いられる
。ｐｃＧｌｌは本発明者らが先に開示〔特願昭５６−１
８１ＯＮ特開昭５７−１３４５００）　　）　ｌ、たプ
ラスミドで、コリネバクテリウム・グルタミクム２２５
−５７　（ＡＴＣＣ３１８０ｇ、ＦＥＲＭ−Ｐ５８６５
）から分離されたプラスミドｐｃＧ１における制限酵素
Ｂｇβ■のただ一つの切断部位に、コリネバクテリウム
・グルタミクム２２５−２５０（＾ＴＣＣ３１８３０、
ＦＥＲＭ−Ｐ５９３９）から分離されたプラスミドｐｃ
ｃ４のストレプトマイシンおよび／またはスペクチノマ
イシン耐性（Ｓｍ”　／５ｐｅｃ”）遺伝子を含むＢａ
ｍｆ（ｒ断片を両者の同一接着末端を利用して結合させ
たプラスミドである。

ｐｃＧｌｌ　は、分子１約６，８Ｋｂのプラスミドで単
一な制限部位としてＢｇｊ！ＩＩ、Ｐｓｔ　Ｉを有しＳ
ｍ”／５ｐｅｃ”の表現型を与える。

ｐＥＣ５４は次のようにして作成することができる。

まず、ｐＣＧ２をその保育園コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−２１８株（ＦＥＲＭ−Ｐ５９５４　、
＾ＴＣＣ３１８３２）の培養菌体から特願昭５６−１３
３５５７　（特開昭５８−３５１９７）に開示した方法
で、ｐＧ＾２２をその保有大腸菌の培養菌体から通常用
いられる方法で濃縮単離する。両プラスミドＤＮＡを各
分子中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばＰｓｔｌ
で完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子の両端
に単鎖として突き出た同一接着末端で両ＤＮへ分子の連
結した和合分子を生成させるためにＴ４ファージＤＮＡ
ＩＪガーゼを作用させる。このＤＮＡ混成物中からの両
プラスミド分子の和合連結した組換え体プラスミドの取
得は、−旦、ｐＧ＾２２に由来する薬剤耐性で選択され
るコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属
菌種の形質転換株を分離し、これら形質転換株の保有す
るプラスミドを解析することによって達成される。

ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に開示
したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種のプロトプラストを使用する形質転換法〔特願昭５
６−５８１８７（特開昭５７−１８６４９２＞および特
願昭５６−６５７７７（特開昭５７−１８６４８９）　
）により実施することができる。選択に用いる薬剤はｐ
Ｇ＾２２に由来する薬剤耐性遺伝子のうち、ｐＧ＾２２
との連結部位となるため挿入不活化されるアンピシリン
耐性遺伝子を除いた他の耐性遺伝子に対応するテトラサ
イクリン（Ｔｃ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ　）あ
るいはカナマイシン（にｍ）を使用すればよい。形質転
換株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正常細
胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラサイク
リン０．４−１．６ｇ／ｍＩ、クロラムフェニコール２
．５−５■／ｍｌおよびカナマイシン１００−８００埒
／ｉｆ）を含む高張寒天培地上で復帰するコロニーを分
離するか、あるいは、−旦非選択的に再生培地上で正常
細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この再懸濁液を受
容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常、テトラ
サイクリン０．５−４８７ｍ１１、クロラムフェニコー
ル２−［５■／ｍ１およびカナマイシン２２５■／ｍｌ
）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分離すること
によって得られる。テトラサイクリン、クロラムフェニ
コールあるいはカナフィシン耐性（Ｔｃ’、　Ｃｍ’、
　Ｋｍ”とそれぞれいう）により選択された形質転換株
の中には、ｐＧ＾２２由来の他の薬剤耐性形質をも同時
に獲得しているものがある。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、本発明者らが特願昭５６−１８１０１（特開昭５
７−１３４５００）および特願昭５６−６５７７７（特
開昭５７−１８６４８９＞　に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成
するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常
法により構造を知ることができる。

形質転換株の一株から分離されたプラスミドでｐＣＥ５
４である。

ｐｃＥ５４は大きさ約１４．５Ｋｂのプラスミドで、単
一制限部位としてεｃｏＲＩ、Ｓａｌ　Ｉ、Ｓｍａｌ、
　Ｘｈｏｌなどを有し、Ｔｃ”、　ＣＩ＋＋１．に１１
の表現型を与える。

Ｘｈｏ　Ｉはにｍｌ遺伝子中にあり、いわゆる挿入不活
化（ＤＮＡ断片の挿入により当該表現型の発現が妨げら
れる現象）による選択も可能である。

プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００
）、同５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）
および同５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９
７）に記載の方法に従って行えばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
の作製は、公知の試験管内組換えＤＮＡ技法を駆使する
ことにより実施できる。

試験管内のＤＮＡ組換えは、通常、目的の遺伝子を含む
供与体Ｄ　Ｎ　ＡとベクターＤＮＡの切断と再結合によ
り行われる。ＤＮＡの切断は、制限酵素を用いれば容易
にできる。試験管内組換えに使われる制限酵素は生物種
を問わずすべての２木鎖ＤＮＡ上で特定の塩基配列部分
を認識し切断する。

その塩基配列は、制限酵素の種類により異なっている。

従って適当な制限酵素を使用することにより目的の遺伝
子は発現機能を損うことなく一つのＤＮＡ切断片として
切り出される。同一制限酵素により切断された供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの切断片の末端構造は同一構造を
もち、ある種の制限酵素の場合には１本鎖が突き出た接
着末端を与え、別の制限酵素では、平滑末端を与える。

いずれの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与体
ＤＮＡの切断片とベクターＤ　Ｎ　Ａの切断片は、Ｔ４
ファージＤＮＡリガーゼにより連結することができる。

両ＤＮＡを異なる制限酵素で切断した場合も、例えば、
接着末端をＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼで修復して２本鎖と
して、平滑末端になおしてから結合したり、ターミナル
トランスフェラーゼで相捕的なホモポリマーを付与して
接着末端としてから結合したり、あるいは、ある種の制
限酵素切断部位を含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカ
ーを連結させてから、その内部を切断して接着末端を作
ってから結合させることができる。これらの連結法によ
り目的の遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ断片とベクターＤＮＡ
切断片の組換え体が生成する。

リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を−
Ｈクローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。

組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用でき
る。

Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、　　ＢＨＪ、、　　Ｕ、Ｓ、Ｐａ
ｔｅｎｔ　４．２３７，２２４、遺伝子操作実験法〔高
木康敬編著、講談社サンエンティフィック（１９８０）
　）　、！Ｊｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
６８、　ＲｅｃｏＩＴｌｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｅｄ＋
ｔｅｄ　ｂｙ　Ｒａｙ　ｆｌｕ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ　１９７９ 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有
する菌株ならばいかなる菌株を用いてもよい。好適には
本発明者らが先に特願昭５６−１５１４６４　（特開昭
５８−５６６７８）において開示したリゾチーム感受性
微生物を用いる。具体的な菌株の一例としては次の菌株
があげられる。

寄託番号 ＦＥＲＭ−Ｐ　　　ＡＴＣＣ コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｌ−１５５９４６
３１８３４コリネバクテリウム・ハーキｌリス　Ｌ−１
０３５９４７３１８６６プレビパクテリウム・ディバリ
カフム　Ｌ−２０４５９４８３１８６７プレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム　Ｌ−３１２５９４９３１
８６８宿主微生物の組換え体ＤＮＡによる形質転換はｌ
）培養細胞からのプロトプラストの８！！、２）プロト
プラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プ
ロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選
択、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下
に示す。

ｌ）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらに数世代増殖さ
せることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にする
ことができる。

このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇを純水１！に含み、ｐＨ７，２に調整した
培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ〔グルコース１０ｇ５
ＮＨ＜Ｃｊ！　　４　ｇ、尿素２ｇ、酵母エキスＩｇ、
に１ＩｚＰＯ＜　　Ｉ　ｇ、　Ｋ２ＨＰ０．３ｇ、　！
ＪｇＣｊ’２・６Ｌ０　０．４　ｇ、　Ｆｅ５０．・７
Ｈｚ０１０ｍｇ、　ＭｎＳＯ４−４−６１１Ｊ０、２ｍ
ｇ、　ｚｎｓＯａ４Ｈｔ００．９０１ｇ５　ＣｕＳＯ４
・５Ｈｘ００．４　ｔｎｇ。

Ｎａ２Ｂ４０ｔ・１ＯＨｚロ　　０．０　９１ｇ、　　
（ＮＨｓ）６Ｍｏｉｏｘ＜・４Ｎ２００．０４ｍｇ、ビ
オチン３０鴻、サイアミン塩酸塩Ｌ■を水Ｉｆに含み、
ｐＨ７，２に調整した培地〕などが用いられる。

この培地に微生物を接種し、振盪培養する。

比色計によって６６０ｎｍにおける吸光度（００）を測
定し対数増殖期の初期Ｃ０Ｄ＝　０．１−０．４　）に
培養液中０．１〜２．０単位／ｍ　Ｉの濃度になるよう
にペニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養を
さらに続けて、０口が０．３〜０，５に増加したところ
で細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗浄する。次いで細胞を適
当な高張培地、例えばＰＦＭ培地（Ｓ３Ｍ２倍希釈液中
にシヨ糖０．４　Ｍ、　ＭｇＣＲ２・６Ｈ２００、ＯＩ
Ｍを含み、ｐＨ１，０〜８．５に調整した培地）あるい
はＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ、カゼイン加水分解物５
ｇ、酵母エキス２５　ｇ　、　Ｋ２１（Ｐｏ、　３．５
ｇ１　ＫＬＰ口４　　１．５　　ｇＳ　ＭｇＣｌ１２・
６Ｆ１．０　　０．４１ｇｐｅｓｏ＋−７８２ｏ　１０
ｍｇ、　！ＪｎＳＯ＊’４〜６Ｈｚ０　２ｍｇ、　２ｎ
Ｓ０４・７０２０　　０．９　ｍｇ、ＣｕＳ口ａ’５Ｈ
Ｊ　　０．４　ｍｇ、Ｎａ、Ｂ＜Ｏｔ’１ＯＨＪＯ９０
９”ｇｓ　（ＮＨ４）ｓＭ（ｈＯｚ４・４Ｈ２０ｏ、　
０４　ｒｎｇ、ビオチン３０１１ｇ、サイアミン塩酸塩
２　ｔａｇ　ｓコハク酸二ナトリウム１．３５　ｇを水
Ｉｆに含み、ｐＨ７，０〜８．５に調整した培地〕に再
懸濁する。この細胞懸濁液に最終濃度０．２〜１０ｍｇ
／ｍｌ　となるようにリゾチームを加え３０〜３７℃で
反応する。プロトプラスト化は反応時間が進むにつれて
進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕微鏡下
でほとんどの細胞がプロトプラスト化されるに要する時
間は、細胞培養時の添加ペニシリン濃度および用いるリ
ゾチームの濃度によって変わるが、前記条件にて３〜２
４時間である。

生成したプロトプラストは低張条件で破裂死するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約ｌロー４の残存度に
抑えることができる。

このようにして調製したプロトプラストは適当な高張寒
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地に０．３〜０．８Ｍコハク
酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピロリド
ン（分子１１０．０００あるいは４０，０００）を含有
させたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地（ＲＣＧ培地に３％のポ
リビニルピロリドン（分子ｆｆ１ｌＯ，０００）　　と
１．４％の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いる
ことができる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい
。

再生コロニーの出現が認められるのに要する培養日数は
菌株により差があるが、釣菌できるまでの大きさ１ごな
るのは１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種、培養中
途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によっ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり１Ｏ−
２〜１０−４の効率である。

２）プロトプラストへの組換え体ＤＮＡによる形質転換 プロトプラストへの組換え体ＤＮＡの取り込みは細胞が
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１．５４０〜６．０００）あるいはポリビニル
アルコール（ＰＶＡ、］ｉ合度５００〜１，５００）と
二価金属陽イオンを加えて処理することによって行われ
る。高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロ
トプラストの保持に一般に使われるものでよく、例えば
ショ糖やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。

ＰＥＧおよびＰＶＡの使用可能な濃度範囲は最終濃度で
各々５〜６０％、１〜２０％である。二価金属陽イオン
は最終濃度１〜１００１１１Ｍ（７）Ｃａ”、ｌａｇ”
、Ｉｎ＋−１Ｂａ”Ｓｒ”などが効果的で単独あるいは
併用することができる。処理の温度は０〜２５℃が好適
である。

３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 組換え体ＤＮＡで形質転換処理したプロトプラストの再
生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハク酸
二ナトリウムとポリピロリドンを含有する高張寒天培地
（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを塗布し、
正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５℃で培養
することによって行われる。形質転換株は供与体ＤＮＡ
に由来する遺伝子が菌に付与する形質について選択する
ことによって取得できる。この特徴的形質獲得に基づく
選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行ってもよく、
あるいは−旦非選択的に再生させてから再生正常細胞を
集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したり
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程ｌ）におけるペニシリン処理を行なわずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
１）〜３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性微生
物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたりｌｏ−４〜
１０−８の高頻度で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。

組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由
来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて
培地に薬剤を補給するときもある。

本発明の形質発現方法により生産されるアミノ酸などの
有用物質の採取は、発酵液からのこれらの物質を採取す
る常法により行なわれる。

本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物
質、酵素、ペプタイド、蛋白質の生産性の増大または新
たな生産性の付与が可能となった。また微生物の代謝活
性を強化し、基質の利用能を増大させ、新たな代謝活性
を与え、新しい基質の利用性を与えるなどの製造法の改
良も可能になった。

さらに本発明における特徴は、異種遺伝子あるいは外来
性の組換えＤＮＡをコリネバクテリウム萬またはブレビ
バクテリウム属微生物において発現させるのに成功した
点にある。すなわち、実施例に示すような大腸菌のスレ
オニンオペロン、フォスホエノールビルビン酸カルボキ
シラーゼ（ＰＰＣ）遺伝子、枯草菌およびブドウ状球菌
で発現する遺伝子ｐＵＢ１１０　Ｃにｅｇｇｉｎｓ　Ｋ
、Ｍ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ八ｃ
ａへ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　ｈ　１４２３（１
９７ｇ）　）のカナマイシン耐性遺伝子、コリネバクテ
リウム・グルタミクムのリジン生合成に関与する遺伝子
、ブレビバクテリウム・フラブムのアンスラニレート合
成酵素遺伝子がコリネバクテリウム属菌において発現し
た。

例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのプラスミドに連結した形で導入されており
、コリネバクテリウム・グルタミクムで発現させるため
の特殊な操作は施していない。また、遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、コリネバクテリウム・グルタミクムのプラス
ミドに対して、いずれの向きに連結しても、コリネバク
テリウム・グルタミクム内で発現することから、コリネ
バクテリウム・グルタミクムは、導入された遺伝子の転
写・翻訳の開始点を正確に認識し、転写・翻訳を遂行で
きる機能をもつことが明白である。周知のように全ての
遺伝子は、正確に転写・翻訳が開始されるために必要な
塩基配列のレベルで類似性のある部位を有していること
を考慮すると、コリネバクテリウム・グルタミクムは、
例示した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点をも認
識して発現しうることが容易に推察される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な自学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から各研究者により、種々の閉包が
付されており属名までもコリネバクテリウム属あるいは
ブレビバクテリウム属などさまざまである。しかしなが
ら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの
塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間に
は、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが明
らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白であ
る（Ｋｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、　：Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　
ｔｈｅＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｎｏ、５５．１（１９８０）、
および５ｕｚｕｋ＋、　Ｋ、、　Ｋａｎｅｋｏ、　Ｔ、
、　ａｎｄにｏｍａｇａｔａ。

Ｋ、：　　Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　５ｙｓｔ、　　Ｂａｃ
ｔｅｒ＋ｏｌ、、３１．　１３１（１９８１）参照〕。

本明剖書では組換えＤＮＡ実験に使用でき、る宿主が規
制されているため、本発明のを剛性はコリネバクテリウ
ム・グルタミクムし−２２の誘導様を宿主として示した
が上記の事実を踏法えれば、グルタミン酸生産菌全般に
そのまま適用できることが容易に類推される。組換え体
ＤＮＡがこれら菌種において安定に保持され、発現され
るためにはＤＮＡの相同性など宿主菌の性質における若
干の相違は問題でなく、これら菌種が当該プラスミドの
自律複製と導入遺伝子の発現を可能にする機能を有して
いればよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能を共
有していることは、本発明者らが、先に開示〔特願昭５
６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）　）　し
たコリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０か
ら分離され、ストレプトマイシンおよび／またはスペク
チノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４が
コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種
など、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、また、
その耐性遺伝子が発現される〔特願昭５６−５８１８７
（特開昭５７−１８６４９２）　）ことから明らかであ
る。従って、本発明を適用し得る宿主菌としては、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグルタ
ミン酸生産菌全てが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタ
ミクム＾ＴＣＣ２１５４３のリジン生合成に関与する遺
伝子のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム
・グルタミクムによるリジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３の染色体ＤＮＡとベクターｐＣＧ１１の調！
！：コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ１３０
３２から誘導され、リジンアナログであるＳ−（２−ア
ミノエチル）−システィン（以下ＡＢＣと略す）に耐性
を有するリジン生産性変異株コリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡを次のよう
にして抽出単離する。

４０　Ｑｍｌ半合成培地ＳＳＭＣグルコース２０ｇ。

（Ｎｌ（、）　２Ｓ０４１０　ｇ、尿素３ｇ、酵母エキ
スＩｇ。

ＫＩＩ２ＰＯ，１ｇＳＭｇＣＪ！ｔ−６Ｈｚ００．４　
ｇＳＦｅＳＯ，−７）１，０１０ｍｇ、ｕｎｓ０４・４
〜６Ｈ＊Ｏｏ、２　ＩＩＩｇ、２ｎＳ口、−７８２００
，９口ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇＳ　Ｎａ２
８４０ｔ’１ＯＨｉＯｏ、０　９ｍｇ５　（ＮＨ４）　
ｇＭ（ｈｅｗｎ・４Ｈ２００，０４ｍｇ−ビオチン３０
■、サイアミン塩酸塩１　ｍｇを水ｉｆに含みｐＨ７，
２に調整した培地〕にスレオニンを１００　ｇ／ｍｌと
なるように補った培地に種培養を接種して３０℃で振盪
培養する。東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度
（０口）を測定し、ＯＤｏ、２になった時点で培養液中
０．５単位／１Ｔ１１の濃度となるようにペニシリンＧ
を添加する。さらに培養を継続しＯＤ約０．６になるま
で生育させる。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）　、０．００５１ＪεＤＴ＾、０．０５１ＪＮａ
Ｃｉ！　：　ｐＨ８，０）で洗浄後、リゾチーム液（２
５％ショ糖、０．１！Ｊ　Ｎａ１Ｊ、　０．０５Ｍ）リ
ス、０．８ｍｇ　７ｍ　Ｉリゾチーム＋ｐＨ３，Ｑ以下
同じ）　ｌＱｍｌに懸濁し３７℃で４時間反応させる。

集菌した菌体から斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ、　Ｈ，ｅ
ｔ　ａ土：　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　７２　、６１９（１９６
３）　３に従って高分子染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐｃＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導株
ＬＡ１０３のｐｃＧｌｌ保有株ＬＡ１０３／ｐＣＧ　１
１（＾ＴＣＣ３９０２２）から次のようにして単離する
。

４００＋ｎ１ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキ
ス５ｇを水ｌＩｌに含み９Ｈ１，２に調整した培地）で
３０℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる
。菌体を集菌し、ＴＥＳｔｌｌｉ液で洗浄後、リゾチー
ム液ＩＱａ＋１に懸濁し、３７℃で２時間反応させる。

反応液に５Ｍ　ＮａＣｊ！　２．４ｍｌ、０．５ＭＥＤ
Ｔ＾（ｐＨ８，５）　　０．６ｍｌ、４％ラウリル硫酸
ナトリウムと０．７ＭＮａ１からなる溶液４．４ｍｌを
順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間置
く。

溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間、６９、４０
０　ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。

これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）　６．０００　（牛丼化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１
．５００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離してペレットを回
収する。ＴＢＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてペレットを静かに
再溶解してから１．５　Ｉ１ｇ／ｍｌエチジウムブロマ
イド２．Ｑｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて
静かに溶解し密度を１．５８０に合わせる。この溶液を
１０５．０００　ｘ　ｇ　、　１８℃で４８時間超遠心
分離にかける。この密度勾配遠心により共有結合で閉じ
られた環状のＤＮＡは、紫外線照射することによって遠
心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出される
。このバンドを注射器で遠心チューブの側面から抜きと
ることによってｐｃＧｌｌ　ＤＮＡが分離される。次い
で分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百
分率９０％イソプロピルアルコール、ｌＯ％ＴＢＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。

（２）コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１
５４３のリジン生合成に関与する遺伝子のクローン化 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３■を含む
制限酵素ＢｇｌＵ用反応液（ｌＯｄ）　リス塩酸、７ｄ
　ＭｇＣＬ　、６０ｍＭ　　ＮａＣｌ２．７ｍＭ　２−
メルカプトエタノール、ｐＨ７，５）　６０ｍに６単位
のＢｇｉ’ｌＩ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止する。

一方コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ２１５
４３の染色体ＤＮＡ８■を含む制限酵素８ａｍＨＥ反応
液（ＩＯｄ　トリス塩酸、７ｍＭＭｇＣ１ｚ、１００ｍ
Ｍ　ＮａＣＲ、２ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０
．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，０）　１４０ｍ
に４単位の［ｌａｍＨＩを添加し、３７℃で６０分間反
応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。

画情化物を混合し、Ｔ４１Ｊガーゼ用緩衝液（トリス塩
酸６６０ｄ、　！ｇｃｆｆｉ２６６ｍＭ　、ジチオスレ
イトールｌｏｏｍＭ　ＳｐＨ７，６）　４０ｍ、ＡＴＰ
（５Ｉｎ＆＋）　４０ｍ、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、
■単位／Ｊｉ１）０．３ｍおよびＨ，０１２０ｍを加え
、１２℃で１６時間反応させる。この混合物をＴＥＳ４
１衝液で飽和したフェノール４００ρで２回抽出し、Ｔ
ＥＳｉＪｔ衝液に対して透析してフェノールを除外する
。

このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウム・グル
タミクムし一２２株から誘導させたＡＥＣ感受性のＬＰ
４株の形質転換に供する。

形質転換はＬＰ４株のプロトプラストを用いて行なう。

ＬＰ４株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤｏ、６になった時点で集菌し、該細胞をＲＣ
ＧＰ培地〔グルコース５ｇ１カザミノ酸５ｇ、酵母エキ
ス２．５　ｇ　、　Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ　Ｓ　ＫＨ，
Ｐ口４　１．５　　ｇ、ｕｇｃｉｘ・６Ｈ，００，４１
ｇ　、　Ｆｅ５Ｏｎ’７Ｈｚ０１０ｍｇ、　ＭｎＳ［１
４’４〜６）ＩＪ　２　ｍｇ１ＺｎＳＯｃ７Ｎ２０　０
．９　ｍｇ、　　（ＮＨ４）Ｊｏｔ０２４’４ＨＪ　　
Ｏ，０４ｍｇ５ビオチン３０Ｊ１ｇ、サイアミン塩酸塩
２ｍｇ５コハク酸二ナトリウム１３５　ｇ　、ポリビニ
ルピロリドン（分子！ｔ１００００）　３０　ｇを水１
１に含む培地〕１：　１　ｔａｇ／ｍＩのりゾチームを
含む液（ｐ）１７．６）に約１０’細胞／ｍｌとなるよ
うに懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やか
に振盪反応してプロトプラスト化する。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２
５００　ｘ　ｇで５分間遠心分離しＴＳＭＣ緩衝液（１
０ｄ塩化マグネシウム、３０ＩＩＩＭ塩化カルシウム、
５０ｍ１Ｊ　）リス、４００ｍＭショ糖、ｐ）１７．５
＞　　１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣＥＩ衝
液Ｑ、１ｍ１に再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のＴ
ＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対ｌ
混合液１００ｍを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液
中に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液０．８１１１
１を添加して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７
，２）　２ｍｌを添加し、２．５（１（ｌ　ｘ　ｇで５
分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロ
トプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから０．
２１１１１をスペクチノマイシン４００　ｇ／ｍｌを含
むＲＣＧＰ寒天培地（Ｒ１１：ＧＰ培地に１．４％塞天
を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３０℃で７日間培
養する。

寒天培地上に生育した菌全量をかき集め生理食塩水で洗
浄後、１ｍｌの生理食塩水に懸濁する。

この菌液をスレオニン２１Ｔ１ｇ７ｍ１、＾ＥＣ２ｍｇ
／ｍｌおよびストレプトマイ７ンＩ　２．５　ｇ／ｎ＋
Ｉ相当を含有する最少寒天培地ＭＩＣグルコースＩＯｇ
。

ｘＬｌｈＰＯ＜　　ｌ　ｇ、　ＫＣｌ０．２　ｇＳ！Ｊ
ｇＳＯ＜・７Ｈ７００、２ｇ　５ｐｅｓｏ４・’７１ｔ
２ｏ　１０ｍｇ、　ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０ｏ、　２
ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏａ４Ｈ２００，９ｍｇ、　ｃＵｓｏ４
’５ｏ２ｏ　ｏ、　４　ｍｇ１Ｎａ２Ｂ、０１’１ＯＨ
ｚＯｏ、０　９　ｆｆ１ｇ、　　（ＮＨ＜）ｓ）Ｊｏ１
口、、・４Ｈ，００、０４ｍｇ、ビオチン５０ｇ、ｐ−
アミノ安息香酸２．５ｍｇ、サイアミン塩酸塩１ｍｇ５
寒天１６ｇを水２中に含みｐＨ７，２に調整した培地〕
上に再塗布して３０℃で３日培養する。出現したコロニ
ーの中からへＥＣ，スペクチノマイシンおよびストレプ
トマイノンに耐性の株が得られる。

これらの形質転換株の保有するプラスミドは、前記のｐ
ｃＧｌｌを単離したのと同様の方法で単離される。これ
らのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ｌμｇを用い、ｐＣＧ　Ｉ
　Ｉ上に切断部位のある制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析し、生成断片の和か
ら分子量を同定した。分子量は同一アガロースゲル上で
同時に泳動したラムダファージＤＮＡの制限酵素１ｉｎ
ｄ［消化で生成する分子１既知の各断片の泳動距離で描
かれる標準曲線に基づいて算定する。形質転換株の一株
から得られたプラスミドｐＡｅｃ　５は分子！Ｉｔ　１
０．７ＫｂでｐｃＧｌｌのＢｇｊ！ＩＩ切断部位に３．
９ＫｂのＤＮＡ断片が挿入された組換え体プラスミドで
ある。

ｐＡｅｃ５ＤＮＡを用い上記と同様な方法でＬＰ４株の
プロトプラストを形質転換しスベクチノマイシン耐性で
選択される形質転換株は同時にＡＢＣ耐性形質を付与さ
れたεｃｏＲＩの切断様式で判定されるｐＡｅｃ　５と
同一のプラスミドを保有している。即ちｐＡｅｃ　５に
コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ２１５４３
のΔＥＣ耐性形質を支配する遺伝子がクローン化されて
いることが明らかである。ｐＡｅｃ　５保存菌株は米国
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＣｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍｇｌｕＬａｍｉｃｕｍ　
Ｋ１７　ＡＴＣＣ３９０３２として寄託されている。

（３１ｐＡｅｃ　５保有株によるリジンの生産コリネバ
クテリウム・グルタミクムし一２２株から誘導されたＬ
Ｐ４株のｐＡｅｃ　５保有株（ＡＴＣＣ３９０３２）と
非保有株のリジン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で
生育させた菌を１白金耳ずつ５ｍＭの生産培地ＰＩ　　
〔グルコース］００ｇ、　（ＮＩＬ）ｚｓＯｎ２４．５
ｇ、　Ｋ）１２ＰＯ，１ｇＳ！ＪｇＳＯ＊・７１１．０
　０．４　ｇ　。

Ｆｅ５０＋’７ＨＪ　ｌ０ｍｇ、　！ＪｎＳ０４’４−
６１（２０１０１０ｌｌ１　ビオチン５０■、サイアミ
ン塩酸塩２００ｇ、パントテン酸カルシウム５００■、
ニコチン酸５００■、大豆加水分解物１０　ｇ　、炭酸
カルシウム３０ｇを水ｌｌに含みｐＨ７，２に調整した
培地〕の入った試験管に植菌し３０℃で７５時間振盪培
養する。培養後、培地中のＬ−ＩＪジン生成量を酸性−
銅ニンヒドリン反応を用いる比色法によって測定した結
果を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 Ｐ−４ ＬＰ−４／ｐＡｅｃ５　　　　　　　　７．２実施例２
．大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝子のクロー
ン化とその遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム
・グルタミクムによるスレオニンの生産Ｅ （＋）　　大腸菌スレオニンオペロンを含有するＤ　Ｎ
　Ａ断片のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミ
クムへの導入： クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして用いたｐＧ＾２２は本プラスミドを作製し
たアンらが用いている方法［Ａｎ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｔ
　：　Ｊ、８ａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１１．４００（
１９７９）　）に従い、本プラスミドを保有する大腸菌
に一１２株亜株の培養菌体から単離する。供与ＤＮＡと
なる高分子染色体ＤＮＡは大腸菌に１２株（ＡＴＣＣ２
３７４０）の培養菌体からスミスのフェノール抽出法（
Ｓｎ＋＋ｔｈ、　Ｍ、Ｇ、　　：　！Ｊｅｔｈｏｄ　ｉ
ｎＥｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ、　１２．　ｐａｒｔ＾、　
５４５　（１９６７）　）に従って単離する。

ｐＧ＾２２プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　４■を含む制限酵素
１（１０ｄｌｌ１反応液（１０ｍｌＪ　）リス塩酸、７
ｍＭ　！ＪｇＣβ２（ｉＱｍＭ　ＮａＣｊ！　、　ｐＨ
７，５＞　６０ｍ　ｌ：　ｏ、　４単位）ｔｌｉｎｄｌ
ｌ（宝酒造社製、６単位／ｄ）を添加し３７℃で３０分
間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止する。ｐ
Ｇ＾２２には２ケ所の旧ｎｄ［Ｉ切断部位が存在するが
、同一条件でＨｉｎｄ［消化した試料をアガロースゲル
電気泳動で調べた結果、−断片に切断されていることが
確認される。別に、染色体ＯＮ＾８■を含む制限酵素旧
ｎｄＩ［Ｉ反応液１４０鱈に４単位の旧ｎｄｌＩ［を添
加し３７℃で６０分間反応後６５℃で１０分間加温して
反応を停止させる。

雨滴化物を混合し、Ｔ４リガーゼ用緩衡液４０〃、＾Ｔ
Ｐ（５ｍＭ）４０ｍ、　Ｔ　４リガーゼ０．３ＪＩＩＩ
およびＨ２Ｏ１２０ｄを加え、１２℃で１６時間反応さ
せる。

この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００
〃で２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノ
ールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＧＴ−
３ＣＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１１７．　１３３
−１４３（１９７４）　）（ホモセリンおよびジアミノ
ピメリン酸要求性）の形質転換に供与する。

ＧＴ−３株のコンピテント・セル（ＤＮＡ取り込み能を
有する菌株）はダジエルトらの方法ＣＤａｇｅｒｔ、　
Ｍ、、　ｅｔ　３上：　Ｇｅｎｅ、　６．２３（１９７
９）　）で：Ａ製する。即ち１００■／ｍ　ｌとなるよ
うにジアミノピメリン酸を補ったＬ培地（バクトドリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇを水ＩＩ！に含みρ■７．
２に調整した培地）　５０ｍ１に植菌し、Ｏ［］０．６
になるまで３７℃で培養する。培養液を氷水で１０分間
冷却してから遠心集菌する。冷却したＯ、１Ｍ塩化カル
シウム２０１１１１に再懸濁し、０℃に２０分間置く。

細胞を再遠心し、０．１Ｍ塩化力ルウシウム０．５ｍｌ
に懸濁し０℃で１８時間置く。

塩化カルシウム処理した菌液４００ｍに前記リガーゼ反
応混合物２００屑を添加混合し、０℃に１０分間置いて
から３７℃で５分間加温する。次いでＬ培地９ｍｌを添
加し、３７℃で２時間振盪培養する。生理食塩水で２回
遠心洗浄後、１２．５ｇ／ｍｌ相当のカナマイシンを添
加したＭ９最少寒天培地（ブドウ糖２　ｇ、　ＮＨ＋Ｃ
ｊｌ’　　１　ｇ、　Ｎ８２１１ＰＯ＋　　６　ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４３ｇ、　　ＭｇＳ口ｎ・７Ｌ０　０．Ｉ　
　ｇ、　　ＣａＣＬ・２８２０　１５ｍｇ、サイアミン
塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５ｇを水ｌβに含み、ｐ）１
７．２に調整した培地）に塗布し３７℃で３日培養する
。出現したただ一つのコロニーは、アンピシリン２５ｇ
／ｍ＋、クロラムフェニコール２５ｘｒ／ｍｌあるいは
カナマイシン２５ｑ／ｍｌを含むＬ寒天培地上でも生育
することが確認される。

この形質転換株の培養菌体から上記（１，）でｐＧ＾２
２を単離したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡを
単離する。このプラスミドＤＮＡを用い制限酵素消化と
アガロースゲル電気泳動で解析した結果、第１図にｐＧ
ｌ１２として示した構造を有している。ｐＧ＾２２に挿
入されたＤＮＡ断片は既にクローン化された大腸菌オペ
ロン含有ＤＮＡ断片（Ｃｏｓｓａｒｔ、　Ｐ、、　ｅｔ
　ａｌ　：　！Ｊｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、。

Ｇｅｎｅｔ、、Ｌｌｉ　３９（１９７９）参照〕と同一
（７）　制御　酵素切断部位を有していることからｐＧ
Ｈ２がスレオニンオペロンを含有することが確認される
。

次にｐＣＧ　１　ｌとρＧＨ２の組換え体を作製する。

まず、ｐｃＧＩＩ　とｐＧＨ２を各々Ｂｇ！■、および
３μｍｌｌ　Ｉで適正条件下完全消化する。各プラスミ
ドＤＮＡ２■を含む消化物を混合し、総容量２００ρに
対してＴ４リガーゼ用ｓｕｉ液４０ＪＪＪｌ、　Ａ　Ｔ
　Ｐ　（５ｍＭ）４０ρ、Ｔ４リガーゼ０．２ｍおよび
Ｈ２Ｏ１２０屑を加え１２℃で１６時間反応させる。こ
の混合物をＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール４００ｔ
ｌＩｔで２回抽出しＴＥＳ緩衝液に対して透析してフェ
ノールを除去する。続いて２倍高濃度の７３ＭＣ緩衝液
と前記リガーゼ反応混合物の１対ｌ混合液１００ｍを供
与ＤＮＡとして用い、実施例１　（１）と同様な方法で
コリネバクテリウム・グルタミクムし＾２０１株（員１
０３の誘導体、ホモセリン、ロイシン要求株）のプロト
プラストを形質転換した後、ＲＣＧＰ寒天培地に塗抹し
、３０℃で６日間培養して再生増殖させる。寒天培地上
全面に生育した閑をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄後
、ロイシン５０　ｔｔｇ　／ｍ　ｌを補充した最少寒天
培地Ｍｌ上に再塗布して、３０℃で３日間培養する。出
現したコロニーの中からカナマイシン１２．５μｇ　／
　ｍ　ｌあるいはスペクチノマインン１００■／ｍ　ｌ
を含むＮＢ寒天培地上で生育できる株が得られる。

これらの形質転換株から実施例１（１）記載のエチジウ
ムブロマイド、センラムクロライド密度勾配遠心により
プラスミドを単離する。

これらのプラスミドＤＮＡ０．５ｔｔｇを用い各種制限
酵素による単独消化および二種類の制限酵素による二重
消化で生成するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で
解析し、分子ｌおよびプラスミド分子中の各制限酵素切
断部位を同定する。−株から得られたプラスミドをｐＥ
ｔｈｒ　ｌ　と命名した。制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｅｃ
ｏＲＩ　、およびＸｈｏ　Ｉの切断部位で特徴づけられ
る構造を第３図に示す。ｐｆ’ｔｈｒ　ｌ　はｐｃＧｌ
ｌにｐＧＨ２のスレオニンオペロンを含む、ＢａｍＨＩ
切断片を結合した構造を有することが判明した。

ｐＥｔｈｒ　ｌ　ＤＮＡを用いて、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性とカナマインンおよびス
ペクチノマイシン耐性形質が連関して導入され、それら
の形質転換株は、各種制限酵素切断様式で特徴づけられ
るｐＥｔｈｒ　ｌ　と同一のプラスミドを保をしている
。ホモセリンデヒドロゲナーゼの欠失に起因するＬＡ１
０３株のホモセリン要求性がｐＥｔｈｒ　Ｉによりホモ
セリン非要求性に復帰するのは、大腸菌スレオニンオペ
ロン上にあるホモセリンデヒドロゲナーゼが発現してい
るためにほかならない。

（２）　　ｐＥｔｈｒ　１保有株の造成コリネバクテリ
ウム・グルタミクムし一２２株より誘導したスレオニン
生産菌、コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ−１０
６（メチオニン要求性、ＡＥＣ耐性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸耐性）のｐ［！ｔｈｒ　１保有株は、
ＬＡ−１０６のプロトプラストをｐＥｔｈｒ　１で形質
転換することによって得られる。

プロトプラストはＬＡ−１０６株を半合成培地ＳＳＭに
１００■／ｍｌ相当のメチオニンを補った培地で培養し
、ＯＤ約０．６まで生育させた細胞を実施例Ｉ〔２〕と
同様な工程で処理することにより調製する。形質転換も
実施例１（２）と同様に行ないスペクチノマイシン４０
０　ｔｔｇ　／ｌｌｌ１を含むＲＣＧＰ寒天培地上で選
択して形質転換株を取得する。

ｐｌＥｔｈｒｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクシＢンにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに１９　ＡＴＣＣ３９０３４
として寄託されている。

（３）ｐＥｔｈｒ　ｌ保有株によるスレオニンの生産上
記のようにして得たＬＡ−１０６株のｐＥｔｈｒ　１保
有株（ＡＴＣＣ３９０３４）と非保有株のスレオニン生
産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で生産させた菌を１白
金耳ずつ５＋ｎｌの生産培地Ｐ２（グルコース１００　
ｇ、　（ＮＨ４）２ＳＯ４２０ｇ、に１４２ＰＯ４０，
５ｇ　−に２８Ｐ口＋　　０．５　ｇ　、　　！ＪｇＳ
０４’７Ｈ２０１ｇ　、ＦｅＳＱａ４Ｈｔ０１０ｍｇ、
　Ｍｎ５Ｏ＊・４−６Ｈ２０Ｌｏｎｇ、ビオチン１００
■、炭酸カルシウム２０ｇ、メチオニン１００ａ＋ｇを
水１１に含みｐＨ７，２に調整した培地〕の入った試験
管に植菌し３０℃で７５時間振盪培養する。

培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色後、比色窓ｌしてＬ−スレオニン生成
量を測定した。結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＬＡ−１０６ ６，１ ＬＡ−１０６／９εｔｈｒｌ　　　　　１３．４実施例
３゜ 大腸菌のフォスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（ＰＰＣ）遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
コリネバクテリウム・グルタミクムによるグルタミン酸
の生産： （υ　大腸菌のＰＰＣ遺伝子（本遺伝子は大腸菌でＧｌ
ｕ−をＧｌｕ“にすることが知られているグルタミン酸
生合成に関与する遺伝子である）を含有するＤＮＡ断片
のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクムへの
導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する。

ベクターとして用いたｐＢＲ３２２は実施例１（１）で
ｐＧ＾２２を調製したのと同一の方法で大腸菌に一１２
株亜株の培養菌体から単離する。供与ＤＮＡとなる高分
子染色体ＤＮＡは実施例２（＋）で大腸菌に一１２株（
ＡＴＣＣ２３７４０）から調製したものを使用する。

ρＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ　：ｂｃｇおよび染色体
ＤＮＡ９ｘｒを含む制限酵素５ａｉｌ用反応液（１０ｍ
ｌＪ　）リス塩酸、７１１１Ｍ　ＭｇＣ１２，１００ｍ
Ｍ　ＮａＣｊ！　。

７ｍＭ　２−メルカブトエタ／−ル、０．０１％ウシ血
清アルブミン、ｐＨ７，５）　２００ｍに１０単位の５
ａｌｌ（宝酒造社！ｉりを添加し、３７℃で６０分間反
応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。こ
の混合消化物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０ρ、Ａ　Ｔ
　Ｐ　（５ｍＭ）　４０Ａ１１、Ｔ４リガーゼ０．４薦
および水１２０ｍを加え、１２℃で１６時間反応させる
。この混合物をＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール４０
０ρで２回抽出し、ＴＥＳ緩衝液に対して透析しフェノ
ールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＰＰＣ
２（Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ、　Ｎ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　５１．　１６７（１９５５））　（ａｒｇ−、ｔ
ｈｒ−、Ｉｅｕ−、ｈｉｓ−、Ｔｈ１−、　　ＰＰＣ−
。

ＳＴ”）の形質転換に供する。ＰＰＣ２株のコンピテン
ト・セルは２ｍｇ／ｍｌのグルタミン酸を補ったし培地
で培養し、実施例２（１）でＧＴ−３株のコンピテント
・セルを得たのと同様に調製する。形質転換は前記リガ
ーゼ反応混合物２００４を使用し、実施例２（１）と同
様に行う。Ｌ培地９ｍｌを添加し、３７℃で２時間振盪
培養して形質発現させる。次いで生理食塩水で２回遠心
洗浄後、アルギニン、スレオニン、ロイシン、ヒスチジ
ン各５０　ｇ　／ｍ　ｌを補ったＭ９最少寒天培地に塗
布し、３７℃で３日間培養する。出現したコロニーをア
ンピシリン２５　ｇ　／ｍ　１あるいはテトラサイタリ
ン２５ｑ／ｍｌを含むし寒天培地上にレプリカし、３７
℃で２４時間培養してアンピシリン耐性でテトラサイタ
リン感受性のものを選び出す。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様の方法で
プラスミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得
られたプラスミドＩ）ＰＣＩを制限酵素消化とアガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２のＳａｌ
　ｌ　切ＩＪｆｒ部位に４，４ＸｂのＤＮＡ断片が挿入
されたゲノムサイズ８，８Ｋｂの組換え体プラスミドで
あることが判明した。

このｐｐｃ　ｌ　プラスミドを用いてＰＰＣ２株を前記
と同様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選択さ
れる形質転換株は全てグルタミン酸非要求性で、制限酵
素切断様式で特徴づけられるｐＰＣｌ　と同一構造のプ
ラスミドを保有している。このことはｐｐｃ　１　プラ
スミド上に大腸菌のＰＰＣ遺伝子がクローン化されてい
ることを示す。

クローン化されたＰＰＣ遺伝子をコリネバクテリウム・
グルタミクムに導入するために、ｐＣＧ　１１とｐｐｃ
　１の組換え体を宿主大腸菌で調製する。

ｐｃＧｌｌ　およびｐｐｃ　１　プラスミドＤＮＡを各
々２■含む制限酵素Ｐｓｔ　ｒ用反応緩衝液〔２０１Ｉ
ＩＭトリス塩酸、１０ｍ！Ｊ　！ＪｇＣＥ２．５０ｄ（
ＮＨ４）２ｓｏ４．０゜０１％ウシ血清アルブミン、ｐ
Ｈ７，５３２００ρに４単位のｐｓｔｌ（宝酒造社製）
を添加し、３０℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間
加温して反応を停止させる。この反応混合物に７４１Ｊ
ガーゼ用緩衝液４０−１ΔＴ　Ｐ　（５ｄ）　４１ｂｃ
ｌ＋、　Ｔ　４リガーゼ０．２１ｔ１および水１２０ｍ
を加え、１２℃で１６時間反応させる。前記と同様にフ
ェノール抽出後、透析してフェノールを除去する。この
リガーゼ反応混合物１００ρを使用し、前記と同様にＰ
ＰＣ２株を形質転換した。

生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを分離し、
その大きさをアガロースゲル電気泳動で調べた。大きさ
が約１５〜１６にｂのプラスミドを選択し、そのプラス
ミドで再度ＰＰＣ２株を形質転換しＰＰＣ遺伝子の存在
を確認した。先の形質転換株の一株から得られたプラス
ミドｐｌＥｐｐｃ　ｌを制限酵素消化とアガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐｃＧｌｌとｐＰｃｌが両者
のＰｓｔ　Ｉ切断部位で和合連結したゲノムサイズ１５
．６　Ｋｂの組換え体プラスミドであることが明示され
た。こうして大腸菌で調製されたｐερρｃ１プラスミ
ドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム・グルタミクムし
一２２株から誘導されたＬＰ４株を形質転換する。形質
転換は実施例１（２）と同様に行い、形質転換株はスベ
クチノマインン４００　ｔｔｇ　／ｍ　Ｉを含むＲＣＧ
Ｐ寒天培地上で生育するコロニーの中から取得される。

これらの形質転換株から単離されるプラスミドを制限酵
素５ａｌＩあるいはＰｓｔ　１の単独消化または両者の
２重消化し、アガロースゲル電気泳動で解析することに
よりｐεｌｌｌＩＣ１を保有していることが６’ｌ’ｋ
Ｊされる。

ｐＥｐｐｃ　ｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに（：ＯｒｙｎｅｂａＣｔｅｒ
Ｕｉｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ　−１８ＡＴＣＣ３９
０３３として寄託されている。

（２）ｐＥｐｐｃ　ｌ保有株によるグルタミン酸の生産
：コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株から誘
導されたＬＰ４株のｐＥｐｐｃ　１保有株（ＡＴＣＣ３
９０３３）　　と非保有株のグルタミン酸生産試験を行
った。ＮＢ寒天培地上で生育させた菌をかき集め、生理
食塩水で洗浄後、５ｍｌの生産培地Ｐ３［グルコース５
０ｇ、　（ＮＨ，ＬＳＯ＋　　３　ｇ、尿素３　ｇ、　
ＫＨｔＰ０４０．５　ｇ、　Ｋ、ＨＰｏ、　０．５　ｇ
、Ｍｇ５Ｏ＜−７ＨＪ　ｏ、　５　ｇ　、　Ｆｅ５０＊
４Ｈ２０１０ｍｇ、　！ＪｎＳＯａ・４〜５Ｈ，０１０
＋ａｇ−ビオチン３鴻、サイアミン塩酸塩５００埒、フ
ェノールレッドｌ０ｍｇを純水１！に含み、ｐＨ７，２
に調整した培地〕の入った試験管に植菌し、３０℃で振
盪培養する。培養中、２０％尿素液を０．２ｍｌずつ３
回添加し、４０時間培養する。培養後、培養ｐ液をペー
パークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、
比色定潰してＬ−グルタミン酸の生成１を測定した。

結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表 Ｐ−４ １０，１ 実施例４．　ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１
４０６７のアンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバク
テリウム・グルタミクムでのクローン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブム＾ＴＣＣ１４０６７の染
色体ＤＮＡを実施例１（１）と同様の方法で調製する。

ベクターとして用いるｐＣＥ５３は実施例１　（１）で
ｐＣＧ　１１を単離したのと同様の方法でその保有株コ
リネバクテリウム・グルタミクム上−２２株の培養菌体
から単離する。ｐＣε５３は本発明者らが先に開示した
コリネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐＣＧ
ｌ〔特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５０
０）　）と大腸菌のプラスミドρ６八２２　［Ａｎ、　
Ｇ、ｅｔ　ａｌ　：Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１
４０．４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプラ
スミドである。詳しくはｐＣＧ　ｌ上に１ケ所しかない
Ｂｇｊ２１１切断部位とｐＧ＾２２上に２ケ所ある［ｌ
ａｍｔｌ　ｌ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝
子内でないＢａｍＨｌ切断部位とで、両制限酵素の同一
接着末端を利用して連結したものである。

ｐＣＥ５３はｐＧ＾２２由来のカナマイシン耐性遺伝子
などの選択マーカーを有し、制限酵素Ｓａｌ　［に対す
る切断部位は１ケ所である。

上記で調製したｐＣε５３　プラスミドＤＮＡ３Ｊｉｇ
および染色体ＤＮＡ９ｘｒを含む制限酵素５ａｌＩ反応
液２００　ｄにｌＯ小単位５ａｌｌを添加し、３７℃で
６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止
させる。この混合消化物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０
ｄ、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５ｍＭ）　４０Ｉｉ１、Ｔ４リガー
ゼ０．４ＪＩｊ！およびＨ７０１２０屑を加え、１２℃
で１６時間反応させる。この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽
和したフェノール４００Ｊｄｌで抽出し、ＴＥＳｌ衝液
に対して透析し、フェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクム上−２２株から誘導されたアンスラニル酸要求性
変異株ＬＡ１０５（アンスラニル酸合成酵素欠損変異株
）を用いる。アンスラニル酸要求性変異株は、常法の変
異処理により、Ｍｌ寒天培地上で生育できず、アンスラ
ニル酸（３０ｇ／＋ｌ相当）を補ったＭｌ寒天培地上で
生育できる菌を選択することによって取得される。ＬＡ
１０５株のプロトプラストの調製および形質転換は、生
育培地ＮＢに１００■／ｍ　ｌ相当のアンスラニル酸を
補った培地を使用する以外は実施例１（２）と同様に行
う。形質転換株は、カナマイシン２０　Ｌｃｇ／ｍｌ相
当を含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコロニーとして
選択される。出現したコロニーの中からＭｌ寒天培地上
で生育できる形質転換株が得られる。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐＴｒｐ　２−３を各種制限酵素消化とアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５３の唯一
のＳａｌ　ｌ切断部位に約７．ｌＫｂのＳａｌ［）ＮΔ
切断片が挿入されたプラスミドであることがわかった。

ｐＴｒｐ　’ｌ　−３を用い、同様な方法でＬＡ１０５
株を再形質転換したところ、トリプトファン１００ｇ／
ｍｌおよびカナマイシン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ
寒天培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニル
酸非要求性となり、それらは、Ｓａｌ　Ｉの切断様式で
判定されるｐＴｒｐ　２−３と同一のプラスミドを保有
している。

以上の結果は、クローン化された約７．１Ｋｂの５ａｌ
ｌＤＮＡ切断片にはブレビバクテリウム・フラブムＡＴ
ＣＣ１４０６７のアンスラニル酸合成酵素をコードする
遺伝子が存在し、それがコリネバクテリウム・グルタミ
クムＬＡ１０５株中で発現していることを示す。

ｐＴｒｐ　２−３保育園株は米国アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
＋ｕｎ＋ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ２０＾ＴＣＣ３９０
３５として寄託されている。

プラスミドｐＣＥ５２を用いて上記と同様の処理を行い
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７の
アンスラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を有するプ
ラスミドｐＴｒｐ　４−３を得る。

ｐεＣ５２は本発明者らが先に開示したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧＩ　Ｃ特輸昭５
６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００）　）と大
腸菌のプラスミ　ドｐＧ＾２２　〔＾ｎ、Ｇ、ｅｔ　　
ａｌ　　：　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４０、４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプ
ラスミドである。詳しくはｐＣＧ　Ｉ上に１カ所しかな
いＢｇｆｆ■切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所あるＢａ
ｍＨＩ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内の
Ｂａｍ１（Ｉ切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端
を利用して連結したものである。ｐＣε５２はｐＧＡ２
２由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを
有し、制限酵素５ａｉｌに対する切断部位は１カ所であ
る。

ρＣＥ５２は実施例１　（１）でｐｃｃ　Ｉ　１を単離
したのと同様の方法でｐＣＥ５２保有株コリネバクテリ
ウム・グルタミクムし一２２株の培養菌体から単離する
。

上記と同様にトリプトファン生産性のコリネバクテリウ
ム・グルタミクムに３６株（ＦＥＲＩＪ　ＢＰ−４５１
）をｐＴｒｐ　４−３で形質転換する。得られた形質転
換株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ　Ｋ３１゜ＡＴＣＣ３９２８０として寄託され
ている。

ｐＴｒｐ　２−３保有株コリネバクテリウム・グルタミ
クムに２０．ＡＴＣＣ３９０３５およびｐＴｒｐ　４−
３保有株同に３１．　ＡＴＣＣ３９２８０によるＬ−）
リブトファン生産試験を下記のとおり行う。

菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液Ｑ、５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ４〔廃糖蜜１００
ｇ／　ｆ！、（Ｎｌ（、）　２Ｓ０４２０　ｇ　／β、
にＨ２ＰＯ４０，５ｇ／　ｅ　、　Ｋ２ＨＰＯ，０，５
ｇ　／　ｊ！、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，２５ｇ　／　
Ｒ、ＣａＣＯ５２０ｇ／　１、ｐＨ７，２１の入った試
験管に植菌し、３０℃で９６時間振盪培養する。

培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量して、Ｌ−トリプトフ
ァンの生成量を測定する。

対照として、ＬＡ−１０５株およびＬＡＲ−１株を同様
に処理する。

結果を第４表に示す。

第　　　４　　　表 菌　　　　株　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌ−）
リブトフ７ン（ｍｇ／ｍ１）ＬＡ−１０５ ＬＡ−１０５／ｐＴｒｐ　　２−３（Ｋ２Ｏ，ＡＴＣＣ
３９０３５）　　　　　０．３　４ＬＡＲ−１０，４８ 実施例５．　　ｐｃＢｌｏｌの作！！：（１）　　ｐｃ
Ｇｌｌ　とｐＬＩＢ１１０ノ分離ｐｃＧｌｌは、本プラ
スミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミクムＬ
Ａ１０３／ｐｃＧ１１（ＡＴＣＣ３９０２２）を４００
ｍ１ＮＢ培地でＯＤ約０．８になるまで生育させ、その
培養細胞から、実施例１（１）でｐＣＧ２を単離したの
と同一の方法で単離する。

ｐｕｅｔｔｏは、グリクヂンらの方法（Ｇｒｙｃｚａｎ
。

Ｔ、　Ｊ、ｅｔ　　ａｔ、　　：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、１３４．３１８（１９７８）参照〕により、
本プラスミドを保存するバチルア、−サチルス３Ｒ”’
／ｐＵＢ”’　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾、　７５．１４２３（
１９７８））の培養菌体から単離する。

（２）　　ｐｃＧｌｌ　とｐｕｅｔｔｏの試験管内組換
え上記で調製したｐｃＧｌｌ　プラスミドＤＮＡ　２Ｊ
ｔｇを含む制限酵素Ｂｇｊ！ＩＩ反応緩衝液（１０Ｉｎ
Ｍトリス塩酸、７ｍＭ　　！ＪｇＣＬ、　６（ｂｎＭ　
　ＮａＣｊ！、　７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、
ｐＨ７，５）１００βに２単位のＢｇｉ（全酒造社製、
６単位／ｍ）を添加し、３７℃で６０分間反応させる。

また、ｐＵ８１１０プラスミドＤＮＡ２Ｊｉｇを含む制
限酵素Ｂａｍ１（Ｉ反応ｔＪｔ所液（１０ｍＭ　）リス
塩酸、７ｄ　！ＪｇＣ１２，１００ｍＭＮａＣｉ’、２
１１ＩＭメルカプトエタノール、０．Ｏ１％１％ランア
ルブミン、ｐＨ８゜０）１００μｇに２単位のＢａｍＨ
Ｉ（宝酒造社製、６単位／ｍ）を添加し、３７℃で６０
分間反応させる。

両制限酵素消化物を混合し、Ｔ４’Ｊガーゼ緩衝液４０
ｇ、ΔＴＰ　（５ｄ）４０ρ、Ｔ４リガーゼ０８２度お
よびＨ２Ｏ１２０Ｊｄ！を加え、１２℃で１６時間反応
させる。この混合物を、ＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノ
ール４００ｄで２回抽出し、ＴＥＳ榎所液に対して透析
したフェノールを除外する。

（３）　　ｐｃＢｌｏｌの取得 ２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応混合物
のｌ対ｌ混合液１ｏｏｎを供与ＤＮＡとして用い、実施
例１（３）と同様な方法で、コリネバクテリウム・グル
タミクムＬＡ１０３を形質転換し、カナマイシン耐性株
を選択する。出現したコロニーをカナマイシン１２．５
　Ｊｔｇ／ｍｌ　するいはスペクチノマイシン１００■
／ｍｌを含ｂＮＢ寒天培地上にレプリカし、３０℃で２
日培養して生育した二重耐性形質転換株３株を任意に選
び、同一寒天培地上で純化する。この３株を４００ρＮ
Ｂ培地で、ＯＤ約０．８になるまで生育させ、集菌後、
その培養細胞から実施例１（１）記載のエチジウムブロ
マイド−セシウムクロライド密度勾配遠心によりプラス
ミドを単離する。いずれの形質転換株からも３０〜３５
■のプラスミドＤＮＡが得られる。

これらのプラスミドＤＮＡを実施例１（３）と同じよう
に制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、分
子量と制限酵素Ｐｓｔ　ｌ　、　ＥｃｏＲｒ、１１ｉｎ
ｃＩｌおよびＢｇｉの切断点を同定する。３株のプラス
ミドは全てｐｃＧｌｌとｐＵＢｌｌＯが和合連結した構
造を有し、そのうち二種は第２図にｐｃａｌ旧で示した
構造であるが、他の一種は結合向きが逆向きである。

いずれのプラスミドを有する形質転換株もρＣＧＩＩ由
来のスペクチノマイシン耐性形質とρｕｅ＋ｉｏ由来の
カナマイシン耐性株質を有している。

これらのプラスミドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬ＾１０３株を再形質転換した結果得ら
れたカナマイシン耐性形質転換株は、スペクチノマイノ
ン耐性形質を同時に獲得しており、各種制限酵素切断様
式で特徴付けられる供与プラスミドと同一のプラスミド
を保有している。

実施例６゜ コリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ５６株のし一ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバク
テリウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムによるし一ヒスチジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ５６
株の染色体ＤＮＡとプラスミドｐｃＧ１１の調製：１．
２．４−）リアゾール−３−アラニン耐性でヒスチジン
生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ
５６株（ＦＥＲＭ　０Ｐ−４５３＞の染色体ＤＮＡを実
施例１（１）と同様の方法で調製する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐｃＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導株
ＬＡ１０３のｐｃＧ１１保有株ＬＡ　１０３　／　ｐＣ
Ｇ　ｌ　１（ＡＴＣ（：３９０２２）から実施例１（１
）と同様にして単離する。

（２）コリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ５６株の
ヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化： 上記で調製したｐＣＧ　ｌ　１　プラスミドＤＮΔ３Ｊ
ｉｇおよび上記染色体ＤＮＡ９ｇを含む制限酵素Ｂｇｌ
Ｕ用反応液（１０ｍＭ　ｌ−リス（ｐＨ７，５）　、７
ｍＭＭｇＣｊ！　２．６０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ２−
メルカプトエタ／　−ル）　２００ｍｌ：１０単位（Ｄ
ｉｇ　（ｌ　ＩＩ　（宝酒造社製）を添加し、３７℃で
６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止
させる。この混合消化物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリ
ス２００ｍＭ、ＭｇＣｊ’　２６６ｍＭ、ジチオスレイ
トール１００ｍ１Ｊ　、　ｐＨ７．６）４０ｍ、５ｍ１
ｌΔＴＰ溶液４０ｄ、　Ｔ　４１Ｊガーゼ（宝酒造社製
、１１位／Ｊｔ１）０．３ｄおよび水１２０ｍを加え、
１２℃で１６時間反応させる。

Ｔ４４Ｊガーゼ応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクム１８３３株（ヒスチジン要求性、リゾチーム感受
性）の形質転換に供する。

形質転換は１Ｊ１３３株のプロトプラストを用いて行う
。プロトプラストの調製は実施例１（２）と同様に行う
。

プロトプラスト！！濁液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２
５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、ＴＳ’ＪＣ緩衝液
（１０ｍｌＪ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５（１ｍｌＪ　）リス、４００ｍ＆ｌ　ショ糖、ｐ
Ｈ７，５）　　１ｍ１１．：、再懸濁して遠心洗浄後、
ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、１ｍｌに再懸濁する。この懸濁液に
２倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混
合物のｌ対ｌ混合液１００ＪＩＩＩを加えて混和し、次
いでＴＳＭ（Ｊ漬液中に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を
含む液Ｑ、３ｍｌを添加して混合する。３分後、ＲＣＧ
Ｐ培地（ｐＨ７，２）　２ｍｌを添加し、２．５００Ｘ
ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈降し
たプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してか
ら０．２１Ｔ１１をスペクチノマインン４００ｘｒ／ｍ
ｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒
天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗抹し、３０℃で７日間
培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノマイ／ン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スペクチノマインン１００Ｍ／ｍｌを含む最少寒天培地
Ｍｌに塗布して３０℃で２日間培養し、スペクチノマイ
ンン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質転換株
を選択する。

形質転換株の１株から実施例１（１）記載のエチジウム
ブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠心によりプ
ラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化およ
び２種類の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ１
＃ｉ片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラス
ミドＤＮＡの制限酵素切断様式を同定する。このプラス
ミドをｐＰＨ８と命名した。ｐＰＨ８はｐｃＧｌｌ　の
Ｂｇｉ切断部位に約１０．６ＫｂのＤＮＡ断片が挿入さ
れた構造である。

さらにｐＰＨ８Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＨ３３株（１８３３
株の親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）二ＦＥ
Ｒｕ　８Ｐ−４５２）を再形質転換したところスペクチ
ノマイノン耐性株として選択される形質転換株のすべて
がヒスチジン非要求性となっていた。

これらのことより、ヒスチジン生産菌Ｃ１５６株のヒス
チジン生合成に関与する遺伝子がクローン化されている
ことが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
からＨ３３株を宿主菌株として用いて行うこともできる
。

（３）　　ｐＰＨ８を保有するコリネバクテリウム・グ
ルタミクム菌株によるし一ヒスチジンの生産：コリネバ
クテリウム・グルタミクムＬＡ−１０３株（ＦＥＲＭ　
Ｐ−５９４７、ＡＴＣＣ３１８６６）をｐＰＨ８Ｄ　Ｎ
　Ａで形！１転ｍし、スペクチノマイシン４００　埒／
ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換
株を選択する。得られた形質転換株を純化後、上記と同
様にプラスミドｔ４離、構造解析を行って、ｐＰＨ８と
同じ構造のプラスミドであることを確認した。

ｐＰＨ８保存株コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ
１０３／ｐＰＨ８は米国アメリカン・クイズ・カルチャ
ー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇ
ｌｕｔａｍ＋ｃｕｍＫ３２．ＡＴＣＣ３９２８１として
寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムしＡｌＯ３／ｐｃＧ
１１（ＡＴＣＣ３９０２２）および同しＡｌＯ３／ｐＰ
Ｈ８（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ−ヒスチジン生産試験
を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養した上記の閑をそれぞ
れｌ白金耳ずつ２００■／ｍ　Ｉのアルギニンおよびメ
チオニンを補った５ｍｌの生産培地Ｐ５［糖蜜１２％（
糖として）　、ＫＨ２ＰＯ４０，２％、に２１１ＰＯ４
０，１％、ＪＳＯ＜・７Ｈ２００，０５％、ＮａＣＲＯ
，２５％、ｃＮＨ４＞２ＳＯ４２，３％、尿素０．２％
、ＣａＣＯｘ　　２％、ｐＨ７，４（アンモニアで調整
）〕に植菌する。３０℃で７５時間培養後、培地中のし
一ヒスチジン生成ｌをスルファニル酸（ボーリー）試薬
を用いる比色法（Ｈ，Ｐａｕｌｙ。

Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ　；　Ｚ、　Ｐｈｙｓ＋ｏ
ｌｏ、Ｃｈｅｍ１４２．５０８（１９０４）　、同９４
．２８４（１９１５）　）によって定量した。結果を第
５表゛に示す。

第　　　５　　　表 ＬΔ１０３／ｐｃＧ１１　　　　　　０（４）　　ｐ　
Ｐ　Ｈ８を保有するコリネバクテリウム・ハーキユリス
、ブレビバクテリウム・フラブムおよびブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムによるし一ヒスチジンの生
産： コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐＰＨ８を保有させるために
、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各菌株を３３Ｍ培地で増殖させ、ＯＤ６６００ｍが０．
２になったときにペニシリンＧを０．３単位／ｍｌとな
るように添加する。培養を続け、００６６０ｎｍが０．
６まで増加したところで集菌し、ｌ＋ｎｇ／ｍｌリゾチ
ームを含むＲＣＧＰ培地中で上記の記載と同様にプロト
プラストを形成させる。ｐＰＨ８を用い、上記の方法に
従い形質転換を行い、形質転換株をスベクチノマイシン
４００ｘ／ｍ＋を含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコ
ロニーとして選択する。

純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７−１８３７９９、同
５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらがｐ
Ｐ）１８と同じ構造を有することが制限酵素切断様式よ
り確認される。以上のことから、プラスミドｐｃＧ１１
の誘導体であるプラスミドｐＰＩ１８はコリネバクテリ
ウム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フラブムお
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも
複製可能であり、プラスミドρＣＧＩＩが広くこれら菌
種の細菌で使用可能であることがわかる。

ｐＰＨ８保有株であるコリネバクテリウム・ハーキュリ
スに３３、ブレビバクテリウム・フラブムに３４、およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５は
それぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに＾ＴＣＣ３９２８２，３９２８３および３９２
８４として寄託されている。

これら菌株によるＬ−ヒスチジン生産試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃〜晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれｌ白金耳ずつ５ｍｌの生
産培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、
培地中のし一ヒスチジン生産量をボークー法によって比
色定量する。結果を第６表に示す。

以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成に関与する遺伝子がコリネバクテリウム・
グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキュリス
、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの諸菌種において発現し、ヒス
チジンの生産に寄与していることが明らかであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧＨ２の制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドｐｃＢＩ０１の制限酵素地図を示す
。 第３図はプラスミドｐＥｔｈｒ　１の造成のフローチャ
ートを示す。 特許出願人（１０２＞協和醗酵工業株式会社第　　　６
　　　表 第 図 ｔｏＲＩ 第 図 属 ω ｆｌａｍｌｌ工／ＲｑＩＸＩ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   菌種由来のアンスラニル酸合成酵素をコードする遺伝子
   を含むＤＮＡ断片とコリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属菌種中で自律複製可能なベクターＤＮＡ
   との組換え体ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、
   培養物中にＬ−トリプトファンを生成蓄積させ、該培養
   物からＬ−トリプトファンを採取することを特徴とする
   Ｌ−トリプトファンの製造法。