JPH02471A - Ｌ―リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法に関する。

さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体で、かつ両Ｄ
ＮＡの少なくとも一方が宿主菌株に対して外来性である
組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主菌株
を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し、該
遺伝子の形質を発現させることを特徴とする遺伝子の形
質発現方法に関する。

組換え遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立され、現在
までにソマトスタチン、インシュリン、ヒト生長ホルモ
ン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン
−β、口締病ワクチンなどのベブタイドやワクチンなど
の製造が可能であることが示された。生理活性の高いこ
れらベプタイドやワクチンの発現の宿主として大腸菌は
多くの場合十分であると考えられるが、さらに高い生産
性、菌体外への分泌、グリコジル化を求めあるいは菌体
内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌なども宿主と
して開発されてきている。

ペブタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産する場合
は、上記のような既に組換えＤ　Ｎ　Ａ技法が確立され
ているか、その基礎が整っている菌株を利用すればよい
が、アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物質などの物質の
工業的生産性の向上を組換えＤＮＡ技法により行う場合
には、同技法を従来使用されているそれぞれの生産菌に
適用する工夫が必要である。

コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物によるアミ
ノ酸の工業的製造に最初に用いられた微生物で、以後コ
リネバクテリウム属を含むコリネフォルムバクテリアに
よるグルタミン酸、リジン、アラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、チロシン、フェニルアラニン、スレオニ
ン、インロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン、プ
ロリン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が開発
され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物により生産
されるに至っている。

従ってこれら微生物における組換えＤＮＡ技法の確立は
、今後アミノ酸生産の向上のために極めて重要であると
考えられる。

組換えＤ　Ｎ　Ａ技法は、例えば （１）　　制限酵素による目的遺伝子を含むＤＮＡの断
片化 （２）同一制限酵素によるベクターＤＮＡの単一切断に
よる直鎖状化 （３）上記（１）、（２）の生成物の混合によるアニー
リングとＤＮＡリガーゼを用いる連結による組換え体Ｄ
ＮＡの作成 （４）　　上記組換え体ＤＮＡの宿主菌株への導入（形
質転換） （５）目的遺伝子を含む組換え体の選択と選択されたク
ローンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組換え体
保有株の造成の効率は、上記各段階の積ともいうべきも
ので各段階を検証する手段を準備し、各段階の効率を知
りこれを向上することなしには目的遺伝子の発現可能な
形質転換株を得ることができない。またこのようにして
目的遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する形質転換株が
得られたとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来性
である場合には該遺伝子の発現に際し種々の障壁がある
ことが知られており〔“化学と生物”１８．１１０〜１
１８　（１９７ｇ）　）その発現を行わせることは非常
に困難である。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性である目的遺伝子またはベクターを含む組換え体Ｄ
ＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させた例は今
まで全く知られていない。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とする組換えＤＮＡ技法においても、
これら微生物中で自律複製し、選択可能な表現型を有し
、多くの遺伝子のクローニングに用いうるベクター系の
造成と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。さ
らに上記したような障壁の解消方法の確立が必要である
。

本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
た〔特願昭５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９
９）　、同５６−５８１８７　（特開昭５７１８６４９
２）　、同５６〜６５７７７　（特開昭５７−１８６４
８９）　）。

そこで本発明者らは該プラスミドベクターに既ｊご知ら
れているインビトロにおけるＤＮＡ組倹え技法（ｔｌ、
Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　４，２３７，２２４）を用い、ア
ミノ酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含むＤＮＡ断
片を連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムし一２２株またはその誘導線を形
質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質を
発現され、アミノ酸などの有用物質の生産の増大に利用
することができることを見出し本発明を完成するに至っ
た。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は少なくとも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮＡの少なくも
一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体Ｄ　Ｎ　
Ａを用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物かろ選ばれる宿主菌株を形質転換し
て得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質
を発現させる方法を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核
生物、原核生物、ウィルス、バクテリオファージまたは
プラスミドに由来し少なくとも一種の完全な遺伝子を含
むＤＮＡ断片があげられる。

真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくにヒトの
インターフェロン、インシユリン、生長ホルモンなどの
ベブタイドをコードする遺伝子などがあげられる。原核
生物に由来する遺伝子としては細菌とくにエッシェリヒ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
バチルス属またはスタフィロコッカス属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、細胞の代謝、とくに合成活性
に関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝または
合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸または抗生物
質などの合成ならびにその合成に関与する代謝系を意味
し、本発明においてはアミノ酸とくにグルタミクム、リ
ジン、スレオニン、ヒスチジンまたはトリプトファンの
生合成活性が好適にあげられる。

また目的とするペブタイド、蛋白質などのアミノ酸組成
が知られているときは、相当するＤＮＡを合成して用い
ることもできる。ＤＮＡ合成方法はたとえば、Ｋ、　１
ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ＬＬ　５ｃｉｅｎｃｅ　１ｉｆｔ
、　１０５６（１９７７）に記載の方法に従って行なう
ことができる。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和合性（ｃ
ｏｍｐａｔｉｂｌｅ）で自律増殖できるものでなくては
ならない。具体例としては本発明者らがコリネバクテリ
ウム属に属する微生物から採取した、または採取したも
のを誘導して造成したｐｃＧｌ〔特願昭５６−１８１Ｏ
Ｎ特開昭５７−１３４５００）　）　、ｐＣＧ２〔特願
昭５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９７）　
）　、ｐＣＧ４〔特願昭５６−５８１８６　（特開昭５
７−１８３７９９）　）、ρＣＥ５３、ｐｃＥ５４、ｐ
ｃＧＩＩ、ｐｃＢｌｏｌ、　Ｉ）Ｅｔｈｒｌなどがあげ
られる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　　　　　ＡＴＣＣｐ　
ＣＧ　１　　　　５８６５　　　　　３１８０８ｐ　Ｃ
Ｇ　２　　　　５９５４　　　　　３１８３２ｐ　ＣＧ
　４　　　　５９３９　　　　　３１８３０ｐ　ＣＥ５
４　　　　　　　　　　　３９０１９ｐ　ＣＧ　１１　
　　　　　　　　　　３９０２２ｐ　ＣＢ　１０１　　
　　　　　　　　３９０２０ｐＥｔｈｒ　１　　　　　
　　　　　　３９０２１好適にはｐｃＧｌｌ　、９Ｃε
５４が用いられる。ｐｃＧｌｌは本発明者らが先に開示
〔特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００
）　）　したプラスミドで、コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−５７　（ＡＴＣＣ３１８０ｇ、ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ５８６５）から分離されたプラスミドｐＣＧ　ｌ
における制限酵素Ｂｇｉのただ一つの切断部位に、コリ
ネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０　（ＡＴ
ＣＣ３１８３０、ＦＥＲＭ−Ｐ５９３９）から分離され
たプラスミドｐＣＧ４のストレプトマイシンおよび／ま
たはスペクチノマイシン耐性（Ｓｍ”／５ｐｅｃ”）遺
伝子を含むＢａｍＨ１断片を両者の同一接着末端を利用
して結合させたプラスミドである。

ｐｃＧＩＩ　は、分子量的６．８Ｋｂのプラスミドで単
一な制限部位としてＢｇｊ！ＩＩ、ｐｓｔ　Ｉを存しＳ
ｍ”　／　５ｐｅｃ”の表現型を与える。

ｐＥＣ５４は次のようにして作成することができる。

まず、ｐＣＧ２をその保育園コリネバクテリウム・グル
タミクム２２５−２１８株（ＦＥＲＭ−Ｐ５９５４　、
ＡＴＣＣ３１８３２）の培養菌体から特願昭５６−１３
３５５７　（特開昭５８３５１９７）に開示した方法で
、ｐＧＡ２２をその保有大腸菌の培養菌体から通常用い
られる方法で濃縮単離する。両プラスミドＤＮＡを各分
子中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばＰｓｔ　ｒ
で完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子の両端
に単鎖として・突き出た同一接着末端で両ＤＮＡ分子の
連結した和合分子を生成させるためにＴ４ファージＤ　
Ｎ　Ａ　’Ｉｆガーゼを作用させる。このＤ　Ｎ　Ａ混
成物中からの両プラスミド分子の和合連結した組換え体
プラスミドの取得は、−旦、ｐＧＡ２２に由来する１剤
耐性で選択されるコリネバクテリウム属あるいはブレビ
バクテリウム属菌種の形質転換株を分離し、これら形質
転換株の保有するプラスミドを解析することによって達
成される。

ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に開示
したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種のプロトプラストを使用する形質転換法〔特願昭５
６−５８１８７（特開昭５７−１８６４９２）および特
願昭５６−６５７７７（特開昭５７−１８６４８９）　
）により実施することができる。選択に用いる薬剤はｐ
Ｇ＾２２に由来する薬剤耐性遺伝子のうち、ｐＧ八へ２
との連結部位となるため挿入不活化されるアンピシリン
耐性遺伝子を除いた他の耐性遺伝子に対応するテトラサ
イクリン（ＴＣ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）ある
いはカナマイシン（に…）を使用すればよい。形質転換
株はＤＮＡ無添加系で受容菌プロトプラストが正常細胞
へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラサイクリ
ン０．４−１．６ｘ／ｌｌ１１１クロラムフｓ−’−コ
ール２．５−５　ｘ／ｍ＋およびカナマイシン１００−
８００河／ｍｌ）を含む高張寒天培地上で復帰するコロ
ニーを分離するか、あるいは、−旦非選択的に再生培地
上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この再懸
濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常
、テトラサイクリン０．５−４　ｑ／ｍＬクロラムフェ
ニコール２−１５　ｇ／ｍｌおよびカナマイシン２−２
５１／ｍｌ）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分
離することによって得られる。テトラサイクリン、クロ
ラムフェニコールあるいはカナマイシン耐性（Ｔｃ”、
　Ｃｍ”、　Ｋｍ”　とそれぞれいう）により選択され
た形質転換株の中には、ＩＩＧＡ２２由来の他の薬剤耐
性形質をも同時に獲得しているものがある。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、本発明者らが特願昭５６−１８１０１（特開昭５
７−１３４５００）および特願昭５６−６５７７７（特
開昭５７−１８６４８９）に開示した方法で培養菌体か
ら単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成す
るＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常法
により構造を知ることができる。

形質転換株の一株から分離されたプラスミドでρＣε５
４である。

ｐＣε５４　は大きさ約１４．５Ｋｂのプラスミドで、
単一制限部位としてεｃｏｌｔ　Ｌ　Ｓａｌ　Ｉ、Ｓｍ
ａ　Ｉ、　Ｘｈｏ　Ｉなどを有し、Ｔｃ’、　Ｃｍ”、
　Ｋがの表現型を与える。

Ｘｈｏ　ＩはＫｍ”遺伝子中にあり、いわゆる挿入不活
化（ＤＮＡ断片の挿入により当該表現型の発現が妨げら
れる現象）による選択も可能である。

プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特願昭５６−１８１０Ｈ特開昭５７−１３４５００）
、同５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９＞お
よび同５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５２９７
）に記載の方法に従って行えばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
の作製は、公知の試験管内組換えＤＮＡ技法を駆使する
ことにより実施できる。

試験管内のＤＮＡ組換えは、通常、目的の遺伝子を含む
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と再結合により行
われる。ＤＮＡの切断は、制限酵素を用いれば容易にで
きる。試験管内組換えに使われる制限酵素は生物種を問
わずすべての２本鎖ＤＮＡ上で特定の塩基配列部分を認
識し切断する。

その塩基配列は、制限酵素の種類により異なっている。

従って適当な制限酵素を使用することにより目的の遺伝
子は発現機能を損うことなく一つのＤＮＡ切断片として
切り出される。同一制限酵素により切断された供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの切断片の末端構造は同一構造を
もち、ある種の制限酵素の場合には１本鎖が突き出た接
着末端を与え、別の制限酵素では、平滑末端を与える。

いずれの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与体
ＤＮＡの切断片とベクターＤＮＡの切断片は、Ｔ４ファ
ージＤＮＡリガーゼにより連結することができる。

両ＤＮＡを異なる制限酵素で切断した場合も、例えば、
接着末端をＤＮＡポリメラーゼで修復して２本鎖として
、平滑末端になおしてから結合したり、ターミナルトラ
ンスフェラーゼで相補的なホモポリマーを付与して接着
末端としてから結合したり、あるいは、ある種の制限酵
素切断部位を含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカーを
連結させてから、その内部を切断して接着末端を作って
から結合させることができる。これらの連結法により目
的の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ切断片の
組換え体が生成する。

リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を−
Ｈクローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。

組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用でき
る。

Ｓ　Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、　ｓ、ＬａＬ　ｔｌ、ｓ、Ｐａｔ
ｅｎｔ　４．２３７，２２４、遺伝子操作実験法〔高木
康敬編著、講談社サンエンティフィー／り（１９８０）
　］　、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６
８、　Ｒｅｃｏｍｂ＋ｎａｎｔ　ＤＮＡ　ｅｄｉｔｅｄ
　ｂｙ　Ｒａｙ　１１ｕ、＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
　１９７９ 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有
する菌株ならばいかなる菌株を用いてもよい。好適には
本発明者らが先に特願昭５６−１５１４６４　（特開昭
５８−５６６７８）において開示したリゾチーム感受性
微生物を用いる。具体的な菌株の一例としては次の菌株
があげられる。

寄託番号 Ｆ［！Ｒ１１−Ｐ　　ＡＴＣＣ コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｌ−１５５９４６
３１８３４コリネバクテリウム・八−キズリス　Ｌ−１
０３５９４７３１８６６プレビバクテリウム・デイバリ
カラム　Ｌ−２０４５９４８３１８６７プレビバクテリ
ウム・ラクト７アーメンタム　Ｌ−３１２５９４９３１
８６８宿主微生物の組換え体ＤＮＡによる形質転換は１
）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプ
ラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロ
トプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選択
、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下に
示す。

ｌ）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵素リゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらに数世代増殖さ
せることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にする
ことができる。

このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇを純水ＩＩ！に含み、ｐＨ７，２に調整し
た培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ〔グルコース１０ｇ
５ＮＨ４ＣＩｌ　　４　ｇ、尿素２ｇ、酵母エキスＩｇ
、ＫＮ２Ｐ口４　１　ｇＳＫ２ＨＰＯ１３ｇ１１４ｇＣ
Ｌ・６）１２０　　０．４　　ｇ　、ＦｅＳＯ４４Ｈ２
０１０ｍｇ、ＭｎＳ口、・４〜６Ｌ口Ｑ、　２　ｍｇ、
　Ｚｎ５Ｏ＜・７ＨｚＯｏ、　９　ａ＋ｇ１ＣｕＳＯ１
・５Ｈｚ００．４　ｆｆ１ｇ。

Ｎａ２Ｂ＜０ｔ４０Ｈ２００，０９ｍｇ５　＜Ｎ■＜＞
＊Ｍｏ７０ｔ＜・４Ｈｚ８０、０４　ｍｇ、ビオチン３
０■、サイアミン塩酸塩１ｍｇを水１１に含み、ｐＨ７
，２に調整した培地〕などが用いられる。

この培地に微生物を接種し、振盪培養する。

比色計によって６６０ｒ＋ｍにおける吸光度（００）を
測定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝Ｏ，１〜０，４）に培
養液中０．１〜２．０単位／ｍ　Ｉの濃度になるように
ペニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養をさ
らに続けて、ＯＤが０．３〜０．５に増加したところで
細胞を集菌し３３Ｍ培地で洗浄する。次いで細胞を適当
な高張培地、例えばＰＦＭ培地（Ｓ３Ｍ２倍希釈液中に
シヨｆｉｌ　０．４　Ｍ　ＳＭｇＣｊ！　２・６Ｈ２０
０，０１Ｍを含み、ｐ）１７．０〜８．５に調整した培
地）あるいはＲＣＧ培地〔グルコース５ｇ１カゼイン加
水分解物５ｇ、酵母エキス２５　ｇ　、　Ｋ２ＨＰ０．
３．５ｇ５ＫＬＰＯ４１，５ｇ、１４ｇｃＬ・６）１２
０　０．４１ｇＦｅ５口＜・７Ｈ＊０　１０ｍｇ５　Ｍ
ｎ５Ｏ＊・４〜６）１２０　２　ｔａｇＳ　１ｎｓＯ＜
・７Ｈ２００，９ｍｇ、　ＣｕＳＯ４’５Ｈ７Ｏｏ、　
４　ｍｇ、　ＮａＪｎ０１４０１（ｚｏｏ、　０９　ｍ
ｇ、　（Ｎ）＋４）６Ｍ０．０２４’４）＋２００．０
４　ｍｇｓビオチン３０Ｊｉｇ、サイアミン塩酸塩２ｍ
ｇ、コハク酸二ナトリウム１．３５　ｇを水１１に含み
、ｐＨ１，０〜８．５に調整した培地〕に再懸濁する。

この細胞懸濁液に最終濃度０．２〜１０ｍｇ／ｍｌ　と
なるようにリゾチームを加え３０〜３７℃で反応する。

プロトプラスト化は反応時間が進むにつれて進行し、そ
の経過は光学顕微鏡で観察できる。顕微鏡下でほとんど
の細胞がプロトプラスト化されるに要する時間は、細胞
培養時の添加ペニシリン濃度および用いるリゾチームの
濃度によって変わるが、前記条件にて３〜２４時間であ
る。

生成したプロトプラストは低張条件で破裂列するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約ｌ０−４の残存度に
抑えることができる。

このようにして、Ｊｊ！ｉｌｌしたプロトプラストは適
当な高張寒天培地上でコロニー形成能（再生能）を有す
る。この寒天培地としては栄養培地、半合成培地あるい
は数種類のアミノ酸を補充した合成培地に０．３〜０．
８Ｍコハク酸二ナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニ
ルピロリドン（分子１１０．０００するいは４０．００
０　＞を含有させたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地（ＲＣＧ培地に３％のポ
リビニルピロリドン（分子量１０．０００）　と１．４
％の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いることが
できる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい。

再生コロニーの出現が認められるのに要する培養日数は
菌株により差があるが、釣菌できるまでの大きさになる
のは１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種、培養中
途ペニンリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によっ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり１０−
２〜１０−’の効率である。

２）プロトプラストへの組換え体ＤＮＡによる形質転換 プロトプラストへの組換え体ＤＮＡの取り込みは細胞が
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１．５４０〜６．０００）あるいはポリビニル
アルコール＜ｐｖＡ、Ｍ合皮５００〜１，５００＞と二
価金属陽イオンを加えて処理することによって行われる
。高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロト
プラストの保持に一般に使われるものでよく、例えばシ
ョ糖やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。Ｐ
ＥＧおよびｐｖＡの使用可能な濃度範囲は最終濃度で各
々５〜６０％、１〜２０％である。二価金属陽イオンは
最＃濃度１−１００ｄのＣａ＋゛、Ｍｇ”、Ｍｎ”、９
ａ゛＋５ｒ−−などが効果的で単独あるいは併用するこ
とができる。処理の温度は０〜２５℃が好適である。

３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 ！ｌＩ換え体ＤＮＡで形質転換処理したプロトプラスト
の再生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハ
ク酸二ナトリウムとポリピロリドンを含有する高張寒天
培地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを塗布
し、正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５℃で
培養することによって行われる。形質転換株は供与体Ｄ
　Ｎ　Ａに由来する遺伝子が菌に付与する形質について
選択することによって取得できる。この特徴的形質獲得
に基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行って
もよく、あるいは−旦非選択的に再生させてから再生正
常細胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したリ
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程１）におけるペニシリン処理を行なわずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
１）〜３）走向様に行えばよい。リゾチーム感受性微生
物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたり１Ｏ−４〜
ｌ０−６の高頻度で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。

組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由
来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて
培地に薬剤を補給するときもある。

本発明の形質発現方法により生産されるアミノ酸などの
有用物質の採取は、発酵液からのこれらの物質を採取す
る常法により行なわれる。

本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物
質、酵素、ベプタイド、蛋白質の生産性の増大または新
たな生産性の付与が可能となった。また微生物の代謝活
性を強化し、基質の利用能を増大させ、新たな代謝活性
を与え、新しい基質の利用性を与えるなどの製造法の改
良も可能になった。

さらに本発明における？！ｆｙ：１．は、異種遺伝子あ
るいは外来性の組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属微生物において発現させるの
に成功した点にある。すなわち、実施例に示すような大
腸菌のスレオニンオペロン、フオスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣ）遺伝子、枯草菌およびブ
ドウ状球菌で発現する遺伝子ｐＨＢ１１０　（Ｋｅｇｇ
ｉｎｓ　Ｋ、！Ｊ、、　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　Ｌｉ
、　１４２３（１９７８）　）のカナマインン耐性遺伝
子、コリネバクテリウム・グルタミクムのリジン生合成
に関与する遺伝子、ブレビバクテリウム・フラブムのア
ンスラニレート合成酵素遺伝子がコリネバクテリウム属
菌において発現した。

例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのプラスミドに連結した形で導入されており
、コリネバクテリウム・グルタミクムで発現させるため
の特殊な操作は施していない。また、遺伝子を含むＤ　
Ｎ　Ａ断片を、コリネバクテリウム・グルタミクムのプ
ラスミドに対して、いずれの向きに連結しても、コリネ
バクテリウム・グルタミクム内で発現することから、コ
リネバクテリウム・グルタミクムは、導入された遺伝子
の転写・翻訳の開始点を正確に認識し、転写・翻訳を遂
行できる機能をもつことが明白である。周知のように全
ての遺伝子は、正確に転写・翻訳が開始されるために必
要な塩基配列のレベルで類似性のある部位を存している
ことを考慮すると、コリネバクテリウム・グルタミクム
は、例示した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点を
も認識して発現しうることが容易に推察される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにもかかわら
ず、産業上の重要性から各研究者により、種々の囲包が
付されており属名までもコリネバクテリウム属あるいは
ブレビバクテリウム属などさまざまである。しかしなが
ら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの
塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間に
は、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが明
らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白であ
るｌ：Ｋｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、　：Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ
　ｔｈｅＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　　Ｎｏ、５５．　１（１
９８０）および５ｕｚｕｋｉ、に、ｌにａｎｅｋｏ、　
Ｔ、ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ。

に、　　：　　Ｉｎｔ、Ｊ、　　５ｙｓｔ、　　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、３１．　１３Ｈ１９８１）参照〕。本
明細書では組換えＤＮＡ実験に使用できる宿主が規制さ
れているため、本発明の有用性はコリネバクテリウム・
グルタミクムし−２２の誘導株を宿主として示したが上
記の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にその
まま適用できることが容易に類推される。組換え体ＤＮ
Ａがこれら菌種において安定に保持され、発現されるた
めにはＤＮＡの相同性など宿主菌の性質における若干の
相違は問題でなく、これら菌種が当該プラスミドの自律
複製と導入遺伝子の発現を可能にする機能を有していれ
ばよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能を共有し
ていることは、本発明者らが、先に開示〔特願昭５６−
５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）　）　したコ
リネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０から分
離され、ストレプトマイシンおよび／またはスペクチノ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドρＣＧ４がコリ
ネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種など
、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、また、その
耐性遺伝子が発現される〔特願昭５６−５１１１１８７
（特開昭５７−１８６４９２）　）ことから明らかであ
る。従って、本発明を適用し得る宿主菌としては、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグルタ
ミン酸生産菌全てが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタ
ミクム＾ＴＣＣ２１５４３のリジン生合成に関与する遺
伝子のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム
・グルタミクムによるリジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ［
：２１５４３の染色体ＤＮＡとベクターｐｃＧ１１の調
製：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２から誘導され、リジンアナログであるＳ−（２−ア
ミノエチル）−システイン（以下ΔＥＣと略す）に耐性
を有するリジン生産性変異株コリネバクテリウム・グル
タミクム＾ＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡを次のよう
にして抽出単離する。

４０　Ｑｍｌ半合成培地ＳＳＭＣグルコース２０ｇ１（
ＮＨ４）　２Ｓ０４１０　ｇ、尿素３ｇ、酵母エキスＩ
ｇ、Ｋ＋（２Ｐ０４　　１　　ｇ、ＭｇＣ１ｘ−６８ｚ
０　０．４　　ｇ、Ｆｅ５Ｄ＜・７Ｈｚ０１０ｍｇ、ｌ
１ｎＳＯｓ’４−６Ｈ２０Ｑ、２　ｍｇ、ＺｎＳＯ４’
７）１２００．９ｍｇ、　Ｃｕ５Ｏｎ’５Ｈｚ００．４
　ｍｇＳＮａ２Ｂ４０ｔ’１ＯＨ２０ｏ、　０９’ｇｓ
　（Ｎｉ１４）６Ｍｏｔｈ２４・４Ｌ００．０４　ｍｇ
−ビオチン３０ｇ、サイアミン塩酸塩Ｌ■を水１ｚに含
みｐＨ７，２に調整した培地〕にスレオニンを１００■
／ｍ　ｌとなるように補った培地に種培養を接種して３
０℃で振盪培養する。東京光電比色計で６６０ｎｍにお
ける吸光度（００）を測定し、ＯＤ　０．２になった時
点で培養液中０．５車位／ｍ　ｌの濃度となるようにペ
ニシリンＧを添加する。さらに培養を継続しＯＤ約０，
６になるまで生育させる。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液（０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）　、０．００５！４Ｅ（ｌＴＡ、　０．０５１Ｎ
ａＣｊ！　：ｐＨ８，０）で洗浄後、リゾチーム液（２
５％５％シミ０．１＆Ｎ１ａＣｊ！、０．０５Ｍ）リス
、０．８ｍｇ　７ｍ　ｌリゾチーム：ｐＨ８，０以下同
じ）　ｌＱｍｌに懸濁し３７℃で４時間反応させる。集
菌した菌体から斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ、　）Ｉ、　
ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、　７２　、６１９（１９６
３）　：ｌに従って高分子染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐｃＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導株
Ｌ＾１０３のｐｃＧｌｌ保有株し＾１０３／ｐＣＧ　１
１（ＡＴＣＣ３９０２２＞から次のようにして単離する
。

４ＱＱｍｌＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス
５ｇを水ｌＩ！に含みｐ）１７．２に調整した培地）で
３０℃で振盪培養しＯＤ約０，７になるまで生育させる
。菌体を集菌し、ＴＥＳｌｌ衡液で洗浄後、リゾチーム
液ＩＱｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応
液に５Ｍ　ＮａＣｊ！　２．４ｍｌ、　０．５ＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨＩ３．５）　　０．６＋ｎｌ、　４％ラウリル
硫酸ナトリウムと０．１ＭＮａＣＲからなる溶液４．４
ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５
時間置く。

溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間、６９、４０
０　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。

これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール
（ＰＢＧ）　６．０００　（半井化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水中に置く。１０時間後１
．５ｆ）ＯＸ　ｇで１０分間遠心分離してベレットを回
収する。ＴＥＳ緩衡液５ｍｌを加えてペレットを静かに
再溶解してから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイ
ド２．Ｏｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し密度を１．５８０に合わせる。この溶液を１
０５．０００　ｘ　ｇ　、　１８℃テ４８時間超遠心分
離にかける。この密度勾配遠心により共・有結合で閉じ
られた環状のＤＮＡは、紫外線照射することによって遠
心チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出される
。このバンドを注射器で遠心チューブの側面から抜きと
ることによってｐｃＧｌｌ　ＤＮＡが分離される。次い
で分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容１ｄ
分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３のリジン生合成に関与する遺伝子のクローン
化 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮΔ３ＪＬｇを
含む制限酵素Ｂｇｊ’ｎ用反応液（１（ｂｎＭ　）　リ
ス塩酸、７ｍＭ　ＩＪｇｃｆ２．６０ｄ　　ＮａＣＬ　
７ｄ　２メルカプトエタノール、ｐＨ７，５）　６０Ｊ
Ｉ１１に６単位のＢｇｆＵ　（宝酒造社製）を添加し、
３７℃で６０分間反応後６５℃で１０分間加温して反応
を停止する。一方コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡ８ｕｇを含む制限酵素
３ａｍＨＩ反応液（１０ｍＭ　）リス塩酸、？＋ｎＭＭ
ｇＣＬ、１００ｍＭ　ＮａＣｊ！、　２ｍＭ２−１ルカ
ブトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ
８，０）　１４０Ｊｔｔｔに４単位の３ｄｍＨＩを添加
し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温し
て反応を停止させる。

雨滴化物を混合し、Ｔ４’Ｊガーゼ用緩衝液（トリス塩
酸６６０ｍＭ、　ＭｇＣ１’２６６１１１Ｍ　、ジチオ
スレイトール１１００Ｉｎ、　ｐＨ７，６＞　４０ｍ、
ＡＴＰ（５ｄ）　４０１１１、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社
製、１単位／１ｄｌ）０．３ｔｄおよびＨ２Ｏ１２ｈｊ
！を加え、１２℃で１６時間反応させる。この混合物を
ＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール４００ρで２回抽出
し、ＴＥＳ瑳ｍ液に対して透析してフェノールを除外す
る。

このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウム・グル
タミクム上−２２株から誘導させたＡＢＣ感受性のＬＰ
４株の形質転換に供する。

形質転換はＬＰ４株のプロトプラストを用いて行なう。

ＬＰ４株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤｏ、６になった時点で集菌し、該細胞をＲＣ
ＧＰ培地〔グルコース５ｇ１カザミノ酸５ｇ、酵母エキ
ス２．５ｇ、に２ＨＰ口。

３．５ｇ、にＨ２ＰＯ，１，５ｇ　、　ｌ！ｇＣｌ　２
・６ｔ＋ｔｏ　ｏ、　４１ｇ、ＦｅＳＯ４−７１１２０
１０ｍｇ５　ＭＩＩＳＯ４・４〜６Ｈ２０２ｆｆ１ｇ。

２ｒ＋５Ｏ１−７Ｈ２００，９ｍｇ、（Ｎ）Ｉ、）、！
Ｊｏｔ０２＜・４Ｈ２００，０４ＵＳビオチン３０■、
サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１３５
　ｇ、ポリビニルピロリドン（分子！１１００００）　
３０　ｇを水１ｉ’に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌ　のり
ゾチームを含む液（ｐＨ７，６）に約１０９細り包／ｍ
　ｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で
５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化する。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５＋ｎｌを小試験管にとり
２５００ｘｇで５分間遠心分離しＴＳＭＣ緩衝液（１０
ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウム、５０
ＩＴＩＭトリス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５）１ｍ
ｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、１ｍｌ
に再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衡液
と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物のｌ対ｌ混合液１００
ｍを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％Ｐ
　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して混合
する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　２ｍｌを
添加し、２．５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離にかけて
上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌの
ＲＣＧＰ培地に懸濁してからＱ、２ｍｌをスペクチノマ
イシン４００　ｘ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣ
ＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐ）１７．２）に
塗抹し、３０℃で７日間培養する。

寒天培地上に生育した菌全遣をかき集め生理食塩水で洗
浄後、１ｍｌの生理食塩水に懸濁する。

この菌液をスレオニン２ｍｇ／ｍ１、八〇Ｃ２ｍｇ／＋
ｎ　Ｉおよびストレプトマイシン１２．５■／ｍ　Ｉ相
当を含有する最少寒天培地Ｍｌ　　（グルコース１０ｇ
。

ＮＨ，）Ｉ２ＰＯ１１ｇ、　ＫＣｌ　０．２　ｇ　、　
Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００、２ｇ　、　ＦｅＳＯ４’７Ｈ
Ｊ　１０ｍｇ、ｙｎｓＯ，−４〜６８ｚＯＯ，２ｍｇ、
　２ｎＳＯ＜４）１２００．９　ｍｇ、　ＣｕＳＯ４・
５ＨＪ　ｏ、　４　ｍｇ１Ｎａ２８４０ｉ’１ＯＨ２０
０，０９ｍｇｓ　（ＮＨ４）８ＭＯ７０２４’４Ｈ２０
０、０４ｍｇ、ビオチン５０■、ｐ−アミノ安息香酸２
、５　ｍｇ、サイアミン塩酸塩１＋＋＋ｇ、寒天１６ｇ
を水１１中に含みｐＨ７，２に調整した培地〕上に再塗
布して３０℃で３日培養する。出現したコロニーの中か
らＡＥＣ、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシ
ンに耐性の株が得られる。

これらの形質転換株の保有するプラスミドは、前記のｐ
ｃＧｌｌを単離したのと同様の方法で単離される。これ
らのプラスミドＤＮＡ　１ｇｇを用い、ｐｃＧｌｌ上に
切断部位のある制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化後、アガ
ロースゲル電気泳動で解析し、生成断片の和から分子１
を同定した。分子１は同一アガロースゲル上で同時に泳
動したラムダファージＤＮＡの制限酵素Ｈｉｎｄｌ［ｌ
消化で生成する分子量既知の各断片の泳動距離で描かれ
る標準曲線に基づいて算定する。形質転換株の一株から
得られたプラスミドｐＡｅｃ　５は分子！ｌ　１０．７
ＷｂでｐｃＧｌｌ　のＢｇ！■切断部位に３．９にｂの
ＤＮＡ断片が挿入された組換え体プラスミドである。

ｐＡｅｃ５ＤＮＡを用い上記と同様な方法でＬＰ４株の
プロトプラストを形質転換しスベクチノフイシン耐性で
選択される形質転換株は同時にへεＣ耐性形質を付与さ
れたεｃｏＲＩの切断様式で判定されるｐＡｅｃ　５と
同一のプラスミドを保有している。即ちｐＡｅｃ　５に
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１５４３
のＡＢＣ耐性形質を支配する遺伝子がクローン化されて
いることが明らかである。ｐＡｅｃ　５保存菌株は米国
アメリカン・タイプ・カルチ＋−’：ＩＬ／クションに
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａＩＴｌｉｃ
ｕｍ　Ｋ１７＾ＴＣＣ３９０３２として寄託されている
。

（３）　　１１Ａｅｃ　５保有株によるリジンの生産コ
リネバクテリウム・グルタミクムし一２２株から誘導さ
れたＬＰ４株のρ＾ｅｃ５保有株（ＡＴＣＣ３９０３２
）と非保有株のリジン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地
上で生育させた菌を１白金耳ずつ５ｍＭの生産培地ＰＩ
（グルコース１００ｇ、　（ＮＨ，）２ＳＯ４２４、５
ｇ　、にＨ２ＰＯ４１ｇ、　Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００，
４ｇ。

Ｆｅ５Ｏａ’７ＨｚＯｌｏ＋ａｇ、　ｕｎｓｏｓ−４−
６ｔ＋ｚ０１０ｍｇ、ビオチン５０■、サイアミン塩酸
塩２００ｇ、パントテン酸カルシウム５０ｈｇ、ニコチ
ン酸５００■、大豆加水分解物１０　ｇ　、炭酸力ルン
ウム３０ｇを水１ｐに含みｐＨ７，２に調整した培地〕
の入った試験管に植菌し３０℃で７５時間振盪培養する
。培養後、培地中のＬ−リジン生成遣を酸性−銅ニンヒ
ドリン反応を用いる比色法によって測定した結果を第１
表に示す。

第　　　　１　　　　表 Ｐ−４ 実施例２．　大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝
子のクローン化とその遺伝子の発現を利用したコリネバ
クテリウム・グルタミクムによるスレオニンの生産： （リ　大腸菌スレオニンオペロンを含有するＤＮＡ断片
のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクムへの
導入： クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして用いたｐＧ＾２２は本プラスミドを作製し
たアンらが用いている方法〔＾ｎ、　　　Ｇ、　　　ａ
ｔ　　ａｔ　　　：　　Ｊ、　　　Ｂａｃｔｅ口ｏｆ、
、　　　Ｌｍ　　　４００（１９７９）　］に従い、本
プラスミドを保有する大腸菌に一１２株亜株の培養菌体
から単離する。供与ＤＮＡとなる高分子染色体ＤＮＡは
大腸菌に１２株（ＡＴＣＩ”２３７４０）の培養菌体か
らスミスのフェノール抽出法（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍ、　Ｇ
、　　：　！Ｊｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙ−ｍｏｌｏｇ
Ｙ、　　１２．　ｐａｒｔ　Ａ、　５４５（１９６７）
）に従って単離する。

ｐｃ＾２２プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　４４ｇを含む制限酵
素１１＋ｎｄｌ１反応液（１０ｍＭ　）リス塩酸、７ｍ
Ｍ　ＭｇＣＩｔ　２゜６０ｍ！Ｉ　ＮａＣＩｌ、　ｐｌ
（７，５）　６０ｍに０．４単位のＨｉｎｄｕ（宝酒造
社製、６単位／屑）を添加し３７℃で３０分間反応後６
５℃で１０分間加温して反応を停止する。ｐＧＡ２２に
は２ケ所のＨｉｎｄＵＩ切断部位が存在するが、同一条
件で旧ｎｄ［［消化した試料をアガロースゲル電気泳動
で調べた結果、−断片に切断されていることが確認され
る。別に、染色体ＤＮ＾８Ｉｔｇを含む制Ｖａ酵素）１
ｊｎｄ１反応液】４０屑に４単位の旧ｎｄｍを添加し３
７℃で６０分間反応後６５℃で１（１分間加温して反応
を停止させる。

雨滴化物を混合し、Ｔｌガーゼ用緩衝液４０μＩＳＡＴ
Ｐ（５ｍＭ＞４０ｍ、　Ｔ　４リガーゼ０．３ｇおよび
）＋２０　ｔ２０ｍを加え、１２℃で１６時間反応させ
る。

この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００
ρで２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノ
ールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＧＴ−
３［Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１１７．　１３
３−１４３（１９７４）　　）（ホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸要求性）の形質転換に供与する。

ＧＴ−３株のコンピテント・セル＜ＤＮＡ取り込み能を
有する菌株）はダジエルトらの方法（Ｄａｇｅｒｔ、　
Ｍ、、　ｅｔ　Ｍ上：　Ｇｅｎｅ、　Ｌ　２３（１９７
９）　］で調製する。即ちＩ　００　ｇ　／ｍ　ｌとな
るようにジアミノピメリン酸を補ったし培地（バタトト
リブトン１０ｇ１酵母エキス５ｇを水ｉｆに含みｐ１７
．２に調整した培地）　５０ＩＩＩｌに植菌し、０［１
０，６になるまで３７℃で培養する。培養液を氷水で１
０分間冷却してから遠心集菌する。冷却した０、１Ｍ塩
化カルシウム２０ＩＴｌｌに再懸濁し、０℃に２０分間
置く。

細胞を再遠心し、Ｏ，ｌ　Ｍ塩化カルウシラム０．５ｍ
ｌに懸濁し０℃で１８時間置く。

塩化カルシウム処理した菌液４００屑に前記リガーゼ反
応混合物２００ｍを添加混合し、０℃に１０分間置いて
から３７℃で５分間加温する。次いでＬ培地９ｍｌを添
加し、３７℃で２時間振盪培養する。生理食塩水で２回
遠心洗浄後、１２．５ｘ／ｍｌ相当のカナマイシンを添
加したＭ９最少寒天培地（ブドウＷ１２　ｇＳＮＨ４Ｃ
ｊ！　　１　ｇ、　Ｎａ、１ＩＰＯ４６ｇ。

Ｋ１１２ＰＯ４３ｇＳＭｇＳＯ４−７Ｎ２００．１　ｇ
、　ＣａＣｊ！ａ・２ＩＩ　、０　１５　ｍｇ　、サイ
アミン塩酸塩４＋ｎｇおよび寒天１５ｇを水ＩＮに含み
、ｐＨ７，２に調整した培地）に塗布し３７℃で３日培
養する。出現したただ一ツノコロニーは、アンピシリン
２５Ｊｔｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール２５Ｎ／ｍｌ
あるいはカナマイシン２５　ｇ　／ｍ　ｌを含むし寒天
培地上でも生育するこきが確認される。

この形質転換株の培養菌体から上記（１）でｐＧ＾２２
を単離したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡをｉ
ｎする。このプラスミドＤＮＡを用い制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、第１図にｐＧＨ
２として示した構造を有している。ρＧ＾２２に挿入さ
れたＤＮＡ断片は既にクローン化された大腸菌オペロン
含有ＤＮＡ断片［：Ｃｏ５５ａｒｔ、　Ｐ、、　ｅｔ　
ａｌ　：　！ｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、。

Ｇｅｎｅｔ、、　ＪＪ４３９（１９７９）参照］と同一
の制限酵素切断部位を有していることからｐＧＨ２がス
レオニンオペロンを含有することが確認される。

次にｐｃＧｌｌとｐＧＨ２の組換え体を作製する。まず
、ｐＣＧ　ｌ　ｌとｐＧＨ２を各々Ｂｇｊ！ＩＩ、およ
びＤａｍ）Ｉ　Ｉで適正条件下完全消化する。各プラス
ミドＯＮ＾２■を含む消化物を混合し、総容量２００ｇ
に対してＴ４リガーゼ用緩衝液４０＃、Ａ　Ｔ　Ｐ　（
５＋ｎＭ）４０ｍ、Ｔ４リガーゼ０．２ｎおよびｉｔ、
ｏ　１２０ｉｄｌを加え１２℃で１６時間反応させる。

この混合物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００
頭で２回抽出しＴＥＳＩ衝液に対して透析してフェノー
ルを除去する。続いて２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衝液と前
記リガーゼ反応混合物の１対１混合液１００４を供与Ｄ
　Ｎ　Ａとして用い、実施例１　（１）と同様な方法で
コリネバクテリウム・グルタミクム上Ａ２０１株（Ｌ＾
１０３の誘導株、ホモセリン、ロイシン要求株）のプロ
トプラストを形質転換した後、ＲＣＧＰ寒天培地に塗抹
し、３０℃で６日間培養して再生増殖させる。寒天培地
上全面に生育した菌をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄
後、ロイシン５０　ｕ　／ａｎ　ｌを補充した最少寒天
培地ＭＩ上に再塗布して、３０℃で３日間培養する。出
現したコロニーの中からカナマイシン１２．５■／ｍｌ
あるいはスペクチノマイシン１００　ｇ　／ｒｎ　Ｉを
含むＮＯ寒天培地上で生育できる株が得られる。

これらの形質転換株から実施例１（１）記載のエチジウ
ムブロマイド、セシウムクロライド密度勾配遠心により
プラスミドを単離する。

これらのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　０．５■を用い各種制
限酵素による単独消化および二種類の制限酵素による二
重消化で生成するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動
で解析し、分子量およびプラスミド分子中の各制限酵素
切断部位を同定する。−株から得られたプラスミドをｐ
Ｅｔｈｒ　ｌ　と命名した。制限酵素Ｐｓｔｌ、εｃｏ
ＲＩ、およびＸｈｏ　Ｉの切断部位で特徴づけられる構
造を第３図に示す。ｐＢｔｈｒ　１　はｐｃＧｌｌにｐ
ＧＨ２のスレオニンオペロンを含む、３ｎｍＨＩ切断片
を結合した構造を有することが判明した。

ｐＥｔｈｒ　ｌ　ＤＮＡを用いて、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性とカナマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性形質が連関して導入され、それら
の形質転換株は、各種制限酵素切断様式で特徴づけられ
るｐＥｔｈｒ　１　と同一のプラスミドを保有している
。ホモセリンデヒドロゲナーゼの欠失に起因するＬＡ１
０３株のホモセリン要求性がｐＥｔｈｒ　ｌによりホモ
セリン非要求性に復帰するのは、大腸菌スレオニンオペ
ロン上にあるホモセリンデヒドロゲナーゼが発現してい
るためにほかならない。

（２）　　ｐＥｔｈｒ　１保有株の造成コリネバクテリ
ウム・グルタミクムし一２２株より誘導したスレオニン
生産菌、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ＾−１０
６（メチオニン要求性、ＡＥＣ耐性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸耐性）のｐＥｔｈｒ　１保有株は、Ｌ
Ａ−１０６のプロトプラストをｐＥｔｈｒ　］で形質転
換することによって得られる。

プロトプラストはＬＡ−１０６株を半合成培地ＳＳＭに
１００　ｔｔｇ　／ｍ　ｌ相当のメチオニンを補った培
地で培養し、ＯＤ約０．６まで生育させた細胞を実施例
１（２）と同様な工程で処理することにより調製する。

形質転換も実施例１（２）と同様に行ないスベクチノマ
イシン４００■／ｍｆを含むＲＣＧＰ寒天培地上で選択
して形質転換株を取得する。

ｐＥｔｈｒｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋ｕ
ｍｇｌｕｔａｍ＋ｃｕｍに１９＾ＴＣＣ３９０３４とし
て寄託されている。

（３）ｐＥｔｈｒ　ｌ保有株によるスレオニンの生産上
記のようにして得たＬＡ−１０６株のｐＥｔｈｒ　ｌ保
有株（＾ＴＣＣ３９（１３４）と非保有株のスレオニン
生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で生産させた菌を１
白金耳ずつ５ｍｌの生産培地Ｐ２（グルコース１００ｇ
、（ＮＨ，）　２Ｓ０４２０　ｇ　、にＨ２ＰＯ４０，
５ｇ。

Ｋａｌ（ＰＯ４０，５ｇ、　１１ｇ５Ｏ＊・７Ｈ２０１
ｇ％ＦｅＳＯａ−７１１ｚ０１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ＜・
４〜６Ｈｚ０　１０ｍＬビオチン１００河、炭酸力ルン
ウム２０ｇ１メチオニン１００ｍｇを水ｉｌに含みｐ）
１７．２に調整した培地〕の入った試験管に植菌し３０
℃で７５時間振盪培養する。

培養後、培養Ｐ液をベーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−スレオニン生成
■を測定した。結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＬＡ−１０６ ６，１ 実施例３゜ 大腸菌のフォスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ
（ＰＰＣ）遺伝子を含む組換え体プラスミドを保存する
コリネバクテリウム・グルタミクムによるグルタミン酸
の生産： （１）　　大腸菌のＰＰＣ遺伝子（本遺伝子は大腸菌で
Ｇｌｕ−をＧｌｕ”にすることが知られているグルタミ
ン酸生合成に関与する遺伝子である）を含有するＤＮＡ
断片のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクム
への導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する。

ベクターとして用いたｐ８Ｒ３２２は実施例１（１）で
ｐｃＡ２２を調製したのと同一の方法で大腸菌に一１２
株亜株の培養菌体から単離する。供与ＤＮＡとなる高分
子染色体ＤＮＡは実施例２（＋）で大腸菌に一１２株（
ＡＴＣＣ２３７４０）から調製したものを使用する。

ρＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ３ｇおよび染色体ＤＮＡ
９■を含む制限酵ＭＳａ冊用反応液（ｌＱｎ＋ＡＩ　）
リス塩酸、７ｍ１Ｊ　ＭｇＣｊ！　７．１００ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ！　。

７ｍ１ｌ　　２−メルカプトエタノール、０．０１％ウ
シ血清アルブミン、ｐＨ７，５）　２００ｎにＩＯ単位
の５ａｌｅ（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６０分間
反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる。

この混合消化物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０〃、Ａ　
Ｔ　Ｐ　（５ｍ！Ｊ）　４０ｔｄｌ、Ｔ４リガーゼ０．
４Ａｌ’および水１２０ｄを加え、１２℃で１６時間反
応させる。この混合物をＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノ
ール４００βで２回抽出し、ＴＥＳ緩衝液に対して透析
しフェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＰＰＣ
２（Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ、　Ｎ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、坦、１６７（１９６５））　（ａｒｇ−、ｔｈｒ、
　　１ｅｕ−、ｈｉｓ−、Ｔｈ１−、　　ＰＰＣ−。

ＳＴ’）の形質転換に供する。ＰＰＣ２株のコンピテン
ト・セルは２ｍｇ／ｍｌのグルタミン酸を補ったＬ培地
で培養し、実施例２（１）でＧＴ−３株のコンピテント
・セルを得たのと同様に調製する。形質転換は前記リガ
ーゼ反応混合物２００ｇを使用し、実施例２（１）と同
様に行う。Ｌ培地９ｍｌを添加し、３７℃で２時間振盪
培養して形質発現させる。次いで生理食塩水で２回遠心
洗浄後、アルギニン、スレオニン、ロイシン、ヒスチジ
ン各５０■／ｍｌを補ったＭ９最少寒天培地に塗布し、
３７℃で３日間培養する。出現したコロニーをアンピシ
リン２５１１ｇ／ｍｌあるいはテトラサイタリン２５　
ｇ　／ｍ　Ｉを含むし寒天培地上にレプリカし、３７℃
で２４時間培養してアンピシリン耐性でテトラサイタリ
ン感受性のものを選び出す。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様の方法で
プラスミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得
られたプラスミドｐＰＣｔを制限酵素消化とアガロース
ゲル電気泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２のＳａｌ　
ｌ切断部位に４．４にｂのＤＮＡ断片が挿入されたゲノ
ムサイズ８．８Ｋｂの却換え体プラスミドであることが
判明した。

このｐｐｃ　１　プラスミドを用いてＰＰＣ２株を前記
と同様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選択さ
れる形質転換株は全てグルタミン酸非要求性で、制限酵
素切断様式で特徴づけられるｐｐｃ　Ｉ　と同一構造の
プラスミドを保有している。このことはｐＰＣＩ　プラ
スミド上に大腸菌のＰＰＣ遺伝子がクローン化されてい
ることを示す。

クローン化されたＰＰＣ遺伝子をコリネバクテリウム・
グルタミクムに導入するために、ｐｃＧｌｌとＰＰＣ１
の組換え体を宿主大腸菌で調製する。

ｐｃＧｌｌおよびｐｐｃ　１　プラスミドＤＮＡを各々
２■含む制限酵素ｐｓｔＩ用反応緩衝液（２０ｄ　）　
ＩＪス塩酸、１０ｍＭ　！ＪｇＣＬ　、５０ｍ１４（Ｎ
Ｌ）ｉｓＬ　、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７
，５）　２００ｍに４単位のＰｓｔＩ（宝酒造社製）を
添加し、３０℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加
温して反応を停止させる。この反応混合物にＴ４リガー
ゼ用緩新液４０ｔｌ、　ＡＴＰ（５ｍ＆ｌ）　４０１ｄ
！、Ｔ４リガーゼ０．２ＪＪ！１および水１２０屑を加
え、１２℃で１６時間反応させる。前記と同様にフェノ
ール抽出後、透析してフェノールを除去する。このリガ
ーゼ反応混合物１００ＩＩＪＩを使用し、前記と同様に
ＰＰＣ２株を形質転換した。

生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを分離し、
その大きさをアガロースゲル電気泳動で調べた。大きさ
が約１５〜１６Ｋｂのプラスミドを選択し、そのプラス
ミドで再度ＰＰＣ２株を形質転換しＰＰＣ遺伝子の存在
を確認した。先の形質転換株の一株から得られたプラス
ミドｐＥｐｐｃ　１を制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、ｐＣＧ　１１　とｐＰｃｌが両
者のＰｓｔ　ｌ切断部位で和合連結したゲノムサイズ１
５．６Ｋｂの組換え体プラスミドであることが明示され
た。こうして大腸菌で調製されたｐＥｐｐｃ　ｌ　プラ
スミドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム・グルタミク
ムし一２２株から誘導されたＬＰ４株を形質転換する。

形質転換は実施例１（２）と同様に行い、形質転換株は
スベクチノマイシン４００■／１Ｔ１１ヲ含むＲ［ＧＰ
寒天培地上で生育するコロニーの中から取得される。こ
れらの形質転換株から単離されるプラスミドを制限酵素
５ａｉｌあるいはＰｓｔ　１の単独消化または両者の２
重消化し、アガロースゲル電気泳動で解析することによ
りｐＥｐｐｃ　ｌを保有していることが確認される。

ｐＥｐｐｃ　ｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カ
ルチャー−：ＩＬ／クションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｕｉｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ−１８＾ＴＣＣ３９
０３３として寄託されている。

（２）　　ｐＥｐｐｃ　ｌ保有株によるグルタミン酸の
生産：コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株か
ら誘導されたＬＰ４株のｐＥｐｐｃ　１保有株（＾ＴＣ
Ｃ３９０３３）　　と非保有株のグルタミン酸生産試験
を行った。ＮＢ寒天培地上で生育させた閑をかき集め、
生理食塩水で洗浄後、５ｍＭの生産培地Ｐ３（グルコー
ス５０ｇ、（Ｎ）１４）　２５０４　３　ｇ　１尿素３
　ｇ　、　ＫＨｚＰＯ４０，５ｇ−、に２ＨＰＯ４０，
５ｇ　。

！、１ｇ５Ｏ４４）ＩＪ　ｏ、　５　ｇ　、　Ｆｅ５Ｏ
ｓ４Ｈ２０１０ｍｇ５Ｍｎ５Ｏｎ・４−６Ｌ０１０ｍｇ
、ビオチン３Ｉｉｇ、サイアミン塩酸塩５００Ｊｉｇ、
フェノールレフトＩＱｍｇを純水１１に含み、ｐＨ７，
２に調整した培地〕の入った試験管に植菌し、３０℃で
振盪培養する。培養中、２０％尿素液を０．２１１１１
ずつ３回添加し、４０時間培養する。培養後、培養Ｐ液
をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発
色後、比色定１してＬ−グルタミン酸の生成量を測定し
た。

結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表 Ｐ−４ １０，１ ＬＰ−４／ｐＥｐｐｃ　１　　　　　　　１５．８実施
例４．　ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０
６７のアンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバクテリ
ウム・グルタミクムでのクローン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７の染
色体ＤＮＡを実施例１（１）と同様の方法で調製する。

ベクターとして用いるｐＣε５３は実施例１　（１）で
ｐｃＧｌｌを単離したのと同様の方法でその保有株コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬ〜２２株の培養菌体か
ら単離する。ｐＣε５３は本発明者らが先に開示したコ
リネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧｌ
　（特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５０
０）　）と大腸菌のプラスミドｐＧＡ２２　［Ａ口、６
．低」上：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１４０．４０
０（１９７９）参照〕を和合連結させたプラスミドであ
る。詳しくはＩＩＣＧＩ上に１ケ所しかないＢｇｌ！Ｕ
切ＩＦｒａＢ位とｐＧＡ２２上に２ケ所あるＢａｍ１　
Ｉ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内でない
ＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端を
利用して連結したものである。

ｐＣε５３はｐＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子
などの選択マーカーを有し、制限酵素Ｓａｌ　［に対す
る切断部位は１ケ所である。

上記で調製したｐｃＩＥ５３プラスミドＤＮＡ３ｕｇお
よび染色体ＤＮＡ９ｇを含む制限酵素５ａｌ１反応液２
００　ＪＬｌに１０単位のＳａｌ［を添加し、３７℃で
６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止
させる。この混合消化物にＴ４１Ｊガーゼ用緩衝液４０
〃、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５ｍＭ）　４０Ｊｉ１、Ｔ４リガー
ゼ０．４４およびＨ，０１２０ｍを加え、１２℃で１６
時間反応させる。この混合物をＴＥＳ緩衝液で飽和した
フェノール４００ｍで抽出し、ＴＥＳ緩衝液に対して透
析し、フェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムし一２２株から誘導されたアンスラニル酸要求性
変異株ＬＡ１０５（アンスラニル酸合成酵素欠損変異株
）を用いる。アンスラニル酸要求性変異株は、常法の変
異処理により、Ｍｌ寒天培地上で生育できず、アンスラ
ニル酸（３０■／ｍｌ相当）を補ったＭ１寒天培地上で
生育できる菌を選択することによって取得される。ＬＡ
１０５株のプロトプラストの調製および形質転換は、生
育培地ＮＢに１００■／ｍｌ相当のアンスラニル酸を補
った培地を使用する以外は実施例１（２）と同様に行う
。形質転換株は、カナマイシン２００Ｉｉｇ／ｍｌ相当
を含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコロニーとして選
択される。出現したコロニーの中からＭｌ寒天培地上で
生育できる形質転換株が得られる。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐＴｒｐ　２−３を各種制限酵素消化とアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣε５３の唯一
の５ａｌｌ切断部位に約７．１にｂの５ａｌｌＤＮＡ切
断片が挿入されたプラスミドであることがわかった。

ｐＴｒｐ　２−３を用い、同様な方法でＬＡ１０５株を
再形質転換したところ、トリプトファン１１００Ｉ１／
ｍｌおよびカナマイシン４００　ｔｔｇ／＋ｎｌを含む
ＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコロニーは、同時にアン
スラニル酸非要求性となり、それらは、Ｓａｌｌの切断
様式で判定されるｐＴｒｐ　２−３と同一のプラスミド
を保有している。

以上の結果は、クローン化された約７．ＩＫｂの５ａｌ
ｌＤＮＡ切断片にはブレビバクテリウム・フラブム＾Ｔ
ＣＣ１４０６７のアンスラニル酸合成酵素をコードする
遺伝子が存在し、それがコリネバクテリウム・グルタミ
クムＬΔ１０５株中で発現していることを示す。

ｐＴｒｐ　２−３保有菌株は米国アメリカン・タイプ・
カルチャーφコレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
＋ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ２０＾ＴＣＣ３９０３
５として寄託されている。

プラスミドルＣ巳５２を用いて上記と同様の処理を行い
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７の
アンスラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を有するプ
ラスミドｐＴｒｐ　４−３を得る。

ｐＥＣ５２は本発明者らが先に開示したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１　（特願昭５
６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００）　）と大
腸菌のプラスミドｐＧ＾２２　［Ａｎ、　　Ｇ、　　ｅ
ｔ　３上：　Ｊ、１３Ｂ（、ｔｅｒｉｏｌ。

１４０、４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプ
ラスミドである。詳しくはｐＣＧ　Ｉ上に１カ所しかな
いＢｇ！■切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所ある［ｌａ
ｍＨＩ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内の
ＢａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端を
利用して連結したものである。ρＣε５２はｐＧ＾２２
由来のカナマインン耐性遺伝子などの選択マーカーを有
し、制限酵素Ｓａｌ　Ｉに対する切断部位は１カ所であ
る。

ρＣε５２は実施例１　（１）でｐｃＧｌｌを単離した
のと同様の方法でｐＣε５２保有株コリネバクテリウム
・グルタミクムし一２２株の培養菌体から単離する。

上記と同様にトリプトファン生産性のコリネバクテリウ
ム・グルタミクムに３６株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５１）
をｐＴｒｐ　４−３で形質転換する。得られた形質転換
株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ　Ｋ３１゜ＡＴＣＣ３９２８０として寄託されて
いる。

ｐＴｒｐ　２−３保有株コリネバクテリウム・グルタミ
クムに２０．　ＡＴＣＣ３９０３５およびｐＴｒｐ　４
−３保有株同に３１．　ＡＴＣＣ３９２８０によるＬ−
トリプトファン生産試験を下記のとおり行う。

菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液Ｑ、５ｍｌを５ｍＭの生産培地Ｐ４［廃糖蜜１００
ｇ／　ｉ、（Ｎ）１．）　ｚｓＯ＊　２０　ｇ　／　１
、ＫＨ，ＰＯ，０，５ｇ／Ｉ！　、　Ｋ２ＨＰ口４　　
０．５　　ｇ　／　ｆ　−Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００，２
５ｇ／Ｉｔ、ＣａＣＬ　２０ｇ／　Ｉｔ　、　Ｊ］８７
．２　）の入った試験管にＭｍし、３０℃で９６時間振
盪培養する。

培養後、培養ｐ液をペーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定潰して、Ｌ−）’Ｊブト
ファンの生成量を測定する。

対照として、ＬＡ−１０５株およびＬＡＩＩ−１株を同
様に処理する。

結果を第４表に示す。

第　　　４　　　表 ＬＡ−１０５ し八−１０５／ｐＴｒｐ　　２−３（Ｋ２Ｏ，ＡＴＣＣ
３９０３５）　　　　　　０．３　４ＬＡＲ−１０，４
８ 実施例５．　　ｐｃＢｔｏｔの作！！！：（１）　　ｐ
ｃＧｌｌ　とｐ［ｌＢ１１０）分離ｐｃＧ１１　は、本
プラスミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミク
ムＬＡ１０３／１１ＣＧＩＩ（ＡＴＣＣ３９０２２）を
４００ｍ１ＮＢ培地でＯＤ約０．８になるまで生育させ
、その培養細胞から、実施例１　（１）でｐＣＧ２を単
離したのと同一の方法で単離する。

ρ１８１１０は、グリクザンらの方法（Ｇｒｙｃｚａｎ
。

Ｔ、　Ｊ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　：　Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉ吐、１３４．３１８（１９７８）参照〕により、本
プラスミドを保有するバチルス・サチルスＢＲＩＳ’／
ｐＵＢ”’　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．１４２３（１
９７８））の培養菌体から単離する。

（２）　　ｐｃＧｌｌ　とｐｕｅｉｔｏの試験管内組換
え上記で調製したｐｃＧｌｌ　プラスミドＤＮＡ２Ｊ１
ｇを含む制限酵、ｉＢｇｊ！ＩＩ反応緩衝液（１０ｍＭ
　）　！Ｊス塩酸、７ｍＭ　　！ＪｇＣｆ２．６０ｍＭ
　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　２−メルカプトエタノール、
　ｐＨ７，５＞　　１００屑に２単位のＢｇｆｎ（宝酒
造社製、６単位／ρ）を添加し、３７℃で６０分間反応
させる。また、ρＩＩＢＩＩＯプラスミドＤＮＡ２■を
含む制限酵素ＢａｍＨＩ反応緩衝液（１０ｆｆｌｌＪ　
）リス塩酸、７ｍＭ　ＭｇＣＬ　、１００ｍＭＮａＣ１
，２ｍＭメルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清ア
ルブミン、ｐＨ８，０）　　１００Ｊｄ！に２単位のＢ
ａｍＨＩ（全酒造社製、６単位／〃）を添加し、３７℃
で６０分間反応させる。

両制限酵素消化物を混合し、Ｔ４’Ｊガーゼ緩衝液４０
４、ＡＴＰ　（５ｍｌＪ）４ｋ、Ｔ４リガーゼ０．２ｍ
およびＨ，０１２０ｍを加え、１２℃で１６時間反応さ
せる。この混合物を、ＴＥＳ緩衡液で飽和したフェノー
ル４００４で２回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析し
たフェノールを除外する。

（３）　　ｐｃＢｌｏｌの取得 ２倍高濃度のＴＳＭＣｊｌ衝液と上記リガーゼ反応混合
物の１対１混合液１００ρを供与ＤＮＡとして用い、実
施例１（３）と同様な方法で、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬＡ１０３を形質転換し、カナマイシン耐性
株を選択する。出現したコロニーをカナマイシン１２．
５　、ｉｃｇ／＋ｎｌ　アルいはスペクチノマイシン１
００　ｇ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地上にレプリカし、３
０℃で２日培養して生育した二重耐性形質転換株３株を
任意に選び、同−寒天培地上で純化する。この３株を４
００ｄＮＢ培地で、ＯＤ約０．８になるまで生育させ、
集菌後、その培養細胞から実施例１（１）記載のエチジ
ウムブロマイド−セシウムクロライド密度勾配遠心によ
りプラスミドを単離する。いずれの形質転換株からも３
０〜３５Ｊ１ｇのプラスミド０１１＾が得られる。

これらのプラスミドＤＮＡを実施例１（３）と同じよう
に制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、分
子量と制限酵素ｐｓｔｌ、εｃｏＲＩ、ＨｉｎｃＩＩお
よびＢｇｊ！ＩＩの切断点を同定する。３株のプラスミ
ドは全てρＣＧＩＩと１口８１１０が和合連結した構造
を有し、そのうち二種は第２図にｐｃＢｌｏｌで示した
構造であるが、他の一種は結合向きが逆向きである。

いずれのプラスミドを有する形質転換株もｐｃＧｌｌ　
由来のスペクチノマイシン耐性形質とｐＨＢ１１０由来
のカナマイシン耐性形質を有している。

これらのプラスミドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム
・グルタミクムしＡｌＯ３株を再形質転換した結果得ら
れたカナマイシン耐性形質転換株は、スペクチノマイシ
ン耐性形質を同時に獲得しており、各種制限酵素切断様
式で特徴付けられる供与プラスミドと同一のプラスミド
を保存している。

実施例６゜ コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６株のし一ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバク
テリウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムによるし一ヒスチジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６
株の染色体ＤＮＡとプラスミドｐｃＧ１１の調製：１．
２．４−トリアゾール−３−アラニン耐性テヒスチジン
生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＣｌ
５６株（ＰＥＲｌＪ　０Ｐ−４５３）の染色体ＤＮＡを
実施例１（１）と同様の方法で調製する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐＣＧ　ｌ　ｌ
は、コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘
導株ＬＡ１０３のｐｃＧ１１保有株ｔ、ＡｌＯ３／ｐＣ
ＧＩＩ（ＡＴＣＣ３９０２２）から実施例Ｉ（１）と同
様にして単離する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６
株のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化： 上記で調製したｐｃＧｌｌ　プラスミドＤＮＡ３■およ
び上記染色体ＤＮＡ９■を含む制限酵素Ｂｇｉ用反応液
Ｃｌ０ｍＭ　）リス（ｐＨ７，５）　、７ｆｆ１Ｍ！Ｊ
ｇＣｊ！　２．６０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ２−メルカ
プトエタノール〕２００ｄにｌＯ単位の８ｇｌ■（全酒
造社製）を添加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で
１０分間加温して反応を停止させる。この混合消化物に
Ｔ４’ｌｌガーゼ用緩衝液（トリス２００ｍＭ　。

ＭｇＣＲ２６６ｍＬジチオスレイトール１００ｍ１Ｊ　
％　ｐＨ７、６　）　４０ｍ、５ｍＭΔＴＰ溶液４０屑
、Ｔ４リガーゼ（全酒造社製、１単位／１１１１）０．
３Ｊ１１１および水１２０１ｊＪＩを加え、１２℃で１
６時間反応させる。

Ｔ４１Ｊガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グル
タミクムＬＨ３３株（ヒスチジン要求性、リゾチーム感
受性）の形質転換に供する。

形質転換はＬＨ３３株のプロトプラストを用いて行う。

プロトプラストの調製は実施例１（２）と同様に行う。

プロトプラスト懸濁液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２５
００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（Ｉ
Ｑｍ！塩化マグネシウム、３０ｄ塩化力ルンウム、５０
ｄ）リス、４００ｍＭショ糖、ｐＨ１，５＞１ｍｌに再
懸濁して遠心洗浄後、ＴＳ＆ＩＣ緩衝液Ｑ、１ｍｌに再
懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のＴＳＩＪ［：緩衝液
と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物のｌ対ｌ混合液１００
屑を加えて混和し、次いでＴＳＭＣｔｊ！衝液中に２０
％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して
混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　２ｍ
ｌを添加し、２，５００ｘｇで５分間遠心分離にかけて
上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌの
ＲＣＧＰ培地に懸濁してから０，２１Ｔ１１をスペクチ
ノマインン４００ｘ／ｌ′Ｉｌｌを含むＲＣＧＰ寒天培
地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，
２１に塗抹し、３０℃で７日間培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スベクチノマイシン１１００Ａ／ｍｌを含む最少寒天培
地Ｍｌに塗布して３０℃で２日間培養し、スベクチノマ
イシン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質転換
株を選択する。

形質転換株の１株から実施例１（１）記載のエチジウム
ブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠心によりプ
ラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化およ
び２種類の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラスミド
ＤＮＡの制限酵素切断様式を同定する。このプラスミド
をｐＰＨ８と命名した。ｐＰＨ８はｐＣＧ　１１　のＢ
ｇＩ！Ｉｆ切断部位に約１０．６にｂのＤＮＡ断片が挿
入された構造である。

さらにｐＰＨ８Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＨ３３株〔０１１３
３株の親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）：Ｆ
ＥＲＩＪ　０Ｐ−４５２３を再形質転換したところスペ
クチノマイシン耐性株として選択される形質転換株のす
べてがヒスチジン非要求性となっていた。

これらのことより、ヒスチジン生産菌０１５６株のヒス
チジン生合成に関与する遺伝子がクローン化されている
ことが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
から８３３株を宿主菌株として用いて行うこともできる
。

（３）　　ｐＰＨ８を保有するコリネバクテリウム・グ
ルタミクム菌株によるし一ヒスチジンの生産二コリネバ
クテリウム・グルタミクムＬＡ−１０３株（ＦＥＲＭ　
Ｐ−５９４７、ＡＴＣＣ３１８６６）をｐＰＨ８Ｄ　Ｎ
　Ａで形質転換し、スペクチノマイシン４００　ｇ／ｍ
ｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換株
を選択する。得られた形質転換株を純化後、上記と同様
にプラスミド単離、構造解析を行って、ｐＰ）１３と同
じ構造のプラスミドであることをｆ＆認した。

ｐＰＨ８保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ
１０３／ｐＰＨ８は米国アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＋ｕｍｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ３２．ＡＴＣＣ３９２８１とし
て寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムしＡｌＯ３／ｐｃＧ
ＩＩ　（ＡＴＣＣ３９Ｑ２２）右よび同［、Ａｌｆ１３
／ｐＰＨ８（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ−ヒスチジン生
産試験を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養した上記の菌をそれぞ
れｌ白金耳ずつ２００　Ｉ１ｇ／ｍｌのアルギニンおよ
びメチオニンを補った５ｍｌの生産培地Ｐ５（糖蜜１２
％（糖として）、にＨ，Ｐｏ、　　０．２％、Ｋ、１（
Ｐｏ、　　０．１％、Ｍｇ５Ｏｔ・７ＦＩ２ＣＩ　　０
．０５％、ＮａＣｆ　　Ｏ，２５％、（ＮＨ４）２ＳＯ
４２，３％、尿素０．２％、ＣａＣ０ｚ　　２％、ｐＨ
７，４（アンモニアで調整）〕に植菌する。３０℃で７
５時間培養後、培地中のし一ヒスチジン生成量をスルフ
ァニル酸（ポーリー）試薬を用いる比色法［Ｈ，Ｐａｕ
ｌｙ。

Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ　；　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌｏ、　Ｃｈｅｍ、、　４２．５０８（１９０４）　、
同９４．２８４（１９１５）　）によって定量した。結
果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 ＬＡ１０３／Ｉ）ＣＧＩＩ　　　　　　　ＯＬＡ　１０
３／ｐＰＨ８（Ｋ３２）　　　　２．６（４）　　ｐ　
Ｐ　Ｈ８を保有するコリネバクテリウム・ハーキュリス
、ブレビバクテリウム・フラブムおよびブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムによるし一ヒスチジンの生
産： コリネバクテリウム・ハーキュリス＾ＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム＾ＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐｐＨ８を保有させるために
、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各菌株を３３Ｍ培地で増殖させ、ＯＤ６６０１ｍが０．
２になったときにペニシリンＧを０．３単位／ｍ　Ｉと
なるように添加する。培養を続け、Ｏ［１６６０ｎｍが
０．６まで増加したところで集菌し、１ｍｇ／ｍｌリゾ
チームを含むＲＣＧＰ培地中で上記の記載と同様にプロ
トプラストを形成させる。ｐＰＨｇを用い、上記の方法
に従い形質転換を行い、形質転換株をスペクチノマイシ
ン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育する
コロニーとして選択する。

純化したスベクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
・よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７−１８３７９９、
同５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらが
ｐＰＨｇと同じ構造を有することが制限酵素切断様式よ
り確認される。以上のことから、プラスミドρＣＧＩＩ
の誘導体であるプラスミドｐＰＨ８はコリネバクテリウ
ム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フラブムおよ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも複
製可能であり、プラスミドｐｃＧｌｌが広くこれら菌種
の細菌で使用可能であることがわかる。

ｐｐＨ８保有株であるコリネバクテリウム・ハーキュリ
スに３３、ブレビバクテリウム・フラブムに３４、およ
びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５は
それぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションにＡＴＣＣ３９２８２，３９２８３および３９２
８４として寄託されている。

これら菌株によるＬ−ヒスチジン生産試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれｌ白金耳ずつ５ｍｌの生
産培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、
培地中のＬ−ヒスチジン生産債をポーツー法によって比
色定１する。結果を第６表に示す。

第　　　６　　　表 以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成に関与する遺伝子がコリネバクテリウム・
グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキュリス
、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの諸菌種において発現し、ヒス
チジンの生産に寄与していることが明らかであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧ１１２の制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドｐｃＢ１旧の制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐ６ｔｈｒ　ｌの造成のフローチャ
ートを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社＾ＴＣＣ１
３８６９／ｐＰＨ８（に３５．ＡＴＣＣ３９２８４）２
．０ 第 ■ 図 ｃｏｌｕ １゜ 目 名 ＋１１ａｍｌｌＩ／Ｆ３ｇｌＨ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   菌種由来でＳ−（２−アミノエチル）−システインに感
   受性を示す微生物をＳ−（２−アミノエチル）−システ
   イン耐性株に変換する活性を有する遺伝子を含むＤＮＡ
   断片とコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属菌種中で自律複製可能なベクターＤＮＡとの組換え体
   ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ
   −リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採
   取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。