DE10117085A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch Fermentation coryneformer Bakterien, bei dem man Bakterien einsetzt, in denen man die für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nucleotidsequenz (poxB-Gen) abschwächt, wobei man folgende Schritte ausführt: DOLLAR A a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für Pyruvat-Oxidase kodierende Gen abgeschwächt wird; DOLLAR A b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien in denen das poxB-Gen abgeschwächt ist.

Stand der Technik

Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes Vitamin dar, das in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung findet.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Zwischenstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch aufgetrennt, D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so die gewünschte D-Pantothensäure erhalten.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren.

EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.

EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin gezeigt, daß nach Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sind, in den oben genannten Stämmen in glucose­ haltigen Nährlösungen, die Produktion von D-Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β-Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.

Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure mit Hilfe von Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) sind in der Literatur nur ansatzweise bekannt. So berichten Sahm und Eggeling (Applied and Environmental Microbiology 65 (5), 1973-1979 (1999)) über den Einfluss der Überexpression der Gene panB und panC und Dusch et al. (Applied and Environmental Microbiology 65 (4), 1530-1539 (1999)) über den Einfluß des Gens panD auf die Bildung der D-Pantothensäure.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen die für das Enzym Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nucleotidsequenz (poxB-Gen) abgeschwächt wird.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure, in dem folgende Schritte durchführt werden:

• a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nucleotidsequenz (poxB) abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet wird;
• b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
• c) Isolierung der produzierten D-Pantothensäure.

Die eingesetzten Stämme produzieren gegebenenfalls bereits vor der Abschwächung des poxB-Gens D-Pantothensäure.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenea FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032ΔilvA/pEC7panBC
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2.

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierenden poxB-Gens in verbesserter Weise Pantothensäure produzieren.

"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.

"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.

Die Nukleotidsequenz des poxB-Gens ist in der SEQ ID No. 1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz des Enzymproteins in SEQ ID No. 2 dargestellt.

Das in der SEQ ID No. 1 beschriebene poxB-Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des poxB-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.

Eine neue, in SEQ ID No. 6 dargestellte Nukleotidsequenz wurde gefunden, die stromaufwärts der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleotidsequenz der poxB-Genregion liegt. Weiterhin wurde eine neue, in SEQ ID No. 7 dargestellte Nukleotidsequenz gefunden, die stromabwärts der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleotidsequenz der poxB-Genregion liegt. Auf diese Weise wurde die in SEQ ID No. 4 dargestellte Sequenz der poxB-Genregion erhalten.

Es wurde gefunden, daß diese Polynukleotide dargestellt in SEQ ID No. 6 und 7, nützlich sind in der Herstellung von Mutanten mit abgeschwächtem, insbesondere ausgeschaltetem poxB-Gen.

Es wurde auch gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des poxB-Gens in verbesserter Weise Pantothensäure produzieren.

Zur Erzielung einer Abschwächung kann entweder die Expression des poxB-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Erniedrigung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung ("Mutation") der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-290, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen eine Insertionsmutagenese des poxB-Gens durchgeführt werden kann, ist pCR2.1poxBint (Fig. 1).

Plasmid pCR2.1poxBint besteht aus dem von Mead et al. (Bio/Technology 9: 657-663 (1991)) beschriebenen Plasmid pCR2.1-TOPO, in das ein internes Fragment des poxB-Gens, dargestellt in SEQ ID No. 3, eingebaut wurde. Dieses Plasmid führt nach Transformation und homologer Rekombination in das chromosomale poxB-Gen (Insertion) zu einem Totalverlust der Enzymfunktion.

Ein anderes Beispiel für ein mutiertes poxB-Gen ist das in Plasmid pCRB1-poxBdel (Fig. 2) enthaltene ΔpoxB-Allel. Das ΔpoxB-Allel enthält lediglich die 5'- und die 3'-Flanke des poxB-Gens. Der 1737 bp lange Abschnitt der Kodierregion fehlt (Deletion). Die Nukleotidsequenz des ΔpoxB-Allels bzw. der 5'- und der 3'-Flanke ist in der SEQ ID No. 12 dargestellt. Dieses ΔpoxB-Allel kann durch Integrationsmutagenese in coryneforme Bakterien eingebaut werden. Hierzu bedient man sich des oben angegebenen Plasmides pCRB1-poxBdel oder überführt das ΔpoxB-Allel in das Plasmid pK18mobsacB und verwendet das dabei entstehende Plasmid vom Typ pK18mobsacBpoxBdel. Nach Übertragung durch Konjugation oder Transformation und homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross over"-Ereignisses und eines zweiten, eine Excision bewirkenden "cross over"-Ereignisses im poxB-Gen erreicht man den Einbau des ΔpoxB-Allels und erzielt einen Totalverlust der Enzymfunktion in dem jeweiligen Stamm. Das durch SEQ ID No. 12 charakterisierte ΔpoxB-Allel ist Gegenstand der Erfindung.

Anleitungen und Erläuterungen zur Insertionsmutagenese bzw. Integrationsmutagenese und Genaustausch findet man beispielsweise bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) oder Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)).

Weiterhin kann es für die Produktion von Pantothensäure vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe

• - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)),
• - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)),
• - das für die Acetohydroxysäure Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen (EMBL-GenBank: Accession Nr. L09232), und
• - das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD-Gen (EP-A-1006189);

zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Weiterhin kann es für die Produktion von Pantothensäure vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für die Pyruvat-Oxidase kodierenden Gens das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase) kodierende pck-Gen (DE: 199 50 409.1, DSM 13047) abzuschwächen.

Schließlich kann es für die Produktion von Pantothensäure vorteilhaft sein, neben der Abschwächung der Pyruvat-Oxidase unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro­ organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982), die die Produktion der Pantothensäure vermindern.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pantothensäure-Produktion kultiviert werden.

Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen.

Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenerer Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische, Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium­ haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies zur zusätzlichen Steigerung der Pantothensäure-Produktion Vorstufen der Pantothensäure, wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure, und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Konzentration an gebildeter Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.

Folgender Mikroorganismus wurde am 19. Oktober 1999 als Reinkultur bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:

• - Escherichia coli Stamm DH5α/pCR2.1poxBint als DSM 13114.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben, isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA- Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.

Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.

Beispiel 2 Isolierung und Sequenzierung des poxB-Gens

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 µg/ml Zeocin ausplattiert.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 1737 Basenpaaren, welches als poxB-Gen bezeichnet wurde. Das poxB-Gen kodiert für ein Polypeptid von 579 Aminosäuren dargestellt in SEQ ID No. 2.

Beispiel 3 Herstellung des Integrationsvektors pCR2.1poxBint für die Mutagenese des poxB-Gens

Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des poxB-Gens wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
poxBint1:
5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'
poxBint2:
5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'.

Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein ca. 0,9 kb großes DNA-Fragment isoliert, welches ein internes Fragment des poxB-Gens trägt und in der SEQ ID No. 3 dargestellt ist.

Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. Anschließend wurde der E. coli Stamm Top10F' (Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4649) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1poxBint (Fig. 1) genannt.

Beispiel 4 Herstellung eines Austauschvektors für die Deletionsmutagenese des poxB-Gens 4.1 Bestimmung der Nukleotidsequenz der Flanken des poxB-Gens

In weiteren Sequenzierschritten wurde die Nukleotidsequenz der in SEQ ID No. 1 dargestellten poxB-Genregion um jeweils ca. 500 bis 600 bp stromaufwärts und stromabwärts erweitert. Hierzu wurde die in Beispiel 2 beschriebene Methodik angewendet. Auf diese Weises wurde die in SEQ ID No. 4 dargestellte, erweiterte Nukleotidsequenz der poxB-Genregion erhalten. Die neue stromaufwärts der in SEQ ID No. 1 dargestellten poxB-Genregion ist in SEQ ID No. 6 dargestellt. Die neue stromabwärts der in SEQ ID No. 1 dargestellten poxB-Genregion ist in SEQ ID No. 7 dargestellt.

4.2 Konstruktion eines ΔpoxB-Allels

Für die Konstruktion des ΔpoxB-Allels wurde die von Horton (Molecular Microbiology 3: 93-99 (1995)) beschriebene Methode der GenSOEing-PCR angewendet. Hierfür wurden die in der Tabelle 1 angegebenen Primerpaare (Siehe auch SEQ ID No. 8 bis 11) konstruiert. Mittels einer PCR wurde mit dem Primerpaar 1 der 5'-Bereich vor dem poxB-Gen und mit dem Primerpaar 2 der 3'-Bereich hinter dem poxB-Gens amplifiziert. Eine weitere PCR wurden dann mit den beiden Amplifikaten und den Primern pox-del1 und pox-del4 durchgeführt, wodurch mittels GenSOEing die beiden Amplifikate verbunden wurden. Das so erhaltene Deletionsfragment bzw. ΔpoxB-Allel enthält die flankierenden Sequenzen des poxB-Gens. Die Nukleotidsequenz des ΔpoxB-Allels ist in SEQ ID No. 12 angegeben.

Tabelle 1

4.3 Konstruktion eines Austauschvektors

Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K2800-20) in den Vektor pCR-Blunt II-TOPO Vektor (Shuman et al., (1994) Journal of Biological Chemistry 269: 32678-32684; Bernard et al., (1983) Journal of Molecular Biology 234: 534-541) ligiert. Anschließend wurde der E. coli Stamm Top10 (Grant et al. (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87: 4645-4649) mit dem Ligationsansatz transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCRB1-poxBdel (Fig. 2) genannt.

Aus diesem Plasmid wurde das ΔpoxB-Allel tragende Insert mittels EcoRI herausgespalten, aus dem Gel isoliert und in den ebenfalls EcoRI-gespaltenen, nicht-replikativen Integrationsvektor pK18mobsacB (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)) ligiert. Die Klonierungen wurden in E. coli DH5αmcr (Grant et al., (1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4649) als Wirt durchgeführt. Das resultierende Plasmid wurde als pK18mobsacB-poxBdel bezeichnet.

Beispiel 5 Mutagenese des poxB-Gens in dem Stamm FERM BP-1763

In der Patentschrift US-A-5,188,948 ist der L-Valin produzierende Stamm Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 beschrieben.

Für die Deletion des poxB-Gens wurde das Integrationsplasmid pK18mobsacB-poxBdel in den Stamm FERM BP-1763 elektroporiert. Nach Selektion auf Kanamycin (25 µg/ml) wurden Einzelklone erhalten, bei denen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag. Um die Excision des Vektors zu ermöglichen wurden Einzelkolonien in 50 ml flüssigem LB-Medium ohne Antibiotika 24 Stunden bei 30°C und 130 rpm inkubiert und dann auf Saccharose-haltigen Agarplatten (LB mit 15 g/l Agar und 10% Saccharose) ausgestrichen. Durch diese Selektion wurden Klone erhalten, die den Vektoranteil durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren hatten (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Um solche Klone zu identifizieren, die das ΔpoxB-Allel trugen, wurde eine Polymerase-Kettenreaktion mit den Primern pox-del1 und pox-del4 (Tabelle 1 und SEQ ID No. 8 und 11) durchgeführt.

Diese Primer amplifizieren auf Gesamt-DNA des Ausgangsstamms Stamm FERM BP-1763 ein ca. 3150 bp großes Fragment, während die Primer auf der DNA von poxB-Deletionsmutanten ein verkürztes, 1422 bp großes Fragment amplifizierten. Einer so identifizierten Deletionsmutante fehlt folglich ein 1,7 kb großer Bereich des poxB-Gens.

Ein auf diese Weise hergestellter und geprüfter Stamm wurde als FERM BP-1763ΔpoxB bezeichnet und für die weiteren Untersuchungen eingesetzt.

Beispiel 6 Herstellung von Pantothensäure 6.1 Herstellung der Stämme

Aus der EP-A-1006192 ist das Plasmid pND-DBC2 bekannt, welches die Gene panB, panC und panD von Corynebacterium glutamicum trägt. Das Plasmid ist in Form des Stammes ATCC13032/pND-DBC2 als DSM 12437 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.

Durch Transformation der Stämme FERM BP-1763 und FERM BP-1763ΔpoxB mit dem Plasmid pND-DBC2 entstanden die Pantothensäure produzierenden Stämme FERM BP-1763/pND-DBC2 und FERM BP-1763ΔpoxB.

6.2 Herstellung von Pantothensäure

Jeweils eine Probe der Stämme Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763/pND-DBC2 und FERM BP-1763ΔpoxB/pND-DBC2 wurde auf HHK-Agar ausgestrichen.

HHK-Agar besteht aus Hirn-Herz-Agar, der von der Firma Merck KgaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen und mit Kanamycin supplementiert wurde. Die Zusammensetzung des HHK-Agars ist in Tabelle 2 angegeben.

Diese Agarplatten-Kultur wurde 17 Stunden bei 37°C inkubiert und dann im Kühlschrank bei +4°C aufbewahrt. Ausgewählte Einzelkolonien wurden anschließend auf dem gleichen Medium weiter vermehrt. Mit einer Impföse wurde Zellmaterial eines Klons vom HHK-Agar abgenommen und in 100 mL HHK-Bouillon übertragen, die in einem Schüttelkolben von 1000 mL Gesamtvolumen enthalten waren.

HHK-Bouillion besteht aus Hirn-Herz-Medium, das von der Firma Merck KgaA (Darmstadt, Deutschland) bezogen und mit Glucose und Kanamycin supplementiert wurde. Die Zusammensetzung der HHK-Bouillon ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 2

HHK-Agar

Tabelle 3

HHK-Bouillon

Die Ansätze wurde bei 30°C und 150 rpm für 22 Stunden inkubiert. Nach Ende der Kultivierung wurde im Photometer bei einer Wellenlänge von 660 nm (OD 660) eine optische Dichte von jeweils ca. 6 gemessen. Diese Kultur des Stammes wurden zur Beimpfung des Produktionsfermenters verwendet.

Zur Fermentation wurde das in Tabelle 4 angegebene Medium SK-71 verwendet. Alle Komponenten des SK-71-Mediums wurden direkt entsprechend der Arbeitskonzentrationen im Fermenter vorgelegt und in situ sterilisiert.

Tabelle 4

Medium SK-71

Als Fermenter wurden 10 l Rührreaktoren der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat E/ED) verwendet.

Zur Inokulierung von 1950 g des Fermentationsmediums SK-71 wurden jeweils 100 mL der oben beschriebenen Schüttelkolbenvorkulturen in HHK-Bouillon eingesetzt.

Der Ansatz wurde über die gesamte Fermentationsdauer bei einer Temperatur von 30°C, einer volumenspezifischen Belüftung von 0,75 vvm, einer vom Sauerstoffverbrauch abhängigen Rührung von 800-1700 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung kultiviert. Die Kultur wurde insgesamt für ca. 49 Stunden unter den obengenannten Bedingungen bis zum Erreichen einer OD 660 von ca. 26 kultiviert. Als Korrekturmittel zur pH-Wertregulierung wurde eine wässrige Ammoniak-Lösung (25% w/v) verwendet.

Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildeter D-Pantothensäure mittels HPLC (Hypersil APS 2 5 µm, 250 × 5 mm, RI-Detektion) bestimmt.

In der Endprobe (ca. 49 Stunden) der Fermentationskultur des Stammes FERM BP-1763/pND-DBC2 wurde eine D-Pantothensäure Konzentration von ca. 0,20 g/l gemessen. Die Pantothensäure Konzentration in der entsprechenden Probe des Stammes FERM BP-1763ΔpoxB/pND-DBC2 betrug ca. 0,23 g/l.

Folgende Figuren sind beigefügt:

Fig. 1 Karte des Plasmides pCR2.1poxBint,

Fig. 2 Karte des Plasmides pCRB1-poxBdel.

Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca.-Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten werden.

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

Fig. 1

ApR: Ampicillin-Resistenzgen
ColE1 ori: Replikationsursprung ColE1
f1 ori: Replikationsursprung des Phagen f1
KmR: Kanamycin-Resistenzgen
lacZ: Reste des lacZα-Genfragmentes
poxBint: internes Fragment des poxB-Gens.

Fig. 2

'lacZa: 3'-Ende des lacZα-Genfragmentes
3'-Region: 3'-Flanke des poxB-Gens
5'-Region: 5'-Flanke des poxB-Gens
ccdB: ccdB-Gen
Km: Kanamycin-Resistenzgen
lacZa': 5'-Ende des lacZα-Genfragmentes
plac: Promotor des lac-Operons
pMB1: Replikationsursprung des Plasmids pMB1
Zeocin: Zeocin-Resistenzgen.

Darüberhinaus wurden folgende Abkürzungen verwendet:
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
ClaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ClaI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (16)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) kodierende Nucleotidsequenz (poxB) abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet wird;
• b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien; und
• c) Isolierung der produzierten D-Pantothensäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Abschwächung das Verfahren der Insertion insbesondere mittels des Vektors pCR2.1poxBint, dargestellt in Fig. 1 und hinterlegt in E. coli als DSM 13114, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Abschwächung das Verfahren der Deletion insbesondere mittels des Vektors pCRB1-poxBdel, dargestellt in Fig. 2, verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der D-Pantothensäure verstärkt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man gleichzeitig das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen verstärkt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man gleichzeitig das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen verstärkt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man gleichzeitig das für die Acetohydroxysäure Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen verstärkt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man gleichzeitig das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD-Gen verstärkt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, in denen man gleichzeitig das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen abschwächt.

11. Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Gene in coryneformen Bakterien verstärkt, die bereits D-Pantothensäure produzieren.

12. Verfahren gemäß den Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man coryneforme Bakterien einsetzt, die bereits D-Pantothensäure produzieren, in denen man das pck-Gen abschwächt.

13. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, das stromaufwärts der SEQ ID No. 1 liegt, und in SEQ ID No. 6 dargestellt ist.

14. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, das stromabwärts der SEQ ID No. 1 liegt und in SEQ ID No. 7 dargestellt ist.

15. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine Deletionsmutation des poxB-Gens dargestellt in SEQ ID No. 12.

16. Coryneforme Bakterien, die die in SEQ ID No. 12 dargestellte Deletionsmutation tragen.